Presentacin de PowerPoint

Breve historia sobre el DNA1865 Medel

1902 Boveri y Sutton, proponen que los factores hereditarios estn en los cromosomas

1910 confirma Teora cromosmica de la herenciaEl experimento de Griffith (1928)

Primera evidencia de que el DNA es el material hereditarioPrincipio transformante

Avery, Mcleod y Mccarthy (1944)

Retoman principio transformante e identifican DNA como molcula de la transformacin bacteriana

Hershey y Martha Chase en 1952

Capa proteicaDNATrabajan con bacterifagos para determinar cual es la causa de la transformacin de la bacteria

Modelo de Watson y Crick

Propuesto en 1953Describe como pareja de hebras que se entrelazan Cadenas formadas de polinucletidos

Dos cadenas de polinuecletidos enrollados sobre un eje comnLas bases purina y pirimidina estn en el interior, mientas que las unidades de fosfato y desoxirribosa se encuentran en el exteriorLas dos cadenas permanecen unidas por puentes de hidrogenoLa adenina siempre esta emparejada con la guanina y la citosina con la timina

Importancia del ADNSntesis proteicaContiene la informacin para dirigir el procesoLa secuencia de aminocidos esta determinada por la secuencia de bases del DNAAlmacena la informacin genticaReplicacin Caractersticas hereditarias transmitidas por transcripcin del DNA

IMPORTANCIA BIOLGICA DEL DNAInformacin para sntesis de protenas

Replicar el ADN

Informacin gentica

Mutacin

REPLICACIN DE DNAProceso por medio del cual se sintetiza una molcula de DNA utilizando como molde el propio DNA celular.

Hiptesis de replicacin:

Extraccin de DNA

El procedimiento bsico de la extraccin de DNA se puede dividir en 5 pasos, algunos se realizan simultneamente dependiendo del protocolo a usar:

Ruptura de las clulasEliminacin de protenasEliminacin de RNAEliminacin de protenasConcentracin de DNA

Lisis celularEliminacin de protenasEnzimas proteolticas: proteinasa K.Algunos protocolos utilizan para la lisis celular el SDS en presencia de la proteinasa K en un solo paso.La digestin se acompaa de EDTA para inhibir la accin de las ADNasas .Organismos ricos en protenas (micobacterias y tripanosomas): despus de la digestin se realiza un tratamiento con bromuro de hexadecil-trimetil-amonio (CETAB), que es un detergente catinico en presencia de NaCl 0.7M. El Ditiotreitol o DTT

Sirve para desproteger al ADNEste reduce los puentes disulfuro de las protenasMuchas veces la reduccin de los puentes disulfuro se da por una desnaturalizacin esta puede ser a altas temperaturas, un agente desnaturalizador como hidrocloruro de guanidinio a 6M, urea 8 M o de dodecilsulfato de 1%

Eliminacin de RNADigestin del RNA con ARNasas, como la ribonucleasa A de pncreas de bovino.

En algunos protocolos se lleva a cabo despus de la extraccin del DNA.Eliminacin de protenasSolventes orgnicos:fenol-cloroformo-alcohol isoamlico Fenol: bidestilado, equilibrado y protegido contra la oxidacin mediante la adicin de 8-hidroxiquinolina.Cloroformo: se le adiciona alcohol isoamlico (24:1), para prevenir la produccin de espuma

Concentracin de DNAPrecipitacin con etanol en presencia de cationes monovalentes a concentraciones de 0.1-0.5 M.

Se remueven residuos de fenol y cloroformo.

Sales: acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro de litio.PROPIEDADES FISICAS Y QUMICAS DEL ADNPolmero largo formado por nucletidos. Unidos por puentes de hidrgeno, mide 22 a 26 A .

Soluble en soluciones concentradas de NaCl

Insoluble en alcohol

Puede ser disociado de la protena por el tratamiento con un detergente o un fenol.

TARJETAS WHATMAN

Las tarjetas FTA contienen sustancias qumicas que lisanclulas, desnaturalizan protenas y protegen los cidos nucleicos de las nucleasas, del dao oxidativo y el dao causado por la radiacin UV.Los cidos nucleicos quedan capturados en la matriz de celulosa de la tarjeta, los detritos celulares son eliminados con reactivo de purificacin y agua libre de nucleasas.

