Facultad de Ciencias Agrarias Coordinación de Posgrado...
67
1 Facultad de Ciencias Agrarias Coordinación de Posgrado INFORME FINAL DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA DE LA TORTUGA TAPACULO Kinosternon leucostomum postinguinale (Testudines: Kinosternidae) Natalia Ramírez Guerra Trabajo de grado para optar al título de Magister en Ciencia Animal
Transcript of Facultad de Ciencias Agrarias Coordinación de Posgrado...
1
Facultad de Ciencias Agrarias
Coordinación de Posgrado
INFORME FINAL DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA DE LA TORTUGA TAPACULO Kinosternon
leucostomum postinguinale (Testudines: Kinosternidae)
Natalia Ramírez Guerra
Trabajo de grado para optar al título de Magister en Ciencia Animal
2
Facultad de Ciencias Agrarias
Coordinación de Posgrado
Caracterización filogenética de la tortuga tapaculo Kinosternon leucostomum
postinguinale (Testudines: Kinosternidae)
Natalia Ramírez Guerra
Zootecnista, estudiante de Maestría en Ciencias Animales, Facultad de Ciencias
Agrarias, Universidad de Antioquia, Email: [email protected]
Tutor: Claudia Patricia Ceballos Fonseca, MV, MSc, PhD. Escuela de Medicina
Veterinaria, Universidad de Antioquia, Email: claudiap.ceballos@ udea.edu.co
Cotutor: Iván Darío Soto, Biol, MSc, PhD. Instituto de Biología, Universidad de
Antioquia, Email: [email protected]
Comité tutorial: Nicole Valenzuela, Biol, PhD, Iowa State University, Ames, IA,
Email: [email protected]
3
Agradecimientos
Al Grupo de Investigación Genética, Mejoramiento y Modelación Animal (GaMMA), al
Programa de Sostenibilidad de la Universidad de Antioquia, y al programa Jóvenes
Investigadores de Colciencias por su apoyo logístico y financiero. A la Fundación
Zoológico de Cali, por la donación de muestras. A los profesores Alan Giraldo y John
Carr, por la donación de muestras, sus valiosos comentarios que mejoraron este
manuscrito, y por su paciencia. A Natalia Rivera por su ayuda en campo. A mis tutores
Claudia P. Ceballos y Iván D. Soto por guiarme en este proceso. A Nicole Valenzuela
miembro de mi comité tutorial por sus valiosos aportes para el desarrollo de este
trabajo. A mis compañeros Carolina, Daniel y Yulieth por su apoyo. A Jorge Álvarez por
estar presente en todo momento
Dedicatoria
A mis padres, por la vida y la libertad para vivirla.
4
Tabla de Contenido
Lista de Tablas ................................................................................................................. 6
Lista de Figuras ................................................................................................................ 7
Lista de Anexos ................................................................................................................ 8
1. Introducción .......................................................................................................... 12
2. Objetivos .............................................................................................................. 14
2.1. Objetivo general ................................................................................................ 14
2.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 15
3. Hipótesis ............................................................................................................... 15
4. Marco teórico ........................................................................................................ 15
5. Métodos ................................................................................................................ 17
5.1. Construcción de base de datos de secuencias mitocondriales y nucleares ...... 17
5.2. Captura y toma de muestras ............................................................................. 17
5.3. Metodología de laboratorio ................................................................................ 18
5.4. Análisis filogenético ........................................................................................... 19
5.5. Estimación de distancias genéticas .................................................................. 20
6. Resultados............................................................................................................ 20
6.1. Análisis filogenético ........................................................................................... 20
6.2. Distancias genéticas ......................................................................................... 22
7. Discusión .............................................................................................................. 23
8. Conclusiones ........................................................................................................ 26
9. Referencias .......................................................................................................... 28
5
10. Tablas ................................................................................................................... 37
11. Figuras ................................................................................................................. 39
12. Anexos ................................................................................................................. 46
6
Lista de Tablas
Tabla 1. Resumen de muestras de tejidos de K. l postinguinale colectadas o recibidas
como donación para este estudio. NA = Desconocido ................................................... 37
Tabla 2. Valores de porcentaje de variación, diversidad nucleotídica, y diversidad
hapotipica de los genes seleccionados para este estudio .............................................. 38
7
Lista de Figuras
Figura 1. Hipótesis evaluadas en este estudio respecto a las relaciones filogenéticas.
Las ramas en color rojo representan individuos de K. l. postinguinale (KLP), mientras
que las negras representan individuos de K. l. leucostomum (KLL). .............................. 39
Figura 2. Relaciones filogenéticas para la familia Kinosternidae (Iverson et al., 2007). . 40
Figura 3. Filogenia de las familias Kinosternidae y Staurotypidae sugeridas
recientemente por Iverson et al. (2013). Figura tomada de (Ceballos y Iverson 2014). . 41
Figura 4. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir de los genes
mitocondriales concatenados consistente con el escenario 3 (Figura 1). Los valores en
los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota
las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio. ................... 42
Figura 5. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir de los genes nucleares
concatenados consistente con un escenario 4 (Figura 1). Los valores en los nodos
corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las
secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio .......................... 43
Figura 6. Distancias entre especies hermanas a partir de genes nucleares (Spinks et al.,
2014) 44
Figura 7. Distancias entre especies hermanas a partir de genes mitocondriales (Iverson
et al., 2013). ................................................................................................................... 45
8
Lista de Anexos
Anexo 1.Información de las secuencias de genes nucleares (Spinks et al., 2014)
tomadas del GenBank usadas en este estudio. ............................................................. 46
Anexo 2.Información de las secuencias de genes mitocondriales (Iverson et al., 2013)
tomadas del GenBank usadas en este estudio. ............................................................. 49
Anexo 3.Primers de los genes nucleares (Spinks et al., 2014) y los genes mitocondriales
(Iverson et al., 2013) usados en este estudio. ................................................................ 51
Anexo 4. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen mitocondrial
12S. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo
de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este
estudio. ........................................................................................................................... 52
Anexo 5. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen mitocondrial
16S. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo
de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este
estudio. ........................................................................................................................... 53
Anexo 6. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen mitocondrial
CytB. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo
de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este
estudio. ........................................................................................................................... 54
Anexo 7. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear HNFL.
Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las
ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
....................................................................................................................................... 55
Anexo 8. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear
NB17367. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color
9
rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en
este estudio. ................................................................................................................... 56
Anexo 9. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear
NB17483. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color
rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en
este estudio. ................................................................................................................... 57
Anexo 10. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear
NB22519. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color
rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en
este estudio. ................................................................................................................... 58
Anexo 11. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear PAX.
Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las
ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
....................................................................................................................................... 59
Anexo 12. Reglamento de la Revista Acta Biológica Colombiana. ................................ 60
10
Resumen
Recientemente las relaciones filogenéticas de la familia Kinosternidae de tortugas han
sido objeto de controversia. En el 2013 se propuso que Kinosternidae estaba formada
por tres clados parafiléticos: Kinosternon, Cryptochelys y Sternotherus. Sin embargo, en
el 2014 esta propuesta fue rechazada sugiriendo volver a las relaciones filogenéticas
anteriores con sólo dos clados, Kinosternon y Sternotherus. Una de las razones para
rechazar la filogenia del 2013 fue que la cobertura geográfica usada no reflejaba toda la
variación geográfica de las especies, además de que ninguno de los análisis previos ha
incorporado muestras de todas las subespecies descritas de esta familia. El presente
estudio tiene como objetivo determinar el estatus taxonómico de la subespecie K. l.
postinguinale. Cuatro hipótesis filogenéticas fueron evaluadas respecto a la posición de
K. l. postinguinale: 1) la subespecie es polifilética 2) la subespecie es monofilética pero
anidada dentro del clado de K. leucostomum, 3) la subespecie es parafilética, y 4) la
subespecie exhibe monofilia recíproca. Las filogenias generadas con genes
mitocondriales concatenados y con genes nucleares concatenados revelan un conflicto
y apoyan hipótesis diferentes. Específicamente, en la filogenia de genes mitocondriales
se reconocen tres clados bien soportados, y presenta una topología donde K. l.
postinguinale es un grupo parafilético con respecto a K. l. leucostomum. Este resultado
no es consistente con la clasificación K. l. postinguinale como subespecie (diferente de
K. l. leucostomum). Por el contrario, en la filogenia de genes nucleares se reconocen
dos clados bien soportados, y en la topología de este árbol K. l. postinguinale exhibe
monofilia recíproca con respecto a K. l. leucostomum. Este resultado sugiere que K. l.
postinguinale es un taxón diferenciado de K. l. leucostomum. Posibles explicaciones de
esta discrepancia son discutidas, incluyendo el mecanismo de transmisión del ADN
mitocondrial y el nuclear en esta especie americana.
11
Abstract
Recently, the phylogenetic relationships of species in the turtle family Kinosternidae
have been debated. In 2013, it was proposed that Kinosternidae comprised three
paraphyletic clades: Kinosternon, Cryptochelys and Sternotherus. Nevertheless, in 2014
this proposal was refuted, and instead it was suggested to return to the previous
taxonomy with just two clades, Kinosternon and Sternotherus. Among the reasons for
rejecting the 2013 phylogeny was that the geographic coverage used did not reflect all
the potential geographic variation of the species, plus such previous analysis failed to
include samples of all described subspecies. The present study aims to determine the
phylogenetic relationship of the subspecies K. l. postinguinale with its sister species.
