FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

Secuenciación de la región 16S de cepas aisladas de BAL y

determinación de su capacidad bactericida

Trabajo de graduación previo a la obtención de título de:

Ingeniera en Alimentos

Autora

Tatiana Gabriela Camacho Sánchez

Director

Rodrigo Sebastián Caroca Cáceres

Co-Directora

María Fernanda Rosales Medina

Cuenca – Ecuador

2018

Camacho Sánchez ii

DEDICATORIA

El presente trabajo se lo dedico a mis padres

Aydita y Pedro, quienes han sido el motor principal

y el mejor ejemplo de lucha, sabiduría

y dedicación en mi vida, para seguir adelante;

A mi hermano Pedro, por ser la persona

que me inspira a querer ser mejor todos los días

para darle un buen ejemplo;

A mis abuelitos maternos Delia y Héctor y

mis abuelitos paternos Rosa y Juan, por todo

su apoyo incondicional y sus sabios consejos

para nunca rendirme y siempre seguir adelante.

Camacho Sánchez iii

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero expresar mi más profundo agradecimiento a Dios por la fuerza y sabiduría

que me ha brindado para llegar a cumplir todas y cada una de las metas que me he propuesto en

la vida.

A la Ingeniera María Fernanda Rosales y al Doctor Rodrigo Caroca, por la confianza que

depositaron en mi persona para realizar el presente trabajo y por haber compartido conmigo todos

sus conocimientos.

Al Ingeniero Diego Montero y a la Ingeniera Johanna Tacuri por su constante apoyo y aporte de

conocimientos durante la realización de esta tesis.

A la Universidad del Azuay por abrirme sus puertas y por el aporte económico invaluable en la

realización del presente trabajo.

A Javier Cueva, por ser una persona maravillosa y haberme brindado un apoyo incondicional

durante la realización de este trabajo, mismo que me ha permitido hoy llegar hasta aquí.

A mi familia, tíos, primos, a mis compañeros de aula, a mi compañera de proyecto, a mis amigos,

gracias a todos y cada uno de ellos que de una u otra manera me brindaron su apoyo sincero

para que este camino sea un poco más llevadero.

Camacho Sánchez iv

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA .......................................................................................................................................... ii

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................... iii

ÍNDICE DE CONTENIDOS ......................................................................................................................... iv

Resumen ................................................................................................................................................. v

Palabras claves:....................................................................................................................................... v

ABSTRACT .............................................................................................................................................. vi

KEYWORDS ............................................................................................................................................ vi

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 1

MATERIALES Y METODOLOGÍA ............................................................................................................... 5

1.1. Activación de cepas ..................................................................................................................... 5

1.2. Verificación de bacterias .................................................................................................................... 5

1.2.1. Tinción de Gram ......................................................................................................................... 5

1.3 Identificación molecular de las BAL mediante amplificación y secuenciación del gen 16S DNA. ....... 5

1.3.1 Amplificación del DNA de la región 16S de las BAL mediante PCR .............................................. 5

1.4. Capacidad de inhibición de las BAL frente a bacterias patógenas ..................................................... 6

1.4.1 Capacidad bactericida de Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus plantarum y

Enterococcus faecium contra cepas de S. aureus ATCC 12600, E. coli ATCC 8739, Salmonella ATCC

14028 y B. cereus ATCC 10876 ................................................................................................................. 6

.................................................................................................................................................................. 7

1.6 Análisis estadístico .............................................................................................................................. 8

CAPITULO II ............................................................................................................................................. 9

RESULTADOS ........................................................................................................................................... 9

2.1 Verificación de las bacterias ............................................................................................................... 9

2.2 Identificación molecular de las BAL mediante amplificación y secuenciación del gen DNAr 16S ....... 9

2.3 Capacidad de inhibición de las BAL frente a bacterias patógenas S. aureus ATCC 12600, E. coli ATCC

8739, Salmonella ATCC 14028 y B. cereus ATCC 10876 .......................................................................... 11

CAPITULO III ..........................................................................................................................................15

DISCUSIONES ........................................................................................................................................15

CONCLUSIONES .....................................................................................................................................18

BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................................19

ANEXOS ................................................................................................................................................24

Camacho Sánchez vii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama de procesos para la realización de cultivos mixtos (co-cultivos) ................... 7

Figura 2. Muestras de la tinción de Gram de las 9 cepas de BAL. En las muestras 1, 5 y 6 se

observa morfología cocoide. En las muestras 2, 3, 4, 7, 8 y 9 se observa morfología bacilar. 9