Whatman Ltd 2007-2009

Importancia del DNA obtenidoDiagnstico prenatal o deteccin de portadores sanos de enfermedades genticas

Enfermedad de DuchenneEnfermedad de HuntingtonDrepanocitosisDiagnstico molecular de las enfermedades infecciosas

Estudio de regiones polimrficas en ADN humano conduce al desarrollo de tecnologa para identificacin humana, como exclusin de paternidad.

Criminalstica

ObjetivoQue el alumno comprenda la importancia biolgica de los cidos nuclicos y aplique sus propiedades fisicoqumicas para su aislamiento a partir de diversos tejidos biolgicosPASO No.DESCRIPCIN1LIMPIAR PERFECTAMENTE EL REA DE TRABAJO, USAR GUANTES Y CUBREBOCAS, CERRAR LO QUE PERMITA LA CIRCULACIN DE AIRE (PUERTAS, VENTANAS, ETC)2ETIQUETAR TUBOS FALCON DE 15 ML CON LA CLAVE CORRESPONDIENTE A LA MUESTRA A TRABAJAR3COLOCAR 3 ML DE SANGRE EN EL TUBO FALCON ETIQUETADO 4ADICIONAR 9 ML DE AGUA ESTRIL LIBRE DE NUCLEASAS5AGITAR POR INVERSIN DURANTE 1 MINUTO. PEDIR ASESORA PARA SABER SI LOS ERITROCITOS SE LISARON.6CENTRIFUGAR A 3000 RPM DURANTE 10 MINUTOS. AL CABO DE ESTE TIEMPO, DEBE OBSERVARSE UN PELLET BLANCO (LEUCOCITOS). 7DESECHAR EL SOBRENADANTE CON SUMO CUIDADO PARA EVITAR LLEVARSE EL PELLET CON LOS LEUCOCITOS Y EL DNAProcedimiento para sangre lquida8AGREGAR A LA MUESTRA 2 ML DE UNA SOLUCIN QUE CONTENGA:100 MICROLITROS DE PROTEINASA K 10 mg/ml100 MICROLITROS DE DTT 1MEN 800 MICROLITROS DE AMORTIGUADOR DE LISIS PROTEICA.9AGITAR EN VORTEX E INCUBAR A 65C DURANTE UNA HORA O HASTA OBSERVAR LA LISIS DEL PELLET10AGREGAR 4 ML DE LA MEZCLA FENOL-CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMLICO CON SUMO CUIDADO (TXICOS E IRRITANTES),TAPAR PERFECTAMENTE EL TUBO Y AGITAR VIGOROSAMENTE DURANTE 10 MINUTOS11CENTRIFUGAR DURANTE 10 MINUTOS DE 3000-3500 RPM. PARA SEPARAR LAS TRES FASES: UNA INFERIOR (ORGNICA. FENOL-CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMLICO; OTRA INTERMEDIA, PROTENAS PRECIPITADAS Y UNA SUPERIOR O ACUOSA CON EL ADN)12SEPARAR LA FASE ACUOSA Y COLOCARLA EN 10 ML DE ETANOL ABSOLUTO FRO EN OTRO TUBO FALCON, TENIENDO CUIDADO DE NO REMOVER PROTENAS PRECIPITADAS, PERO TRATANDO DE RECUPERAR AL MXIMO ESTA FASE ACUOSA, YA QUE LA MAYOR PARTE DEL ADN SE ENCUENTRA MUY CERCA DE LA INTERFASE AGUA-PROTENAS13MEZCLAR POR INVERSIN. EN OCASIONES ES POSIBLE OBSERVAR LA PRECIPITACIN DEL ADN. SI EL PRECIPITADO SE OBSERVA BLANCO U OPALESCENTE, SIGNIFICA QUE CONTIENE TODAVA MUCHAS PROTENAS, POR LO QUE EL PROCESO DE PURIFICACIN FUE INEFICAZ14DEJAR EN CONGELACIN POR LO MENOS DOS DAS PARA PROMOVER LA PRECIPITACIN DE LA MAYOR PARTE DEL ADN15CENTRIFUGAR A 3000 RPM DURANTE 15 MINUTOS Y DESECHAR EL ETANOL ABSOLUTO

