Extraccion Para Armar Tesis

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RESUMEN Enfermedad de Chagas, siendo Tripanosoma cruzi el agente causal, es un importante problema de Salud Pública en los países de América latina. Muestra un curso clínico variable, desde asintomática hasta fases crónicas con parasitémia bajas, cuya forma más severa es la cardiopatía. Las poblaciones de T. cruzi, también denominados aislados o cepas, presentan una gran heterogeneidad de comportamiento biológico; diferentes grados de virulencia en animales experimentales y humanos, variaciones en la sensibilidad a fármacos, diferente grado de agresión hacia el hospedero (tropismo tisular), etc. T. cruzi exhibe un alto grado de polimorfismo intraespecífico, incluyendo desde aspectos morfológicos y marcadores moleculares recientemente descritos, que han podido clasificarlo. En un principio fue clasificado dentro de dos linajes principales, fue en los últimos años que se logró clasificar y dividir en 6 unidades discretas de tipificación (DTU), lo cual, ha permitido conocer mejor la variabilidad de los aspectos clínicos de la enfermedad de Chagas y poder contrarrestarlos. En este contexto se desarrolló la caracterización molecular de una nueva cepa denominada LJ02, aislada de heces de triatómino de la localidad Las Josefinas del municipio de Tezonapa, Veracruz. La caracterización constó de varios procedimientos, en primer lugar determinamos su presencia mediante microscopia directa de las heces, posteriormente mantuvimos el parásitos en un organismo vivo al inocularlo en un modelo murino, desde el cual obtuvimos sangre periférica para realizar un crecimiento del parasito en un medio de cultivo, en este caso un hemocultivo de condiciones bifásicas el cual consistió de sangre humana y medio de cultivo LIT. Finalmente realizamos la tipificación de la cepa LJ02 y con otras cepas de referencia, particularmente cepa “Y” y Nayarit cepas mantenidas en cultivo, mediante la amplificación utilizando la técnica de PCR, de diferentes marcadores moleculares como el gen mini exón y el dominio divergente del ARNr 24sα usando oligonucleótidos específicos, además se realizaron restricciones mediante RFLP de secuencias, específicamente HSP60 y GPI, con el objetivo de clasificar cada una de las cepas según el linaje resultante

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RESUMENEnfermedad de Chagas, siendo Tripanosoma cruzi el agente causal, es un importante problema de Salud Pública en los países de América latina. Muestra un curso clínico variable, desde asintomática hasta fases crónicas con parasitémia bajas, cuya forma más severa es la cardiopatía.Las poblaciones de T. cruzi, también denominados aislados o cepas, presentan una gran heterogeneidad de comportamiento biológico; diferentes grados de virulencia en animales experimentales y humanos, variaciones en la sensibilidad a fármacos, diferente grado de agresión hacia el hospedero (tropismo tisular), etc. T. cruzi exhibe un alto grado de polimorfismo intraespecífico, incluyendo desde aspectos morfológicos y marcadores moleculares recientemente descritos, que han podido clasificarlo. En un principio fue clasificado dentro de dos linajes principales, fue en los últimos años que se logró clasificar y dividir en 6 unidades discretas de tipificación (DTU), lo cual, ha permitido conocer mejor la variabilidad de los aspectos clínicos de la enfermedad de Chagas y poder contrarrestarlos.En este contexto se desarrolló la caracterización molecular de una nueva cepa denominada LJ02, aislada de heces de triatómino de la localidad Las Josefinas del municipio de Tezonapa, Veracruz. La caracterización constó de varios procedimientos, en primer lugar determinamos su presencia mediante microscopia directa de las heces, posteriormente mantuvimos el parásitos en un organismo vivo al inocularlo en un modelo murino, desde el cual obtuvimos sangre periférica para realizar un crecimiento del parasito en un medio de cultivo, en este caso un hemocultivo de condiciones bifásicas el cual consistió de sangre humana y medio de cultivo LIT. Finalmente realizamos la tipificación de la cepa LJ02 y con otras cepas de referencia, particularmente cepa “Y” y Nayarit cepas mantenidas en cultivo, mediante la amplificación utilizando la técnica de PCR, de diferentes marcadores moleculares como el gen mini exón y el dominio divergente del ARNr 24sα usando oligonucleótidos específicos, además se realizaron restricciones mediante RFLP de secuencias, específicamente HSP60 y GPI, con el objetivo de clasificar cada una de las cepas según el linaje resultante