Specifically, four phylogenetic hypotheses were evaluated: 1) K. l. postinguinale is
polyphyletic, 2) K. l. postinguinale is monophyletic but nested into the K. leucostomum
clade, 3) K. l. postinguinale is paraphyletic, and, 4) K. l. postinguinale exhibits reciprocal
monophyly. The phylogenies generated with concatenated mitochondrial genes and
concatenated nuclear genes reveal a conflict and support different hypotheses. Namely,
the phylogeny of mitochondrial genes revealed three clades well supported in which K. l.
postinguinale is a paraphyletic group with respect to K. l. leucostomum. This finding
does not support the classification of K. l. postinguinale as a subspecies (different from
K. l. leucostomum). On the contrary, the phylogeny of nuclear genes revealed two well-
supported clade in which K. l. postinguinale exhibits reciprocal monophyly with respect
to K. l. leucostomum. This result suggests that K. l. postinguinale is a well-differentiated
taxon from K. l. leucostomum. Possible explanations of this discrepancy are discussed,
including the transmission mechanism of mitochondrial and nuclear DNA in this New
World turtle species.
12
1. Introducción
Durante las tres últimas décadas las relaciones filogenéticas de la familia Kinosternidae
han sido evaluadas a partir de datos morfológicos, cariotípicos, aloenzimáticos y
genéticos. Entre los primeros análisis de este grupo se utilizaron aloenzimas a partir de
muestras de las 18 especies de Kinosternon donde se determinó que el género
Kinosternon es parafilético con respecto a Sternotherus (Seidel et al., 1986).
Posteriormente se combinaron los datos de aloenzimas con 27 caracteres morfológicos,
a partir de lo cual se generaron filogenias de datos combinados que vinculaban a K.
leucostomum como parte del grupo de Kinosternon scorpioides (Iverson, 1991),
llevando más tarde a una nueva organización sistemática de Kinosternidae (Iverson et
al., 2007). Posteriormente las relaciones filogenéticas de Kinosternidae fueron
reevaluadas mediante el análisis conjunto de secuencias de tres marcadores
mitocondriales (Citocromo B y los RNA ribosomales 12S y 16S) y tres genes nucleares
(C-mos, RAG1, y RAG2) de 25 especies. A partir de este análisis se elevaron las
subfamilias Staurotypinae y Kinosterninae al nivel de familia (Staurotypidae y
Kinosternidae, respectivamente) (Iverson et al., 2014). Staurotypinae contiene los
géneros Staurotypus y Claudius, mientras que Kinosternidae los géneros Sternotherus,
Kinosternon y Cryptochelys, siendo este último un género propuesto por Iverson et al.
(2013). No obstante, Spinks et al. (2014) arguyeron que dicho análisis estuvo sesgado
hacia la información proporcionada por el DNA mitocondrial más que el DNA nuclear, ya
que las filogenias basadas en genes nucleares presentaron un soporte débil de los
nodos y una baja resolución. En ese estudio (Spinks et al., 2014) se analizó un mayor
número de loci, y se incluyeron muestras de casi todas las especies de la superfamilia
Kinosternoidea, recobrando solo los géneros tradicionales, Kinosternon y Sternotherus,
y rechazando la monofilia de Cryptochelys (Spinks et al., 2014).
13
Actualmente se reconoce la superfamilia Kinosternoidea con 26 especies incluyendo la
familia monotípica Dermatemydidae y la familia Kinosternidae la cual contiene 18
especies de Kinosternon, cuatro especies de Sternotherus, dos especies de
Staurotypus, y el género monotípico Claudius (Van Dijk et al., 2014). En Colombia se
encuentran las especies K. dunni (Schmidt, 1947), K. scorpioides (Linnaeus, 1766) y K.
leucostomum (Duméril y Bibron, 1851 en Duméril y Duméril, 1851).
Fenotípicamente las tortugas de Kinosternidae son de tamaño medio, con una longitud
de caparazón entre 8 y 38 cm. Los machos exhiben colas más largas que las hembras,
con una uña en el extremo distal. El caparazón es angosto y usualmente presenta
forma de domo. Su coloración varía entre amarillo, café oliva, y negro (Berry, 1978;
Berry y Iverson, 2001; Giraldo et al., 2012). El plastrón presenta hasta 11 escamas
epidermales y posee una o dos bisagras transversales que permiten que el animal
oculte completamente la cabeza, la cola, y las extremidades dentro de la concha (Berry,
1978). Aunque de hábitos acuáticos, las tortugas de Kinosterninae se encuentran más
adaptadas para caminar en el fondo de los cuerpos de agua que para nadar. Debido al
hábito de permanecer en el fondo de los cuerpos de agua y frecuentemente enterradas,
se les conoce como tortugas del lodo. Estas poseen glándulas de almizcle bien
desarrolladas en la región axilar e inguinal que expelen un olor nauseabundo cuando el
animal se siente en peligro (Giraldo et al., 2012).
Si bien varios estudios han estudiado las relaciones filogenéticas de Kinosternidae, aún
hay carencias de resolución a nivel de varias subespecies que no se agrupan entre sí.
Por ejemplo, la subespecie K. scorpioides abaxilare se agrupa con K. oaxacae, en lugar
de agruparse con su subespecie hermana K. s. cruentatum (Fritz y Havaš, 2013). Así
mismo las subespecies K. subrubrum hipocrepis y K. s. steindachneri no son
monofiléticas y no se agrupan dentro del mismo clado (Iverson et al., 2013). El caso de
las 2 subespecies de Kinosternon leucostomum, K. l. leucostomum (subespecie del
norte porque habita desde México hasta Nicaragua) y K. l. postinguinale (subespecie
14
del sur porque habita desde Nicaragua hasta Perú), no ha sido evaluado a la fecha. En
las últimas reconstrucciones de la filogenia de Kinosternidae (Iverson et al., 2013; y
Spinks et al., 2014), K. leucostomum sólo fue representada por individuos de K. l.
leucostomum, dejando por fuera a K. l. postinguinale que habita en Colombia. Dadas la
inconsistencias en varias subespecies de esta familia, se hace necesario revisar las
relaciones filogenéticas a este nivel incluyendo muestras de todas las subespecies y
cubriendo el mayor rango de distribución posible.
En este estudio se evaluaron las relaciones filogenéticas de la subespecie colombiana,
Kinosternon leucostomum postinguinale, dentro de la familia Kinosternidae a partir de
genes mitocondriales y nucleares. Específicamente se evaluaron cuatro posibles
escenarios (Fig. 1): (1) K. l. postinguinale es polifilético, lo que quiere decir que los
especímenes de K. l postinguinale están dispersos dentro del clado de K. leucostomum,
y no soportaría su estatus de subespecie (2) K. l. postinguinale es un grupo monofilético
pero anidado dentro del clado de K. leucostomum, lo que sería consistente con la
existencia de subespecies dentro de K. leucostomum. (3) K. l. postinguinale es un grupo
parafilético con respecto al resto de la especie con el clado de K. l. leucostomum. Este
escenario, como el primer caso, no soportaría su estatus de subespecie (4) K. l.
postinguinale exhibe monofilia recíproca con respecto a K. l. leucostomum, lo que
sugeriría la existencia de K. l. postinguinale y K. l. leucostomum como clados
diferenciados.
2. Objetivos
2.1. Objetivo general
Analizar la relación filogenética de la tortuga tapaculo, Kinosternon leucostomum
postinguinale, a nivel intraespecífico e interespecífico en la familia Kinosternidae.
15
2.2. Objetivos específicos
Analizar la relación filogenética de K. leucostomum postinguinale, en relación a
su subespecie hermana K. leucostomum leucostomum.
Analizar la relación filogenética de K. leucostomum postinguinale con otras
especies de la familia Kinosternidae.
3. Hipótesis
Cuatro hipótesis son evaluadas (Fig. 1):
Hipótesis 1: K. l. postinguinale es polifilético, lo que quiere decir que los especímenes
de K. l postinguinale están dispersos dentro del clado de K. leucostomum.
Hipótesis 2: K. l. postinguinale es un grupo monofilético pero anidado dentro del
clado de K. l. leucostomum, lo que sería consistente con la existencia de subespecies
dentro de K. leucostomum.
Hipótesis 3: K. l. postinguinale es un grupo parafilético con respecto al resto de la
especie con el clado de K. l. leucostomum.
Hipótesis 4: K. l. postinguinale exhibe monofilia recíproca con respecto a K. l.
leucostomum, lo que sugeriría la existencia de K. l. postinguinale y K. l. leucostomum
como clados diferenciados.
4. Marco teórico
De las 327 especies de tortugas que existen en el mundo Colombia posee 27 especies
continentales y 7 especies marinas (Van Dijk et al., 2014). Desafortunadamente el
orden Testudines al que pertenecen las tortugas es uno de los grupos de vertebrados
16
más amenazados en el mundo y por tanto conocer su biología e historia evolutiva es
una prioridad para tomar acciones de conservación adecuadas. La superfamilia
Kinosternoidea, distribuida en el continente americano, se encuentra desde el sureste
de Canadá hasta Brasil y norte de Argentina (Páez et al., 2012). Esta superfamilia
contiene la familia monotípica Dermatemydidae y Kinosternidae, la cual contiene a su
vez 18 especies de Kinosternon, cuatro especies de Sternotherus, dos especies de
Staurotypus, y el género monotípico Claudius (Van Dijk et al., 2014). Del género
Kinosternon en Colombia se encuentran las especies K. dunni, K. scorpioides y K.
leucostomum.
