Producción de nematodos entomopatógenos por métodos in vitro

Experiencias con Nematodos Entomopatgenos. Retos y oportunidades de su uso en Latinoamrica

Editado por:

Adriana Senz Aponte Pontificia Universidad Javeriana

Juan Carlos Lpez Nez

Centro Nacional de Investigaciones del CafCenicaf

Luz ngela Galindo Leva Scientia Colombia S.A.S.

Responsable Editorial:

Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el desarrollo (CYTED). Red de implementacin de enemigos naturales para el control de plagas y enfermedades en cultivos hortcolas de importancia en Iberoamrica COBIHO. Cdigo 111RT0418. Portada: Huevos con desarrollo de JI. Heterorhabditis sp. SL0708 Adriana Senz Aponte Diseo y Diagramacin: Luz ngela Galindo Leva Primera Edicin: Bogot D.C. 2011 Editores: Adriana Senz Aponte, Juan Carlos Lpez Nez y Luz ngela Galindo Leva Para la presente edicin Red de implementacin de enemigos naturales para el control de plagas y enfermedades en cultivos hortcolas de importancia en Iberoamrica COBIHO. Cdigo 111RT0418. ISBN: 978-958-46-1409-4 Todos los derechos reservados conforme a la ley. Impreso en Colombia.

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Adriana Ins Rodrguez-Hernndez Ph.D. Profesora Investigadora de la Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo. Mxico.

Adriana Saenz Aponte Biloga. Ms.C. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. Colombia.

Ana Milena Caicedo Ingeniero Agrnomo Ph.D. ICA. Manizales, Caldas. Colombia.

Arturo Carabal Ingeniero Agrnomo Ph.D. ICA. Palmira, Valle. Colombia.

Carolina Mara Jaramillo Estudiante Biologa. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. Colombia.

Clara Yalexy Delgado-Chica Estudiante Ms.C. Biologa. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. Colombia.

Gabriela Maciel Vergara Ingeniera. Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo. Mxico.

Gerardo Trres Director Unidad Microscopa Universidad del Cauca. Colombia

Jaime Eduardo Muz Ingeniero Agrnomo Ph.D. Universidad de Palmira, Valle. Colombia.

Jos Joaqun Celeita-Bernal Estudiante Biologa. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. Colombia.

Juan Carlos Lpez-Nez Microbilogo. Investigador Cientfico I. Disciplina de Recursos Naturales y Conservacin. Cenicaf. Colombia.

Juan Pablo Molina-Acevedo Ingeniero Agrnomo Ph.D Investigador Cientfico. Corpoica. Turipan. Colombia.

Luis G. Leite Bilogo. Ph.D. Instituto Biolgico CEIB. Campinas. Brasil

Mabell Orbio Estudiante Biologa. Universidad del Cauca, Cauca. Colombia.

Miguel Uribe Estudiante Ingeniera Agronmica. Universidad de Caldas, Caldas. Colombia.

Mitzi Flores-Ponce Estudiante de posgrado. Laboratorio Nacional de Genmica para la Biodiversidad, CINVESTAV-IPN. Guanajuato, Mxico.

Norberto Chavarra-Hernndez Ph.D. Profesor Investigador de la Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo. Mxico.

Paola Andrea Zuluaga Estudiante Ingeniera Agronmica. Universidad de Palmira, Valle. Colombia.

Rafael Montiel Duarte Ph.D. Investigador del Laboratorio Nacional de Genmica para la Biodiversidad, CINVESTAV-IPN. Guanajuato, Mxico.

Autores

compuestos naturales y las civilizaciones griega y romana utilizaban una variedad de fumigantes, aceites y arsnico como insecticidas. Entre los siglos XVI y XVII surgi la era de los compuestos naturales como la nicotina y el xido de mercurio, mientras que el xito de los pesticidas sintticos tuvo lugar en 1939 cuando Paul Muller descubri el DDT (difenildiclorotrietano), compuesto usado en sus inicios para combatir los mosquitos causantes de la propagacin de la malaria y posteriormente en los cultivos agrcolas. A esto sigui la fabricacin de compuestos organofosforados y organoclorados con mayor potencial destructivo, algunos de los cuales se encuentran todava en uso (Pretty y Hine, 2005).

La finalidad del uso de pesticidas es eliminar plagas interfiriendo con algunos procesos bioqumicos y fisiolgicos vitales. Las diferencias entre los pesticidas son bsicamente su persistencia en el ambiente, toxicidad y sobre todo el espectro que tienen para actuar contra especies sensibles a ellos; sin embargo su uso causa inevitablemente daos en menor o mayor medida (Bro-Rassmunsen, 1996). Los efectos del uso

Cuerpo Acadmico de Biotecnologa Agroalimentaria. Instituto de Ciencias Agropecuarias. Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo, Mxico. E-mail: [email protected]

Produccin de nematodos entomopatgenos por mtodos in vitro

Introduccin

Norberto Chavarra Hernndez, Gabriela Maciel Vergara y Adriana Ins Rodrguez Hernndez

Contenido del Captulo

Introduccin 166

Control Biolgico 168

Nematodos como agentes de control biolgico 171

Produccin masiva de nematodos entomopatgenos 174

Un Mtodo para producir nematodos entomopatgenos 184

Referencias Bibliogrficas 188

Desde la antigedad la agricultura ha sido la base de la humanidad, pero fue hasta los aos 1900s que comenz a constituirse como una actividad industrial con la introduccin de mecanizaciones y nuevas tcnicas en las labores de cultivo. Paralelamente a este hecho, surgi el uso de sustancias qumicas en prctica agrcolas, incluyendo especficamente el uso de pesticidas qumicos (Harwood, 1990) justificndose esto por razones como las siguientes: a) los rendimientos en los cultivos eran mayores, b) la eliminacin de plagas era rpida y poco costosa, y c) controlaban agentes que causaban enfermedades infecciosas que posteriormente podan convertirse en epidemias (Ecobichon, 2001). Estas ventajas hicieron que su uso se intensificara sin una evaluacin de las consecuencias y riesgos a futuro.

El uso de pesticidas se remonta a tiempos anteriores a la era cristiana con los sumerios (2500 A. de C.) quienes utilizaban compuestos sulfurados para el control de insectos, los granjeros chinos trataban las semillas con

Pg ina 167 Chavarria, Vergara y Rodriguez

de libras (Cuadro 1). Los pesticidas utilizados se concentran solamente en algunos cultivos de frutas y vegetales, arroz, maz, algodn, trigo, cebada y soya, siendo los pases industrializados los mayores consumidores, aunque la demanda crece tambin en los pases en desarrollo, con algunas desventajas como:

baja tecnificacin para la aplicacin de qumicos, falta de informacin sobre el uso correcto y riesgos, y sobre todo el uso ilegal o bien el uso de productos que actualmente estn prohibidos.

De ah que cada vez son ms frecuentes los reportes sobre trabajadores intoxicados por la exposicin a productos qumicos en pases donde an no hay una regulacin adecuada para el uso de

de pest ic idas qu micos no tienen la misma intensidad en todos los ecosistemas y se presentan de diversas formas:

alterando las cadenas trficas debido a la muerte de uno o ms organismos que son fuente de alimento para otros.

generando daos al ambiente (i.e. daando la capa de ozono, contaminando los mantos acuferos, la lluvia, el aire y el suelo entre otros) provocando enfermedades debido a su acumulacin en los tejidos adiposos de animales.

