FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL...

FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO

CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL PSÍLIDO ASIÁTICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.

MEMORIA PRESENTADA COMO REQUISÍTO PARA OBTENER EL TÍTULO DE

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA

AUTOR: AARÓN CRUZ HERNÁNDEZ ASESOR ACADÉMICO: ING. CUAUHTÉMOC HERNÁNDEZ CUELLAR ASESOR INDUSTRIAL: ING. EDI ARROYO CRUZ HUEJUTLA, HGO ABRIL DEL 2012

FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL

PSÍLIDO ASIÁTICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.

Memoria presentada

Por

AARÓN CRUZ HERNÁNDEZ

Ante la Universidad Tecnológica de la Huasteca Hidalguense como requisito parcial para optar

al título de

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA Abril de 2012

DATOS GENERALES DE LA EMPRESA

EMPRESA

CESAVEH (COMISIÓN ESTATAL DE SANIDAD VEGETAL DEL ESTADO DE HIDALGO)

SECTOR

PÚBLICO

DIRECCIÓN

CARRETERA HUEJUTLA-CHALAHUIYAPA, Km. 3.5 BARRIO TEPOXTEQUITO

PROYECTO

FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CUATRO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL


ASESOR INDUSTRIAL

ING. EDI ARROYO CRUZ

CARGO DEL ASESOR

COORDINADOR DE CAMPAÑA

iv

DEDICATORIAS

A mi angelito hermoso:

A veces llega un momento en la vida en que las cosas parecen ya no tener

sentido, que todo el mundo se viene abajo y las personas impiden que seas feliz.

En esos momentos no existe mayor preocupación que la nada, y la importancia

hacia la vida desaparece. No puedo expresar el dolor, impotencia y rabia que me

causa ver que cosas pasen delante de mis ojos, sin poder hacer nada. Tú le diste

una esperanza a mi vida, un haz de luz a la penumbra en mi alma y me diste

motivos para seguir viviendo cada día con felicidad.

Estás siempre conmigo; en mi alma, en mi mente y en mi corazón. Te amo.

A mi princesa:

Es curioso como el destino une a las personas.

Ese día estabas radiante. El mirarte ahí sentada inundó mi corazón de

felicidad y mi estómago de nauseas; los rayos de sol penetraban el follaje de un

árbol y hacían resplandecer tus ojos -cafés, profundos y llenos de vida-. Me

enamoré, como solo un loco puede hacerlo y supe que sería por toda la eternidad.

Tú me diste la fuerza que necesitaba para seguir adelante; cuando estaba

agonizante en mí soledad, me diste el regalo más hermoso que jamás habría

recibido, me diste tu amor incondicional. Solo en ese momento me di cuenta que

vivir valía la pena, si era por ti. Rubí Sánchez Palacios.

“En un beso, sabrás todo lo que he callado.”

Pablo Neruda (1904-1973) Poeta chileno.

http://www.proverbia.net/citasautor.asp?autor=704

v

AGRADECIMIENTOS

Agradezco infinitamente a esa gran mujer que en cada acción derramaba

un rio de amor incondicional, que con sacrificios, fuerza y determinación me dio las

armas para seguir adelante, a la mujer que estuvo allí desde que nací, que cuando

estoy feliz ríe, y cuando estoy triste llora. A esa mujer de voluntad inquebrantable.

A esa mujer de coraje y valor. Gracias por todo tu amor. Lilia Hernández Ramírez.

Gracias padre mío, de ti aprendí a enfrentar la vida y sobreponerme a las

dificultades que se presentan en la vida, me educaste como solo los hombres

formidables pueden hacerlo, la disciplina y trabajo que en mi inculcaste son un

regalo maravilloso. Gracias por tu amor, trabajador incansable. Arnulfo Cruz

Alvarado.

Hermana, eres muy importante para mí. Somos la misma carne y sangre.

Cuando sufres sufro. Infinitamente gracias por estar conmigo en todo momento,

eres mi pilar y mi fuerza. Te amo hermana. Gracias por tu amor incondicional.

Liliana Cruz Hernández.

A mis amigos. Aunque no se los dije antes; los quiero mucho.

A mi familia. Gracias por todo.

A todos mis profesores que en el deber de su trabajo se comprometieron de

todo corazón conmigo e hicieron posible un logro más en mi vida. Gracias.

A la Universidad Tecnológica de la Huasteca Hidalguense. Gracias.

Expreso mi gratitud al Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de

Hidalgo, en especial al Ing. Edi Arroyo Cruz y al Ing. Moisés Alvarado Martínez,

por su amistad y apoyo. A todas las personas que conocí ahí, gracias.

vi

ÍNDICE

INDICE DE CONTENIDO

Página

DEDICATORIAS………............................................................................................iv

AGRADECIMIENTOS...............................................................................................v

INDICE DE CONTENIDO.........................................................................................vi

INDICE DE FIGURAS..............................................................................................ix

INDICE DE TABLAS…………………………………………………….………….……..x

INDICE DE GRAFICAS…………………………………………………..………………xi

RESUMEN………………………………………………………………….……………..xii

ABSTRACT……………………………………………………………………………….xiii

I. INTRODUCCION...................................................................................…............1

II. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA………..…………………….………………2

2.1.1 Datos generales de la empresa……………………………….................2

2.1.2 Descripción de la empresa………………………………………………..3

III. PLANTEAMIENTO DE LA PROBLEMÁTICA…………………………………...…4

3.1Justificación…………………………………………………………………....4

3.2 Objetivos……………………………………………………………………….5

3.2.1 Objetivo general…………………………………………………….5

3.2.2 Objetivos específicos…………….…………………………………5

3.3 Metas……………………………………….….……………………………….5

3.4 Duración del proyecto………………………………………………….…..…5

IV. FUNDAMENTOS TEÓRICOS…………………………………………………….....6

4.1 Huanglongbing (“citrus greening”)……………………………………..…....6

4.1.1 Antecedentes………………………………………..………………6

4.1.2 Definición………………………………………………………….....6

4.1.3 Formas de transmisión del HLB……………………………….…..7

4.1.4 Vectores que trasmiten la enfermedad……………………….…..7

vii

4.2 Vectores del HLB………………………………………………………….…..8

4.2.1 Psílidos que trasmiten la enfermedad........................................8

4.2.2 Diaphorina citri……………………………………..…………….....8

4.2.3 Características morfológicas y fisiológicas de Diaphorina

citri…………………………………………………………………………………..9

4.3 Hongos entomopatógenos………………………………………………....11

4.3.1 Generalidades……………………………………………………..11

4.3.2 Clasificación de los hongos entomopatógenos……………..….13

4.3.3 Mecanismo de infección de los hongos entomopatógenos…..13

4.3.3.1 Adhesión y germinación de la espora en la cutícula del

insecto……………………………………………………………………..14

4.3.3.2. Penetración dentro del hemocele……………………..15

4.3.3.3. Desarrollo del hongo que resulta en la muerte del

insecto……………………………………………………………………..15

4.4 Medio de cultivo……………………………………………………………...17

4.4.1 Definición…………………………………………………………..17

4.4.2 SABORAU……………………………….…………………………18

V. HIPÓTESIS……………………………………………………………………………19

VI. DESARROLLO DEL PROYECTO…………………………………………………20

6.1 Metodología…………………………………………………………………..20

6.2 Desarrollo…………………………………………………………………….21

6.2.1 Desarrollo del experimento………………………………….……21

6.2.1.1 Materiales utilizados……………………………….……21

6.2.1.2 Selección de cepas……………………………….…..…22

6.2.1.3 Lavado de cristalería y esterilización de áreas –

materiales…………………………………………………………………22

6.2.1.4 Preparación del medio de cultivo……………….…..…23

6.2.1.5 Vaciado en cajas Petri…………………………...……..24

6.2.1.6 Siembra…………………………………………………..24

6.2.1.7 Incubación………………………………………..………26

viii

6.2.2 Desarrollo del proceso de producción masiva..........................29

6.2.2.1 Materiales………………………………………...………29

6.2.2.2 Desinfecciones de cristalería y limpieza de las áreas de

producción………………………………………………………………...30

6.2.2.3 Preparación de la solución……………………………..30

6.2.2.4 Lavado de arroz……………………………………….…31

6.2.2.5 Embolsado de arroz…………………………………..…32

6.2.2.6 Esterilización……………………………………………..32

6.2.2.7 Inoculación……………………………………………….33

6.2.2.8 Crecimiento………………………………………………34

6.2.2.9 Deshumificación…………………………………………34

6.2.2.10 Cosecha....................................................................35

6.2.3 Determinacion de concentracion de esporas libres……………36

6.2.3.1 Materiales……………………….………………………..36

6.2.3.2 Desarrollo………..……………………………………….36

VII. RESULTADOS………………………..…….…………………………………….…44

7.1 Interpretación de resultados……………………….…………………………….…44

VIII. CONCLUSIONES………………………………………………………………….50

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………….51

X. ANEXOS………………………………………………………………………………52

ix

INDICE DE FIGURAS

Figura A…………………………………………………………………………………….9 Figura B………...…………………………………………………………………………11 Figura C……………………………..……………………………………………………14