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INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas, que es causada por el protozoario Trypanosoma cruzi (T. cruzi), es un problema de Salud Pública importante en los países de América Latina con una distribución diferente del parásito a través del continente. Según la OMS, es la tercera enfermedad tropical en importancia a nivel mundial en cuanto a morbimortalidad. Debido a sus cuadros clínicos en el desarrollo de esta enfermedad que presenta cardiopatías, megaesófago y megacólon es la importancia de su estudio, estas manifestaciones clínicas están relacionadas con su variabilidad génetica. El perfil genético de T. cruzi ha mostrado una gran diversidad y variabilidad del parásito que permite su clasificación en seis unidades discretas de tipificación (DTU TcI-TcVI). Estos DTUs son conjuntos de poblaciones que están genéticamente más relacionados entre sí que a cualquier otra acción y que son identificables por los marcadores comunes genéticos, moleculares o inmunológicos. Dado el nivel actual del estudio genético de T. cruzi, la historia ecológica para los DTUs de T. cruzi no pueden todavía discernirse plenamente. La distribución geográfica de esta enfermedad se había enfocado en el sur del continente. Ahora esta distribución se ha ampliado significativamente a otros lugares. En México se estima que el DTU que prevalece es TcI. A pesar de la distribución geográfica pueden encontrarse otros DTUs en el país, mediante la utilización de estos marcadores moleculares se podrán caracterizar linajes de T. cruzi presentes en la región. Permitiendo confirmar la diversidad genética de T. cruzi en el estado de Veracruz. En este proyecto identificaremos mediante caracterización molecular el DTU de una cepa de T. cruzi aislada de chinches del Género Triatoma dimidiata (T. dimidiata) en el estado de Veracruz.

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MARCO TEÓRICO 2.1 Antecedentes generales 2.1.1 Enfermedad de Chagas 2.1.1.1 Etiología Tripanosoma cruzi es el agente etiológico del mal de Chagas, conocida como tripanosomiasis americana. La relevancia de esta enfermedad se ha relacionado con las viviendas rurales hechas de adobe, carrizo y techos de hojas de palmera o de paja; estas habitaciones favorecen la colonización intradomiciliaria de los vectores hematófagos del género Triatoma, familia Reduiidea, subfamilia Triatominae conocidos vulgarmente como chinches hociconas, vinchucas, etc. Es una importante causa de cardiopatías, megaesófago y megacolon entre los habitantes de México, Centroamérica y Sudamérica, enfermedad potencialmente mortal [1]. Zoonosis en la que participan un gran número de reservorios vertebrados y transmisores triatóminos. Según la estadísticas de la OMS del año 2014, la enfermedad de Chagas se encuentra sobre todo en zonas endémicas de 21 países de América Latina, donde se transmite a los seres humanos principalmente por las heces de insectos triatomíneos conocidos como vinchucas, chinches o con otros nombres, según la zona geográfica. Se calcula que en el mundo hay entre 7 y 8 millones de personas infectadas, la mayoría de ellas en América Latina, donde la enfermedad de Chagas es endémica [2]. 2.1.1.2 Mecanismos de transmisión Las vías de transmisión de la enfermedad de mayor repercusión desde el punto de vista epidemiológico es la vectorial. Además puede ser transmitida de otras maneras, por ejemplo puede ingresar en forma directa por hemotransfusión, transmisión de madres con la enfermedad de Chagas a sus fetos o trasplante de órganos, incluso por accidentes en laboratorios. 3