Este ltimo punto ha sido motivo de estudios recientes por las evidencias encontradas de efectos secundarios que causa la acumulacin, que varan desde ligeras molestias hasta la muerte por intoxicacin, cncer o deficiencias en los sistemas y tejidos. Paradjicamente, la demanda y uso de pesticidas a nivel mundial en los ltimos cincuenta aos se increment en gran medida con ventas de hasta 25 mil millones de dlares anuales en lo que va de este siglo (Pretty y Hine, 2005). De entre stos, los herbicidas acumularon 36% de las ventas, mientras que los insecticidas y funguicidas slo el 25% y 10% respectivamente de un total de 5,351 millones

Tabla 1. Uso de Pesticidas (ingredientes activos) en EUA y a nivel mundial (Kiely et al., 2004)

Mundial EUA

Tipo Millones kg (ingredientes acti-

% Millones kg (ingredientes acti-

% Relacin de % utilizado en EUA y % utilizado a nivel

Herbicidas (1) 883 36% 542 44% 28%

Insecticidas 615 25% 122 10% 9%

Fungicidas 234.264 10% 74 6% 14%

Otros (2) 697 29% 496 40% 32%

Total 2,429 100% 1,234 100% 23% Ao 2001

Herbicidas (1) 849 37% 553 46% 30%

Insecticidas 559 24% 105 9% 9%

Fungicidas 215.65 9% 73 6% 15%

Otros (2) 667 29% 472 39% 32%

Total 2,291 100% 1,203 100% 24% (1) "Herbicidas" incluye herbicidas y reguladores de crecimiento.

(2) "Otros" incluye nematicidas, fumigantes, rodenticidas, molusquicidas, pesticidas para peces y aves y algu-nos otros pesticidas convencionales adems de qumicos como azufre y petrleo, en ocasiones utilizados co-mo pesticidas.

Ao 2010

Pg ina 168 Producc in de nematodos entomopatgenos

pesticidas qumicos (Ecobichon, 2001).

En Mxico, la situacin no es muy distinta a la del resto del mundo, puesto que segn datos de la Asociacin Mexicana de la Industria de Plaguicidas y Fertilizantes (AMIPFAC), en 1995 el monto de plaguicidas utilizados fue de 54,678.96 Ton, de las cuales una parte sustancial correspondi a insecticidas y herbicidas con 47% y 29% respectivamente (Figura 1). Los cultivos en que se utilizaron las cantidades mayores de estos productos fueron en maz, hortalizas, caa y algodn (SNIARN, 2008).

Si bien es cierto que despus de 1950 se increment el uso de pesticidas en el mundo y en general no haba una conciencia sobre los daos causados por su uso, cabe aclarar que algunos aos antes ya se tena la idea de desarrollar una nueva agricultura con prcticas que aseguraran cierta estabilidad, lo cual dio lugar al trmino agricultura sustentable que fue usado por primera vez en la dcada de 1980s bajo dos principios clave:

La disminucin del uso de pesticidas qumicos y la concepcin de la agricultura como un proceso biolgico y un sistema integral donde el manejo debera ser responsable.

Debido a que dentro de la idea de sustentabilidad el suelo es considerado como un sistema vivo, se desarrollaron algunas prcticas agrcolas con enfoque en la dinmica poblacional para el manejo de la compleja interaccin husped-plaga-predador evitando la alteracin del ecosistema. As se cre un nuevo concepto que determin las prcticas para el control de plagas basadas en la interaccin ecolgica: el manejo integral de plagas (MIP). El MIP es un conjunto de estrategias que rene factores econmicos, ecolgicos, culturales y biolgicos donde los productos qumicos solamente son utilizados como ltimo recurso, evitando al mximo el dao al ambiente. Dentro del MIP, adems de las prcticas culturales como la rotacin de cultivos y la planeacin de la siembra-cosecha, existen otras estrategias que resultan eficientes como el llamado control biolgico de plagas (Harwood, 1990).

Control Biolgico Una de las definiciones tradicionales del

control biolgico es la manipulacin de parsitos, predadores y patgenos para mantener las poblaciones plaga en niveles donde no haya un dao econmico (Harwood, 1990), sin embargo los avances biotecnolgicos de los ltimos aos han permitido la inclusin de nuevos trminos, por lo

cual existen otras definiciones como la de Gnanamanickam et al (2002): el uso de organismos naturales o modificados, genes o productos genticos para reducir los efectos de organismos indeseables y favorecer a organismos deseables como insectos benficos y algunos microorganismos. Muy relacionada con la definicin anterior, es la dictada

Figura 1. Volumen de pesticidas usados en Mxico en 1995 (SNIARN, 2008)

Pg ina 169

por la Oficina de Asesora Tecnolgica del Congreso Estadounidense en 1995, la cual hace referencia a las tecnologas basadas en la biotecnologa para el control de plagas (BBTs por sus siglas en ingls), las cuales comprenden el uso de predadores, patgenos, feromonas, derivados naturales de plantas, reguladores del crecimiento en insectos e insectos estriles como agentes de control biolgico (Hagler, 2000). Aunque los inicios del control biolgico datan de varios siglos atrs, la era moderna comenz en 1888 cuando se importaron enemigos naturales del insecto causante del algodoncillo desde Australia hasta California, en la

mayor prdida econmica reportada en la industria de los ctricos causada por una plaga. Desde entonces, el control biolgico ha sido utilizado algunas veces con xito y otras veces sin l, en diferentes cultivos y contra diversas plagas en donde factores como las condiciones climticas, la adaptacin de los enemigos naturales al ecosistema (si son introducidos), el estado del cultivo, la afinidad plaga-predador y el tipo de control biolgico aplicado tienen influencia directa en los resultados que se obtienen. En Mxico, ste comenz en 1940 y se dio con la introduccin de enemigos naturales para combatir plagas como la escama algodonosa de los ctricos, la escama

Tabla 2. Caractersticas y ejemplos de los agentes de control biolgico segn Hagler (2000)

Caracterstica Predador Parasitoide Patgeno Pesticida Qu-

mico (PQ) Espectro contra plaga Moderado Reducido Reducido Amplio Disponibilidad comercial Baja Baja Media Alta Vida de anaquel Corta (das) Corta (das) Corta / Moderada Larga (Aos) Costo Alto Alto Medio Bajo Aplicacin Difcil Difcil Fcil Fcil Efectividad Baja Baja / moderada Baja / moderada Alta Compatibilidad con PQ Baja Baja Alta - Impacto ambiental Bajo Bajo Bajo Muy alto

Resistencia por parte de la plaga Nula Nula Bajo Alta Ejemplo Orden Coleoptera Diptera

DDT Familia Carabidae Phoridae Enterobacteriaceae

Nombre comn/cientfico Scarabaeidae sp. Bacillus thuringiensis

Presa

orugas, huevecillos de insecto e insectos de

cuerpo suave

hormigas, termitas, catarinas, moscas,

etc.

larvas de insectos pertenecientes al orden Lepidoptera

todo tipo de insectos e incluso algunas especies de peces y aves

Chavarria, Vergara y Rodriguez


purprea, las moscas de la fruta y el pulgn manchado de la alfalfa, ente otras (Barrera, 2002).

Tipos de Control Biolgico

Existen tres tipos de control biolgico: con-servativo, introductivo y aumentativo. El primero favorece la preservacin del ambiente para que los enemigos naturales presentes puedan actuar como agentes de control biolgico (ACB). Algunas es-trategias empleadas en este tipo de control son el establecimiento de cultivos refugio (extensiones pequeas de cultivo donde no se esparcen pestici-das qumicos), la provisin de alimento y la dismi-nucin del uso de pesticidas qumicos de amplio espectro. El control introductivo se denomina tambin control biolgico clsico, puesto que se introduce accidental o intencionalmente un ACB forneo a un rea nueva, donde ste se desa-rrolla y controla a la plaga existente en el lugar. Son muchas las desventajas que algunos crticos encuentran en este tipo de control, puesto que adems de que se altera el ecosistema original, existe la posibilidad de efectos letales en organis-mos benficos y sobre todo la amenaza de que el organismo introducido pueda convertirse en plaga por no tener enemigos naturales en el lugar donde se usa. Todo esto puede suceder si no se estudia con detalle la dinmica que se utilizar a la hora de aplicar el control. A pesar de ello, tambin existen algunas ventajas que permiten que actual-mente todava est en uso este tipo de estrategia.