Figura 3. Fragmentos del gen 16S DNA de cepas de BAL amplificados por PCR. Marcadores de

talla molecular de DNA Ladder Tracklt 1 Kb DNA Invitrogen (100bp – 15000bp) en los carriles

externos; Carriles 1 a 9, productos de PCR derivados de las cepas de BAL. ............................. 10

Figura 4. Cinética de muerte de las cepas de a) S. aureus ATCC 12600, b) E. coli ATCC 8739,

c) Salmonella ATCC 14028 y d) B. cereus ATCC 10876 en co-cultivo con L. paraplantarum 12

Figura 5. Cinética de muerte de las cepas de a) S. aureus ATCC 12600, b) E. coli ATCC 8739,

c) Salmonella ATCC 14028 y d) B. cereus ATCC 10876 en co-cultivo con L. plantarum ........... 13

Figura 6. Cinética de muerte de las cepas de a) S. aureus ATCC 12600, b) E. coli ATCC 8739,

c) Salmonella ATCC 14028 y d) B. cereus ATCC 10876 en co-cultivo con E. faecium .............. 14

Camacho Sánchez viii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Identificación morfológica e Identificación molecular de las BAL. ................................. 10

Camacho Sánchez ix

ANEXOS

Anexo 1. Visualización del gel de electroforesis de los fragmentos purificados de ADN de las 9

muestras de BAL. ......................................................................................................................... 24

Anexo 2. Comparación estadística de las muestras control de BAL y de las muestras de BAL en

co-cultivo con bacterias patógenas mediante el test LSD. 1 ....................................................................................... 24

Anexo 3. Comparación estadística de las muestras control de bacterias patógenas y de las

muestras de bacterias patógenas en co-cultivo con BAL mediante el test LSD. 2 ................................... 24

Camacho Sánchez 1

Tatiana Gabriela Camacho Sánchez

Trabajo de Graduación

Rodrigo Caroca, PhD.

Octubre del 2018

Secuenciación de la región 16S de cepas aisladas de BAL y determinación de su

capacidad bactericida

INTRODUCCIÓN

Debido a que cada año se presentan enfermedades de transmisión alimentaria que han cobrado

la vida de millones de personas, sumado al importante crecimiento de las industrias de alimentos,

es necesario buscar alternativas de protección para los productos alimenticios y así evitar

pérdidas humanas y económicas debido a la contaminación por microorganismos de los mismos

(OMS 2016).

Durante mucho tiempo en la industria se han utilizado compuestos químicos para preservar los

alimentos. Sin embargo, muchas de estas sustancias producen serios problemas de salud a

mediano o largo plazo, como se ha evidenciado en estudios recientes. Por esta razón, los

consumidores prefieren productos más sanos, lo cual nos motiva a buscar otras alternativas para

la preservación de alimentos que sean naturales y que sean inocuas para el consumidor (Badui

2013).

Las bacterias ácido lácticas (BAL) han sido estudiadas a lo largo de los años, debido a que

desempeñan un papel importante en la obtención de alimentos fermentados tales como el yogurt,

encurtidos, embutidos, quesos, etc.; también confieren una función conservadora en los alimentos

que es atribuida a la producción de metabolitos, los cuales inhiben el desarrollo de bacterias

alterantes y patógenas. La utilización de BAL o sus metabolitos permitiría incrementar la vida útil

de los alimentos, así como la obtención de alimentos más seguros con una reducción

considerable de las cantidades de aditivos químicos empleados habitualmente (García Ibarra

2007).

Las BAL son microorganismos Gram-positivos, no pigmentados, no formadores de esporas, no

reductores de nitratos y catalasa negativos. En términos generales, estas bacterias tienen

algunos requerimientos para su crecimiento como la presencia de vitamina B, aminoácidos,

péptidos, bases púricas y pirimídicas. Por esta razón estos microorganismos abundan en un

medio tan rico nutricionalmente como es el caso de la leche. Para el cultivo de las BAL a nivel de

laboratorio, se deben emplear medios selectivos tales como el caldo o agar MRS (Man,

Camacho Sánchez 2

Rogosa y Sharpe) y el agar Rogosa, entre otros, ya que poseen los nutrientes mencionados

anteriormente (Cabeza Herrera 2014).