Figura 1 Pesando los ingredientes para el medio de cultivo…………….………….53

Figura 2 Preparación del medio de cultivo.…………………………….…………..…53

Figura 3 Esterilización de materiales y medio de cultivo ……………………………54

Figura 4 Vaciado del medio de cultivo en cajas Petri…..……………………………54

Figura 5 Cajas Petri con cinco días de inoculadas…………………………………..55

Figura 6 Cajas Petri con quince días de inoculadas………………………...………55

Figura 7 Siembra.……………………………………………………..…………………56

Figura 8 Conteo de colonias……………………………………….……..……………56

Figura 9 Laboratorio…………………………………………………………….………57

Figura 10 Área de crecimiento de la producción masiva ……..……………………57

x

INDICE DE TABLAS

Tabla 1.1………………………………………………………………………………….26 Tabla 1.2………………………………………………………………………………….27 Tabla 1.3………………………………………………………………………………….27 Tabla 1.4………………………………………………………………………………….27 Tabla 1.5………………………………………………………………………………….28 Tabla 2.1………………………………………………………………………………….37 Tabla 2.2………………………………………………………………………………….37 Tabla 2.3………………………………………………………………………………….38 Tabla 2.4………………………………………………………………………………….38 Tabla 2.5…………………….……………………………………………………………38

xi

INDICE DE GRAFICAS Graficas A…………………………………………………………………………………45 Graficas B…………………………………………………………………………………46 Graficas C………………………………………………………………………………...47 Graficas D………………………………………………………………………………...48 Graficas E…………………………………………………………………………………49

xii

RESUMEN

FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DEL


ABRIL 2012

AARÓN CRUZ HERNÁNDEZ

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA HUASTECA HIDALGUENSE

ASESOR ACADÉMICO: ING. CUAUHTÉMOC HERNÁNDEZ CUELLAR

ASESOR INDUSTRIAL: ING. EDI ARROYO CRUZ

El presente proyecto de investigación se llevó a cabo en el laboratorio Bio-Huas, perteneciente al Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Hidalgo (CESAVEH), con el objetivo de evaluar el factor crecimiento de cinco diferentes cepas de hongos entomopatógenos conservados en el propio laboratorio como referencia para la determinación de la factibilidad de inocular dichos hongos a nivel masivo. Las cepas evaluadas en la siguiente fueron: Beauveria bassiana, por excelencia de los hongos entomopatógenos mayormente utilizados en la región por su fácil reproducción y abundante esporulación, esta cepa presenta una coloración blanca a la hora de esporular; la cepa del hongo Metarhizium anisopliae (Ma59), al igual que la anterior una de las cepas mayormente utilizadas en la región, que fue adquirida del laboratorio de Sanidad Vegetal del Estado de Puebla y presenta un color verde soldado en su etapa de esporulación; las cepas de Isaria fumosorosea en sus variedades Pf14, Pf16 y Pf20, la diferencia entre cada cepa pudiese ser la procedencia de la cepa, insecto de la que fue aislada, humedad e incluso la hora en que fue colectada de campo, estas cepas presentan en la esporulación un color blanco amarillento. El experimento se realizó con el fin de determinar que cepa crecía mas rápidamente para utilizarla como inoculo ideal en la producción masiva y comercialización. Para ello se utilizaron cinco repeticiones de sembrado por cada cepa en cajas Petri con medio de cultivo SABOURAUD y con las mismas condiciones de humedad, temperatura, asepsia y condiciones terciarias. Palabras clave: Hongos entomopatógenos, cepas, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, SABORAUD

xiii

ABSTRACT

TECHNICAL FEASIBILITY FOR MASS REPRODUCTION OF FIVE STRAINS OF FUNGI ENTOMOPATHOGENIC CONTROL OF THE ASIAN PSYLLID IN THE

HUASTECA HIDALGUENSE.

APRIL 2012

AARON CRUZ HERNÁNDEZ

ENGINEER IN BIOTECHNOLOGY

TECHNOLOGICAL UNIVERSITY OF THE HUASTECA HIDALGUENSE

ACADEMIC ADVISOR: ING. CUAUHTÉMOC HERNANDEZ CUELLAR

INDUSTRIAL ADVISOR: ING. EDI ARROYO CRUZ This research project was conducted in the laboratory Bio-Huas, belonging to the State Plant Health Committee of the State of Hidalgo (CESAVEH) in order to evaluate the growth factor of five different strains of entomopathogenic fungi preserved in their own laboratory for determining the feasibility of such fungi inoculated on a massive scale. The strains were evaluated as follows: Beauveria bassiana, for excellence of entomopathogenic fungi mostly used in the region for easy playback and abundant sporulation, this strain appears white when sporulate, the strain of the fungus Metarhizium anisopliae (Ma59 ), like the previous one strain mostly used in the region, which was acquired from the laboratory of Plant Protection of the State of Puebla and is green soldier in his stage of sporulation, strains of Isaria fumosorosea varieties in Pf14 , and PF20 Pf16, the difference between each strain could be the origin of the strain, that bug was isolated, humidity and even the time it was collected in the field, these strains present in the yellowish-white sporulation. The experiment was conducted to determine which strain grew more rapidly for use as inoculum ideal for mass production and marketing. This was accomplished by five repetitions of each strain seeded in Petri dishes with SABOURAUD medium with the same conditions of humidity, temperature, aseptic and tertiary conditions. Keywords: Entomopathogenic fungi, strains, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, SABOURAUD

1

I. INTRODUCCIÓN

El uso excesivo de plaguicidas provoca efectos negativos en el suelo, el

agua y el ambiente. Además ha contribuido a aumentar los problemas de plagas

debido al desarrollo de resistencia y a la destrucción de los enemigos naturales.

Muchos plaguicidas también afectan la salud de las personas. Para reducir estos

efectos se procura la implementación de sistemas agrícolas sostenibles, basados

en el conocimiento de las relaciones entre los cultivos, el ambiente y los

organismos presentes en el campo. Una de las alternativas es el uso de

organismos entomopatógenos, los cuales tienen la capacidad de reducir las

poblaciones de plagas. Existen varios tipos de organismos entomopatógenos,

tales como virus, hongos, bacterias y nematodos. Actualmente, se han identificado

y estudiado diversas especies de hongos que afectan plagas de cultivos de

importancia económica; muchos de ellos son utilizados exitosamente en

programas de control biológico. Algunos de estos entomopatógenos son

reproducidos masivamente y se venden comercialmente.

Estos hongos se encuentran en la naturaleza, en rastrojos de cultivos,

estiércol, en el suelo, las plantas, etc. Logran un buen desarrollo en lugares

frescos, húmedos y con poco sol. Los hongos entomopatógenos constituyen el

grupo de mayor importancia en el control biológico de insectos plagas.

Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades

causadas por estos hongos. Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700

especies de hongos entomopatógenos. Entre los más importantes están:

Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia,

Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y

Verticillium. De ahí la importancia para el desarrollo del siguiente proyecto basado

en un análisis de factibilidad para determinar la cepa que mejor se desarrollo para

nuestro fin.

2

II. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA

2.1.1 DATOS GENERALES DE LA EMPRESA

El Comité Estatal de Sanidad Vegetal (CESAVEH) es un organismo

auxiliar de la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y

Alimentación (SAGARPA) conformada por una Asociación de productores de

Cítricos para el desarrollo e implementación de medidas fitosanitarias en la región

Huasteca del Estado de Hidalgo que atiende los municipios de Orizatlán, Jaltocán,

Huejutla, Atlapexco, Huautla, Yahualica, Chapulhuacán y Pisaflores.

El Comité Estatal de Sanidad Vegetal en Coordinación con el Gobierno del

Estado y la SAGARPA activan el programa emergente contra la langosta

Schistocerca piceifrons piceifrons (walker), para el control de la misma

llevándose a cabo acciones de exploración, muestreos y control químico.

La campaña contra la broca del café, se inició en el estado de Hidalgo en

julio de 1995, una vez que se localizó la plaga en la localidad de San Antonio el

Grande, municipio de Huehuetla, Hgo, y se confirmó por la Dirección General de

Sanidad Vegetal que se trataba de Hypothenemus hampei (Ferr.).

A partir de este año, se han realizado muestreos, capacitación, divulgación,

control químico y control biológico en las zonas afectadas, así como actividades

de prevención en las zonas libres del Estado.

Esta junta se establece el 11 de mayo de 1997 con la finalidad de controlar

las poblaciones de moscas de la fruta nativas, las cuales causan grandes pérdidas

en la producción de cítricos en la región.

3

2.1.2 DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA.

Mision:

Prestar servicios a los productores y coadyuvar con las autoridades en la

prevención, control y erradicación de plagas para mejorar la producción y

productividad agrícola a través del cumplimiento de los programas de trabajo

fitosanitarios.