La mayor parte del conocimiento sobre la especie K. leucostomum se basa en datos
obtenidos de K. l. leucostomum, por lo que existe un desconocimiento casi total de K. l.
postinguinale. Kinosternon leucostomum fue descrita inicialmente por Duméril (1851) a
partir de individuos del valle del río Magdalena y Santa Fé de Bogotá (Duméril, 1851). A
principios del siglo XX, Boulenger (1913) clasificó algunos individuos colectados en
Condoto (Chocó) como K. spurrelli (Boulenger, 1913). Luego, Berry (1978) consideró
que K. postinguinale era una subespecie de K. leucostomum y que K. spurrelli era
sinónimo de K. l. postinguinale (Giraldo et al., 2012). Posteriormente, a partir de un
análisis filogenético que incluía datos moleculares y morfológicos se determinó que K.
leucostomum y K. dunni eran especies hermanas (Iverson et al., 2007).
Recientemente, Iverson et al. (2013) presentaron una nueva filogenia apoyada en datos
moleculares donde los clados pertenecientes a la familia Kinosternidae se agrupan de
manera diferente a la propuesta por Iverson et al. (2007, Fig. 2), dando lugar a varios
cambios dentro de la filogenia. Primero se sugiere reconocer una nueva familia,
Staurotypidae, así como las subespecies K. scorpioides abaxilare y K. scorpioides
cruentatum (Fritz y Havaš, 2013). Por otro lado, en esta filogenia las subespecies K.
subrubrum hipocrepis y K. subrubrum steindachneri no comparten un ancestro común.
17
Finalmente, se sugiere un nuevo clado, Cryptochelys, en el cual Kinosternon
leucostomum se denomina Cryptochelys leucostoma (Iverson et al., 2013, Fig. 3).
Posteriormente Spinks et al. (2014) rechazan esta nueva clasificación y realizan un
estudio con una mayor cantidad de marcadores moleculares, pero nuevamente usa una
base de datos que no incluye todas las subespecies de Kinosternidae, por lo tanto aún
se desconoce la posición de los taxones habitantes en Colombia. Debido a la
discrepancia de los resultados de los análisis de las relaciones filogenéticas propuestas
para Kinosternidae, y a que ninguna de éstas ha incluido ejemplares de la subespecie
colombiana, el presente estudio reconstruye las relaciones filogenéticas de la
subespecie colombiana K. l. postinguinale dentro del género Kinosternon, y hace
comparaciones con otras subespecies y especies de la familia.
5. Métodos
5.1. Construcción de base de datos de secuencias mitocondriales y nucleares
Se compiló una base de datos de 20 genes candidatos de las especies de
Kinosternidae disponibles en GenBank. Del total de 93 individuos de dicha base de
datos, hay 68 muestras de nueve subespecies de Kinosternon, 13 muestras de dos
subespecies de Sternotherus, seis muestras de Staurotypus, y tres muestras de
Claudius. Como grupo externo se utilizó a Dermatemys mawii, especie única de la
familia Dermatemydidae (Anexos 1 y 2).
5.2. Captura y toma de muestras
Para obtener DNA de la subespecie colombiana K. l. postinguinale se usaron muestras
de sangre de 12 individuos de diferentes regiones de Colombia con el objeto de abarcar
la mayor variabilidad logísticamente posible de la siguiente manera. Tres individuos
fueron capturados con trampas artesanales en una población silvestre en el municipio
de San José del Nus, Antioquia (6º 29' 33" N, 74º 49' 59.9" W) (Ceballos et al., 2016).
18
Otros 3 individuos fueron muestreados en el Hogar de Paso de Corpourabá en Carepa,
Antioquia (07° 46´31" N, 76° 39´ 46.8" W), y otros 3 individuos de la colección de
animales de la Fundación Zoológica de Cali, Valle del Cauca (3° 26′ 55″ N, 76° 33′ 31″
O). A estos 9 individuos se les tomó una muestra de sangre mediante punción del seno
venoso occipital. Las muestras fueron preservaron en tubos con EDTA y mantenidas
refrigeradas hasta su llegada al Laboratorio de Genética Animal del Instituto de Biología
de la Universidad de Antioquia. Finalmente se recibieron muestras de sangre de 3
individuos silvestres provenientes de Guarinocito, Caldas (5° 22' 34,88'' N, 74° 47'
09,10'' W) donadas por el profesor Alan Giraldo de la Universidad del Valle (Tabla 1).
5.3. Metodología de laboratorio
Utilizando el kit MyTaq™Blood-PCR (Bioline, Londres, Reino Unido) y siguiendo las
instrucciones del fabricante se realizó la amplificación de ocho loci directamente de la
sangre, incluyendo tres genes mitocondriales: 12S, 16S, y Citocromo B (Iverson et
al.,2013; Palumbi et al.,1991) y cinco genes nucleares: el Factor Nuclear de Hepatocitos
(HNFL), el proteosoma subunidad 26S (NB17367), el gen “High movility group box"
(HMGB2- NB17483), el metiltransferasa (guanina-7) RNA (NB22519), y el gen “Paired
box” (PAX). Estos genes fueron seleccionados por presentar mayores valores de
porcentaje de variación, diversidad nucleotídica, y diversidad haplotípica entre todos los
todos los genes evaluados en los anteriores estudios (tres genes mitocondriales: 12S,
16S, CytB y 17 genes nucleares: cmos, RAG1, RAG2, AHR, AIING, BDNF, BMP2,
NB17483, HNFL, NB17367, NB22519, PAX, R35, RAG, TB01, TB29, ZFHX1B, Iverson
et al., 2013; Spinks et al., 2014). Los valores de diversidad mencionados anteriormente
fueron estimados mediante el software DnaSP 5.10.1 (Tabla 2) (Librado y Rozas, 2009),
y el alineamiento y análisis de las secuencias se hizo mediante el software MEGA 5
(Kumar et al., 2008).
19
Las condiciones de PCR para los genes mitocondriales fueron 94 ºC por tres minutos,
95 °C por 15 segundos, entre 50 y 68 °C (dependiendo del Tm de los primers) por 45
segundos, 72 °C por 45 segundos por 34 ciclos, y un paso final a 72 °C por 10 minutos.
Las condiciones para los genes nucleares fueron 94 ºC por tres minutos, 95 °C por 30
segundos, entre 50 y 68 °C (dependiendo del Tm de los primers) por 45 segundos, 72
°C por 45 segundos por 34 ciclos, y un paso final a 72 °C por cinco minutos. Las
secuencias de ambas hebras de cada locus amplificado se obtuvieron mediante
secuenciación tradicional tipo Sanger (Sanger, 1977) contratada con el laboratorio
comercial MACROGEN (Seúl, Corea del Sur). Las secuencias se alinearon por medio
del software Geneious V. 6 y se editaron manualmente antes de obtener las secuencias
consenso (Kearse et al., 2012).
5.4. Análisis filogenético
Se determinó el mejor modelo de evolución para cada gen independientemente, así
como para la primera, segunda, y tercera posición de codones de regiones codificantes
mediante el software JMODELTEST V. 2.1.1. (Darriba et al., 2012), utilizando el criterio
de información de Akaike (AIC). Los genes fueron analizados de manera independiente,
así como también secuencias concatenadas de mitocondria (1919 pb, n=50) y núcleo
(3576 pb, n=61) por medio de inferencia bayesiana (IB) usando el software MrBayes V.
3.1.2 (Ronquist et al., 2012). La probabilidad posterior bayesiana fue calculada usando
el algoritmo MCMC (Markov Chain Monte Carlo) para lo que se realizó una búsqueda
independiente para cada una de las bases de datos anteriormente mencionados. Cada
búsqueda consistió en una cadena fría y seis cadenas calientes. Todas las bases de
datos fueron analizadas incluyendo 50 millones de generaciones y los árboles fueron
muestreados cada 1,000 generaciones. La confluencia de los datos generados por el
análisis bayesiano se verificó usando TRACER V.1.4 (Rambaut y Drummond, 2007).
Los primeros 5.000 árboles fueron descartados como “burn-in” (10% del total de las
generaciones) para realizar la aproximación de la probabilidad posterior. Los resultados
20
fueron resumidos usando TREEANNOTATOR V. 1.8.2 (Drummond y Rambaut, 2007) y
visualizados usando FIGTREE V.1.4.2 (Rambaut, 2009).
5.5. Estimación de distancias genéticas
Las distancias entre los genes nucleares y los genes mitocondriales de especies y
subespecies hermanas fueron calculadas con el fin de determinar si son iguales o
diferentes (mayores o menores) a las distancias entre las dos subespecies de K.
leucostomum. Las distancias genéticas entre especies fueron determinadas para cada
gen mediante el software MEGA V. 5.0 (Tamura et al., 2011). En este análisis se utilizó
el modelo de Kimura dos parámetros (Kimura, 1980), el cual distingue entre transiciones
(purina a purina o pirimidina a pirimidina) y transversiones (purina a pirimidina y
viceversa). Así mismo, se asumió que las tasas evolutivas entre los sitios se modelan
mediante la distribución Gamma (Yang, 2006), el cual no incorpora los sitios invariables.