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2.1.1.2.1 Vectorial T. cruzi se transmite a través del contacto con insectos triatominos, que son hematófagos obligados y de hábitos nocturnos y que constituyen el principal mecanismo de transmisión en la naturaleza [3]. Entre los insectos vectores de importancia epidemiológica, se encuentran: Triatoma barberi, T. dimidiata, T. pallidipennis (Meccus pallidipennis), T. longipennis (Meccus longipennis), T. infestans, T. mazzotti (Meccus mazzotti), T. mexicana, T. gearslaeckeri, T. picturata (Meccus picturatus), Rhodnius prolixus, Dipetalogaster maxima y Panstrongylus spp [4]. La mayoría de las infecciones en el hombre se producen en zonas rurales, en donde el parásito se transmite a través de las heces del insecto cuando los insectos infectados se alimentan con la sangre de un animal u hombre. Los vectores infectados excretan los tripanosomas en sus heces durante la succión de sangre [3]. 2.1.1.2.2 Transfusional El proceso de urbanización de la enfermedad de Chagas es la vía de transmisión transfusional, causada por la migración de la población rural de áreas endémicas hacia las grandes ciudades. A pesar de que la transmisión transfusional está prácticamente controlada en la mayoría de los países de nuestro Continente, aún continúa representando un serio problema de transmisión en aquellos países en donde todavía no se decreta la obligatoriedad de tamizar a los donantes que acuden a los bancos de sangre. En los últimos decenios, el número de donantes con serología positiva ha sido muy elevado en los países endémicos. Actualmente, en la mayoría de los países de América Latina se ha establecido por ley la obligatoriedad de que los bancos de sangre dispongan de sistemas de tamizaje para prevenir la transmisión transfusional de T. cruzi. Es importante señalar que dicha transmisión no se limita a los países en que la enfermedad es endémica. El problema se ha agudizado aún más en los países no endémicos, especialmente en España y en los estados de Florida y California en Estados Unidos, debido a la afluencia de migrantes infectados procedentes de áreas endémicas [3]. 4

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2.1.1.2.3 Congénita La enfermedad de Chagas congénita ha sido limitada a las zonas rurales; sin embargo, se notifica cada vez con mayor frecuencia en ciudades donde no hay transmisión vectorial, pero a las que han migrado desde el campo numerosas mujeres infectadas en edad de procrear. Se han notificado casos de enfermedad de Chagas congénita en Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Colombia, Guatemala, Honduras, Paraguay, Uruguay y Venezuela. En países no endémicos, principalmente en España, el riesgo de transmisión varía según la cepa de T. cruzi, la parasitémia de la madre, la existencia de lesiones en la placenta y la región geográfica; este riego de transmisión se ha estimado en un promedio de 5% [3]. 2.1.1.2.4 Trasplante de órganos La transmisión por trasplante de órganos de donadores infectados ha sido reportada, sobre todo, en casos de trasplante de riñón. Los trasplantes de corazón, médula ósea y páncreas de donantes vivos y muertos son también posibles causas de transmisión de la enfermedad de Chagas. Se han notificado casos en Argentina, Brasil, Chile y Venezuela [3]. 2.1.1.2.5 Accidental Se ha notificado la transmisión accidental de la enfermedad de Chagas en varias situaciones, como en laboratorio y hospitales. Se han registrado más de 70 casos bien documentados en técnicos, médicos e investigadores, al manipular diferentes tipos de materiales contaminados, como excretas de triatóminos, cultivos de parásitos y sangre infectada de seres humanos y animales. 2.1.1.2.6 Oral Tras la ingestión de alimentos contaminados con triatóminos infectados o con sus excretas. La transmisión oral de T. cruzi ha sido ampliamente documentada en la Amazonía brasileña, en donde los habitantes locales consumen jugo de frutos de palmeras que al cosecharlos, accidentalmente, se procesan también triatóminos silvestres infectados, de manera que el jugo de los frutos se contamina con las heces infectadas de los insectos vectores [3] también a través de ingesta de los triatóminos; ingesta de cualquier alimento contaminado con heces de los artrópodos, con secreciones de reservorios [4]. 5