Filosofía:

Trabajar para el beneficio de los productores, así como también mejorar la

calidad fitosanitaria de los productos agrícolas de la región.

Visión:

Alcanzar la sanidad, calidad e inocuidad, cumpliendo con las normas que

les permitan a los agricultores comercializar sus productos en el mercado nacional

e internacional.

Valores:

Ética profesional

Respeto

Humildad

Lealtad

Honestidad

Bien común

Objetivos:

Prevenir, controlar y/o erradicar plagas y enfermedades que atacan a los

cultivos de la región, las cuales ocasionan pérdidas económicas a los productores.

4

III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

3.1JUSTIFICACIÓN

La región de la Huasteca Hidalguense tiene como fuente importante de

ingresos la venta de productos agrícolas, uno de estos casos es la

comercialización de cítricos a nivel local y regional; siendo la naranja y la

mandarina los cultivos más demandados.

En fechas recientes, el cultivo de estos, está siendo amenazado por una

enfermedad por el momento incurable conocida como HLB (Huanglongbing) que

es causada por la bacteria Candidatus liberibacter spp., ésta enfermedad produce

la muerte exponencial de las plantas de cítricos y acaba con el cultivo total en

pocos años, dando origen a una gran pérdida económica para los productores.

Por tal motivo el CESAVEH; junto con diferentes organizaciones públicas y

privadas, toma medidas relacionadas con la inocuidad de los cítricos, ya que el

HLB es prioridad por su devastador modo de infección; y a sapiencia de la “no

cura” de la enfermedad, se opta por el control quimico y biológico del principal

insecto vector (Diaphorina citri o psílido asiático).

El control del insecto antes mencionado se realiza de manera química, con

insecticidas selectivos comerciales; y biológica, que engloba la parasitación del

psílido con hongos entomopatógenos y con el insecto parasitoide Tamarixia

radiata.

El presente proyecto opta por el método de control biológico con hongos

entomopatógenos; que se reproducirán masivamente en laboratorio y los cuales

darán significado al siguiente proyecto.

5

3.2 OBJETIVOS

3.2.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la metodología y condiciones necesarias para el aislamiento y

reproducción masiva de las cepas de los hongos entomopatógenos Beauveria

bassiana, Metarhizium anisopliae (Ma59) y de Isaria fumosorosea (Pf14, Pf16,

Pf20)

3.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-Determinar la metodología que conduzca a los mejores resultados de

acuerdo a la respuesta de crecimiento de las cepas de hongos.

-Determinar que cepa de hongo resulta mas viable reproducir masivamente

para su aplicación en campo.

-Determinar que cepa tiene mayor capacidad de multiplicación y agresividad

parasitaria.

3.3 METAS

Identificar la especie más fácilmente reproducible a nivel laboratorio y demostrar

que cepa es más factible reproducir masivamente mediante previas pruebas.

3.4 DURACIÓN DEL PROYECTO

El desarrollo del siguiente proyecto tiene una duración aproximada de cuatro

meses, que van del 09 de enero al 30 de abril de 2012 del periodo de estadía.

6

IV. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

4.1 HUANGLONGBING (“Citrus greening”)

4.1.1 ANTECEDENTES

El primer reporte de síntomas de HLB se dio en la India en el siglo XVIII,

anteriormente, el patógeno estaba probablemente presente en plantas nativas de

rutáceas y cuando los cítricos se plantaron en áreas nuevas, los insectos psílidos

pudieron haberles transmitido la enfermedad. El HLB fue reportado por citricultores

del sureste de China a finales del siglo XIX. En África del Sur esta enfermedad fue

reportada por primera vez en los años veinte del siglo pasado. La existencia de

esta enfermedad en Asia y África propició que a través de los años se dispersara

hacia varios países de ambos continentes.

4.1.2 DEFINICIÓN

El HLB, yellow dragon, citrus greening o enverdecimiento de los cítricos es

una enfermedad causada por una bacteria “Candidatus Liberibacter spp.”, Gram

negativa, vascular, limitada al floema, que no es posible cultivarla en forma aislada

en medios artificiales. Es transmitida por psílidos, uno de los vectores más

importantes es el psílido asiático de los cítricos (Diaphorina citri), (Hemiptera:

Psyllidae).

La bacteria es de difícil control, afecta la vida útil de las plantas tanto

jóvenes como adultas de todos los cítricos, incluyendo a sus híbridos (Hall 2008).

Aunque la bacteria se restringe al floema de las rutáceaes, tiene la capacidad de

multiplicarse en la hemolinfa y las glándulas salivales de los psílidos vectores.

Dentro del insecto, la bacteria cruza la pared intestinal hasta llegar a las glándulas

salivales, vía hemolinfa, tomándose para esto de 1 a 3 semanas según la

virulencia de la cepa (Orozco 1995).

7

Se considera a esta enfermedad como una de las más destructivas de los

cítricos en el mundo, por la severidad de los síntomas, la rapidez con la que se

dispersa y porque afecta a todas las especies comerciales de cítricos. Es una

enfermedad que aún no tiene cura.

África y Asia se han establecido como dos orígenes diferentes del HLB por

lo que se reconocen dos formas del agente causal: “Candidatus liberibacter

asiaticus” y “Candidatus liberibacter africanus”.

El agente causal que afecta a la citricultura brasileña es una variante de

Candidatus liberibacter asiaticus a la cual se le ha denominado Candidatus

liberibacter americanus (Texeira et al. 2005).

4.1.3 FORMAS DE TRANSMISIÓN DEL HLB

La transmisión del HLB la realizan los insectos vectores: Diaphorina citri

Kuwayama y Trioza erytreae; pero también puede transmitirse por yemas

infectadas (injerto). La distribución de la bacteria dentro de un árbol infectado

puede ser irregular, por lo que no todas las yemas contendrán la bacteria o

transmitirán la enfermedad.

4.1.4 VECTORES QUE TRASMITEN LA ENFERMEDAD

Ca. liberibacter spp. es una bacteria persistente que se reproduce dentro

del insecto pero no se transmite a otras generaciones, de tal forma que la bacteria

infecta al vector sin afectar los procesos fisiológicos del insecto, este al

alimentarse de la planta transmite la enfermedad. La bacteria circula por el floema

de la planta impidiendo la circulación de los nutrientes por el taponamiento de los

vasos floemáticos, provocando síntomas típicos de deficiencias nutrimentales en

la planta (Da Graca 1991).

8

4.2 VECTORES DEL HLB

4.2.1 PSÍLIDOS QUE TRASMITEN LA ENFERMEDAD

- Trioza erytreae (África), que se adapta a climas mas fríos, es muy sensible al

calor y al clima seco las mejores condiciones para su desarrollo se encuentran

entre los 500 y 600 msnm.

- Diaphorina citri Kuwayama (Asia) esta especie tiene mayor distribución en el

mundo, se caracteriza por un corto periodo de vida y una alta fecundidad.

4.2.2 Diaphorina citri

Se limita a las rutáceas, tanto las especies silvestres como en los cítricos

comerciales, especialmente limones (Citrus limon), limón rugoso (Citrus jambhuri),

naranja agria (Citrus aurantium), toronja (Citrus paradisi) y limas (Citrus

aurantiifolia). Limonaria (Murraya paniculata) es una planta rutácea que se utiliza a

menudo como ornamental, es una de las

plantas preferidas de Diaphorina citri.

(htpp://eppo.org/QUARANTINE)

Figura A. Planta ornamental muy común

conocida como limonaria

(Murraya paniculata)

9

4.2.3 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y FISIOLÓGICAS DE Diaphorina

citri

• Tamaño: 3 a 4 mm de longitud; color marrón claro, con moteados recubiertos de

polvo ceroso.

• Cabeza: café con ojos rojos.

• Antenas: Con 11 segmentos, ápice negro con dos manchas café claro en la parte

media.

• Alas: Son anchas en tercio apical y transparentes con manchas marrón claro en

el borde, el cual es un carácter importante para la identificación.

• Huevos: Alargados de 0.3 mm de longitud, color amarillo claro a anaranjado.

• Ubicación: Ápices de las hojas nuevas y brotes, en forma vertical.

• Reproducción: La hembra oviposita hasta 800 huevos durante su vida y se

reproduce en forma sexual.

• Ciclo de vida:

Consta de 15 a 47 días dependiendo de las condiciones del clima.

Los adultos pueden vivir algunos meses.

Tienen 9 a 10 generaciones al año.

Ciclo de vida de Trioza erytrae: de 17 a 43 días

• Las ninfas mueren a temperaturas de -1°C. Los adultos a temperaturas de -10°C.

• Las mayores densidades de población se presentan en los meses secos, la cual

disminuye al aumentar la precipitación. (Mead, 1977).