De acuerdo a esta distribución la tasa de sustitución a menudo varía de un sitio a otro
dentro de una secuencia (Nei y kumar, 2000).
6. Resultados
6.1. Análisis filogenético
Las filogenias de genes individuales (Anexos 4 - 11) fueron variables, tanto en la
topología como en el soporte de las ramas. Las filogenias obtenidas para los genes
CytB, PAX, y 16S presentaron la mejor resolución a nivel de especies, y valores de
probabilidad posterior (PP) correspondientes a PP ≤80%, PP≤70%, y PP≤50%
respectivamente, los cuales son consistentes con los análisis preliminares de porcentaje
de variación, diversidad nucleotídica, y diversidad theta. Sin embargo, el soporte de las
ramas fue menor que las filogenias de genes concatenados. En las filogenias estimadas
a partir de los genes HNFL y NB17367 se recuperan clados correspondientes a
21
Kinosternon, Sternotherus, Staurotypus y Claudius con un alto soporte de las ramas
(PP≤90%), pero los nodos internos en estos clados presentan un valor de soporte bajo
(PP≥50%). La filogenia del gen NB22519 presenta un soporte de rama alto (PP=100%)
para el clado Staurotipinae, mientras que el clado de Sternotherus se resuelve como
parafilético (PP>50%). La filogenia obtenida a partir de los análisis del gen 12S agrupa
las especies de Sternotherus como polifilético, es decir, se encuentran dispersas dentro
de los diferentes clados recuperados, y adicionalmente los nodos internos presentan
soporte de las ramas bajos (PP>50%). La filogenia obtenida a partir de los análisis del
gen NB17483 presenta un nivel de soporte de las ramas bajo (PP>50%) y una
distribución de las especies en el árbol, que revela información filogenética inadecuada.
por lo que no fue tenido en cuenta en los análisis.
En la filogenia de genes mitocondriales concatenados (1919 pb, Fig. 4) se recuperó un
clado monofilético consistente con el clado descrito por Iverson et al. (2013) como
Cryptochelys (PP=100%), y dos géneros parafiléticos correspondientes a Sternotherus
y Kinosternon (PP=80%). En cuanto a las relaciones al interior de “Cryptochelys”, se
recuperaron tres clados, un clado monofilético conformado por las especies K. acutum,
K. creaseri y K. herrerai y dos grupos parafiléticos. De estos, el primero está
conformado por K. leucostomum y el segundo por Kinosternon angustipons y
Kinosternon dunni, con un soporte PP ≥ 80%. Estos resultados concuerdan con el
escenario donde K. l. postinguinale es parafilético respecto al clado de K. l.
leucostomum
Por otro lado, la filogenia de genes nucleares concatenados (3576 pb, Fig. 5) se
recuperaron dos géneros Sternotherus y Kinosternon (PP=100%). En cuanto a las
relaciones filogenéticas al interior de Kinosternon se recuperó un clado monofilético
conformado por K. subrubrum, K. bauri, K. flavescens, K. arizonense y K. durangoense
(PP=99%) y dos clados parafiléticos. De estos, el primero está conformado por K.
22
leucostomum y K. dunni, y el segundo está conformado por los géneros restantes
(PP=100%). Las dos subfamilias ya reconocidas Staurotypinae y Kinosterninae fueron
recuperadas como monofiléticas en ambos análisis (PP=100%). Estos resultados
concuerdan con el escenario donde K. l. postinguinale exhibe monofilia recíproca con
respecto a K. l. leucostomum
6.2. Distancias genéticas
Las distancias entre especies hermanas a partir de genes nucleares variaron entre 0 -
0,0032, siendo esta última la distancia obtenida entre los genes NB17367 de
Sternotherus depressus y Sthernotherus minor. El gen NB17483 presenta el mayor
valor de distancia entre K. l. leucostomum y K. l. postinguinale (0,007), seguido por PAX
(0,005), el gen que menor valor de distancia genética presenta para este par de
especies es el gen HNFL (0,000). Según los resultados de los análisis de distancias
genéticas de los genes nucleares K. l. leucostomum y K. l. postinguinale podrían ser
clasificadas como especies diferentes (Fig. 6). Por otro lado, las distancias entre los
genes mitocondriales fueron hasta 20 veces mayor que las distancias entre los genes
nucleares. Por ejemplo, las distancias de CytB entre los pares de especies analizados
variaron entre 0,001 - 0,066, y las distancias entre 12S variaron entre 0 - 0,016 y para
16S variaron entre y 0 - 0,023 (Fig. 7). Las distancias de los genes 12S, 16S y CytB
entre K. l. leucostomum y K. l. postinguinale fueron de 0,002, 0, y 0,001
respectivamente. Los valores de distancia genética entre K. l. leucostomum y K. l.
postinguinale son menores que los obtenidos para el resto de parejas evaluadas, Según
estos resultados se podría afirmar que K. l. leucostomum y K. l. postinguinale son
subespecies.
23
7. Discusión
En este trabajo se evaluaron las relaciones filogenéticas de esta familia a nivel
intraespecífico (K. leucostomum) e interespecífico. A nivel intraespecífico, la filogenia de
genes mitocondriales concatenados presenta una topología consistente con el
escenario donde K. l. postinguinale es parafilético respecto al clado de K. l.
leucostomum, es decir, no es consistente con la clasificación de subespecie. Los
análisis de distancia genética de los genes mitocondriales entre K. l. leucostomum y K.
l. postinguinale son menores que el resto de las distancias estimadas para los otros
pares de especies, esto correspondería con la clasificación de subespecie. Por su parte
la filogenia de genes nucleares concatenados es consistente con el escenario donde K.
l. postinguinale exhibe monofilia recíproca con respecto a K. l. leucostomum. A
diferencia de la primera, esta segunda hipótesis sugiere que K. l. postinguinale es un
taxón que podría ser una especie distinta de K. l. leucostomum. Los análisis de
distancia genética de los genes nucleares entre K. l. leucostomum y K. l. postinguinale
soportan los hallazgos de los análisis filogenéticos, es decir K. l. leucostomum y K. l.
postinguinale podrían ser clasificas como especies diferentes.
Las filogenias obtenidas evidencian un conflicto entre las historias estimadas a partir de
los datos nucleares y mitocondriales. Esta situación se debe probablemente a las
diferencias en el medio de transmisión del ADN mitocondrial y el nuclear. El ADN
nuclear se hereda de ambos progenitores y pasa por el proceso de recombinación,
mientras que el ADN mitocondrial es de herencia materna y la carece de recombinación
(Moritz et al., 1987). Debido a esto puede no obtenerse la misma topología en algunos
casos (Melnick y Hoelzer, 1993). En general las diferencias en las filogenias han sido
atribuidas a diferentes mecanismos incluyendo baja tasa de mutación de las secuencias
de ADN nuclear, separación incompleta de linajes, introgresión, hibridación, y selección
24
natural (Avise et al., 1987; Sanderson y Shaffer, 2002; Funk y Omland, 2003; Ballard y
Whitlock, 2004).
Vargas-Ramírez et al. (2013) reportan conflicto en los análisis filogenéticos realizados a
partir de datos nucleares y mitocondriales en tortugas Rhinoclemmys. Ellos sugieren
que las diferencias en los resultados se deben a flujo genético pasado entre especies
distribuidas alopátrica y parapátricamente, es decir, una hibridación pasada entre
especies diferentes de la misma familia. Así mismo, Spinks y Shaffer (2009) analizaron
la filogenia de tortugas de la familia Emydidae y encontraron incongruencias nucleares
y mitocondriales que atribuyeron a una introgresión relativamente antigua. Estos
mismos autores reportan en un estudio realizado para la familia de tortugas
Geoemydidae que algunas inconsistencias en los resultados fueron generadas por una
introgresión mitocondrial debido a la utilización de individuos en cautiverio (Spinks y
Shaffer, 2007).
A nivel interespecífico los resultados obtenidos soportan la monofilia de los clados
anteriormente reconocidos en Kinosternidae: (Staurotypus, Claudius) y (Sternotherus,
Kinosternon). La filogenia de los genes mitocondriales evaluados apoya la monofilia de
Kinosternon (Cryptochelys) propuesta por Iverson et al. (2013), pero la filogenia de los
genes nucleares rechaza la monofilia de dicho clado como fue sugerido por Spinks et
al. (2014). Es importante señalar que los resultados de Spinks et al. (2014) no son
necesariamente contradictorios de los resultados de Iverson et al. (2013), en cambio
sería más útil una reconciliación planteando hipótesis biológicas que los explique.
Comparando las filogenias obtenidas a partir de los datos nucleares y mitocondriales se
puede observar que aunque no se obtiene las mismas relaciones filogenéticas, en
genera las especies se agrupan de acuerdo a su distribución geográfica en el
25
continente americano (norte, centro y sur américa). Las discordancias a nivel
interespecífico se pueden atribuir a los mismos mecanismos ya mencionados. En este
caso discriminar entre separación incompleta del linaje e hibridación como causas de
conflictos en las reconstrucciones filogenéticas, puede ser particularmente retador y
requiere de análisis de múltiples marcadores nucleares y mitocondriales (Spinks y
Shaffer, 2009).
