Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de San Martín Instituto de Cultivos Tropicales

Caracterización morfológica de hongos endófitos asociados a cacaonativo y su capacidad antagónica para el control de Moniliophthora

perniciosa

G. Rodriguez¹٭, E.J. Flores¹, B. Leon², E. Arévalo²

¹Universidad Nacional de San Martín – Laboratorio de Sanidad Vegetal - Tarapoto – Perú²Instituto de Cultivos Tropicales – Laboratorio de Fitopatología – Tarapoto – Perú

Octubre de 2011

Abstract

This research was conducted with the objective of characterizing morphologically the endophytic fungiassociated with native cocoa to assess their antagonistic ability to control Moniliophthora perniciosa. It wasdeveloped in the laboratory of Plant Pathology of Instituto de Cultivos Tropicales(ICT), located in the districtof Banda Shilicayo, province and department of San Martin. For the morphological characterization was used68 isolates of endophytic fungi from Alto Amazonas. Variables and categories were employed to determine thegenetic distance with 185 markers, which was calculated using the DICE coefficient (Dice, 1945). Clusteranalysis was done using the algorithm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Arithmetic Average usingn)using the Darwin program (Dissimilarity Analysis and Representation for Windows). To evaluate theantagonistic capacity of fungal endophytes, were carried out test for antibiosis and mycoparasitism through theproduction of soluble inhibitory metabolites and method of precolonizada plate respectively, for both tests was

used the Completely Randomized Design (CRD). The cluster analysis was able to form eight big groups A, B,C, D, E, F, G and H corresponding to the genera of Trichoderma (T-E), Clonostachys (Cl-E), Botryosphaeria(Bo-E ) Xylaria (X-E), Pestalotiopsis (P-E), Acremonium (Acr-E), Fusarium (F-E) and Colletotrichum (Coll-E),respectively, and these at the same time are subdivided into 20 morphotypes (A1, A2, A3 , A4, B1, B2, B3, C1,C2, C3, D1, E1, F1, G1, G2, G3, G4, H1, H2 and H3). Likewise, the analysis of dispersion, was able to formfour groups far between. The Trichoderma and Clonostachys genera showed a close approach; betweenColletotrichum and Fusarium, and Botryosphaeria, Pestalotiopsis, Xylaria showed a slightly approach .However, the Acremonium genus was the most distant of the other genera. The isolation TE-17 proved to be apotential biocontrol in vitro, was able to inhibit (100%) the mycelial growth of M. perniciosa, followed byisolation Bo-E-107 that inhibited 45.2% compared of isolates Cl-E-61, Cl-E-119 and Coll-E-33 that had noeffect on mycelial inhibition. Likewise, TE-17 proved to be the only aggressive mycoparasite (100%colonization), compared to other isolates of endophyte fungi that had no effect on mycoparasitism of M.perniciosa.

Key Word: Endophytic fungi, Theobrama cacao, Morphological characterization, Antibiosis andmycoparasitism.

Resumen

El presente trabajo de investigación se realizó con el objetivo de caracterizar morfológicamente los hongosendófitos asociados a cacao nativo para evaluar su capacidad antagónica para el control de Moniliophthoraperniciosa. Se desarrolló en el Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Cultivos Tropicales (ICT), ubicadoen el distrito de la Banda de Shilicayo, provincia y departamento de San Martín. Para la caracterizaciónmorfológica se utilizó 68 aislamientos de hongos endófitos procedentes del Alto Amazonas. Se empleovariables y categorías, para determinar la distancia genética con 185 marcadores, la cual fue calculada con elcoeficiente de DICE (Dice, 1945). El análisis de agrupamiento se realizó mediante el algoritmo UPGMA(Unweighted Pair-Group Method usingn arithmetic Average) utilizando el Programa DARwin (DissimilarityAnalysis and Representation for Windows). Para evaluar la capacidad antagónica de los hongos endófitos, serealizaron pruebas de antibiosis y micoparasitismo mediante la producción de metabolitos inhibitorios solublesy el método de placa precolonizada respectivamente, para ambas pruebas se utilizó el Diseño Completamente alAzar (DCA). Con el análisis de agrupamiento, se logró formar ocho grandes grupos A, B, C, D, E, F, G y H quecorresponden a los géneros: Trichoderma (T-E), Clonostachys (Cl-E), Botryosphaeria (Bo-E), Xylaria (X-E),Pestalotiopsis (P-E), Acremonium (Acr-E), Fusarium (F-E) y Colletotrichum (Coll-E); respectivamente, y estosa su vez se subdividen en 20 morfotipos, (A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3, C1, C2, C3, D1, E1, F1, G1, G2, G3,G4, H1, H2, y H3). Así mismo, en el análisis de dispersión, se logro formar cuatro grupos distantes entre sí. Losgéneros Trichoderma y Clonostachys, muestran un estrecho acercamiento y ligero acercamiento entre losgéneros Colletotrichum y Fusarium, y Botryosphaeria, Xylaria y Pestalotiopsis; sin embargo, el géneroAcremonium se encuentra muy distante a los demás géneros. El aislamiento T-E-17, resultó ser un potencialbiocontrolador in vitro, logró inhibir (100%) el crecimiento micelial de M. perniciosa, seguido del aislamientoBo-E-107 que inhibió el 45,2 % a comparación de los aislamientos Cl-E-61, Cl-E- 119 y Coll-E-33 no tuvieronefecto en la inhibición micelial. Así mismo, T-E-17 resulto ser el único micoparásito más agresivo (100% decolonización), a comparación de los demás aislamientos de hongos endófitos que no tuvieron efecto enmicoparasitar a M. perniciosa.