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2.1.1.3 Características clínicas La enfermedad de Chagas presenta un curso clínico variable, cursa tres períodos evolutivos. Período primario o agudo. Llamado de primoinfección con puerta de entrada del T. cruzi generalmente a través del vector. Durante esta etapa se produce una diseminación polihística, configurando un cuadro clínico infeccioso generalizado y también de acuerdo a la afectación visceral dando origen a una miocarditis aguda y/o meningoencefalitis aguda. Puede ser asintomática, oligosintomática o sintomática, con fiebre, adenomegalias, conjuntivitis unilateral (signo de Roñama). Esta fase inicial puede ser fatal hasta un 10% de los casos graves, con mayor mortalidad en niños menores de tres años de edad debido a meningoencefalitis. Período secundario intermedio, inaparente, latente o crónico indeterminado. Se caracteriza por la disminución de la parasitémia, la atenuación e incluso desaparición de los síntomas. Constituye la etapa silenciosa de la enfermedad, dado que la mayoría de las veces pasa inadvertida. Período terciario o crónico determinado, donde se manifiestan las lesiones definitivas en los órganos blancos, como corazón, aparato digestivo y sistema nervioso, caracterizado por miocardiopatía dilatada, síndrome de disperistalsis esófago-gastroentérico, disautonomía y en menor frecuencia neuropsicopatía. Estos pueden presentarse en forma aislada o asociada. Esta fase presenta un período de latencia de 10-15 años referido como la forma indeterminada, después de que alrededor del 27% de las personas infectadas desarrollan síntomas cardiacos que pueden conducir a la muerte súbita 6% desarrollan lesiones en el aparato digestivo, y 3% puede presentar del sistema nervioso periférico. La variabilidad genética del parásito y del anfitrión puede influir en la forma clínica de la enfermedad de Chagas [5]. 2.1.2 Triatóminos El triatomino es la principal forma de transmisión de la enfermedad de Chagas. Pertenecen al orden hemíptera, el cual se caracteriza por aparato bucal tipo succionador. La mayoría son organismos que se alimentan de plantas (fitófagos), algunos otros insectos (depredadores) y unos pocos de sangre de vertebrados (hematófagos. En el suborden Heteróptera se encuentra 6

la familia Reduviidae y subfamilia Triatominae, única hematófaga en este grupo. De las 124 especies registradas, 111 están restringidas al Nuevo Mundo y 107 Se han informado en infecciones naturales y experimentales con T. cruzi. [6]. La clasificación taxonómica actual del Triatoma se describe en la Tabla I. En la figura 1 se muestran las principales especies vectoras asociadas con el hábitat humano, que actualmente son el blanco de acciones de control y vigilancia epidemiológica en Latinoamérica [3].

Actualmente se conocen 30 especies de Triatominae en México, presentan una amplia distribución geográfica que abarca 14 estados principalmente en la región central del país (figura 2) [8]. El primer informe relacionado con la enfermedad de Chagas en México era una descripción de T. dimidiata. México por ser un país con una enorme variedad climática y una gran biodiversidad, proporciona una oportunidad para el desarrollo de agentes etiológicos de todo tipo. La invasión de las poblaciones humanas en los ecosistemas terrestres se ha traducido en el establecimiento y la propagación de la enfermedad. Al menos 30 especies de triatóminos son conocidos y todos son vectores potenciales. Nueve o diez de ellos son reconocidos como importantes vectores, pero se necesitan estudios de capacidad vectorial y competencia vectorial de una mayor comprensión de la transmisión natural [9].