Con la denominación de BAL se generaliza a un grupo de bacterias que fermentan azúcares,

tales como la glucosa y lactosa, para producir ácido láctico. Dentro de este grupo se reconoce la

existencia de microorganismos aerobios, anaerobios y/o anaerobios facultativos. Los géneros

más representativos de las BAL se denominan: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus,

Bifidobacterium y Pediococcus. Además, estos microorganismos se pueden clasificar por su

metabolismo en homofermentativos y heterofermentativos. Los primeros producen ácido láctico

como producto principal o único de la fermentación de la glucosa, mientras que los segundos,

producen también ácido acético, etanol y dióxido de carbono (Del Campo et al 2008). Otra

característica de algunas BAL es que, al ser ácido tolerantes, pueden desarrollarse a pH tan bajos

como 3.2, otras a valores tan altos como 9.6 y la mayoría crecen a un pH de entre 4 y 4.5. Esto

les permite sobrevivir de manera natural en medios donde otras bacterias no soportarían la

actividad producida por los ácidos orgánicos (Ramírez et al 2011).

Los géneros que se describen brevemente a continuación son los que tienen mayor relevancia

en la microbiología de alimentos:

Lactobacillus: son bacilos o cocobacilos no esporulados, aerotolerantes o anaerobios, con

requerimientos nutricionales complejos. Alrededor de 50 especies conforman este género. Los

límites de temperatura para desarrollarse varían de 2 a 53 °C con una óptima de 30 a 40 °C. Son

frecuentes en la cavidad oral y contenido intestinal de mamíferos. Las especies

homofermentativas están asociadas con el hombre y animales, mientras que las especies

heterofermentativas con los alimentos, en donde llevan a cabo fermentaciones controladas o

causan deterioro especialmente bajo refrigeración de productos empacados. Se aíslan fácilmente

de productos cárnicos, lácteos y de pescados (Neria Pérez 2006).

Enterococcus: comprenden aproximadamente 30 especies de bacterias que fueron separadas

del género Streptococcus al encontrar diferencias genéticas significativas entre las cepas. Son

Gram positivas, con células esféricas, dispuestas individualmente, en pares o en cadenas cortas,

catalasa negativa, no esporuladas, algunas cepas presentan motilidad. La temperatura óptima

para su crecimiento está entre 10 a 45 °C. Son bacterias anaerobias facultativas (García Ibarra

2007).

Streptococcus: consiste en un grupo de bacterias Gram positivas, con forma esférica u ovoide,

no presentan motilidad, típicamente dispuestas en pares o cadenas, catalasa negativa, crecen en

condiciones anaeróbicas o microaerofílicas. Producen fermentaciones tipo homoláctico y crecen

a 37 °C (García Ibarra 2007).

Camacho Sánchez 3

Pediococcus: comprende bacterias pertenecientes al grupo de cocos, Gram positivas, catalasa

negativa, sin motilidad, no esporuladas. Crecen bajo condiciones microaerofílicas o anaeróbicas

facultativas y fermentan la glucosa produciendo ácido láctico D o L (+). El género consiste

aproximadamente de 8 especies: Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, P. parvulus, P.

dextrinicus, P. damnosus, P. inopinatus, P. halophilus y P. urinaeequi (García Ibarra 2007).

Lactococcus: se presentan en forma de cocos, dispuestos en pares o en cadena de longitud

variable. Son bacterias Gram positivas, no esporuladas, sin flagelo, homofermentativas, que

producen sólo ácido láctico L (+), anaerobias facultativas y microaerófilas. Su temperatura óptima

de crecimiento es próxima a los 30 °C. Se encuentran en productos como leche y cremas

fermentadas, así como en los quesos donde constituyen la microflora predominante y en los

cuales desempeñan un papel irremplazable contribuyendo a la textura, sabor y asegurando la

conservación y la salubridad de los productos (Neria Pérez 2006).

Leuconostoc: son bacterias Gram positivas en forma de cocobacilos, anaerobias facultativas,

catalasa negativa, dispuestas en pares y cadenas. Son bacterias heterofermentativas que

producen ácido láctico D (+), etanol y CO2. Tienen una temperatura óptima de crecimiento de 20

a 30 °C. Este género está involucrado en el deterioro de alimentos empacados al vacío, ricos en

carbohidratos simples. Sin embargo, son utilizados en forma controlada para la fabricación de

algunos quesos debido a la generación de aromas apreciables (Neria Pérez 2006).

Las bacterias ácido lácticas presentan algunas características tales como: ser termorresistentes,

ser activas en pH bajos, ser inocuas para los consumidores y ser estables en los alimentos. Es

por ello que se han utilizado como bioconservantes naturales en los alimentos, que además

mejoran las características organolépticas como el olor, sabor, textura, aumentan la calidad

nutritiva de los productos y mejora el tracto gastrointestinal de los seres humanos.