El daño directo es causado por ninfas y adultos (Fig. 2) al extraer grandes

cantidades de savia de las hojas y pecíolos, lo cual debilita las plantas, al mismo

tiempo introducen sustancias tóxicas en los tejidos, dejando manchas cloróticas

en las hojas donde se han alimentado. El mayor daño e impacto económico de

Diaphorina citri es provocado por la transmisión del HLB.

10

La bacteria se trasmite de manera persistente, hay un periodo de latencia

después de que el psílido contrae la bacteria; ésta se multiplica en el insecto

vector antes de que pueda trasmitirla. Dado el período de latencia, casi todos los

psílidos capaces de transmitir el HLB son ninfas en la fase final o adultos, estos

siguen siendo capaces de transmitir la enfermedad durante toda su vida después

de haber contraído la bacteria.

Las ninfas al alimentarse de plantas infectadas por 15 a 30 minutos,

requieren un período de 21 días para incubar y transmitir la bacteria.

Los adultos son capaces de transmitir la enfermedad, con sólo alimentarse

durante 15 minutos de plantas enfermas.

Y la eficiencia aumenta al 100% cuando éstos se alimentan por 1 hora.

Figura B: A. Adulto de Diaphorina citri.

B. Estadíos juveniles con túbulos cerosos

C. huevecillos. Tomado de R. H. Brlansky y M. E. Rogers (University of Florida-IFAS Citrus Research and Education Center)

11

4.3 HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

4.3.1 GENERALIDADES

El manejo integrado de plagas (MIP), que se basa en principios totalmente

ecológicos, considera todo el agroecosistema en su conjunto. Como tal,

comprende la aplicación armónica de diferentes métodos de control, como la lucha

biológica y las prácticas culturales que requiere el cultivo, teniendo en cuenta los

niveles poblacionales de las plagas y enfermedades a controlar, la presencia de

los biorreguladores naturales, las etapas fenológicas del cultivo y las condiciones

ambientales presentes.

Uno de los componentes del MIP es el control biológico de las plagas

agrícolas mediante parasitoides, predadores (entomófagos) y organismos

entomopatógenos que pueden ser hongos, bacterias, virus, nematodos y

protozoarios. Los hongos entomopatógenos son los que han recibido mayor

atención por la gran variedad de especies y amplio rango de hospedantes así

como por su crecimiento microscópico sobre la superficie de su huésped. Todos

los insectos son susceptibles de ser afectados por algún hongo.

Ciertos hongos poseen características muy especiales que les permiten

sobrevivir en forma parasítica sobre los insectos y en forma saprofita sobre

material vegetal en descomposición. El crecimiento saprofito puede dar como

resultado la producción de conidióforos, conidias y desarrollo miceliano. Esta

característica permite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando

técnicas de producción en masa de bajo costo.

Los hongos tienen un gran potencial para ser empleados como

biocontroladores.

12

Entre los principales hongos que presentan estas características están:

Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces.

Las principales ventajas de estos hongos son:

1. Presentan grados variables de especificidad, pueden ser específicos a nivel de

familia o especies muy relacionadas. En el caso de las cepas, pueden ser

específicas a nivel de especie, sin afectar a los enemigos naturales.

2. Si el entomopatógeno encuentra las condiciones adecuadas para introducirse y

colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma continua, es decir, se

vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas aplicaciones.

3. Se pueden aplicar mezclas de hongos entomopatógenos con dosis sub letales

de insecticidas para lograr efectos sinérgicos superiores a los logrados con

aplicaciones de cada producto por separado.

4. No contaminan el medio ambiente ni afectan al hombre u otros animales

superiores.

5. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se presentan

efectos secundarios que alteran el normal desarrollo del ciclo de vida del insecto.

Pero también presentan algunas desventajas, como:

1. Sensibilidad a la variación de las condiciones climáticas como temperaturas

extremas, desecación y luz ultravioleta. Estas limitantes están siendo

contrarrestadas mediante el uso de aditivos (protectores solares, aceites,

antidesecantes).

2. Requieren de condiciones de almacenamiento más exigentes que las moléculas

inorgánicas, para evitar que pierdan su patogenicidad.

3. En general, los insecticidas biológicos no matan instantáneamente. Alcanzan

buenos niveles de control entre una y tres semanas después de la aplicación,

dependiendo de la plaga y del ambiente.

13

4.3.2 CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

De acuerdo a la clasificación realizada por Ainsworth (1973), los hongos

son separados en dos divisiones: Myxomycota, aquellos que forman plasmodios, y

Eumycota, aquellos que no forman plasmodios y son frecuentemente micelianos.

Los hongos entomopatógenos se encuentran en la división Eumycota dentro de

cinco subdivisiones: Mastigomycotina (forman zoosporas, oosporas y presentan

estado perfecto), Zygomycotina (no presentan zoosporas, presentan estado

perfecto y forman zygosporas), Ascomycotina (presentan estado perfecto y forman

ascosporas), Basidiomycotina (presentan estado perfecto forman basiodiosporas)

y Deuteromycotina (no presentan estado perfecto ni zoosporas y forman conidias).

Las clases de mayor importancia desde el punto de vista del control de

plagas agrícolas son Zygomycetes e Hyphomycetes (Tanada y Kaya, 1993).

4.3.3 MECANISMO DE INFECCIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

La enfermedad producida por hongos se llama micosis. Tanada y Kaya

(1993) mencionan que el desarrollo de la micosis puede ser separado en tres

fases.

Figura C: Mecanismo

de infección de hongos

entomopatógenos.

14

4.3.3.1 ADHESIÓN Y GERMINACIÓN DE LA ESPORA EN LA CUTÍCULA DEL

INSECTO

El proceso de adhesión, dependiendo del hongo, puede ser un fenómeno

específico o no específico. Mientras que la germinación de las esporas es un

proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeños tubos

germinativos que al crecer y alargarse dan origen a las hifas, este proceso

depende de las condiciones de humedad y temperatura ambiental. En menor

grado la luz condiciona el ambiente alimenticio.

La espora que germina en el insecto forma un tubo germinativo el cual

funciona como una hifa de penetración de la cutícula. También puede producir una

estructura llamada apresorio, la cual ayuda a la adhesión de la espora. El éxito de

la germinación y penetración no dependen necesariamente del porcentaje de

germinación sino del tiempo de duración de la germinación, modo de germinación,

agresividad del hongo, tipo de espora y susceptibilidad del hospedante (Samson,

et al, 1988).

Los hongos, además, pueden infectar a los insectos a través de las

aberturas corporales como son cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas

externas. Las esporas pueden germinar rápidamente en estos ambientes por ser

húmedos. Cuando lo hacen en los fluidos digestivos, pueden destruir a la hifa

germinativa. En este caso, el insecto no muere de micosis sino a causa de las

toxinas.

15

4.3.3.2. PENETRACIÓN DENTRO DEL HEMOCELE

Esta penetración por parte de la hifa es el resultado de la degradación

enzimática de la cutícula y la presión mecánica ejercida por el tubo germinativo.

Además, depende de las propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización,

presencia de sustancias nutricionales y antifungosas (Charnley, 1984) y estado de

desarrollo del insecto.

La digestión del integumento se produce mediante las enzimas (proteasas,

aminopeptidasas, lipasas, esterasas y quitinasas). Cuando la hifa ha llegado al

hemocele, se pueden producir diferentes reacciones de defensa del insecto frente

a un cuerpo extraño: la fagocitosis, encapsulación celular y la formación de

compuestos antimicrobianos como las lisozimas, aglutininas y melanización.

En este caso, el hongo debe vencer el sistema inmunológico del

hospedante antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto.

4.3.3.3. DESARROLLO DEL HONGO QUE RESULTA EN LA MUERTE DEL

INSECTO

Luego de que llegue al hemocele, el hongo puede evitar la defensa inmune del

insecto produciendo células parecidas a levaduras, llamadas blastosporas, que se

multiplican y dispersan rápidamente, desarrollando protoplastos, elementos

discretos ameboideos, sin pared celular que no son reconocidos por los hemocitos

del hospedante (Pérez, 2004) y produciendo micotoxinas (Tanada y Kaya, 1993).

16

La dispersión de éstos en el hemocele depende de la especie del hongo.

Las toxinas producidas juegan un rol muy importante en el modo de acción de los

hongos entomopatógenos. La muerte del insecto se produce con mayor rapidez

cuando es afectado por un hongo entomopatógeno que produce cantidades

considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destrucción de los

tejidos y a las deficiencias nutricionales.

A continuación del crecimiento del hongo en el hemocele, se producen los

síntomas fisiológicos del insecto afectado como convulsiones, carencia de

coordinación y comportamientos alterados (deja de alimentarse, reduce su

movimiento), entra en un estado letárgico y finalmente muere, lo que puede ocurrir

relativamente rápido o en unos cuantos días. Ocurre una competencia entre el

hongo y la flora intestinal. Los hongos pueden producir sustancias antibacterianas

que alteran la coloración del cadáver (Ferrón, 1978).

