Expresión de receptores en oocitos de Expresión de receptores en oocitos de Xenopus laevisXenopus laevis

Fisiología del Sistema Nervioso 2006

Dra. Eleonora KatzDra. Paola Plazas

Se realiza el viernes 7 de abril de 9.30 a 13 hs y de 14 a 17.30 hs en el INGEBI: Vuelta de Obligado 2490.

1. Preparación

2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M

3. Inyección de cRNA

4. Registro de corrientes iónicas con TVC

ProcedimientoProcedimiento

9

Amplificación del plásmidoAmplificación del plásmido

LB + ampicilina

1. Preparación de cRNA1. Preparación de cRNA

Lavado EtOH+ DNA se redisuelve

1. Tris+EDTA (pH 8)+ Rnase A

Purificación del Plásmido (lisis alcalina)Purificación del Plásmido (lisis alcalina)

2. NaOH + SDS

3. Kac (frío)

Plásmido

ssDNARestos célulasKDS

Buffer de lavado

sobrenadante

Linealización y preparación del templadoLinealización y preparación del templado

SP6 ori amp T7 5’UTR 3’UTRinserto

XX

Tratamiento con Proteinasa K +

Extracción con Fenol-cloroformo

Templado para transcripción in vitro

Transcripción Transcripción in vitroin vitro

SP6 ori amp T7 5’UTR 3’UTRinserto

T7 RNApolrATP;rCTP;rUTP:rGTPCAPBuffer

AAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAA

T7RNA pol

Geles de Agarosa con diferentes estadios de la preparación del cRNAGeles de Agarosa con diferentes estadios de la preparación del cRNA

Purificación del plásmidoPurificación del plásmidoPurificación del plásmidoPurificación del plásmido Digestión con Nhe IDigestión con Nhe I Síntesis de cRNASíntesis de cRNA

1. Preparación

2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M

3. Inyección de cRNA

4. Registro de corrientes iónicas con TVC

ProcedimientoProcedimiento

9

2. Aislamiento de los oocitos2. Aislamiento de los oocitos

Anestesiadas con ácido 3-aminobenzoico etil éster

Remoción quirúrgica de los

oocitos

Lóbulos ováricosLóbulos ováricos

Los lóbulos estan formados por oocitos rodeados de tejido conectivo altamente

irrigado (gran cantidad de vasos sanguíneos).

Lóbulos abiertosLóbulos abiertos

Pueden observarse los oocitos en distintos estadios de desarrollo

Polo animal

Polo vegetal

Se eliminan las células folicularesSe eliminan las células foliculares

Diámetro del oocito: 1-1.2mm

1. Preparación

2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M

3. Inyección de cRNA

4. Registro de corrientes iónicas con TVC

ProcedimientoProcedimiento

9

3. Inyección del cRNA a los oocitos 3. Inyección del cRNA a los oocitos

5’UTRAAAAAAAAAAAA

3’UTR

Biosíntesis de la proteína de interés a partir del cRNA por el oocito

… luego de 3 días

Expresión de receptores nAChR 910 en la membrana del oocito

1. Preparación

2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M

3. Inyección de cRNA

4. Registro de corrientes iónicas con TVC

ProcedimientoProcedimiento

9

4. Registro de corrientes iónicas con TVC4. Registro de corrientes iónicas con TVC

Ca2+Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Cl -

Canales endógenos del oocitoCanales endógenos del oocito

BAPTA

•ICl activada por Ca2+ (expresión elevada)

• Canales activados por estiramiento (expresión elevada)• receptores mACh (muscarínicos)• Canales de K+ activados por Ca2+ (expresión baja)

El receptor nicotínico El receptor nicotínico 991010

1960s -1990s AChR ?

1010

9

9

10

99

9

9

9

Elgoyhen et al. 1994 Elgoyhen et al. 2001

El receptor colinérgico nicotínico El receptor colinérgico nicotínico 9910 es una canal iónico10 es una canal iónico

Na +Na + Na +

Na +Na +

Ca2+

Ca2+Ca2+

Ca2+Ca2+

Ca2+

K+ K+

K+

K+

0 5 10 15 20 25 30

-135

-120

-105

-90

-75

-60

ACh

Vsostén = -70mV

Trabajo en el laboratorioTrabajo en el laboratorio10

10

9

9

101. Inyeccción del cRNA de interés a los oocitos (mostración)

2. Fijación de voltaje con dos microelectrodos en oocitos control e inyectados con cRNA de las subunidades nAChR 9 y 10

3. Registro de corrientes evocadas por ACh

4. Efecto de la nicotina

5. Evaluación de la permeabilidad al Ca2+ del nAChR 910 por la activación secundaria de la corriente de cloro activada por Ca2+ en soluciones extracelulares con y sin Ca2+.