Los procesos de separación incompleta de linajes o la introgresión por hibridación,
puede reflejarse en la señal detectada con cada marcador (Brower et al., 1996).En este
caso cada marcador puede estar captando un proceso diferente, la suma de todos
reconstruye parcialmente la realidad histórica de los clados. Por esta razón la historia
evolutiva puede no ser revelada de forma completa cuando se hacen inferencias
filogenéticas basadas en un solo tipo de marcador. Las discordancias entre las
filogenias obtenidas a partir de datos de ADN mitocondrial y ADN nuclear se atribuyen a
diferencias significativas entre estos dos tipos de marcadores. Generalmente el ADN
mitocondrial de vertebrados evoluciona a una tasa bastante elevada en comparación
con el ADN nuclear (Brown et al., 1979). Aunque en tortugas se reporta una tasa más
lenta de evolución molecular del ADN mitocondrial que en la mayoría de otros taxones
(Weisrock y Janzen, 2000). Por otra parte el ADN nuclear contienen regiones
codificantes (exones) o no codificantes (intrones o regiones intergénicas) a diferencia
del ADN mitocondrial de los vertebrados que carece de regiones no codificantes
(Carranza, 2002).
En cuanto a los resultados obtenidos a partir de los análisis de distancia genética inter e
intraespecifica, es importante tener en cuenta que en general se considera que
relativamente pocos cambios en los genes pueden tener como consecuencia
diferencias importantes entre las especies (Jenkins y Sánchez 1982). En este sentido,
los valores de distancia genética entre las mismas especies pueden variar dependiendo
26
del gen que se analice. De acuerdo con las relaciones filogenéticas entre K. l.
leucostomum y K. l. postinguinale y la distancia genética entre las mismas, se puede
sugerir una reciente divergencia, es decir, las diferencias observadas en las filogenias
obtenidas a partir de datos nucleares y mitocondriales se deben a la separación
incompleta de linajes.
En general al comparar filogenias basadas en genes individuales con filogenias
basadas en datos genéticos concatenados, los valores tanto la resolución como del
soporte aumentan considerablemente con el uso de secuencias concatenadas, lo que
sugiere una sinergia positiva (Vargas-Ramírez et al., 2013). En consecuencia, el uso
exclusivo de ADN mitocondrial es inadecuado para análisis filogenéticos, especialmente
en presencia de escenarios evolutivos complejos, incluyendo introgresión, hibridación, y
o selección (Chan y Levin, 2005). Por lo general, los conflictos entre las filogenias
obtenidas a partir de ADN nuclear y ADN mitocondrial pueden estar relacionados con
la cantidad total de diferenciación o en la forma en los marcadores reconstruyen las
relaciones entre los grupos. Por lo tanto es necesario evaluar las genealogías de
múltiples genes con historias evolutivas potencialmente diferentes (Chang et al., 2007).
En los últimos años, el análisis combinado de ADN mitocondrial y ADN nuclear ha sido
utilizado con éxito para inferir las relaciones entre las poblaciones en muchos estudios
(Arnaud-Haond et al., 2003).
8. Conclusiones
A nivel intraespecífico, la filogenia de genes mitocondriales concatenados presenta una
topología consistente con la hipótesis donde K. l. postinguinale es parafilético respecto
al clado de K. l. leucostomum, es decir, no es consistente con la clasificación de
27
subespecie. Mientras que la filogenia de genes nucleares concatenados es consistente
con el escenario donde K. l. postinguinale exhibe monofilia recíproca con respecto a K.
l. leucostomum. Esta hipótesis sugiere que K. l. postinguinale es un taxón que podría
ser una especie distinta de K. l. leucostomum. A partir de los patrones observados se
concluye que en este caso las diferencias se deben probablemente a la separación
incompleta de linajes.
Los análisis de distancia de los genes mitocondriales entre K. l. leucostomum y K. l.
postinguinale son menores (0,001 – 0,003) que el resto de las distancias estimadas
para los otros pares de especies (0,00 – 0,066), lo que es consistente con la
clasificación de subespecie. Mientras que los análisis de distancia de los genes
nucleares entre K. l. leucostomum y K. l. postinguinale varían entre 0,000 y 0,007, y la
distancia entre los otros pares de especies varían entre 0,001 y 0,032, lo que sugiere
que podrían ser una especie distinta. Los análisis de distancias genéticas son una
herramienta para corroborar los resultados obtenidos a partir de los análisis
filogenéticos, pero no es correcto tomar decisiones taxonómicas a partir de estos sin
conocer la variabilidad genética específica para la especie estudiada. Basados en esta
información se recomienda utilizar varios marcadores independientes, la mayor cantidad
de marcadores informativos posible, y un muestreo geográfico más amplio que incluya
zonas de contacto o traslape de la distribución de las subespecies (Van Dijk et al.,
2014).
28
9. Referencias
Arnaud Haond S, Bonhomme F, Blanc F. Large discrepancies in differentiation of
allozymes, nuclear and mitochondrial DNA loci in recently founded Pacific
populations of the pearl oyster Pinctada margaritifera. J Evol Biol.
2003;16(3):388-398. Doi:http://dx.doi.org/10.1046/j.1420-9101.2003.00549.x
Avise JC, Arnold J, Ball RM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE. et al. Intraspecific
phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and
systematics. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst.1987: (18)489-522.
Backström N, Fagerberg S, Ellegren H. Genomics of natural bird populations: a
gene‐ based set of reference markers evenly spread across the avian genome.
Mol Ecol. 2007;17(4):964-980. Doi:http://dx.doi.org/ 10.1111/j.1365-
294X.2007.03551.x
Barley AJ, Spinks PQ, Thomson RC, Shaffer HB. Fourteen nuclear genes provide
phylogenetic resolution for difficult nodes in the turtle tree of life. Mol Phylogenet
Evol. 2010;55(3):1189-1194. Doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ympev.2009.11.005.
Berry JF. Variation and systematics in the Kinosternon scorpioides and K. leucostomum
complexes (Reptilia: Testudines: Kinosternidae) of Mexico and Central America.
1978. (Tesis de Doctorado). Universidad de Utah, SaltLake City, USA. 326 pp
Berry JF, Iverson JB. Kinosternon leucostomum. Cat Am Amphib Rept. 2001;724:1-11.
Boulenger GA. On a collection of batrachians and reptiles made by Dr. HGF Spurrell,
FZS, in the Choco, Colombia. In Proceedings of the Zoological Society of
London. Blackwell Publishing Ltd. 1913:83(4):1019-1038).
Brower AVZ, DeSalle R, Vogler A. Gene trees, species trees, and systematics: a
cladistic perspective. Annual Review of Ecology and Systematics.1996: 27:423-
29
450.Brown, W. M., George, M., Wilson, AC. Rapid evolution of animal
mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci. 1979;76(4):1967-1971.
Doi:http://dx.doi.org/10.1073/pnas. 76.4.1967
Brito PH, Edwards SV. Multilocus phylogeography and phylogenetics using sequence-
based markers. Genet. 2009;135(3):439-455. Doi:http://dx.doi.org/10.1007
/s10709-008-9293-3
Cann RL, Stoneking M, Wilson AC. Mitochondrial DNA and human origins. Nature.
1987;325:31-36.
Carranza S. Los métodos moleculares en el estudio de la sistemática y filogenia de los
Anfibios y Reptiles ibéricos. En: Atlas y Libro Rojo de los Anfibios y Reptiles de
España (Pleguezuelos JM, Márquez M. Lizana, eds.). Dirección General de
Conservación de la Naturaleza-Asociación Herpetológica Española.
Madrid:.2002:(2)550-579.
Chan KM, Levin SA. Leaky prezygotic isolation and porous genomes: rapid
introgression of maternally inherited DNA. Evolution. 2005:59(4), 720-729.
Doi:http://dx.doi.org/10.1554/04-534.
Chang J, Song D, Zhou K. Incongruous nuclear and mitochondrial phylogeographic
patterns in two sympatric lineages of the wolf spider Pardosa astrigera (Araneae:
Lycosidae) from China. Mol Phylogenet Evol. 2007;42(1):104-121. Doi:http://
dx.doi.org/10.1016/j.ympev.2006.06.013
Ceballos CP, Iverson JB. Patterns of sexual size dimorphism in Chelonia: revisiting
Kinosternidae. Biological Journal of the Linnean Society. 2014:111(4):806-809.
Doi:http:// dx.doi.org/10.1111/bij.12273
Ceballos CP, Zapata D, Alvarado C, Rincón E. Morphology, Diet, and Population
Structure of the Southern White-lipped Mud Turtle Kinosternon leucostomum
30
postinguinale (Testudines: Kinosternidae) in the Nus River Drainage, Colombia.
2016. Journal of Herpetology In-Press.
Darriba D, Taboada GL, Doallo R, Posada D. jModelTest 2: more models, new
heuristics and parallel computing. Nat Methods. 2012;9(8):772-772.
Doi:http://dx.doi.org/ 10.1038/nmeth.2109
Doyle JJ. Trees within trees: genes and species, molecules and morphology. Systematic
Biology. 1997:46(3): 537-553. Doi: http://dx.doi.org/ 10.1093/sysbio/46.3.537
Drummond AJ, Ho SY, Phillips MJ, Rambaut A. Relaxed phylogenetics and dating with
confidence. PLoS Biol. (2006:4(5):88. Doi: http://dx.doi.org/10.1371/
journal.pbio.0040088
Drummond AJ, Rambaut A. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees.