Adicionalmente, evitan el desarrollo de microorganismos patógenos capaces de producir

enfermedades, por la estimulación del sistema inmunológico y, por consiguiente, la producción

de anticuerpos (Del Campo et al 2008).

La actividad antibacteriana de dichas bacterias ha sido atribuida a la acumulación de los

productos finales en los procesos de fermentación, entre los que se encuentran el ácido láctico,

dióxido de carbono y peróxido de hidrógeno. Por otra parte, la producción de bacteriocinas

también tiene un rol importante controlando el crecimiento de otras bacterias (Parra Huertas

2010). Las bacteriocinas son moléculas biológicamente activas que tienen estructura tipo péptido

o proteína, las cuales presentan acción bactericida o bacteriostática sobre receptores específicos

de las células. La composición química de estas sustancias es muy variada y su modo de acción

muy específico, por lo que su efecto ha sido estudiado intensamente contra bacterias patógenas

tales como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium

botulinum, Salmonella, entre otras. Algunas bacteriocinas producidas por

Camacho Sánchez 4

las BAL pueden inhibir el crecimiento de bacterias Gram-positivas patogénicas y Gram- negativas,

e incluso también levaduras (Ramírez et al 2011).

En vista que cada BAL produce un tipo de bacteriocina con características particulares y

capacidad bactericida más eficiente sobre cierto grupo de bacterias patógenas, es importante

contar con herramientas que permitan una adecuada identificación taxonómica de la BAL

productora de estos péptidos bioactivos. La identificación clásica a nivel de bacterias lácticas en

productos alimenticios, depende principalmente de métodos fenotípicos, que son el conjunto de

características celulares observables o cuantificables, como su morfología, propiedades

fisiológicas, bioquímicas y por la estructura de sus componentes celulares. La identificación a

nivel de especie, sin embargo, conlleva un exceso de tiempo y grado de incertidumbre en los

resultados al existir cepas atípicas o nuevas que no comparten ciertas características con el resto

del grupo (Jurado et al 2015).

Uno de los métodos de tipificación más utilizados para identificar el género Lactobacilllus y

microorganismos próximos es el API 50 CHL (BioMérieux, Francia). Este método se basa en el

catabolismo de los glúcidos que producen ácidos orgánicos que hacen que el indicador de pH del

medio cambie. Estos resultados constituyen el perfil bioquímico del microorganismo (Méndez

Rojas 2016). Sin embargo, este tipo de análisis ofrece en ocasiones resultados ambiguos y con

una baja sensibilidad puesto que se pueden obtener diferentes respuestas entre cepas

pertenecientes a una misma especie (Apolo García 2018).

A partir del año 2000 se lograron avances importantes en secuenciación de la información

genética, particularmente en el desarrollo de tecnologías y equipamiento que permite la

secuenciación de miles de fragmentos de ADN (Ácido Desoxirribonucleico) en forma paralela.

Existen una serie de sistemas para la identificación genética, entre ellas la que más destaca es

la secuenciación del gen 16S (ADNr) el cual es usado con frecuencia en estudios de filogenia e

identificación microbiana (Cocolin et al 2013).

El objetivo de esta investigación fue la amplificación y secuenciación de la región 16S, además

de la evaluación de la capacidad bactericida de las BAL, que fueron aisladas previamente de

quesos frescos de Bulán, Biblián y San Fernando, frente a bacterias patógenas La amplificación

del ADN se realizó mediante la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), la cual permite

hacer muchas copias de una región en particular de ADN. Los productos de amplificación

obtenidos fueron secuenciados (Macrogen, Corea), y posteriormente se compararon con una

base de datos de ADN para la identificación de las cepas. Por último, se llevaron a cabo cultivos

mixtos o co-cultivos, los cuales consisten en sembrar dos especies diferentes de forma conjunta

en un mismo medio de cultivo. Este ensayo permitió evaluar la capacidad de las BAL para inhibir

el crecimiento de bacterias alterantes de alimentos. Los resultados obtenidos pueden ser de

interés especialmente por su potencial aplicación en la producción de lácteos y cárnicos.