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2.1.1 Trypanosoma cruzi 2.1.1.1 Generalidades Trypanosoma cruzi es considerado el agente causal de la enfermedad de Chagas descrita hace más de 100 años por el Dr. Carlos Chagas en Minas Gerais, Brasil en 1909. Observó la presencia de un flagelado que denomino Schizotrypanum, aislado de las heces de un hematófago; Panstrongylus megistus, que habitaba en las chozas de algunas personas de aquella región. El Investigador Chagas con la experiencia que tenía, llegó a intuir que la enfermedad recientemente descubierta, tenía una forma crónica, pues le impresionaron los 8

síntomas como los trastornos del ritmo cardiaco, extrasístoles y bradicardia. Posteriormente el Dr. Salvador Mazza, investigador médico en enfermedades infecciosas, bacteriólogo y parasicólogo, fue el principal estudioso de la enfermedad de Chagas en la república Argentina, habiendo encarado profundos estudios de tripanosomiasis, abarcando vectores, animales domésticos y silvestres, casos humanos de la enfermedad [10]. Esta infección chagásica, inicialmente fue una enzootia silvestre, transmitida en la naturaleza, entre triatóminos y animales, y se trasformó en una antropozoonosis por el ingreso del hombre en el ambiente natural, en el que circulaba T. cruzi.

Morfología y ciclo de vida Se estima que el T. cruzi surgió como una especie de hace más de 150 millones de años. La filogenia es descrita en la Tabla II. Es un protozoario hemoflagelado, presenta un pleomorfismo natural, se caracteriza por tener un flagelo y un cinetoplasto únicos. Es un parásito unicelular. Los miembros de la familia kinetoplastida se caracterizan por la presencia de una única mitocondria, considerablemente ramificada, que recorre toda a longitud del parasito y presenta una forma definida llamada cinetoplasto, donde se encuentra el DNA mitocondrial, llamado en este caso DNA cinetoplástico [11].

El ciclo de vida de T. cruzi se desarrolla en dos organismos diferentes (invertebrado y vertebrado), presentando en cada uno de ellos una fase con dos estadios. En general los cuatro estadios morfológicos del parásito son: Tripomastigote metacíclico, promastigote, epimastigote y amastigote

En el intestino medio del vector se encuentran los epimastigotes donde se multiplican. Son fulsiformes, con un flagelo que forma una membrana ondulante que nace del blefaroplasto. El cinetoplasto se encuentra cercano a la parte anterior del núcleo que se encuentra en posición central. Este estadio presenta división binaria longitudinal. Al cabo de 15 a 30 días, se transforman en tripomastigotes metacíclicos en la parte posterior del intestino del vector. Los tripomastigotes metacíclicos son flagelados, alargados con un núcleo central, con un cinetoplasto de gran tamaño y el blefaroplasto posterior de donde surge el flagelo que contornea una membrana ondulante, que le confiere movimiento. Este estadio es la forma que penetra e infecta al hospedero, no se multiplica en la sangre del hospedero. El insecto defeca tripomastigotes metacíclicos presentes en heces. Pasa a circulación sanguínea por el sitio de la picadura a través de las mucosas cambiando de estadio a promastigote o tripomastigote sanguíneo.

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El tripomastigote sanguíneo es flagelado y presenta membrana ondulante, alargado, con el cinetoplasto grande alejado de la parte anterior el núcleo, similar al estadio anterior. En sangre de los humanos o ratones infectados experimentalmente se han observado en forma de “C” o “S”. Mide 20 μm de largo por 1 μm de anchura. El citoplasma lleno de ribosomas tiene una mitocondria cresada, en continuidad con las cisternas del retículo endoplásmico granular; el aparato de Golgi lleva vesículas lisas y cuerpecillo multivesiculares. No tiene la capacidad para dividirse, pero sí de invadir otras células. Infecta las fibras del musculo cardiaco estriado o a los fagocitos. Se convierten en amastigostes dentro de las células. Estos son de forma redondeada, carecen de flagelo y por lo tanto no tiene movimiento; tiene un gran núcleo cerca del cual se encuentra el cinetoplasto a manera de disco. Tiene la capacidad de replicación por división binaria simple. Repletan la célula hospedera hasta que se produce la rotura de la célula. Los parásitos liberados se convierten en promastigote y tripomastigote e invaden a otras células. Estos tripomastigotes sanguíneos son ingeridos por el vector al alimentarse de los mamíferos infectados transformándose en el intestino medio en epimastigotes. Y el Ciclo comienza nuevamente; la transmisión sólo ocurre cuando el insecto defeca al momento de alimentarse