El tercer tipo de control es el aumentativo, que consiste en la liberacin de ACB estudiados y producidos masivamente en laboratorio para la supresin de la plaga. Es equivalente a la utiliza-cin de productos qumicos, pero sin daar al am-biente y puede realizarse por inoculacin o bien

por inundacin. La inoculacin se vale solo de pequeas cantidades del ACB, que sobreviven y se mantienen gracias a la presencia del insecto pla-ga al cual eliminan gradualmente; mientras que en el mtodo por inundacin, se aplican grandes can-tidades de ACB para asegurar el exterminio casi inmediato de la plaga, aun cuando el ACB no per-dure por mucho tiempo en el cultivo (Hagler, 2000).

Agentes de Control Biolgico

Existen varias clasificaciones de los enemi-gos naturales, sin embargo una conveniente es la propuesta por Hagler (2000) de acuerdo al modo de accin sobre la plaga y algunas otras caracters-ticas en su desempeo como ACB (Cuadro 2). Los predadores y los parasitoides son agentes ma-crobiolgicos mientras que los patgenos se con-sideran agentes microbiolgicos. Recientemente, un cuarto grupo ha sido aadido y en l se inclu-yen los agentes parabiolgicos de control como son las hormonas, los insectos estriles y los regu-ladores de crecimiento. Entre los patgenos se encuentran varios agentes de control biolgico que actualmente estn disponibles en el mercado, estos agentes son aplicados con el equipo conven-cional para la aplicacin de pesticidas qumicos o bien en los sistemas de irrigacin y su disponibili-dad comercial se debe en gran parte a la facilidad de producirlos en laboratorio y a su inocuidad con relacin al ambiente y a otros organismos benfi-cos. Las desventajas de estos ACB son: a) su espe-cificidad para infectar ciertas plagas y la resisten-cia de stas despus de una aplicacin prolongada, b) corta vida de anaquel y en el campo, y c) sobre todo las dificultades para su regulacin como pro-ductos pesticidas. Es por ello que las investigacio-

Pg ina 17 1

Nematodos como agentes de control biolgico

para que su uso dentro del manejo integral de pla-gas sea ms intensivo.

nes hoy en da se desarrollan para maximizar el desempeo general de estos agentes y sobre todo

Existen siete familias de nematodos con po-tencial biocontrolador: Mermitidae, Tetradonematidae, Allantonematidae, Phaenopsitylenchidae, Sphaerularidae, Steinernematidae y Heterorhabditidae; sin embargo, slo las dos ltimas se han estudiado con ms detalle (Lacey et al., 2001) y se han producido comercial-mente alcanzando ventas de hasta 10 millones USD (en 1998) (Samish y Glazer, 2001). Los nemtodos entomopatgenos (NEP) pertenecientes a los gne-ros Steinernema y Heterorhabditis poseen receptores qumicos para la bsqueda de insectos husped y se encuentran asociados simbiticamente con entero-bacterias, Xenorhabdus sp. para Steinernema y Photor-habdus luminiscens para Heterorhabditis. Los NEP son gusanos redondos no segmentados con sistema res-piratorio, reproductor y digestivo, adems son pat-genos obligados en la naturaleza y han sido utiliza-

dos para controlar un amplio nmero de insectos plaga (Cuadro 3; Figura 2) mediante inundacin en el control aumentativo.

Cabe mencionar que la eficacia de los NEP ha sido comprobada en plagas cuyo estado larvario se desarrolla en la tierra (principalmente especies de los gneros Lepidoptera y Coleoptera), aun cuando tambin se han utilizado en plagas cuya ovoposicin y/o estado larvario se desarrollan en troncos o en las hojas de los rboles (Schroer y Ehlers, 2005). El usarlos como agentes de control biolgico no repre-senta riesgo para los vertebrados, insectos benficos y en general para el medio ambiente; pueden produ-cirse in vivo e in vitro y son aplicados fcilmente con equipo convencional, buscan a su presa y la matan rpidamente (en un lapso entre 24 y 48 h), pueden

Tabla 3. Plagas susceptibles al biocontrol mediante NEP.

Familia Nombre cientfico Agrocultivo Pas

Especie

NEP

Referencias

Lepidoptera Pyralidae Tryporyza incertulas Arroz India Sc Kaya et al., 2006

Noctuidae Spodoptera depravata Csped Japn Sg, Sc Kaya et al., 2006 Glyphipteridae Sagalassa valida Palma Colombia Sc Kaya et al., 2006

Coleoptera Curculionidae Aristobia testudo Litchi China Sc Kaya et al., 2006

Cosmopolites sordidus Pltano Brasil Sc Kaya et al., 2006

Scarabaeidae Epicometis hirta Vid y otros

frutos Turqua Hb Hazir et al., 2004 Diptera Sciaride Lycoriella mali Setas Corea Sc, Hb Kaya et al., 2006

Sc = Steinernema carpocapsae, Sg = Steinernema glaseri, Hb = Heterorhabditis bacteriophora



reciclarse en el ambiente y son compatibles con algunos productos qumicos y otros pesticidas biolgicos, adems de que estn exentos de registro como pesticidas en algu-nos pases (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002; Hazir et al., 2004; Shapiro-Ilan et al., 2006). En contraparte, las razones por las que su uso todava no tiene gran impacto son: a) su reducido rango de accin contra los insec-tos, b) la poca tolerancia a condiciones es-tresantes de humedad, radiacin y tempera-tura, c) corta vida de anaquel, y d) la dife-rencia de su precio con relacin a los pro-ductos qumicos.

Ciclo de vida de los NEP

Tanto los steinernemtidos como los heterorhabdtidos tienen un ciclo de vida que inclu-ye huevo, cuatro etapas juveniles (J1 a J4) y una fase adulta. Bajo ciertas condiciones, la fase J3 se con-vierte en infectivo juvenil (IJ), nica fase que sobre-vive fuera del insecto husped y puede mantenerse en bsqueda de un nuevo insecto, al cual penetra a travs de sus aberturas naturales (boca, ano, espir-culos) liberando la bacteria simbionte, quien infecta

los tejidos del insecto y ste muere por septicemia en las siguientes 24 a 48 h. Los IJ se alimentan de los tejidos del insecto colonizados por la bacteria y se convierten en adultos de primera generacin, mismos que posterior a la fertilizacin dan lugar a huevos que se desarrollan a nematodos J1 y as su-cesivamente hasta otra generacin de adultos. Este ciclo ocurre hasta que los nutrimentos se agotan,

momento en el que los IJ de nueva induccin comienzan a emerger del cadver para continuar buscando otros huspedes (Figura 3) (Neves et al., 2001; Chavarra-Hernndez y de la Torre, 2001; Serwe-Rodriguez et al., 2004). Esta sucesin de estadios tambin se puede observar en culti-vos in vitro, ya sea slidos o lquidos, donde el ciclo puede comenzar con la inoculacin de IJ en un medio previamente inoculado e incubado con la respectiva bacteria simbionte.

Figura 2. Insectos plaga susceptibles al control biolgico usando NEP. A) Hypera postica Gyllenahl, B) Phyllophaga, C) Icerya purchasi, D) Noctuidae.

Figura 3. Ciclo de vida de Steinernema sp.

Pg ina 173

La diferencia en-tre steinernem-tidos y heteror-habdtidos es su modo de repro-duccin, ya que mientras los adultos de los primeros son machos y hem-bras en todas las generaciones con capacidad de producir proge-nie, los adultos heterorhabdti-dos de la primera

generacin son hermafroditas y los adultos de las generaciones subsecuentes son anfimticos, pero incapaces de reproducirse (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005). Con relacin a la bacteria simbionte, aun cuando Xenorhabdus y Photorhabdus tienen diferen-cias entre s como su localizacin dentro del nema-todo IJ (Figura 4), el mecanismo mediante el cual son liberadas dentro del insecto husped y la pro-piedad de bioluminiscencia, exhiben similitudes en algunas caractersticas ya que ambas pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, son mviles (poseen flagelos pertricos), Gram-negativas, aerobias facul-tativas y no forman esporas. Sin embargo, las dos caractersticas ms importantes que tienen en comn, son a) la variacin fenotpica y b) la pro-duccin de inclusiones protenicas cristalinas.