Con la muerte del insecto termina el desarrollo parasítico del hongo y

empieza la fase saprofítica: el hongo crece en el hemocele formando masas

micelianas que salen al exterior fundamentalmente por las regiones

intersegmentales –esporulando sobre el cadáver y produciendo inóculo para

infectar a otros insectos– y por las aberturas naturales (espiráculos, boca y ano).

La gran dependencia de la humedad es el mayor factor limitante que

presentan los hongos, ya que para que se produzca la germinación y esporulación

fuera del hospedante se requieren valores de humedad relativa superiores a 90%.

17

4.4 MEDIO DE CULTIVO

4.4.1 DEFINICIÓN

El medio de cultivo es una sustancia o solución que permite el desarrollo de

microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un

organismo. Los medios utilizados en micología deben contener los nutrientes

suficientes para asegurar el desarrollo y reproducción de los hongos (carbono,

nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente ácido (6 – 6.3)

para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros

microorganismos. Se puede añadir antibióticos antibacterianos para inhibir el

crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras.

Los medios pueden ser sólidos o líquidos. Para conseguir un medio sólido

se debe agregar una sustancia solidificante como el agar (gelatina vegetal) o el

agar agar (polisacáridos provenientes de algas), el cual no tiene valor nutritivo sino

que sirve simplemente para mantener la humedad por un tiempo más o menos

prolongado. La humedad es fundamental para el desarrollo de los hongos, porque

cuando ésta comienza a disminuir, la formación de micelio también disminuye y el

hongo tiene que asegurar su perpetuidad formando estructuras propagativas

(esporas, conidias) y de conservación (clamidosporas).

El agar empieza a derretirse a partir de 80 °C y soporta temperaturas altas

sin descomponerse, solidificándose entre los 35 y 50 °C.

Los medios de cultivo se vierten en placas Petri o en tubos inclinados. Los

primeros ofrecen la ventaja de tener mayor superficie para el desarrollo del hongo

y se utilizan para trabajos rutinarios de aislamientos, aspecto del cultivo, velocidad

de crecimiento, etc. sin embargo, son más fáciles de contaminarse. Los tubos, a

pesar de tener una superficie mucho más reducida, ofrecen seguridad en su

manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación.

18

Se utilizan para conservar cultivos por tiempo más o menos prolongado.

Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir.

El pH recomendado para el cultivo de hongos en el laboratorio es de

alrededor de 7, un pH neutro o ligeramente ácido (6.8). Para seguridad del que

opera y evitar contaminaciones, los medios de cultivo se deben manipular en

campanas de flujo laminar.

4.4.2 SABORAUD

Es un medio de cultivo muy utilizado para aislar hongos de animales. Sirve

para el aislamiento y mantenimiento de hongos en tubo inclinado o caja petri.

Debido a su composición, los hongos crecen exuberantemente y esporulan bien.

Es el medio estándar para observar la morfología típica de los hongos, pero

no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulación.

Extracto de malta 10 g

Extracto de levadura 10 g

Saboraud 65 g

Agua destilada 1000 ml

19

V. HIPÓTESIS

De acuerdo a la literatura, la rapidez del crecimiento así como la

agresividad y esporulación de los hongos entomopatógenos dependen de varios

factores; tanto climáticos, biológicos y de nutrición. En esta práctica se realizará

una evaluación y comparación de cinco cepas de hongos (Beauveria bassiana,

Metarhizium anisopliae (Ma59) y de Isaria fumosorosea (Pf14, Pf16, Pf20), con las

mismas condiciones de crecimiento.

Se intentará demostrar que la cepa del hongo Metarhizium anisopliae es la

que presenta un crecimiento mas acelerado en condiciones de laboratorio. Así

como la comparación de resultados, con la producción masiva de los mismos

sobre sustrato a base de arroz.

20

VI. DESARROLLO DEL PROYECTO

6.1 METODOLOGÍA

En la presente se llevaron a cabo dos metodologías diferentes para el

trabajo con hongos entomopatógenos en dos áreas del laboratorio: la experimental

y la de producción masiva, las cuales se realizaron en el laboratorio Bio-Huas,

perteneciente a las instalaciones del CESAVEH en Huejutla de Reyes, Hidalgo.

Las actividades tuvieron un lapso de realización de cuatro meses a partir de enero

de 2012.

Para ello se inició con una revisión de bibliografía para contar con

referencias para la realización del proyecto y establecer como objetivo analizar

que especie de cepa de hongo entomopatógeno tendrá el más rápido crecimiento

en condiciones de laboratorio y después hacer una comparación con el

crecimiento del hongo en condiciones de producción masiva.

Se establecerá un experimento con cinco tratamientos y cinco repeticiones.

Los tratamientos serán las cepas de Metarhizium anisopliae (Ma59), de Isaria

fumosorosea (Pf14, Pf16, Pf20) y Beauveria bassiana. Las unidades

experimentales serán cajas Petri con el mismo porcentaje de medio de cultivo y

condiciones de esterilización y manejo.

Para la evaluación de las cinco cepas de hongos entomopatógenos que se

emplearán en este trabajo, se utilizaran las que pertenecen a la colección del

centro nacional de referencias de control biológico, estas fueron seleccionadas

previamente con base a la prueba de separación de medias de Turkey; los

ensayos de laboratorio mostraron porcentajes de mortalidad de 100% en ninfas y

95.22% en adultos de D. citri.

21

6.2 DESARROLLO

6.2.1 DESARROLLO DEL EXPERIMENTO

6.2.1.1 MATERIALES UTILIZADOS

Para el desarrollo del experimento se utilizaron los siguientes materiales con el

fin de facilitar la obtención de resultados y obtener mayor comodidad en su

realización.

25 cajas Petri de cristal

Matraz Erlenmeyer de 2000 ml

Probetas graduadas de 1000 ml

Termociclador

Balanza Granataria

Campana de flujo laminar

Mechero de alcohol

Asas bacteriológicas

Indumentos de laboratorio (bata, cubre-bocas, cofia, guantes de asbesto)

Ollas de presión

Estufa

Parafilm

Cinta adhesiva

Bolígrafo

Bolsas de nylon

Algodón

Envases varios de cristal

Estereoscopio

22

6.2.1.2 SELECCIÓN DE CEPAS

Se utilizaron las 5 cepas de hongos entomopatogénos con las que contaba

el laboratorio Bio-Huas; Beauveria Bassiana (aislada en el propio laboratorio),

Metarhizium anisopliae (obtenida del laboratorio de Sanidad Vegetal de Puebla) e

Isaria fumorosea en sus variedades Pf14, Pf16 y Pf20 (obtenidas del mismo

laboratorio en Puebla) pertenecientes a la colección del centro nacional de

referencias de control biológico.

6.2.1.3 LAVADO DE CRISTALERÍA Y ESTERILIZACIÓN DE ÁREAS -

MATERIALES

En este apartado se puso especial atención a la asepsia de utensilios y

áreas de trabajo. Se lavó con agua y jabón toda la cristalería a utilizar en el

experimento, además se esterilizó con alcohol y lo que fue posible en ollas de

presión siguiendo el lineamiento del laboratorio.

Las áreas de trabajo fueron aseadas con especial cuidado y en la zona de

siembra se esterilizó con alcohol 95° de manera total.

El proceso de esterilización de materiales consistió en colocar el material a

esterilizar dentro de las ollas de presión sobre fuego, hasta llegar a una presión de

150 Psi marcados en el manómetro y contabilizando 20 minutos después de llegar

a la presión idónea manteniéndola constante. Dentro de la olla la temperatura

llega a 120° C; los suficientes para eliminar la mayoría de agentes bióticos y

algunas impurezas.

Los materiales que se esterilizaron fueron las 25 cajas Petri colocadas en

bolsas de nylon de cinco en cinco, el matraz que contenía el medio de cultivo y

agua potable en envases de cristal varios. El material esterilizado fue colocado en

la campana de flujo laminar para su posterior uso.

23

6.2.1.4 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

Se estableció un promedio de 10 ml de medio por cada caja Petri, dando un

total de 250 ml necesario para cubrirlos en su totalidad y siguiendo el lineamiento

ideal de preparación siguiente se determinó que:

Agua-----------------------------------------1000ml

SABORAUD-----------------------------------65gr

Extracto de Malta----------------------------10gr

Extracto de Levadura-----------------------10gr

Se utilizó una regla de tres para la determinación del peso de los

ingredientes ideal para los 250 ml necesarios de medio de cultivo.

1000 ml agua------------------ 65 gr SABORAUD

250 ml agua------------------“16.5” gr SABORAUD

1000 ml agua------------------ 10 gr Malta

250 ml agua------------------ “2.5” gr Malta

1000 ml agua------------------ 10 gr Levadura

250 ml agua------------------ “2.5” gr Levadura

Una vez establecido el peso de cada ingrediente para la solución, se

procedió a verter en un matraz con 250 ml de agua potable los ingredientes antes

pesados junto con una pastilla de antibiótico comercial como procedimiento

establecido. El matraz fue colocado sobre el termociclador para disolver la mezcla

a una velocidad en nivel 7 y temperatura en nivel 4 durante aproximadamente 30

minutos, necesarios para observar un color caramelo que indicara el punto idóneo

de agitación. El matraz fue sellado con papel aluminio y esterilizado en una olla de

presión.