2.1.1.2.1 Ciclos epidemiológicos de transmisión También la transmisión de T. cruzi en humanos ha sido atribuida tradicionalmente a dos ciclos que se conectan entre sí y definidos como ciclos selvático y doméstico.

2.2 Antecedentes directos 2.2.1 Variabilidad genética de T. cruzi T. cruzi es un agente patógeno comprende un conjunto de poblaciones de cepas que circulan entre los vectores, hombre y reservorio, tanto domésticos como selváticos. Existe una gran variación intraespecífica en cuanto a diferentes morfologías de las formas sanguíneas, virulencia, habilidad para inducir lesiones, susceptibilidad para agentes quimiterápicos, contitución antigénica y capacidad de infección para células hospedadoras. El comportamiento del parásito puede estar influenciado por el mismo hospedero o las condiciones del medio ambiente. La predisposición genética es un factor importante tanto del parasito como del hospedero.

T. cruzi puede ser transmitida a través de los hemípteros salvaje en un ciclo que implica generalmente mamíferos salvajes (el ciclo "selvático") y también puede ser transmitida por hemípteros casa-vivienda en un ciclo que involucra principalmente los seres humanos y los animales domésticos (el llamado ciclo "nacional "). La conexión entre los dos ecosistemas se hace por las ratas infectadas, ratones, murciélagos, marsupiales y otros mamíferos salvajes. Se estima que el parásito surgió como una especie de hace más de 150 millones de años, infectando originalmente mamíferos primitivos dispersos a lo largo de Laurasia y Gondwana, las regiones que se originaron del Norte y del Sur, respectivamente. Su primer contacto con los seres humanos ocurrió mucho más recientemente, a finales del Pleistoceno (hace 20,000-15,000 años), cuando los humanos poblaron las Américas. Por lo tanto, el Homo sapiens es un nuevo huésped muy reciente para T. cruzi. Evidencia molecular convincente indica la presencia de DNA de T. cruzi en momias exhumadas en el norte de Chile y sur de Perú que datan como de 9000 años atrás [14].

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El genoma de T. cruzi es diploide, con diferentes tamaños homólogos de pares de cromosomas. Su genoma ha sido recientemente secuenciado y se estima entre 106,4 a 110,7 Mb de tamaño (diploide). Al menos el 50% del genoma de T. cruzi es secuencia repetitiva, que consiste principalmente de las grandes familias de genes de proteínas de superficie, retrotransposones y repeticiones subteloméricas. La investigación genómica de la patogénesis de la enfermedad de Chagas se inició a principios de los 90, cuando la presencia de T. cruzi en los tejidos infectados crónicos se reveló mediante la aplicación de técnicas inmunohistoquímicas desarrolladas en las últimas dos décadas. Sin embargo, fue la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa sensible (PCR), que proporcionó evidencia molecular definitiva claramente ligada a alteraciones del tejido en presencia del parásito. Estos nuevos estudios destacaron el papel principal de T. cruzi en la patogénesis de la enfermedad de Chagas y preparan el terreno para el establecimiento de la noción de que la variación genómica de T. cruzi podría influir en el curso de la enfermedad [15]. La diversidad del genoma de T. cruzi y la multiplicidad de sus genotipos y fenotipos son bien reconocidos, su evolución y estructura de la población se encuentran entre los mejores estudiados, aunque no necesariamente la mejor comprendida. Previamente, fue aceptada una estructura poblacional predominantemente clonal, pero con la 14 evidencia de intercambio genético, hibridación y eventos de introgresión mitocondrial, este modelo ha sido cuestionado