BMC Evol Biol. 2007;7(1):214. Doi: http://dx.doi.org/10.1186/1471-2148-7-214
Duméril AMC, Bibron G. en Duméril AMC, Duméril AHA. Catalogue méthodique de la
collection des reptiles du Muséum d'Histoire de Paris. Paris Gide et Baudry. 1851
Fritz UWE, Havaš P. Order Testudines: 2013 update. In: Zhang, Z.-Q.(Ed.) Animal
Biodiversity: An Outline of Higher-level Classification and Survey of Taxonomic
Richness (Addenda 2013). Zootaxa, 2013;3703(1):12-14. Doi: http://dx.doi.org/
10.11646/zootaxa.3703.1.4
Funk DJ, Omland KE. Species-level paraphyly and polyphyly: frequency, causes, and
consequences, with insights from animal mitochondrial DNA. Annu. Rev. Ecol.
Evol. Syst., Evolution, and Systematics, 2003:(34)397-423.
Giraldo AMF, Garcés-Restrepo MF, Carr JL. Kinosternon leucostomum. 2012.332–339
en. Páez-Nieto VP, Morales-Betacourt MA, Lasso CA, Castaño-Mora OV, Bock
B. editor(s). Biología y Conservación de las Tortugas Continentales de Colombia.
31
Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt
(IAvH), Colombia. 2012. p. 332-339.
Hutchison JH, Knell MJ, Brinkman DB. Turtles from the Kaiparowits Formation, In. Titus
AL, Loewen MA. editor(s). At the top of the grand staircase: the Late Cretaceous
of southern. Utah. Indiana University Press, Bloomington; 2013. p. 295-318.
Iverson JB. Phylogenetic hypotheses for the evolution of modern kinosternine turtles.
Herpetol Monogr. 1991;5(17)1-27. Doi: http://dx.doi.org/10.2307/1466974
Iverson JB, Brown RM, Akre TS, Near TJ, Le M, Thomson RC, Starkey DE. In search of
the tree of life for turtles. In: Shaffer HB, FitzSimmons NN, Georges A, Rhodin
AGJ, editor(s). Defining Turtle Diversity: Proceedings of a Workshop on Genetics,
Ethics, and Taxonomy of Freshwater Turtles and Tortoises. Chelonian Research
Monographs. 2007. p. 85-106.
Iverson JB, Le M, Ingram C. Molecular phylogenetics of the mud and musk turtle family
Kinosternidae. Mol Phylogenet Evol, 2013;69(3):929-939. Doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.ympev.2013.06.011
Kearse M, Moir R, Wilson A, Stones-Havas S, Cheung M, Sturrock S, et al. Geneious
Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the
organization and analysis of sequence data. Bioinformatics, 2012;28(12):1647-
1649. Doi: http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/bts199
Kimball RT, Braun EL, Barker FK, Bowie RC, Braun MJ, Chojnowski JL, et al. A well-
tested set of primers to amplify regions spread across the avian genome. Mol
Phylogenet Evol, 2009;50(3):654-660. Doi: http://dx.doi.org/:10.1016/j.ympev.
2008.11.018
32
Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions
through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol.
1980;16(2):111-120. Doi: http://dx.doi.org/:10.1007/BF01731581
Kimura M. The neutral theory of molecular evolution. Cambridge University Press.
1984:369
Kumar S, Nei M, Dudley J, Tamura K. MEGA: A biologist-centric software for
evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Brief Bioinform.
2008;9(4):299-306. Doi: http://dx.doi.org/:10.1093/bib/bbn017
Librado P, Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA
polymorphism data. Bioinformatics, 2009;25(11):1451-1452. Doi:
http://dx.doi.org/: 10.1093/bioinformatics/btp187
Linnaeus C. Systema naturae perregna tria naturae, secundum classes, ordines,
genera, species cum characteribus, differentiis, synomnymis, locis. L. Salvius,
Stockholm, Suecia. 1766;1(12):532.
Melnick DJ, Hoelzer GA. Differences in male and female macaque dispersal lead to
contrasting distributions of nuclear and mitochondrial DNA variation. Int J Primatol
1992;13(4):379-393. Doi: http://dx.doi.org/:10.1007/BF02547824
Melnick DJ, Hoelzer GA, Absher R, Ashley MV. mtDNA diversity in rhesus monkeys
reveals overestimates of divergence time and paraphyly with neighboring
species. Mol Biol Evol. 1993;10(2):282-295.
Moritz C, Dowling TE, Brown WM. Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for
population biology and systematics. Annu Rev Ecol Syst. 1987;18: 269-292.
Nei M. Phylogenetic analysis in molecular evolutionary genetics. Annu. Rev.
Gene. 1996:30(1), 371-403.
33
Nei M, Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics. Oxford university press. 2000.
P 352.
Patterson C, Williams DM, Humpries CJ. Congruence between molecular and
morphological phylogenies. Annu Rev Ecol Syst, 1993:24:153-188.
Páez VP, Morales-Betancourt MA, Lasso CA, Castaño-Mora OV, Bock BC. V Biología y
conservación de las tortugas continentales de Colombia. Serie Editorial Recursos
Hidrobiológicos y Pesqueros Continentales de Colombia. Instituto de
Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt (IAvH). Bogotá,
Colombia, 2012. p 528.
Palumbi SR, Martin A, Romano S, Mc-Millan WO, Stice L, Grabawski G. The simple
fool’s guide to PCR, version 2.0. Privately published document compiled by S.
Palumbi. Departamet of Zoology. University of Hawaii, Honolulu. 1991. p. 45
Primmer CR, Borge T, Lindell J, Sætre GP. Single‐ nucleotide polymorphism
characterization in species with limited available sequence information: high
nucleotide diversity revealed in the avian genome. Mol Ecol. 2002;11(3): 603-612.
Doi: http://dx.doi.org/:10.1046/j.0962-1083.2001.01452.x
Rambaut A. FigTree v 1. 3.1: Tree figure drawing tool. 2009. Available in :
http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/.
Rambaut A, Drummond AJ. Tracer v1. 4. 2007. In http://beast.bio.ed.ac.uk/ Tracer.
Rambaut A, Drummond AJ. TreeAnnotator v. 1.6.1. 2010. Available in http://beast.bio.
ed.ac. uk.
Relethford JH. Genetic drift can obscure population history: problem and solution. Hum
Biol. 1996;68(1):29-44.
34
Ronquist F, Teslenko M, van der Mark, Ayres DL, Darling A, Höhna S, et al. MrBayes
3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large
model space. Syst Biol. 2012;61(3):539-542. Doi: http://dx.doi.org/:10.1093/sysb
io/sys029
Roos C, Zinner D, Kubatko LS, Schwarz C, Yang M, Meyer D et al. Nuclear versus
mitochondrial DNA: evidence for hybridization in colobine monkeys. BMC Evol.
Biol.2011:11(1), 77.
Sanderson MJ, Donoghue MJ. Patterns of variation in levels of homoplasy. Evolution.
1989:43(8):1781-1795.
Sanderson MJ, Shaffer HB. Troubleshooting molecular phylogenetic analyses. Annu.
Rev. Ecol. Evol. Syst. 2002: (33)49-72.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proceedings of the National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-5467.
Schmidt KP. A new kinosternid turtle from Colombia. Chicago Nat. Hist. Museum.
Fieldiana. Zool. 1947;31(13):109-112.
Seidel ME, Iverson JB, Adkins MD. Biochemical comparisons and phylogenetic
relationships in the family Kinosternidae (Testudines). Copeia, 1986;2:285-294.
Doi: http://dx.doi.org/:10.2307/1444989.
Seielstad MT, Minch E, Cavalli-Sforza LL. Genetic evidence for a higher female
migration rate in humans. Nature genetics. 1998:20(3), 278-280.
Spinks PQ, Shaffer HB. Conservation phylogenetics of the Asian box turtles
(Geoemydidae, Cuora): mitochondrial introgression, numts, and inferences from
multiple nuclear loci. Conserv Genet. 2007:8(3), 641-657.
35
Spinks PQ, Shaffer HB. Conflicting mitochondrial and nuclear phylogenies for the widely
disjunct Emys (Testudines: Emydidae) species complex, and what they tell us
about biogeography and hybridization. Syst. Biol. 2009:58(1), 1-20.
Spinks PQ, Thomson RC, Gidiş M, Shaffer HB. Multilocus phylogeny of the New-World
mud turtles (Kinosternidae) supports the traditional classification of the group. Mol
Phylogenet Evol. 2014; 76:254-260. Doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.ympev.2014.
03 .025
Tajima F. Evolutionary relationship of DNA sequences in finite populations. Genetics.
1983; 105(2):437-460.
Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA
polymorphism. Genetics. 1989;123(3):585-595.
Tajima F. The amount of DNA polymorphism maintained in a finite population when the
neutral mutation rate varies among sites. Genetics. 1996;143(3):1457-1465.
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 2003;30:2725–2729. Doi:
http://dx.doi.org/10.1093/molbev/mst197
Toews DP, Brelsford A. The biogeography of mitochondrial and nuclear discordance in
animals. Molecular Ecology. 2012;21(16):3907-3930. Doi:
http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-294X.2012.05664.x
Vargas-Ramirez M, Carr JL, Fritz U. Complex phylogeography in Rhinoclemmys
melanosterna: conflicting mitochondrial and nuclear evidence suggests past
hybridization (Testudines: Geoemydidae). Zootaxa.2013:3670(2), 238-254.