24

6.2.1.5 VACIADO EN CAJAS PETRI

El vaciado del medio dentro de las cajas Petri se realizó dentro de la

campana de flujo laminar con el indumento necesario y adecuada esterilización de

las manos con alcohol, igualmente se esterilizó la campana de flujo laminar y con

ayuda del mechero y un guante de asbesto -ya que la solución estaba caliente- se

realizó el vertido de aproximadamente 10 ml del medio en cada una de las cajas

Petri con la técnica básica, para que posteriormente fueran selladas con cinta

Parafilm.

6.2.1.6 SIEMBRA

El proceso de siembra inició nuevamente con la desinfección del área de

inoculación. Los materiales previamente esterilizados y las cajas Petri a utilizar se

encontraban ya en la campana de flujo, por lo que lo único necesario fue portar

vestimenta de laboratorio y esterilizar las manos para el manejo de los inóculos.

Las cepas a utilizar se encontraban en refrigeración en un empaque térmico para

conservarlos en buen estado y por ende se tuvieron que aclimatar a temperatura

ambiente durante 10 minutos.

Dentro de la campana se encontraban las 25 cajas petri, asas

bacteriológicas sumergidas en alcohol, un mechero de alcohol y cinta Parafilm,

sucesivamente se colocaron los sobres con la cepas de Metarhizium anisopliae

(Ma59), Isaria fumosorosea (Pf14, Pf17, Pf20) y el tubo de ensaye que contenía la

cepa de Beauveria bassiana.

Se quito la cinta Parafilm que sellaba las cajas Petri, se activó la campana

de flujo laminar, se encendió el mechero y se quemaron las asas de siembra para

su utilización. Una vez echo esto, el proceso de sembrado dio comienzo.

25

La primera en ser sembrada fue la cepa de Metarhizium anisopliae, más por

azar que por practicidad. Se destapó el sobre que contenía el hongo dentro de la

campana de flujo y con sumo cuidado se introdujo el asa previamente humedecida

con alcohol dentro del sobre para colectar algunas esporas, una vez que las

esporas estaban en el asa y la caja Petri cerca del mechero para evitar

contaminantes; se trazaron 11 líneas de siembra con el fin de hacer mas fácil el

conteo de las colonias.

Este proceso se realizó cinco veces con la cepa de Metarhizium anisopliae

siendo cuidadosos en quemar el asa en cada ocasión para evitar residuos

indeseables entre siembras. Cada caja fue sellada nuevamente con Parafilm y

señaladas con cinta adhesiva por el nombre de la cepa.

Posteriormente se sembraron con el mismo procedimiento pero con

diferente asa las cepas de Isaria fumosorosea en orden ascendente respecto al

nombre de su variedad (Pf14, Pf16, Pf20) cada caja fue señalada con el nombre

correspondiente y sellada con Parafilm.

Por ultimo se sembró desde el tubo de ensaye la cepa de Beauveria

bassiana aislada en el laboratorio, siguiendo la misma metodología, se sellaron y

señalaron con el respectivo nombre cada una de las cajas.

El resultado fueron cinco cajas Petri inoculadas con Metarhizium anisopliae

(Ma), cinco cajas inoculadas con Isaria fumosorosea (Pf14), cinco cajas con Isaria

fumosorosea (Pf16), cinco cajas Petri con Isaria fumosorosea (Pf20), y cinco mas

con Beauveria bassiana; dando un total de 25 cajas inoculadas.

Después de hacer la siembra se lavó y guardó el material que ya no era

necesario utilizar. Las cajas Petri ya inoculadas pasaron al área de incubación.

26

6.2.1.7 INCUBACIÓN

Las muestras se colocaron en orden en el área de incubación a temperatura

casi constante de 35°C durante 15 días a partir de la siembra para su óptimo

desarrollo y realizar las observaciones pertinentes.

En este proceso se realizaron observaciones del desarrollo de las cepas día

a día, mostrado en los siguientes párrafos:

Cronología

Las observaciones se realizaron continuamente excepto los fines de

semana, con anterioridad se había hecho la siembra de las cepas en medio de

cultivo que fueron obtenidas del laboratorio de Puebla con resultados

desalentadores, ya que todas las muestras presentaban signos de contaminación.

Al tercer día se pudo observar el crecimiento de cada caja Petri y se

contabilizaron las colonias.

Tabla 1.1

Metarhizium anisopliae (Ma59)

colonias/línea Día 1 Día 4 Día 7 Día 10 Día 13 Día 15 Observaciones

Caja 1 0 23 25 25 25 25 La muestra presentó

contaminación severa









27

Tabla 1.2

Isaria fumosorosea (Pf14)

Día 1 Día 4 Día 7 Día 10 Día 13 Día 15 Observaciones











Tabla 1.3













Tabla 1.4













28

Tabla 1.5

Beauveria bassiana


Caja 1 0 41 53 54 57 61 La cepa se desarrollo sin

contaminantes


contaminantes

Caja 3 0 52 53 56 61 63 La cepa se desarrollo sin contaminantes


contaminantes


contaminantes

El conteo de las colonias se hizo tomando como referencia la línea

intermedia de las cajas Petri con ayuda de un estereoscopio y es aproximado.

29

6.2.2 DESARROLLO DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN MASIVA

6.2.2.1 MATERIALES

Para la producción en masa de hongos entomopatógenos se utilizaron los

siguientes materiales para optimizar el crecimiento y esporulación de hongo.

Tinas

Malla mosquitera

Escurridor

Bolsas de nylon

Engrapadora

Arroz

Ollas de presión

Jeringa de inoculacion

Solución (a base de agua potable y antibiótico de amplio espectro)

Campana de flujo laminar

Cinta adhesiva

Marcador permanente

Deshumificador

Extractor de esporas

Sellador

Estufa

Marcador indeleble

Matraces

Vaso de precipitados

Termociclador

Mortero

Tijeras

30

6.2.2.2 DESINFECCIONES DE CRISTALERÍA Y LIMPIEZA DE LAS ÁREAS DE

PRODUCCIÓN

Este apartado es de gran importancia por que de el dependió el resultado

de la práctica. El medio ambiente se encuentra cargado generalmente de

microorganismos diversos que pueden contaminar el área de trabajo, por ello

conviene no descuidar la limpieza de los materiales, instrumentos y equipo

necesario para el trabajo.

Se lavó con agua limpia todo el material con agua limpia y se limpió

detalladamente cada área del laboratorio, se limpiaron los pisos, ventanas y

paredes con jabón y cloro, así como la limpieza con alcohol de algunos materiales

e instrumentos.

6.2.2.3 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN

Se preparó una solución con el fin de actuar como dispersante y

humectante para las esporas desecadas contenidas en los sobres. La cantidad de

solución dependió de la cantidad de bolsas con arroz a inocular, teniendo una

tendencia aproximada de 10 ml (capacidad de la jeringa de inoculación) por cada

bolsa. La solución se preparó con la siguiente formulación:

2000 ml ----------- 1 pastilla antibiótico molido

En un matraz de 2000 ml se vacío una pastilla de antibiótico de amplio

espectro molido en el mortero y se colocó en el termociclador para que la mezcla

se volviera homogénea. Una vez que estaba lista la solución se puso a esterilizar

en una olla de presión con la metodología establecida.

31

6.2.2.4 LAVADO DE ARROZ

Se lavaron aproximadamente 20 kg de arroz en cada ocasión con el fin de

eliminar la mayor cantidad de impurezas y contaminantes como polvo, insectos

muertos, pelos de rata y demás contaminantes.

El proceso consistió en colocar el arroz a lavar en dos tinas separadas para

hacer más fácil su limpieza, se vacío agua en las tinas y se agito con las manos;

tres repeticiones de agitación manual y escurrimiento se utilizaron para cada tina.

Al final al arroz escurrido en cada tina, se le agregó agua potable para la

desinfección con antibiótico. En cada tina se contuvo un aproximado de 20 lt de

agua y siguiendo la siguiente formulación se mezcló el antibiótico ya pesado:

1 lt --------- 2.5 gr antibiótico amplio espectro

20 lt -------- 50 gr antibiótico amplio espectro

Una vez mezclado el antibiótico, el agua y el arroz se dejó reposar durante

30 minutos, no sin realizar un movimiento manual de mezclado cada 10 minutos

durante la espera para su mayor efectividad.

Posteriormente a la espera se procedió a eliminar el exceso de agua de las

tinas con antibiótico con ayuda de la malla mosquitera pera evitar pérdidas de

arroz limpio.