16COLOCAR 2 ML DE ETANOL AL 70%17CENTRIFUGAR A 3000 RPM DURANTE 15 MINUTOS Y DESECHAR EL ETANOL AL 70%18DEJAR SECAR DURANTE 30 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE19HIDRATAR CON 1 ML DE AGUA20LEER EN EL ESPECTROFOTMETRO:260 nm: ABSORCIN DEL ADN230 Y 280 nm: ABSORCIN DE ENLACE PEPTDICO Y AMINOCIDOS AROMTICOS21OBTENER LA RELACIN DE LAS ABSORBANCIAS:260/230 Y 260/280INTERPRETACIN:SI EL COCIENTE ES DE 1.8-2: ADN DE ALTA PUREZASI EL COCIENTE ES 2: ADN CONTAMINADO CON FENOLProcedimiento para FTAPASO No.DESCRIPCIN1LIMPIAR PERFECTAMENTE EL REA EN LA QUE SE VA A TRABAJAR CON HIPOCLORITO DE SODIO AL 5%2ETIQUETAR TUBOS EPPENDORF DE 1.5 ML CON LA CLAVE CORRESPONDIENTE A LA MUESTRA A TRABAJAR 3COLOCAR 5 FRAGMENTOS DE 1.2 MM DE DIMETRO DE PAPEL FTA CON LA MUESTRA DE SANGRE EN UN TUBO EPPENDORF DE 1.5 ML PREVIAMENTE ETIQUETADO UTILIZAR EL HARRIS MICROPUNCHER4LLEVAR LAS MUESTRAS AL REA DE EXTRACCIN DE ADN Y COLOCAR 400 MICROLITROS (8 GOTAS) DEL REACTIVO DE FTA A CADA TUBO.5INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE Y AGITACIN (1000 RPM) DURANTE 5 MINUTOS EN EL THERMOMIXER O POR INVERSIN6DECANTAR CON SUMO CUIDADO EL REACTIVO DE FTA, PROCURANDO LIMPIAR EL REMANENTE DEL REACTIVO EN LA BOCA DEL TUBO CON UN PAPEL ABSORBENTE LIMPIO7COLOCAR 400 MICROLITROS (8 GOTAS) DE AGUA DESTILADA ESTRIL LIBRE DE NUCLEASAS A CADA MUESTRA8INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE Y AGITACIN (1000 RPM) DURANTE 5 MINUTOS EN EL THERMOMIXER O MANUALMENTE9DECANTAR CON SUMO CUIDADO EL AGUA, PROCURANDO LIMPIAR EL REMANENTE DEL REACTIVO EN LA BOCA DEL TUBO CON UN PAPEL ABSORBENTE LIMPIO10COLOCAR 400 MICROLITROS (8 GOTAS) DE AGUA DESTILADA ESTRIL LIBRE DE NUCLEASAS A CADA MUESTRA11INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE Y AGITACIN (1000 RPM) DURANTE 5 MINUTOS EN EL THERMOMIXER12RETIRAR EL AGUA CON UNA MICROPIPETA Y PUNTA DE 1000 MICROLITROS CON SUMO CUIDADO (O PIPETA PASTEUR)13COLOCAR LOS TUBOS A 60C DURANTE 30 MINUTOS, OBSERVAR QUE NO QUEDEN RESIDUOS DE AGUA14LA MUESTRA EST LISTA PARA AMPLIFICARSE CON EL PROTOCOLO DE PCR SET UP Y AMPLIFICACIN DE FTA CON TAQ GOLD O LA TAQ DE PROMEGA REFERENCIASGuyton A. Fisiologa mdica.11 ed. Madrid: Elevier, 2006.Passarge. Gentica: texto y atlas: mdica panamericana,2010.Oliva R. Gentica mdica.3 ed, Barcelona: Ediciones universidad ,2004.Hernndez Chavarra Francisco, fundamentos de epidemiologia: el arte detectivesco de la investigacin epidemiolgica, San Jos, C.R: EUNED, 2002. Orfila 4, IV jornadas anuales sociedad espaola medicina legal y forense, Cdiz, Espaa: 1990.Concepcin J Puerta B y Claudia P. Uruea P, practicas de biologa molecular, Espaa: Editorial Pontificia Universidad Javeriana.