La relacin entre los NEP y su bacteria sim-bionte es esencialmente mutualista y puede ser di-vidida en tres fases (Ciche et al., 2006):

Fortica. Fase en la que tanto la bacteria co-mo el nematodo se encuentran fuera del husped; es decir, el nematodo se encuentra en busca de ali-mento y al mismo tiempo sirve como vector a la bacteria y como su proteccin contra el medio am-biente. No existen reportes de que la bacteria haya sido encontrada en forma libre, sino solamente en el intestino de los IJ y en insectos husped que han sido infectados por NEP. El mecanismo de coloni-zacin del intestino de las fases IJ por la bacteria es an poco conocido, sin embargo existen dos teor-as acerca de ello; la primera es que debido a un agotamiento en las fuentes de nutrimentos, los J2 disminuyen su funcin digestiva y por lo tanto en lugar de digerir a la bacteria, la retienen dentro. La segunda teora se basa en la afinidad de los IJ por su bacteria simbionte y esto sucede porque si la bacteria presente en el insecto husped no es la simbionte especifica del nematodo, ste no la retie-ne.

Patgena. En esta fase, el complejo nemato-do-bacteria es directamente responsable de la muerte del insecto husped, que es infectado debi-do a la introduccin de la bacteria, llevada a cabo por los IJ. Una vez dentro, la bacteria invade y afecta el sistema inmunolgico del insecto, que en condiciones naturales impedira la accin de agen-tes externos por procesos como melanizacin o encapsulacin (Hazir et al., 2004), mientras que el nematodo tambin contribuye inhibiendo los me-canismos enzimticos del insecto plaga para reco-nocer a sus invasores, de ah que la relacin nema-todo-bacteria sea mutualista porque ambos orga-nismos necesitan uno del otro para sobrevivir.

Saprfita. Sucede una vez que el insecto ha muerto; la bacteria y el nematodo se alimentan de

Figura 4. Localizacin de la vescula bacterial en la parte an-terior del intestino de Steinerne-ma spp. (vista lateral). En el ca-so de Heterorhabditis spp., la bac-teria se encuentra dispersa en todo el tracto gastrointestinal (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005)



Actualmente existen tres mtodos para la produccin masiva de NEP: in vivo, in vitro slido e in vitro lquido los cuales se explican brevemente a continuacin.

Cultivo In vivo

En este mtodo, insectos husped son inocu-lados con fases IJ, las cuales se desarrollan y com-pletan su ciclo de vida durante dos a tres genera-ciones, despus de unos das, cuando los nuevos IJ comienzan a dejar el cadver, se procede a las ope-raciones de cosecha, sanitizacin, formulacin y almacenamiento de los mismos. La cosecha se rea-liza en dispositivos denominados trampa de Whi-te que constan de una caja Petri donde existe una zona elevada (i.e., vidrio de reloj invertido) cubierta por papel filtro y rodeada por agua (Woodring y Kaya, 1988; Hazir et al., 2004). Una vez infectadas, las larvas se colocan en el papel filtro y cuando los IJ emergen se dirigen hacia el agua donde son co-sechados fcilmente evitando contaminaciones. Los IJ as cosechados pueden pasar a una etapa de concentracin para eliminar el agua excedente y posteriormente ser sanitizados con distintas solu-ciones comerciales, la concentracin puede hacerse

mediante sedimentacin y posterior decantacin o bien mediante centrifugacin (Shapiro-Ilan y Gau-gler, 2002). La formulacin implica procedimientos que permiten a los NEP reducir su actividad me-tablica y entrar en un estado de deshidratacin (anhidrobiosis parcial) debido a la baja humedad relativa de los agentes inertes usados como el carbn activado, vermiculita, alginatos, caoln y poliacrilamida. Estos agentes propician un menor costo en el almacenamiento y transporte del pro-ducto, un mejor manejo y mayor vida de anaquel. Los NEP tambin pueden formularse en solucio-nes acuosas pero esto no es muy conveniente por-que deben mantenerse en refrigeracin y con agita-cin moderada, adems de que hay un mayor ries-go de contaminacin. En la actualidad, se pueden formular en grnulos dispersables en agua (WDG, por sus siglas en ingls), mtodo que presenta las mismas ventajas de los agentes inertes en cuanto a costo y facilidad de operacin y adems asegura una mayor vida de anaquel. Para optimizar el pro-ceso de produccin in vivo de NEP, hace algunos aos se propuso un sistema denominado LOTEK construido con bandejas y repisas. No obstante que se requiere de poca experiencia para el mtodo

Produccin Masiva de Nematodos Entomopatogenos

los tejidos del hospedero. La bacteria entra en un estado estacionario de crecimiento y el nematodo desarrolla su ciclo de vida. Diversos estudios se han realizado ya que aparentemente la diferencia-cin sexual y el proceso de fertilizacin y liberacin de los huevos tienen que ver con la concentracin de bacteria y nutrientes en esta fase de la relacin nematodo-bacteria (por lo menos en Heterorhabdi-tis). Aqu tambin ocurre la migracin de los IJ fue-

ra del cadver una vez que se han agotado las fuen-tes de nutrientes.

Las fases mencionadas anteriormente tam-bin tienen lugar cuando se cultiva a los NEP en medios artificiales, donde la recuperacin e induc-cin de los IJ se debe aparentemente a sealizacio-nes qumicas que la bacteria simbionte produce en el medio (Johnigk y Ehlers., 1999).

Pg ina 175

in vivo, las desventajas son el costo de los hospede-ros y el equipo, cuya inversin no es fcil de recu-perar a partir de las ganancias obtenidas, adems la concentracin final de IJ en un cultivo in vivo, depende de factores como el tamao del insecto husped, el tamao del inculo de IJ, la forma en que son inoculados (en suspensin acuosa o in-cluidos en la comida del insecto husped) y la afi-nidad con el husped, as como condiciones de humedad y temperatura (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002). Los IJ obtenidos por este mtodo pueden aplicarse dentro del cadver del insecto husped, colocndolo en los cultivos y protegiendo as a los NEP del medio ambiente mientras encuentran un nuevo husped.

Cultivo Slido in vitro

Inicialmente el cultivo slido se desarroll axnicamente (i.e., cultivo puro de nematodos) sin embargo, se encontr que la inclusin de la bacte-ria simbionte en el cultivo se traduca en mejores resultados. Los primeros cultivos slidos se desa-rrollaron en cajas Petri con medios con sangre de becerro, alimento para perro y extracto de rin porcino entre otros ingredientes. En este sistema bidimensional se inoculaban fases IJ sanitizadas. Actualmente este procedimiento sigue utilizndo-se. En 1960, Bedding dise un sistema tridimen-sional para la produccin de NEP que actualmen-te se utiliza en algunas empresas pequeas, donde el medio lquido se esteriliza junto con placas de espuma de poliuretano como agente inerte en ma-traces, bolsas de plstico o recipientes de vidrio, suministrndoles aire mediante bombeo o bien empleando un dispositivo permeable al aire que evita la conveccin forzada de aire. En este mto-do, tambin se inocula la bacteria y despus de

Tabla 4. Compaas productoras de nematodos entomopatgenos en Estados Unidos de Amrica y la Comunidad Europea (Kaya et al., 2006)