Consecuentemente el arroz escurrido se colocó en escurridores que

consistían en mesas de metal con malla para su escurrimiento por gravedad. Este

proceso se realizó en el exterior del laboratorio por el factor sol que beneficiaba el

secado. En ese estado se dejo escurriendo 40 minutos más.

32

6.2.2.5 EMBOLSADO DE ARROZ

Una vez escurrido el arroz se embolsó en cantidad de aproximadamente

200 gr por bolsa de nylon, cantidad medida con ayuda de un vaso marcado como

referencia y colocado en tinas para su traslado a un área mas cómoda para

engraparlas.

Se utilizó un doblado especial señalado en el laboratorio para evitar el

escape de aire de la bolsa, dejando además una cantidad adecuada de aire dentro

para que el intercambio de oxigeno se realizara adecuadamente. Ya engrapadas

se pasaron al área de esterilización.

6.2.2.6 ESTERILIZACIÓN

La esterilización por calor húmedo o a presión se obtiene con el uso de

autoclave, pero en nuestro caso solo contábamos con olas de presión aunque

tienen el mismo principio de funcionamiento. A mayor presión, mayor es la

temperatura de ebullición del agua: cuando la presión aumenta a 15 psi cm2, la

temperatura llega a 121°C.

Pocos microorganismos toleran esta temperatura durante 20 minutos. El

tiempo es el factor que permite que el calor penetre en la masa de esteriliza con y

se absorba. De acuerdo a estos estándares se realizó la esterilización del arroz,

de la solución para la inoculación y del material utilizado para la inoculación.

Se colocaron dentro de la olla de presión estos artículos durante 20 minutos

a fuego constante para mantener la presión de 15 psi constante igualmente. El

arroz fue colocado en lotes de 20 bolsas por cada olla de presión.

33

Posterior se llevaron al área de inoculación para que se enfriaran y al día

siguiente se realizara la siembra. El arroz esterilizado se coloco en la sala de

inoculación acomodado sobre las mesas de trabajo en un aproximado de 120

bolsas cada vez durante el proceso.

6.2.2.7 INOCULACIÓN

Con la solución preparada anteriormente se mezclaron las cepas de los

hongos con cantidad aproximada de 10 gr por cada 2000 ml de solución y se

agitaron para su dispersión. Se procedió al armado de la jeringa veterinaria cerca

del mechero para mayor asepsia y se coloco la parte para succión dentro de la

disolución con hongos preparada.

Las bolsas con arroz fueron marcadas con marcador indeleble en un punto

intermedio específico para referencia de la inoculación. Después se tomaron cada

una de las bolsas para introducir la jeringa y vaciar su contenido dentro de la bolsa

con arroz, no sin antes quemar la punta de la jeringa en el mechero, la bolsa

inoculada fue sellada nuevamente con cinta adhesiva y se realizó un movimiento

lateral para la dispersión del inoculo dentro de a bolsa. El material sobrante fue

desechado y el material utilizado fue lavado y guardado en su respectivo sitio.

Este proceso siguió hasta consumar la inoculación total de las bolsas de

arroz estériles y posteriormente fueron colocadas en tinas para su traslado al área

de crecimiento. Cabe mencionar que este proceso se realizo día con día con cada

cepa de hongos con que el laboratorio contaba para obtener una producción

continua. Los lotes fueron de 120 – 150 bolsas cada día aproximadamente.

34

6.2.2.8 CRECIMIENTO

El crecimiento del hongo es la etapa donde las esporas germinan en un

determinado tiempo, y para esto debe reunir ciertas condiciones de humedad

cercanas al 90% y a una temperatura de 27°C, bajo estas condiciones fueron

sometidas las bolsas para su germinación y crecimiento durante un periodo de 15

días, las bolsas inoculadas se colocaron en un área un tanto oscura, acomodadas

sobre anaqueles de metal debidamente señalados con el nombre de la cepa y la

fecha.

Cada 5 días las bolsas eran agitadas para una mejor esporulación así como

la revisión de cada bolsa, para determinar que inóculos fueron contaminados y

decidir su conservación o desecho.

6.2.2.9 DESHUMIFICACIÓN

A los 15 días el hongo ya acabó de esporular y por lo tanto debería estar

listo para ser preparado para su cosecha. En este proceso se procedió a cortar

cada una de las bolsas para enrollar el sobrante de bolsa y que el arroz inoculado

quedara expuesto, esto con el fin de promover la deshidratación de las esporas

para realizar su cosecha más fácil.

La apertura de las bolsas se realizó con la ropa adecuada para evitar la

ingesta o aspiración accidental de esporas. Una vez abiertas todas las bolsas, se

colocaron los extractores de humedad dentro de las salas y se mantuvieron ahí

durante cuatro días para asegurar el secado de las esporas. En este proceso la

revisión diaria fue bien aceptada ya que fue necesario eliminar las bolsas

contaminadas o dañadas.

35

6.2.2.10 COSECHA

Después de llegar al punto ideal de secado de las esporas se procedió a

llevar las bolsas al are a de cosecha, este proceso se realizó de manera

semiautomática con ayuda de una cosechadora mecánica, que consiste en un

mecanismo que separa el arroz de las esporas, proceso que se realizo bajo las

siguientes condiciones de seguridad y debido a la excesiva concentración de

esporas que pudiera ocasionar trastornos de salud

Para este proceso se uso la bata de laboratorio obligatoria, gafas de

seguridad, cubrebocas doble con carbón activado y cofia. El proceso consistió en

vaciar el contenido de las bolsas en la parte superior de la cosechadora, la

recolección del arroz se uso en una apertura bajo la cosechadora en un costal

reutilizado y la recolección de las esporas en otra apertura colectada en una bolsa

de nylon para su refrigeración y posterior uso.

Esta metodología se repitió con cada cepa de hongo contenida en el

laboratorio, y a pesar de las medidas de seguridad e higiene la mayoría de los

inóculos obtenidos estuvieron con contaminación, excepto la Beauveria bassiana

que presentó una pureza aceptable.

36

6.2.3 DETERMINACION DE CONCENTRACION DE ESPORAS LIBRES

6.2.3.1 MATERIALES

Se decidió además hacer una determinación de concentración de esporas

libres de las cepas de hongos para ello se utilizaron los siguientes materiales.

Matraz

Alcohol

Termociclador

Algodón

Balanza

Cámara neubauer

Microscopio

Contador mecánico

Calculadora

6.2.3.2 DESARROLLO

Se pesaron 0.5 gr de la cepa y se disolvieron en 500 ml de agua potable

dentro del matraz, después se colocó éste -sellado- en el termociclador durante 10

minutos para que se disolviera correctamente.

En el área de formulación se limpio la cámara neubauer y los cubreobjetos

con alcohol, se coloco una gota de agua en cada extremo de la cámara y sobre

ésta un cubreobjetos, se colocó en el microscopio para enfocar los cuadrantes.

Para realizar la cuantificación de esporas por unidad de volumen o peso, se

utiliza un hemacitómetro o cámara de neubauer que esta conformado por dos

áreas de conteo, cuando las esporas están suspendidas en agua se precipitan

rápidamente en un aproximado de 5 minutos necesarios para empezar el conteo.

37

Para el conteo se utilizo el área dividida por 25 celdas a su vez divididas en

líneas triples, se utilizaron cinco celdas por área, las cuatro de las esquinas y la

del centro; en total se contaron diez celdas, cinco arriba y cinco abajo, debido a

que se cuanta el numero de esporas contenido en el volumen de agua es

necesario seguir un criterio uniforme, se inicio el conteo por la parte inferior

izquierda con la consideración de que las esporas que toquen la línea en la parte

inferior o la parte exterior por el lado izquierdo se consideran en el conteo, en

cambio aun y cuando las esporas estén dentro pero en la parte superior o en el

lado derecho no se consideran en el conteo.

Este proceso se realizó una vez con cada cepa de hongo arrojando que:

Tabla 2.1


Cuadrante 1 Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5

Primer

extremo 183 203 195 256 194

Segundo

extremo 220 263 183 228 205

Total de

esporas 2130

Tabla 2.2



Primer

extremo 105 122 118 130 98

Segundo

extremo 120 163 143 128 117

Total de

esporas 1244

38

Tabla 2.3



Primer

extremo 112 160 134 188 112

Segundo

extremo 143 208 172 156 201

Total de

esporas 1586

Tabla 2.4



Primer

extremo 101 94 126 129 129

Segundo

extremo 142 165 128 141 145

Total de

esporas 1300

Tabla 2.5

Beauveria bassiana


Primer

extremo 390 380 396 360 425

Segundo

extremo 361 345 355 401 395

Total de

esporas 3839

39

Para la determinación de la concentración se realizaron una serie de

operaciones para tenerla como referencia, para ello se procedió a realizar lo

siguiente:


Numero total de esporas entre el número de conteos.

2130/10 = 231

El resultado se multiplica por el número total de celdas en la subarea.

231*25 = 5775

El resultado se multiplica por el número de esporas contenidas en la diezmilésima

parte de un mililitro.