36
Van Dijk PP, Iverson JB, Rhodin AGJ, Shaffer HB, Bour R. Turtles of the world:
annotated checklist of taxonomy, synonymy, distribution with maps, and
conservation status. Chelon Res Monogr. 2014;5(7):329-479.
Vogt RC. New methods for trapping aquatic turtles. Copeia. 1980;(2):368-371. Doi:
http://dx.doi.org/ 10.2307/1444023.
Weisrock DW, Janzen FJ. Comparative molecular phylogeography of North American
softshell turtles (Apalone): implications for regional and wide-scale historical
evolutionary forces. Mol. Phylogenet. Evol. 2000:14(1), 152-164.
Yang Z. Computational molecular evolution. Oxford: Oxford University Press. 2006. p.1-
4.
Yu Y, Harris A, He XJ. A rough guide to RASP 2.1 (Beta). University of Sao Paulo, Brazil
2013. p. 1-25.
37
10. Tablas
Tabla 1. Resumen de muestras de tejidos de K. l postinguinale colectadas o recibidas
como donación para este estudio. NA = Desconocido
ID Departamento Municipio Coordenadas sitio
de colecta
Fecha colecta
o donación Observaciones
Nus 025 Antioquia San Roque 6º 29' 33" N/ 74º 49'
59.9"W
14/04/2014 Silvestre
Nus 070 Antioquia San Roque 6º 28' 53.3" N/ 74º
50' 16.2"W 14/04/2014 Silvestre
Nus 062 Antioquia San Roque 6º 29' 20.6" N/ 74º
50' 32.5"W 16/04/2014 Silvestre
Tule 001 Antioquia Carepa 07° 46´31" N/ 76°
39´46.8" W 27/09/2014 Hogar de Paso
Tule 002 Antioquia Carepa 07° 46´31" N/ 76°
39´46.8" W 27/09/2014 Hogar de Paso
Tule 003 Antioquia Carepa 07° 46´31" N/ 76°
39´46.8" W 27/09/2014 Hogar de Paso
Zoo 001 Valle del Cauca NA NA 08/11/2014 Cautiverio
Zoo 002 Valle del Cauca NA NA 08/11/2014 Cautiverio
Zoo 003 Valle del Cauca NA NA 08/11/2014 Cautiverio
Gua 095 Caldas Guarinocito 5°22'34,88'' N/
74°47'09,10'' W 26/06/2014 Silvestre
Gua 098 Caldas Guarinocito 5°21'53,65''N/
74°47'48,21'' W 26/06/2014 Silvestre
Gua 096 Caldas Guarinocito 5°22'34,88''N/
74°47'09,10''W 27/06/2014 Silvestre
38
Tabla 2. Valores de porcentaje de variación, diversidad nucleotídica, y diversidad
hapotípica de los genes seleccionados para este estudio
Locus S h Hd Pi
12S 52 28 0.952 0,025
16S 129 34 0,971 0,059
CytB 191 36 0,976 0,105
HNFL 71 22 0,914 0,027
NB17367 87 16 0,865 0,020
NB17483 73 25 0,932 0,031
NB22519 80 19 0,915 0,016
PAX 120 17 0,861 0,032
(S) Número de sitios variables, (h) Numero de haplotipos; (Hd) Diversidad haplotípica;
(Pi) Diversidad nucleotídica.
39
11. Figuras
Figura 1. Hipótesis evaluadas en este estudio respecto a las relaciones filogenéticas.
Las ramas en color rojo representan individuos de K. l. postinguinale (Klp), mientras que
las negras representan individuos de K. l. leucostomum (Kll).
40
Figura 2. Relaciones filogenéticas para la familia Kinosternidae (Iverson et al., 2007).
41
Figura 3. Filogenia de las familias Kinosternidae y Staurotypidae sugeridas
recientemente por Iverson et al. (2013). Figura tomada de (Ceballos y Iverson, 2014).
42
Figura 4. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir de los genes
mitocondriales concatenados consistente con el escenario 3 (Figura 1). Los valores en
los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota
las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
43
Figura 5. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir de los genes nucleares
concatenados consistente con un escenario 4 (Figura 1). Los valores en los nodos
corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las
secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio
44
Figura 6. Distancias entre especies hermanas a partir de genes nucleares (Spinks et al.,
2014)
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035
Kinosternon acutum - Kinosternon creaseri
Kinosternon baurii - Kinosternon subrubrum
Kinosternon integrum - Kinosternon oaxacae
Staurotypus salvinii - Staurotypus triporcatus
Kinosternon chimalhuaca - Kinosternon hirtipes
Kinosternon arizonense - Kinosternon durangoense
K. l. leucostomum - K. l. postinguinale
Sternotherus depressus - Sternotherus minor
K. l. leucostomun - Kinosternon dunni
Sternotherus carinatus - Sternotherus odoratus
HNFL NB22519 NB17367 NB17483 PAX
45
Figura 7. Distancias entre especies hermanas a partir de genes mitocondriales (Iverson
et al., 2013).
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080
K. l. leucostomum - K. l. Postinguinale
Sternotherus m. peltifer - Sternotherus depressus
Kinostrenon creaseri - Kinosternon acutum
Kinosternon s. albogulare - Kinosternon integrum
Staurotypus triporcatus - Staurotypus salvinii
Kinosternon flavescens - Kinosternon s. hippocrepis
Kinosternon chimalhuaca - Kinosternon hirtipes
Kinosternon oaxacae - Kinosternon s. abaxillare
Kinosternon baurii - Kinosternon s. steindachneri
Kinosternon angustipons - Kinosternon dunni
Kinosternon arizonense - Kinosternon durangoense
12S 16S Cytb
46
12. Anexos
Anexo 1.Información de las secuencias de genes nucleares (Spinks et al., 2014) tomadas del GenBank usadas en este estudio.
Taxón Numero de Catálogo Identificación
Número de acceso del Genbank genes nucleares usados en este estudio
País
NB17483 HNFL NB17367 NB22519 PAX
Claudius angustatus HBS121589 HBS121589 KJ582702 KJ582749 KJ582833 KJ582788 KJ582876 USA
Claudius angustatus JAC18575/ UTA R
43959 JAC18575 KJ582703 KJ582750 KJ582834 KJ582789 KJ582877 Guatemala
Dermatemys mawii HBS116865 HBS116865 KJ582700 KJ582747 KJ582831 KJ582786 KJ582874
Dermatemys mawii HBS116867 HBS116867 KJ582701 KJ582748 KJ582832 KJ582787 KJ582875
Kinosternon acutum HBS117455 HBS117455 KJ582704 KJ582751 KJ582835 KJ582790 KJ582878 Guatemala
Kinosternon arizonense CAS228101 CAS228101 KJ582706 KJ582753 KJ582837 KJ582792 − USA
Kinosternon arizonense CAS228102 GU085592 GU085609 GU085642 GU085625 − USA
Kinosternon baurii HBS108574 KJ582707 KJ582754 − KJ582793 − USA
Kinosternon baurii HBS108576 KJ582708 KJ582755 − KJ582794 − USA
Kinosternon chimalhuaca HBS120895 HBS120895 KJ582709 KJ582756 KJ582838 KJ582795 KJ582880 México
Kinosternon creaseri K35 K35 KJ582710 KJ582757 KJ582839 KJ582796 KJ582881 México
Kinosternon creaseri K36 K36 KJ582711 KJ582758 KJ582840 KJ582797 KJ582882 México
Kinosternon dunni K38 K38 KJ582713 KJ582759 KJ582842 KJ582799 KJ582884 Colombia
Kinosternon dunni MF24134 MF24134 KJ582712 − KJ582841 KJ582798 KJ582883 Colombia
Kinosternon durangoense UF108889 UF108889 KJ582714 KJ582760 KJ582843 KJ582800 − México
Kinosternon durangoense UF157325 UF157325 KJ582715 KJ582761 KJ582844 KJ582801 − México
47
Kinosternon flavencens HBS107613 HBS107613 KJ582716 − KJ582845 KJ582802 − USA
Kinosternon flavencens HBS107614 HBS107614 KJ582717 KJ582762 KJ582846 KJ582803 − USA
Kinosternon herrerai AMNH118236 AMNH118236 KJ582718 KJ582763 KJ582847 KJ582804 KJ582885 México
Kinosternon herrerai MVUZ0455 MVUZ0455 KJ582719 KJ582764 KJ582848 KJ582805 KJ582886 México
Kinosternon hirtipes 5L5L2R 5L5L2R KJ582720 KJ582765 KJ582849 − KJ582887 USA
Kinosternon hirtipes 8L8L2R 8L8L2R KJ582721 KJ582766 KJ582850 − KJ582888 USA
Kinosternon hirtipes UFMF24331 UFMF24331 KJ582722 − KJ582851 KJ582806 KJ582889 México
Kinosternon integrum JAC21644 JAC21644 KJ582723 KJ582767 KJ582852 KJ582807 KJ582890 México
Kinosternon leucostomum USNM559573 USNM559573 KJ582724 KJ582768 KJ582853 KJ582808 KJ582891 Honduras