Camacho Sánchez 5

CAPÍTULO I

MATERIALES Y METODOLOGÍA

1.1. Activación de cepas

Para la activación de las cepas de BAL que fueron previamente aisladas de quesos frescos

obtenidos de las regiones de Bulán-Paute, Biblián-Cañar y San Fernando-Azuay, por María

Méndez (2016), Jessica Calle (2016) y Andrea Abril (2016) en sus respectivos trabajos, se

procedió a tomar una muestra de cada una de estas para cultivarlas en tubos con caldo MRS

(Acumedia, México). Se incubaron a 37 +/- 1 °C durante 72 h y posteriormente se colocaron los

tubos en una jarra de anaerobiosis (Merck, Darmstadt, Germany) y se adicionó Anaerocult (Merck,

Darmstadt, Germany). Se tomó 0.1 mL de muestra de los tubos anteriormente incubados y se

depositó en placas Petri con agar MRS, las que fueron incubadas a 37 +/- 1 °C durante 72 h en

condiciones anaerobias como se indicó previamente (Panreac 2003).

1.2. Verificación de bacterias

1.2.1. Tinción de Gram

Para la tinción de Gram se utilizó kits de tinción de Gram (Proquímica, Cuenca, Ecuador),

siguiendo el protocolo descrito por López, Hernández & Colín (2013). La observación de las

bacterias se realizó con un microscopio óptico (Olympus CX22LED, Japón) y se hicieron registros

fotográficos.

1.3 Identificación molecular de las BAL mediante amplificación y secuenciación del gen

16S DNA.

1.3.1 Amplificación del DNA de la región 16S de las BAL mediante PCR

Las BAL reactivadas (1.1) fueron incubadas durante tres días. Posteriormente, los cultivos se

colocaron en tubos Eppendorf (Axygen, México), los cuales fueron centrifugados a 4500 rpm por

10 min, se desechó el sobrenadante y se lavaron los pellets tres o cuatro veces con agua

destilada. Finalmente, el pellet se resuspendió en 50 µL de agua destilada, para su posterior uso

en las reacciones de PCR.

La amplificación del ADN se realizó, tomando como referencia el protocolo descrito por Vallejo et

al 2009, en un termociclador (Labnet, NJ, USA). Las condiciones para el ensayo de PCR

consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min; seguido de 35 ciclos, en que cada

ciclo incluye un paso de desnaturalización a 95 °C por 40 s, anillamiento a 58 °C por 40 s y una

extensión a 72 °C por 90 s. La reacción terminó con una extensión final a 72 °C por 10 min. La

mezcla de PCR fue de 50 µL para cada una de las muestras, con cantidades de 25 µL de Dream

Taq Green PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific, Massachusetts, USA), 4 µL de

Camacho Sánchez 6

cada primer de concentración 10 µM (Invitrogen, California, USA), 4 µL de agua desionizada

estéril y 2 µL de ADN molde. En dicha reacción, en lugar de ADN bacteriano purificado, se

utilizaron bacterias completas las cuales fueron lisadas para la liberación de su ADN con un

tratamiento térmico a altas temperaturas (95 °C). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo por

duplicado.

Para determinar que primers permiten la amplificación más específica y eficiente de la región 16S

de las bacterias bajo estudio, se evaluaron tres parejas de cebadores: 16SF (5´-

ATCATGATTTACATTTGAGTG-3´) y 16SR (5´-CGACGACCATGAACCACCTGT-3´) (Aureli et al

2009); 7F (5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´) y 1510R (5´-CGGYTACCTTGTTACGACTT-

3´) (Bejarano Bonilla 2014); y el BSF820 (5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´) y el REVB (5´-

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) (Vallejo et al 2009). Los productos de PCR se analizaron por

electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (p/v), usando buffer de corrida TAE 1X (Tris, Ácido

Acético, EDTA) y la visualización se realizó tiñendo el gel con Syber Safe 1X (Invitrogen, USA).

Para estimar el tamaño de las bandas se utilizó el Tracklt 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad,

California).

La visualización de los geles de electroforesis se realizó con un fotodocumentador (Labnet, NJ,

USA), mientras que la purificación de los productos de PCR fue realizada con el Wizard®

Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, USA). Los fragmentos de DNA de las cepas

fueron secuenciados en Macrogen (Seúl, Corea del Sur)

(http://www.macrogen.com/en/main/index.php). Las secuencias obtenidas fueron comparadas

con la base de datos del GenBank utilizando la herramienta BLAST.

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al 1990).