5775*10000 = 5.7x107

Si consideramos que se suspendió un gramo en un litro de agua se obtiene:

5.7x1010

Por lo tanto para formular una concentración de 1.3 x 1012

Si:

1 gr/lt ---------------------5.7x1010

X ----------------------1.3x1010

Donde:

X= 0.228

Por lo tanto esto se formula para una hectárea diluida en 100 litros de agua

debemos realizar la siguiente operación:

100*0.288 = 28.8 gr de esporas libre/ Ht

40



1244/10 = 124.4

El resultado se multiplica por el número total de celdas en la subárea.

124.4*25 = 3110



3110*10000 = 3.1x107


3.1x1010


Si:

1 gr/lt ---------------------3.1x1010

X ----------------------1.3x1010

Donde:

X= 0.419



100*0.419 = 41.9 gr de esporas libres/ Ht

41



1586/10 = 158.6


158.6*25 = 3965



3965*10000 = 3.9x107


3.9x1010


Si:

1 gr/lt ---------------------3.9x1010

X ----------------------1.3x1010

Donde:

X= 0.333




42



1300/10 = 130


130*25 = 3250



3250*10000 = 3.2x107


3.2x1010


Si:

1 gr/lt ---------------------3.2x1010

X ----------------------1.3x1010

Donde:

X= 0.406




43

Beauveria bassiana


3839/10 = 383.9


383.9*25 = 9597.5



9597.5*10000 = 9.5x107


9.5x1010


Si:

1 gr/lt ---------------------9.5x1010

X ----------------------1.3x1010

Donde:

X= 0.136




44

VII. RESULTADOS

7.1 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

El analisis de resultados se vió menguado por la cantidad de contaminantes

presentes en cada una de las muestras, pero aun asi se trato de utilizar el metodo

de conteo estratificado mas preciso posible.Cada caja petri fue observada en el

estereoscopio y registrados sus datos para hacer un diseño experimental. Pero la

aproximacion de los datos supuesta hizo renegar de la viabilidad de este. Por

ende en el siguiente apartado se muestran la cantidad de colonias formadas en

cada una y por cada una de las cepas de los hongos entomopatogenos.Se

menciona ademas que en experimentos anteriores las cepas utilizadas y aun en

uso fueron las siguientes:

Metarhizium anisopliae (Ma59): Fue obtenida en sobres provenientes del

laboratorio de sanidad vegetal de Puebla.

Isaria fumosorosea (Pf14): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio

de sanidad vegetal de Puebla.





Beauveria bassiana: Esta cepa fue aislada en el laboratorio del CESAVEH

De acuerdo al conteo de colonias en cada caja Petri durante dos semanas

se obtuvieron las siguientes graficas.

45

Graficas A: Metarhizium anisopliae (Ma59)

A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aquí cuantificadas y

representadas, sin embargo las gráficas muestran que en un principio el

crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto día las colonias mermaron su

crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacían

competencia por los nutrientes pero el numero de colonias se mantuvo casi

constante.

0

10

20

30

Día 1 Día 4 Día 7 Día10

Día13

Día15

Caja 1

Caja 10

10

20

30

Día 1Día 4Día 7 Día10

Día13

Día15

Caja 2

Caja 2

0

10

20

30


Día13

Día15

Caja 5

Caja 5

0

10

20

30


Día13

Día15

Caja 4

Caja 40

10

20

30


Día13

Día15

Caja 3

Caja 3

46

Graficas B: Isaria fumosorosea (Pf14)





competencia por los nutrientes, al catorceavo día las colonias contaminantes

cubrieron algunas de las colonias deseadas.

0

5

10


Día13

Día15

Caja 1

Caja 10

5

10


Día13

Día15

Caja 2

Caja 2

0

5

10

15


Día13

Día15

Caja 5

Caja 5

0

5

10


Día13

Día15

Caja 4

Caja 40

1

2

3


Día13

Día15

Caja 3

Caja 3

47

Graficas C: Isaria fumosorosea (Pf16)






cubrieron algunas de las colonias deseadas.

0

5

10

15


Día13

Día15

Caja 1

Caja 10

5

10

15


Día13

Día15

Caja 2

Caja 2

0

5

10

15


Día13

Día15

Caja 5

Caja 5

0

5

10


Día13

Día15

Caja 4

Caja 40

5

10

15


Día13

Día15

Caja 3

Caja 3

48

Graficas D: Isaria fumosorosea (Pf20)






cubrieron la gran mayoría de las colonias deseadas.

0

5

10


Día13

Día15

Caja 1

Caja 10

2

4

6


Día13

Día15

Caja 2

Caja 2

0

5

10


Día13

Día15

Caja 5

Caja 5

0

2

4

6


Día13

Día15

Caja 4

Caja 402468


Día13

Día15

Caja 3

Caja 3

49

Graficas E: Beauveria bassiana


representadas, en esta cepa en particular el crecimiento fue satisfactorio, libre de

contaminantes y abundante esporulación. Las graficas muestran un crecimiento

acelerado durante los primeros días y un crecimiento consecutivo pero más lento a

partir del día catorce.

0

50

100


Día13

Día15

Caja 1

Caja 10

50

100

Día1

Día4

Día7

Día10

Día13

Día15

Caja 2

Caja 2

0

50

100


Día13

Día15

Caja 5

Caja 5

020406080


Día13

Día15

Caja 4

Caja 40

20406080


Día13

Día15

Caja 3

Caja 3

50

VIII. CONCLUSIONES

Mediante los análisis realizados se determinó que en un principio, la cepa

de Beauveria bassiana(Bb) crecía a la par de la cepa de Metarhizium anisopliae

(Ma), sin embargo la cepa de Ma comenzó a presentar signos de contaminación

desde el cuarto día junto con las tres cepas de Isaria fumosorosea(Pf) y por lo

tanto su desarrollo fue frenado llegando incluso a perder algunas colonias, cabe

mencionar que el desarrollo de Pf fue mucho mas lento en este orden

respectivamente, Pf20, Pf14 y por ultimo Pf16.

Las cajas que contenían Bb fueron las únicas que no presentaron signos de

contaminación, pero en contrapeso la lógica hizo suponer que las cepas de los

hongos eran las que venían contaminadas desde su empaquetado. Esto debido a

que el desarrollo del experimento tuvo lugar el mismo día de siembra, con las

mismas condiciones de asepsia y demás factores. Además la Bb fue la última

cepa en ser sembrada y por lo tanto tenia mayor riesgo de presentar

contaminación lo que hizo dudar de la pureza de la cepa usada por este pequeño

detalle. Los signos de contaminación se presentaron el varia repeticiones e incluso

al inocular para la producción masiva.

En conclusión la cepa que mas se desarrollo a nivel laboratorio fue la de

Bb, sin embargo esto fue un análisis aproximado ya que las cepas de Ma y Pf para

hacer la comparación eran impuras.

51

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Da Graca, J. V. 1991. Citrus greening disease. Annu. Rev. Phytopathol. 29: 109-36 Orozco, S. S. 1995. Cibrian T. J 2000. Manejo integrado de plagas y control biologico ed. CECSA. Mexico. Enfermedades presentes y potenciales de los cítricos en éxico, Universidad Autónoma Chapingo, México. 150 p. Tanada y Kaya, 1993, Control biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. Taller Internacional sobre Huanglongbing de los cítricos “Candidatus Liberibacter spp” y el psílido asiático de los cítricos (Diaphorina citri), (I, Hermosillo, Son. México: 2008). Cañedo Verónica, Ames Teresa, 2004. Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatógemos, (CIP). Lima. Peru. Memoria/ Ed. Por Mangussi, Da Graca, Hall. D. {et al}, CD.Texeira, D.C., J. Ayres, E.W. Kitajima, L. Danet, S. Jagoueix-Eveillard, C. Saillard, and J.M. Bové. 2005. Hernández Velázquez, Víctor Manuel, Berlanga Padilla Angélica M., 2005, Formulación de hongos entomopatógenos, Centro Nacional de Referencias de Control Biológico, Colima, Mexico. First report of a huanglongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State, Brasil and association of a new Liberibacter species, “Candidatus Liberibacter americanus”, with the disease. Sao Paulo, Brasil.

52

X. ANEXOS

Fig. 1 Pesando los ingredientes para el medio de cultivo.

Fig. 2 Preparación del medio de cultivo.

53

Fig. 3 Esterilización de materiales y medio de cultivo.

Fig. 4 Vaciado del medio de cultivo en cajas Petri.

54

Fig. 5 Cajas Petri con cinco días de inoculadas.

Fig. 6 Cajas Petri con quince días de inoculadas.

55

Fig. 7 Siembra

Fig. 8 Conteo de colonias.

56

Fig. 9 Laboratorio

Fig. 10 Área de crecimiento de la producción masiva.

FACTIBILIDAD TÉCNICA PARA LA REPRODUCCIÓN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL...

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