Kinosternon leucostomum USNM559575 USNM559575 KJ582725 KJ582769 KJ582854 KJ582809 KJ582892 Honduras
Kinosternon oaxacae HBS120899 HBS120899 KJ582726 − KJ582855 KJ582810 KJ582893
Kinosternon oaxacae HBS123635 HBS123635 KJ582727 − KJ582856 KJ582811 KJ582894
Kinosternon scorpioides JAC21033/UTA R
50302 JAC21033 KJ582705 KJ582752 KJ582836 KJ582791 KJ582879 Guatemala
Kinosternon scorpioides USNM559581 USNM559581 KJ582728 KJ582770 KJ582857 KJ582812 KJ582895 Honduras
Kinosternon scorpioides UTAR55533 UTAR55533 KJ582729 − KJ582858 KJ582813 KJ582896 Venezuela
Kinosternon scorpioides
cruentatum HBS119039 HBS119039 KJ582730 KJ582771 KJ582859 KJ582814 KJ582897 México
Kinosternon scorpioides
cruentatum HBS119040 HBS119040 KJ582731 KJ582772 KJ582860 KJ582815 KJ582898 México
Kinosternon sonoriense HBS119037 HBS119037 KJ582732 KJ582773 KJ582861 KJ582816 KJ582899 USA
Kinosternon sonoriense HBS119038 HBS119038 KJ582733 KJ582774 KJ582862 KJ582817 KJ582900 USA
Kinosternon subrubrum HBS119499 KJ582735 − − KJ582819 KJ582901 USA
Kinosternon subrubrum HBS35366 KJ582734 KJ582775 − KJ582818 − USA
Staurotypus salvinii HBS108669 HBS108669 KJ582743 KJ582782 KJ582870 KJ582827 KJ582909
Staurotypus salvinii HBS117456 HBS117456 KJ582744 KJ582783 KJ582871 KJ582828 KJ582910 Guatemala
48
Staurotypus triporcatus HBS117468 HBS117468 KJ582745 KJ582784 KJ582872 KJ582829 KJ582911 Guatemala
Staurotypus triporcatus HBS117914 HBS117914 KJ582746 KJ582785 KJ582873 KJ582830 KJ582912
Sternotherus carinatus RCT21 RCT21 KJ582736 KJ582776 KJ582863 KJ582820 KJ582902 USA
Sternotherus carinatus RCT222 RCT222 KJ582737 KJ582777 KJ582864 KJ582821 KJ582903 USA
Sternotherus depressus HBS116244 HBS116244 KJ582738 KJ582778 KJ582865 KJ582822 KJ582904 USA
Sternotherus depressus HBS116246 HBS116246 KJ582739 − KJ582866 KJ582823 KJ582905 USA
Sternotherus minor RCT60 RCT60 KJ582741 KJ582780 KJ582868 KJ582825 KJ582907 USA
Sternotherus minor minor RCT53 RCT53 KJ582740 KJ582779 KJ582867 KJ582824 KJ582906 USA
Sternotherus odoratus CAS214343 GU085601 GU085615 GU085651 GU085633 GU085667 USA
Sternotherus odoratus HBS23287 HBS23287 KJ582742 KJ582781 KJ582869 KJ582826 KJ582908 USA
49
Anexo 2.Información de las secuencias de genes mitocondriales (Iverson et al., 2013) tomadas del GenBank usadas en este estudio.
Taxón Numero de
Catálogo Identificación
Número de acceso del GenBank genes
Mitocondriales usados en este estudio País
Cyt B 12S 16S
Dermatemys mawii DZ M162 KF301357 KF301254 KF301322 Desconocido
Claudius angustatus WPM K12 KF301358 KF301255 KF301323 México
Staurotypus salvinii WPM K32 KF301359 KF301256 KF301324 México
Staurotypus triporcatus JBI K45 KF301360 KF301257 KF301325 México
Sternotherus carinatus JBI K1 "E" KF301361 KF301258 KF301326 USA
Sternotherus depressus WPM M125 KF301362 KF301259 KF301327 USA
S. minor minor UF 80827 "DD" K11 KF301363 KF301260 KF301328 USA
S. minor peltifer KM K13 KF301364 KF301261 KF301329 USA
Sternotherus odoratus UTA R54409 K78 KF301365 KF301262 KF301330 USA
Kinosternon acutum PVS K33 KF301366 KF301263 KF301331 México
Kinosternon acutum PVS K34 KF301367 KF301264 KF301332 "Belice"
Kinosternon alamosae UF 99877-78 "J" KF301368 KF301265 KF301333 México
Kinosternon angustipons UU 3766 -- KF301369 − KF301334 Costa Rica
Kinosternon arizonense TCWC 72419 "N" KF301370 KF301266 KF301335 USA
Kinosternon baurii MAE "K" K8 KF301371 KF301267 KF301336 USA
Kinosternon chimalhuaca JRV -- KF301372 KF301268 KF301337 México
Kinosternon creaseri JBI/PVS K35 KF301373 KF301269 KF301338 México
Kinosternon dunni FM/OVC K38 KF301374 KF301270 KF301339 Colombia
Kinosternon durangoense UF 157325 "CC" K9 KF301375 KF301271 KF301340 México
Kinosternon flavescens CJF K81 KF301376 KF301272 KF301341 USA
Kinosternon herrerai
UTA-JAC
22435 K93 KF301377 KF301273 KF301342 México
Kinosternon herrerai MVUZ 0455 K110 KF301378 KF301274 KF301343 México
Kinosternon hirtipes UF 40410 K111 KF301379 KF301275 KF301344 México
Kinosternon integrum JRV K46 KF301380 KF301276 KF301345 México
Kinosternon integrum UTA R51954 K86 KF301381 KF301277 KF301346 México
Kinosternon integrum UTA R52531 K92 KF301382 KF301278 KF301347 México
K. l. leucostomum
UTA-JAC
22365 K64 KF301383 KF301279 KF301348 Guatemala
Kinosternon oaxacae JRV skin KF301384 KF301280 KF301349 México
K. scorpioides abaxillare UTA R52532 K95 KF301385 KF301281 KF301350 México
K. s. albogulare SDNHM (REL K16 KF301386 KF301282 KF301351 Honduras
50
041)
K. s. cruentatum UTA R50302 K70 KF301387 KF301283 KF301352 Guatemala
K. s. scorpioides TSBA K100 KF301388 KF301284 KF301353 Venezuela
Kinosternon s. sonoriense JEL K116 KF301389 KF301285 KF301354 USA
K. subrubrum hippocrepis UTA-CJF 4122 K74 KF301390 KF301286 KF301355 USA
K. subrubrum
steindachneri UF 84961 K118 KF301391 KF301287 KF301356 USA
51
Anexo 3.Primers de los genes nucleares (Spinks et al., 2014) y los genes mitocondriales (Iverson et al., 2013) usados en este estudio.
Primer Secuencia 5' - 3' Referencia
L1091.1 (12S) CAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT Kocher et al.,(1989)
H1478.1 (12S) GAGGGTGACGGGCGGTGTGT Kocher et al.,(1989)
AR.1 (16S) CGACTGTTTACCAAAAACAT Palumbi et al.,(1991)
BR (16S) CCGGTCTGAACTCAGATCACGT Palumbi et al.,(1991)
GLUDGE.1(CytB) CTCGAAAAACCACCGTTG Palumbi et al.,(1991)
Cytbpri3 (CytB) CTYAATTCAAATACYGATAAAATCCC Spinks et al.,(2004)
CytbJSr (CytB) CCTGTTGGGTTGTTTGATCC Spinks et al.,(2004)
THR-8.1 (CytB) GGTTTACAAGGCCAATGCTT Spinks et al.,(2004)
HNFLF GCAGCCCTCTACACCTGGTA Primmer et al.,(2002)
HNFLR CAATATCCCCTGACCAGCAT Primmer et al.,(2002)
NB17367F GGAGTCCTGATGGATGACAC Backström et al.,(2008)
NB17367R GGTGGCTTTATACCCATCTC Backström et al.,(2008)
NB17483F GAAATGTGGTCTGARCAGTC Barley et al.,(2010)
NB17483R GGCRCGRTATGCWGCAATATC Barley et al.,(2010)
NB22519F TTTGAGACATATGAGCAGGC Backström et al.,(2008)
NB22519R TGTTTCTGAAGCTTCAAGTC Backström et al.,(2008)
PAXF CCCTCAGACACTGGATTAYGAATCAT Kimball et al.,(2009)
PAXR TGTTTCTGAAGCTTCAAGTC Kimball et al.,(2009)
52
Anexo 4. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen mitocondrial 12S. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
53
Anexo 5. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen mitocondrial 16S. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
54
Anexo 6. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen mitocondrial CytB. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
55
Anexo 7. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear HNFL. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
56
Anexo 8. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear NB17367. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
57
Anexo 9. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear NB17483. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
58
Anexo 10. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear NB22519. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
59
Anexo 11. Árbol filogenético de Kinosternidae recuperado a partir del gen nuclear PAX. Los valores en los nodos corresponden a la probabilidad posterior, y el color rojo de las ramas denota las secuencias de K. leucostomum postinguinale usadas en este estudio.
60
Anexo 12. Reglamento de la Revista Acta Biológica Colombiana.
61
62
63
64
65
66
67