Compaa Especie a Formulacin Mercado

Andermatt Biocontrol, Grossdietwil, Suiza Sc, Sf, Hm Barro

Invernadero, jardinera domstica

Asa Jung Laboratory, Oakland, Califor-nia, EUA

Sc, Sf Barro Variado

BioLogic Willow Hill, Pennsylvania, EUA

Suspensin, g r n u l o s dispersables en agua, esponja

Variado

Bionema, Umea, Suecia

Sc, Sf Polmero Jardinera domstica

Becker Under-wood Ames, Iowa, EUA

Sc, Sf, Sg,Sk, Ss, Hm

Spray, grnulos dispersables en agua

Invernadero, hongos comestibles

Certis b Columbia, Maryland, EUA Sc, Sf, Sr

Suspensin, grnulos dispersable en agua Variado

e-nema GmbH, Raisdorf, Alemania

Sc, Sf, Hb Barro, polmero

Invernadero, vivero, hongos comestibles y jardinera domstica

Hydrogardens, Colorado Springs, Colorado, EUA

Sc, H sp Esponja Invernadero

Integrated Biocontrol, Greendale, Indiana, EUA

Hb, Hi-,Hmar Pasta, esponja Ctricos, csped

Koppert, Berkel en Rodenrijs, Holanda

Sf, Hb Barro Invernadero, csped

M & R Durango, BayWeld, Colorado, EUA

Sc, Sf, Hb Esponja Variado

Nematec, San Ramon, California, EUA

Hb Wool nematode N/A c

Owiplant, Owijska, K/Poznania,

Barro Invernadero, hongos comestibles

a Sc, Steinernema carpocapsae; Sf, S. feltiae; Sg, S. glaseri; Sk, S. kraussei; Sr, S. riobrave; Ss, S. scapterisci; Hb, Heterorhabditis bacteriophora;Hi, H. indica; Hm, H. megidis; Hmar, H. marelatus; H sp., Heterorhabditis species. b En 2005, Certis vendi el rea productora de nematodos a Becker Underwood. c N/A, No disponible



algunas horas de incubacin se inoculan los IJ. La recuperacin del producto se realiza lavando la espuma de poliuretano hasta que todos los IJ hayan migrado o bien por centrifugacin, la cual, al igual que en el cultivo in vivo, incrementa el costo del producto. Las desventajas de este mtodo son que el escalamiento afecta directamente el desarro-llo de los cultivos, ya que se dificulta la medicin en lnea de parmetros como el pH y el oxgeno disuelto a la vez que el muestreo no es representa-tivo debido a la poca uniformidad en la distribu-cin de los NEP (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005).

Cultivo lquido in vitro

El cultivo en medio lquido ha sido hasta ahora la forma ms conveniente para la produc-cin de NEP a gran escala, llevada a cabo comer-cialmente en la actualidad por compaas en Esta-dos Unidos de Amrica y algunos pases de la Co-munidad Europea, principalmente (Cuadro 4). En Mxico, existen pocas compaas productoras de NEP como agentes de control biolgico y los

mtodos que utilizan para producirlos son confi-denciales (Cuadro 5).

Al igual que en el cultivo slido, el cultivo lquido se desarroll inicialmente de forma axnica en matraces y posteriormente de forma monoxni-ca, al cultivar ambos organismos juntos. El primer experimento con biorreactor se patent en Estados Unidos de Amrica por Pace et al. (1986) y desde entonces, diversos trabajos se han desarrollado pa-ra la mejor adaptacin del cultivo lquido de NEP en biorreactores. Este proceso no resulta tan senci-llo como lo es el cultivo in vivo, ya que dentro del biorreactor los NEP se encuentran en un medio junto con burbujas y partculas, inmersos en un proceso de mezclado que se relaciona directamente con su desarrollo, alimentacin y cpula, cuya fi-nalidad es obtener la mayor concentracin de fases IJ. Uno de los factores que afectan el cultivo lqui-do es la viscosidad del medio, por lo que algunos de los retos ms importantes en este sistema son a) proveer suficiente oxgeno para ambos microorga-nismos sin daarlos, b) evitar al mximo el estrs hidrodinmico, c) reducir la espuma generada por la agitacin y/o aireacin, y d) incrementar la

Tabla 5. Instituciones pblicas y privadas productoras de nematodos entomopatgenos para el control de insectos plaga en Mxico reportadas en 1999 (Tamz-Guerra et al., 2001) Entidad Fe-

derativa Compaa Especie a

Sinaloa Biosol S.A. de C.V. (Culiacn, Sinaloa) Sf Agrobiosol de Mxico S.A. de C.V (Culiacn, Sinaloa) Sc D.F. Koppert de Mxico S.A de C.V (Mxico, DF) Sf Chiapas Laboratorio de produccin de OB, CIICA (Chiapas) Sg, Sf a Sf= Steinernema feltiae, Sc=Steinernema carpocapsae, Sg= Steinernema glaseri

Pg ina 177

cpula (para el caso especfico de Steinernema spp.) Estos problemas se han minimizado mediante el diseo y mejora de los biorreactores utilizados, adems de la investigacin detallada sobre el ciclo de vida de los NEP en cultivo lquido (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002). Durante el cultivo lquido, que puede durar desde dos hasta cuatro semanas, es imprescindible mantener condiciones de riguro-sa asepsia ya que cualquier contaminacin puede ser catastrfica para el proceso. Tanto la composi-cin del medio como la cantidad de bacteria pre-sente son factores que influyen en el cultivo lqui-do. Se han usado diversos medios de produccin que incluyen una fuente de carbono (i.e., glicerol o glucosa), protenas animales o vegetales, extracto de levadura y una fuente de grasas.

Entre los diferentes ingredientes usados para la formulacin de medios se encuentran harina de soya, yema de huevo, leche en polvo, extracto de

hgado, aceite de maz, aceite de canola y manteca, y ms recientemente algunos ingredientes no con-vencionales como lactosuero y aguamiel, entre otros (Pace et al., 1986; Friedman et al., 1991; Islas-Lpez et al., 2005; Espino-Garca, 2005). El tipo y cantidad de la fuente lipdica utilizada parece ser un componente clave en el desarrollo y virulencia de los NEP, por lo que un incremento en la concen-tracin de este componente se relaciona con un mayor rendimiento, probablemente debido a la ne-cesidad nutrimental de esteroles en los NEP (Abu-Hatab y Gaugler, 2001; Yoo y Gaugler, 2000). Existen reportes de que Steinernema no es capaz de desarrollarse en medios sin lpidos, mientras que en el caso de Heterorhabditis, su bacteria simbionte es capaz de proveerle todos los nutrimentos. En general se recomienda la adicin de lpidos en cual-quier cultivo de NEP (sea slido o lquido).

Por otra parte, la cantidad del inculo tanto

Figura 5. Variables implicadas en el cultivo monoxnico lquido de NEP.



bacteriano como de fases IJ puede ser variable. Pa-ra las especies de Heterorhabditis, el inculo de ne-matodos es alto debido a que nicamente los adul-tos hermafroditas de primera generacin son los que procrean a los individuos que al final del culti-vo sern IJ, mientras que los adultos unisexuales no producen progenie, al menos en cultivo lquido. Entre los parmetros que favorecen al cultivo lquido de los NEP estn el pH, la concentracin de CO2, la temperatura y la agitacin/aireacin, aun cuando no se ha logrado la total comprensin de la interaccin de estos parmetros para la ob-tencin de cultivos lquidos exitosos (Figura 5).

El pH inicial del medio vara entre 5.5 y 7 pero algunos autores recomiendan ajustarlo a 8. Una vez que se inicia el cultivo es perjudicial tratar de ajustar el pH, puesto que la bacteria es capaz de mantenerlo superior a 7 hasta que finalice el culti-vo (un valor de pH inferior a 6.5 puede ser daino para los nematodos). El pH puede variar con la concentracin de dixido de carbono, y aunque este efecto no se ha reportado porque la medicin de CO2 disuelto no es frecuente durante los culti-vos, se ha encontrado que a mayores concentracio-nes de este gas al inicio del cultivo monoxnico, se incrementa el porcentaje de recuperacin de las fases IJ (Gaugler y Han, 2000). La temperatura de incubacin de la bacteria se hace entre los 28 y 30C y el desarrollo del cultivo monoxnico, entre los 22 y 25C.