1.4. Capacidad de inhibición de las BAL frente a bacterias patógenas

La actividad antimicrobiana de las BAL contra la cepa indicadora fue determinada mediante el

método de co-cultivo propuesto por Roldán et al (2001). Se utilizó tres cepas de BAL identificadas

anteriormente (Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus plantarum y Enterococcus faecium)

que actuaron sobre cuatro cepas de bacterias patógenas (Staphylococcus aureus ATCC 12600,

Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella ATCC 14028 y Bacillus cereus ATCC 10876). Los

ensayos se realizaron por triplicado.

1.4.1 Capacidad bactericida de Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus plantarum y

Enterococcus faecium contra cepas de S. aureus ATCC 12600, E. coli ATCC 8739,

Salmonella ATCC 14028 y B. cereus ATCC 10876.

Para la evaluación de la capacidad bactericida de las cepas de BAL identificadas contra las

bacterias patógenas, se utilizó la técnica de cultivos mixtos o co-cultivos, la cual puede ser

revisada en el siguiente diagrama de procesos.

Camacho Sánchez 7

Incubar a 36.5 +/- 1 °C

por un día

Incubar a 36.5 +/- 1 °C

por tres días

Sembrar en tubo de MRS

(Co-cultivos)

0.1 mL de muestra 0.1 mL de muestra

Figura 1. Diagrama de procesos para la realización de cultivos mixtos (co-cultivos).

Cepas identificadas L. paraplantarum L. plantarum E. faecium

Crioviales de

BAL

Crioviales de

bacterias patógenas

Cepas ATCC S. aureus E. coli Salmonella B. cereus

Sembrar en tubos de

MRS

Sembrar en tubos de

MRS

Tomar muestras a las 0,

4, 8, 24, 28, 32 y 48 h

Incubar a 36.5 +/- 1 °C

por 48 h

Realizar diluciones seriadas

Sembrar

Realizar las curvas de crecimiento y muerte

BAL en Agar MRS S. aureus en placas CompactDry

E. coli en placas CompactDry

Salmonella en Agar SS

B. cereus en Agar selectivo para

dicha bacteria

Incubar a 36.5 +/- 1 °C por 24 h

Camacho Sánchez 8

1.6 Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando el programa Minitab. Los análisis se

expresaron como media logarítmica de mínimo tres réplicas independientes

(n = 3) para cada una de las muestras, a menos que se indique lo contrario.

Cuando fue necesario se realizó el análisis de varianza (ANOVA) para datos

totalmente anidados, seguido por un test LSD (Least Significant Difference)

de Fisher para evaluar las diferencias entre las muestras con un nivel de

significancia de p<0.025.

Camacho Sánchez 9

CONCLUSIONES

Se logró cumplir con los objetivos iniciales de este trabajo, siendo uno de ellos la identificación

taxonómica de bacterias ácido lácticas (BAL) aisladas anteriormente, por María Méndez, Jessica

Calle y Andrea Abril, de quesos frescos de las regiones de Bulán-Paute, Biblián-Cañar y San

Fernando-Azuay. Esto se logró mediante pruebas moleculares, más específicamente por medio

de la secuenciación del gen 16S DNA. Por medio de esta metodología, se identificó especies

como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum y Enterococcus faecium.

Se logró evaluar la capacidad bactericida de las BAL mediante la realización de cultivos mixtos o

co-cultivos frente a cepas de bacterias patógenas, para lo cual se escogió un representante de

cada una de las especies. Se observó que la BAL que más se destacó fue L. plantarum, ya que

tuvo un efecto inhibitorio total contra tres (S. aureus ATCC 12600, E. coli ATCC 8739 y Salmonella

ATCC 14028) de las cuatro cepas patógenas que se utilizaron para el estudio. Seguido de L.

paraplantarum que logró una inhibición total contra dos (S. aureus ATCC 12600 y Salmonella

ATCC 14028) de las cuatro bacterias patógenas. E. faecium sólo logró inhibiciones parciales en

contra de las cuatro bacterias patógenas.

Finalmente, se puede decir que las BAL empleadas, presentan una buena actividad bactericida

(presumiblemente gracias a la producción de bacteriocinas) frente a las cepas de bacterias

patógenas antes mencionadas. Este estudio presenta evidencia para determinar el uso potencial

de las BAL (o de sus metabolitos) para incrementar la vida útil de los alimentos, así como para la

obtención de alimentos más seguros al reducir la cantidad de conservantes químicos que se

emplean habitualmente en la industria alimentaria. Su uso puede estar especialmente enfocado

a productos lácteos y cárnicos.

Camacho Sánchez 10

BIBLIOGRAFÍA

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