Cultivo de NEP en biorreactor

Los biorreactores utilizados para este fin, son los convencionalmente usados en la industria o bien con algunas modificaciones o rediseo para un mejor desarrollo del cultivo, bajo esfuerzo de corte y sobre todo para un suministro adecuado de

oxgeno; la agitacin y aireacin son de suma im-portancia y junto con la geometra del biorreactor determinan la disponibilidad de los nutrientes y oxgeno para ambos microorganismos as como las condiciones para la cpula y desarrollo de los NEP. En steinernemtidos, la cpula se realiza, si el macho que es de menor tamao que la hembra se enrolla alrededor de ella y este evento determi-na, junto con otros factores ya mencionados, el rendimiento final del cultivo. Aunque la agitacin con impulsores de paletas o propelas, provee un mezclado eficiente para procesos en la industria qumica o en cultivos de clulas bacterias y hongos, se ha reportado que en el cultivo de NEP las hem-bras pueden sufrir ruptura mecnica si la velocidad en la punta del impulsor excede de 1 m s-1 (Pace et al., 1986). Para la velocidad de aireacin, se han probado diferentes condiciones que van desde 0.05 volmenes de aire volumen de medio minuto (vvm) hasta 1 vvm en reactores de diferentes tama-os, buscando que al momento de la inoculacin de fases IJ la concentracin de oxgeno sea al me-nos del 20% de saturacin. Una aireacin excesiva a menudo provoca gran produccin de espuma, lo cual puede controlarse adicionando antiespuman-tes convenientes.

Autores como Pace et al. (1986) y Ehlers (2001) han reportado concentraciones desde 23,000 hasta 95,000 IJ/mL (Cuadro 6) en reactores agitados mecnicamente, sin embargo debido a los esfuerzos cortantes imperantes en estos sistemas, se ha optado por usar reactores con agitacin neumtica, principalmente de los llamados Air-lift. La Figura 6 muestra algunos de los diferentes tipos de reactores Air-lift utilizados para el cultivo mo-noxnico de NEP. Las concentraciones logradas

Pg ina 179

este ltimo caso (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005) no se menciona el tipo de agitacin ni la concentra-cin inicial de nemtodos empleada.

con estos sistemas van desde 40,000 hasta ms de 200,000 IJ/mL para Steinernema carpocapsae mientras que para Heterorhabditis indica se han alcanzado con-centraciones de 500,000 IJ/mL; sin embargo, en

Algunos Aspectos de Ingeniera Bsica

de Reactores Air-Lift

Las columnas de burbujeo o reactores Air-lift, patentados por Lefrancois, Mariller y Mejane en 1955, son un diseo alternativo a los tanques con agitacin mecnica, los cuales se han usado duran-te aos en diferentes procesos industriales (Znd et al., 2004). Los Air-lift no incluyen partes mviles y la alimentacin de aire se hace desde la base de una columna delgada que constituye el cuerpo del tanque, algunas veces se utiliza una seccin cnica en la parte superior de esta columna, que incre-menta el rea de intercambio del gas. En estos re-actores, los sensores se colocan en a) la tapa, b) en

donde termina la seccin cnica, o c) en un anillo situado en la parte inferior del tanque (Allman, 1999). Los Air-lift involucran cuatro zonas durante su operacin: en la zona de ascenso o riser, tiene lugar la mayor cantidad de transferencia de masa gas-lquido y es donde el lquido aireado fluye en el mismo sentido de la inyeccin del gas. Al trmino de esta zona, se encuentra la zona de desacelera-cin o separador de gas, porque es aqu donde el gas sube y sale por el venteo del tanque mientras que el lquido, ya sin burbujas de gas o con baja concentracin de stas, fluye a contracorriente del gas por la zona de descenso o downcomer, para ser aireado nuevamente en la zona inferior (Znd et

Figura 6. Distintos diseos de reactores Air-lift utilizados para la produccin de NEP a nivel laboratorio. Los reactores i) a iii) (VL=0.5 L) han sido reportados por Neves et al. (2001), mientras que iv) se trabaj a VL=4.4 L y probando dos


Pg ina 180 Producc in de nematodos entomopatgenos C

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Pg ina 18 1

al. 2004). Estos sistemas se han utilizado en el tra-tamiento de aguas residuales, en la produccin de biomateriales y en fermentaciones de clulas sensi-bles al estrs hidrodinmico. Las ventajas de su uso son el bajo consumo de energa, facilidad de cons-truccin, operacin y mantenimiento, permiten conservar condiciones aspticas por largo tiempo y las caractersticas hidrodinmicas imperantes pue-den modificarse en funcin de cambios en su geo-metra (i.e., tipo de recirculacin, tipo del draft, ac-cesorios adicionales, modo de operacin, tipo del difusor, etc.).

Algunos de los parmetros que describen tanto la hidrodinmica como el funcionamiento de los reactores tipo Air-lift son el hold-up (i.e., frac-cin de retencin de gas), la velocidad del lquido en cada zona del reactor y el coeficiente volumtri-co de transferencia de oxgeno (kLa) (Wen et al., 2005), los cuales se explican a continuacin.

Hold up (fraccin de retencin de gas). Es el aumento del volumen en la fase lquida en proceso a causa de la inyeccin de gas, introduccin de un slido o ambas; este parmetro es de suma impor-tancia para el diseo del reactor ya que determina la altura del mismo y consecuentemente el mximo volumen de trabajo, as como el tiempo de residen-cia del gas en el lquido, que en combinacin con el tamao de burbuja, determina el rea interfacial gas-lquido disponible para la transferencia de ma-sa. El valor del hold up, vara en las distintas zonas del reactor como consecuencia del proceso de mezclado donde tienen lugar la ruptura y coales-cencia de las burbujas. El hold up puede determi-narse por varios mtodos (los ms comunes son expansin de volumen y conductancia) y tanto en la fase slida como en la lquida o ambas. En la

literatura se han reportado algunas correlaciones para determinar el hold up total en un reactor Air-lift, entre ellas la de Molina-Grima et al. (1997):

Donde,

g = Hold up total

Ar = rea seccin transversal del riser

gr = Hold up en el riser

Ad = rea seccin transversal del downcomer

gd = Hold up en el downcomer

Velocidad del lquido: Determina el tiempo de mezclado (i.e., lapso de tiempo que transcurre hasta que las condiciones en el reactor se vuelvan estables a partir de un cambio en la alimentacin), reflejado en variables de respuesta como son pH, temperatura, coloracin y conductancia. Una vez medida experimentalmente la velocidad del lquido y obtenido el valor del hold up, es posible calcular la velocidad superficial del lquido, la cual a su vez permite determinar la prdida de energa por fric-cin del medio con las paredes mediante la Ecua-cin 2 (Molina-Grima et al., 1997):

Donde, Ef = Prdida de energa por friccin

Cr = factor de friccin

hD = altura de la dispersin

Ar = rea seccin transversal del riser

ULr =Velocidad superficial del lquido

Ugr = Velocidad superficial del gas

dr = dimetro del riser

dr

gddgrrg AA

AA++= (1)


)()(2 rLrr

grLrLr AUdhDUUCrUEf += (2)


El factor de friccin Cr se puede deducir a partir de la ecuacin de Blasius (Ecuacin 3 para downcomer y riser; Ecuacin 4, para riser sola-mente) (Wen et al., 2005; Molina-Grima et al., 1997):

Donde el nmero de Reynolds est definido como:

Donde,

i = cada una de las zonas del reactor (i.e. riser, downcomer)

Hi,, L= densidad promedio del lquido (kg/m3)

VLi, ULr= velocidad del lquido en cada una de las zonas i del reactor (m/s)

Di, dr= dimetro en cada una de las zonas i del re-actor (m)

Hi, L= viscosidad promedio (Pa s)

El nmero de Reynolds es la relacin entre las fuerzas de inercia y las fuerzas viscosas (Ecuaciones 6 y 7), por lo que expresa la magnitud de los factores que favorecen el flujo de un fluido y de aquellos que se oponen a ste (Mataix, 1982).

Por lo tanto:

As, valores altos de Re indican que la visco-

sidad no es un factor limitante, mientras que valo-res pequeos indican lo contrario. Por otra parte, este parmetro puede utilizarse como criterio para el escalamiento de procesos donde la viscosidad juega un papel determinante en las transferencias de masa, oxgeno y/o momento.

Coeficiente volumtrico de transferencia

de masa (kLa). Es quiz el parmetro ms impor-tante en una fermentacin aerobia (sin importar el tipo de aireacin), puesto que determina la capaci-dad del sistema para transferir oxgeno a los micro-organismos (Quintero, 1990). La Ecuacin 8 des-cribe el flux de transferencia de oxgeno en proce-sos de este tipo.

Donde,

Na = Flux de transferencia de O2

kL = Coeficiente de transferencia de O2 en la fase lquida

a = rea interfacial por unidad de volumen

C* = Concentracin de saturacin de O2

CL = Concentracin de O2 en el seno del lquido

El kLa puede variar durante el transcurso de cada fermentacin y puede ser determinado experi-mentalmente por diferentes mtodos: a) mtodo dinmico, b) oxidacin de sulfito, y c) consumo biolgico del oxgeno. Especficamente hablando del kLa en reactores Air-lift, Znd et al. (2004) pro-pusieron la Ecuacin 9 para calcular el coeficiente global de transferencia de oxgeno.

25.0Re0791.0 = HiCr

Hi

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(3)

(4)

(5)

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(7) L=Re

)( * LL CCakNa =

Pg ina 183

Donde,

PG = Potencia debida a la aeracin

VL = Volumen de trabajo del reactor

L = densidad del lquido

g = aceleracin de la gravedad

Los tres parmetros hidrodinmicos anterior-mente descritos, estn directamente relacionados con las condiciones de operacin, la geometra del reactor y con las propiedades fisicoqumicas del medio lquido, de las cuales, la viscosidad es una de las ms importantes. sta ltima es la propiedad fsica de los fluidos de resistirse a fluir (Bird et al., 1987) y constituye la constante de proporciona-lidad entre el esfuerzo unitario cortante y la va-riacin de la velocidad de cizalla en las capas de un fluido (Ecuacin 11)

La Ecuacin 11 (ecuacin de Newton para la viscosidad) es generalizada y se cumple en los flui-dos donde el esfuerzo cortante es proporcional al gradiente de velocidad; sin embargo, existen flui-dos en donde la relacin esfuerzo cortantegradiente de velocidad no es proporcional por lo cual se denominan no Newtonianos (Figura 7).

La mayora de los fluidos lquidos utilizados industrialmente son no Newtonianos y los caldos

de fermentacin incubados en biorreactores no son la excepcin, adems de que la viscosidad de stos a menudo es importante y cambia con el tiempo debido a las complejas reacciones bioqu-micas que tienen lugar durante estos procesos (Lpez y Lpez et al., 2000). Por otra parte, la reo-loga -ciencia que estudia el flujo y la deformacin- se encarga de estudiar a los fluidos no Newtonianos, entre otros sistemas, de manera tal que es posible inferir cul es el comportamiento de estos fluidos bajo diversas condiciones de pro-ceso, ajustando los datos obtenidos en pruebas ex-perimentales a modelos reolgicos que relacionen las variables involucradas (i.e. velocidad de cizalla, esfuerzo de corte). Uno de los modelos ms usa-dos para describir el comportamiento de los flui-dos no Newtonianos es el de Ostwald de Waele o Ley de la Potencia (Ecuacin 12) ya que es sencillo


(9) 925.0

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)/(1 rdgrL

L

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(10)

dyd = (11)

Figura 7. Curvas de flujo tpicas de algunos mate-riales.

.


das hasta el momento de su utilizacin. Se estran cajas de NBTA con suspensin de NEP para des-cartar presencia de microorganismos contaminan-tes.

Bacteria simbionte. La bacteria simbionte se ais-la fragmentando fases IJ de Steinernema spp. recin recuperadas de trampa de White, en 10 mL de me-dio STB (Caldo de soya tripticaseina) previa saniti-zacin superficial con hipoclorito de sodio al 7%. Esto se hace por duplicado en cajas Petri (D=5 cm) las cuales se incuban a 28C, y despus de 48 h, se estran cajas de NBTA (Agar Azul de Bromo-timol - Cloruro de Trifeniltetrazolio) que se incu-ban a 28C durante 48 h ms. Posteriormente se selecciona una colonia aislada de color azul que es

Un Mtodo para Producir NEP Mediante Cultivo Sumergido en Biorreactor Air-lift

y se aplica tanto en anlisis tericos como en clcu-los de ingeniera aun cuando solamente describe la zona lineal del comportamiento reolgico, motivo por el cual es necesario manejar con cautela las ex-trapolaciones que puedan hacerse del ajuste con este modelo (Barnes et al., 1999).

Donde,

Donde,

= viscosidad

K=ndice de consistencia

n=ndice de comportamiento al flujo

= cizalla

1

=n

K

Reologa en caldos de fermentacin para la produccin de NEP

Referente al cultivo de NEP, poco se ha in-vestigado con respecto a condiciones hidrodinmi-cas, parmetros reolgicos y viscosidad en los cal-dos de fermentacin involucrados. Sin embargo, algunos autores han evaluado el comportamiento reolgico del cultivo monoxnico en matraz agita-do y en biorreactor Air-lift (Chavarra-Hernndez et al., 2003; Sanjuan-Galindo, 2006) usando precisa-mente el modelo de Ostwald de Waele. La deter-minacin de la viscosidad y su evolucin en siste-mas biolgicos es muy importante porque afecta directamente las condiciones hidrodinmicas y de oxigenacin imperantes en el reactor. Por lo tanto, la viscosidad es un parmetro que debe considerar-se durante el diseo de procesos y la eleccin de las condiciones de operacin para lograr producti-vidades convenientes.

(12)

Materiales y mtodo sugeridos.

Especmenes

NEP. Fases IJ de Steinernema spp. se propa-gan en cultivo in vivo, usando larvas de Galleria mellonella o en cultivo in vitro lquido (medio de produccin para NEP, MA-10) a nivel frasco agita-do orbitalmente. Los IJ obtenidos, se lavan y sani-tizan con solucin 0.2 % v/v Thimerosal para lue-go enjuagarse 3 veces con agua destilada estril. Las fases IJ as sanitizadas se mantienen en suspen-sin acuosa (200,000 IJ/mL) en botellas para culti-vo de tejidos (rea=90 cm2, VT=250 mL y VL=30 mL) con tapa permeable al aire a temperatura am-biente y agitacin de 80 rpm durante 2 h cada 8

Pg ina 185

inoculada en 75 mL de medio STB (matraz Erlen-meyer, VT=0.5 L) que se incuba a 30C y 150 rpm en una incubadora con agitacin orbital (SEV-INO 650V, Mxico) durante 30 h. Transcurrido este tiempo y luego de verificar que el pH del culti-vo bacteriano es entre 8 y 9, se agrega 25% v/v glicerol estril para preparar viales de conservacin (1.5 mL) acondicionados posteriormente a su pre-paracin con 1 h de refrigeracin a -4C, seguida de 1 h en congelacin a -18C para luego mante-nerlos en ultracongelacin a -80C, mantenindo-los as hasta su uso (previa verificacin de que la bacteria se encuentra en fase I).

Medios de Cultivo

STB (Medio de produccin bacteriano) (Buecher y Propiel, 1989). 3% p/v caldo de soya tripticasa y 0.5% p/v extracto de levadura. pH de 7.

Agar NBTA (Medio selectivo y diferencial para bacteria simbionte) (Akhurst, 1980). 2.3% p/v agar nutritivo, 0.0375 % p/v azul de bro-motimol y 0.004 % v/v TTC (cloruro de trife-nil tetrazolio). pH de 8.5.

MA-10 (Medio de produccin para los ne-matodos). 10% v/v aguamiel estril, 2% v/v aceite de maz, 1% p/v yema de huevo des-hidratada, 0.5% p/v NaCl, 1% de extracto de levadura. Incluye 0.3 mL de antiespumante A [100% base silicn] (SIGMA-Aldrich) por cada litro de medio. pH de 7.5.

NOTA: Todos los medios se preparan con agua desionizada, el pH de se ajusta con 40% p/p hidrxido de sodio y se esterilizan a 15 lbf/in2 durante 15 min en autoclave, con ex-cepcin del medio MA-10 para el cultivo en

biorreactor.

Fermentadores

Se utilizan dos configuraciones de reactor Air-lift con recirculacin interna: un MTB (Modular Tower Bioreactor 3.4 L - Applikon, The Nether-lands) acoplado a la consola ADI 1030 y controla-dor ADI 1031 de la misma marca, y un reactor Air-lift con tubo draft liso (Sanjuan-Galindo, 2006) (SEV, Mxico) que se identificarn como Reactor A y Reactor S, respectivamente. El aspecto, dimen-siones y geometra de cada reactor se muestran en la Figura 8 y Cuadro 7. El volumen de trabajo de ambos biorreactores es el mismo, siendo las dife-rencias principales, la forma del tanque y la presen-


Figura 8. i) Reactor S (SEV, Mxico); ii) Filtro y humidi-ficador de aire; iii) sedimentador de acero inoxidable aco-plado a la tapa del reactor A; iv) Reactor A acoplado a consola ADI 1031 y controlador ADI 1030 (Applikon, The Netherlands ).


cia de un sedimenta-dor de acero inoxida-ble en el reactor A, que tiene la finalidad de disminuir la veloci-dad de flujo en el co-mienzo de la zona de descenso (i.e., downco-mer).

Cultivo monoxnico

en biorreactor con

agitacin neumtica.

Inculo bacteriano

Un volumen de 420 mL de medio STB (Matraz Erlenmeyer VT=2 L) se inocula con un vial de conservacin de X. nematophila y se incuba a 30C durante 48 h. Se verifica el pH cercano a 8 y se estran muestras en NBTA.

Los electrodos de pH y temperatura se insertan en los reactores as como el puerto para toma de muestra y electrodo de oxgeno. Se conectan a cada reactor, previa este-rilizacin (40 min a 15 lbf/in2), un filtro de aire accesorio relleno de algodn (construido con una botella de vidrio con dimetro y volumen variables) y en la salida de un filtro PTFE (d=4.5 cm, corte de 0.2 m) unido a un humidificador (d=15 cm, VT=3.8 L con 3 L de agua desionizada), as

como una trampa de gases en el venteo (salida del tan-que) (Figura 9). Cada biorreactor se esteriliza in situ, su-ministrando vapor a 13-15 lbf/in2 durante 50 min al tanque completo y 20 min a cada entrada-salida hacien-do las conexiones necesarias (i.e., filtros de aire -

Cuadro 7. Medidas principales de los reactores A y S utilizados para la produccin de NEP. Representacin Magnitud Reactor A Reactor S

Volumen total de trabajo VT 4.2 L 4.2 L

Radio interno mayor del reactor Rcolumna 6.5 cm 5.5 cm

Radio interno menor de reactor rcolumna 3.125 cm 4.75 cm

Longitud axial mxima de operacin Hcolumna 54 cm 51 cm

rea transversal mxima del reactor Acolumna 132.73 cm2 95.03 cm2

rea transversal de la corona 1 en la zona del downcomer ADWN(1) 109.83 cm

2 71.27 cm2

rea transversal de la corona 2 en la zona del downcomer aDWN(2) 15.47 cm

2 47.12 cm2

Separacin del tubo draft con la base del fermentador hbottom 2.0 cm 2.0 cm

Radio interno del tubo draft rint draft 2.58 cm 2.5 cm

Radio interno del sedimentador [a] rint [a] 5.0 cm -

Radio interno del sedimentador [b] rint [b] 6.5 cm -

Grosor de pared en tubo draft y sedimen-tador epared 0.2 cm 0.25 cm

rea transversal interna del tubo draft (zona de ascenso, riser) aint draft 12.56 cm

2 19.63 cm2

rea transversal interna del sedimentador [a] (zona de ascenso, riser) a int [a] 33.18 cm

2 -

rea transversal interna del sedimentador [b] (zona de ascenso, riser) a int [b] 19.63 cm

2 -

Longitud del tubo draft hdraft 33.3 cm 27.5 cm

Volumen en el interior del tubo draft V int draft 693.53 cm3 579.23 cm3

Dimetro del difusor d difusor 4.0 cm 2.5 cm

Capacidad de suministro de aire del com-presor Q 1-10 lpm 1-10 lpm

Sistema de enfriamiento Chaqueta Chaqueta

Pg ina 187

Cultivo monoxnico

Un volumen de 3.8 L de MA-10 se esteriliza para cada reactor en botellas de vidrio (d=20 mm y VT=9.7 L) a 15 lbf/in2 durante 40 min. Una vez que baja la temperatura de los reactores, se llena la chaqueta de enfriamiento y se bombea el medio de produccin MA-10 estril a cada tanque. Se man-tienen con una aireacin de 2 vvm durante 18 h, tiempo al cual se bombea el inculo bac-teriano (previamente calibrado el electrodo de O2 disuelto), en una proporcin del 10% del to-tal de volumen de trabajo. Se ajusta la temperatura de trabajo a 30C, misma que se mantiene durante 48 h con una aireacin de 1.5 vvm en cada fermentacin realizada. Una vez cumplidas las 48 h, se inoculan fases IJ de NEP a los reactores para alcanzar una concentracin aproximada de 1000 IJ/mL, cam-bindose la temperatura a 23C con un rgimen de aireacin variable (1 a 1.5 vvm) hasta el trmino del proceso.

Muestreo durante el cultivo

El muestreo durante el cultivo se hace cada 2 d involucrndose los siguientes volmenes de caldo de fermentacin extrados de los biorreacto-res:

Purga, 10 mL

Conteo de NEP, 10 mL

Determinaciones reolgicas, 30 mL (cada 4 d)

En cada muestreo se estra una placa de NBTA para revisar el estado de la bacteria y se fo-tografan los diferentes estadios de desarrollo de los NEP en un microscopio de campo claro (Eclipse 80i, Nikkon, Japan) con una cmara digi-tal. Cuando se hace reometra, NEP se fotografan antes y despus del cizallamiento en el remetro.

Conteo de NEP viables

De los 10 mL de caldo de fermentacin des-tinados al conteo de NEP, se toman alcuotas de 100 L y se hacen diluciones hasta 10-3 (dependiendo de la concentracin total de NEP en el reactor) usando agua desionizada de forma que se puedan contar los NEP bajo el microscopio usando magnificaciones de 40 a 400. El recuen-to se hace por triplicado.

Determinaciones reolgicas


Figura 9. Esquema de filtrado y alimentacin de aire en los biorreacto-res Air-lift, as como ubicacin del puerto para toma de muestra y elec-trodos. Clave: C=compresor de aire, FP=filtro PTFE 0.2 m, F=filtro de algodn, H=humidificador, Tm (A, S)=toma-muestra en el Reactor A o S respectivamente, TG=trampa de gases y E= electrodos.


Muestras de 30 mL de caldo de fermentacin son cizalladas en un remetro de esfuerzo contro-lado (AR-2000; TA Instruments, USA) usando la geometra de paletas o vane rotor en un interva-lo de velocidad de cizalla de 50 s1 a 600 s1 y vice-versa con una etapa de pre-cizallamiento con la

finalidad de suspender las partculas del medio y por supuesto, los nematodos, as como descartar posible dependencia de las propiedades reolgicas con el tiempo. Todas las muestras son cizalladas a 25C durante 37 min, obtenindose las curvas de flujo correspondientes.

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Producción de nematodos entomopatógenos por métodos in vitro

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