Palabras claves: Hongos endófitos, Theobroma cacao, caracterización morfológica, Antibiosis ymicoparasitismo.

1. INTRODUCCIÓN.

El cacao es un cultivo de gran relevanciaeconómica, social, y ambiental, constituyéndose enuna especie primordial del sistema agroforestal; sinembargo, existen varios factores que afectan lacalidad y producción de los granos de cacao, siendolas enfermedades las principales limitantes, entreestas se encuentra la escoba de bruja causado por elhongo Moniliophthora perniciosa, que secaracteriza por causar daños a los frutos, cojinesflorales, hojas y brotes, llegando a causar pérdidasde hasta 90% en la producción (Evans, 1981).

El control fitosanitario, químico, genético ybiológico son estrategias principales para el manejode la enfermedad. Sin embargo, la remociónmecánica de todos los tejidos infectados antes delcomienzo de las lluvias son prácticas muy tediosasy costosas, y el control químico con protectantes yfungicidas sistémicos no es una práctica rutinaria enla producción de cacao debido a los altos costos yriesgos asociados con la contaminación de losgranos de cacao y el medio ambiente. Existennuevos estudios sobre el control biológico, dondeindican que las plantas de cacao presentan unacompleja comunidad microbiana de endófitos queprometen ser candidatos para el biocontrol deenfermedades del cacao (Bailey, 2008; Meinhardtet al., 2008; Andebran et al., 1994).

Varios estudios de hongos endófitos y epifitosasociados con cacao se han realizado; sin embargosolo una pequeña parte de la diversidad microbialasociado con cacao han sido descritos y ofrecen sercandidatos únicos para el biocontrol de lasenfermedades del cacao (Bailey, 2008)

Los hongos endófitos son organismos queviven en asociación simbiótica con las plantas en lamayor parte o en todo su ciclo de vida, seencuentran en los espacios intercelulares y, algunasveces, intracelularmente en las hojas y los tallos demuchas plantas, son asintomáticos; en algunoscasos, los hongos endófitos confieren beneficios ala planta que pueden resultar mutuos; utilizan losnutrientes que sintetiza la planta y ésta se beneficiade los metabolitos bioactivos que ellos producen(Salgado y Caridad, 2005).

Actualmente el Instituto de Cultivos Tropicales(ICT) cuenta con 1600 aislamientos de hongosendófitos, provenientes del Alto Amazonas, estoshongos fueron aislados a partir de tallos y hojas decacao nativo durante los años 2008 y 2009. Debido

a la importancia que tienen estos hongos endófitossobre las plantas que los hospedan se caracterizómorfológicamente, y se evaluó su capacidadantagónica contra el fitopatógeno Moniliophthoraperniciosa causante de la enfermedad escoba debruja en cacao.

2. MATERIALES Y MÉTODOS.

2.1. Ubicación del ensayo

El presente trabajo de investigación se desarrollóen el Laboratorio de Fitopatología del Instituto deCultivos Tropicales (ICT), ubicado en el distrito dela Banda de Shilicayo, provincia y departamento deSan Martín; que se encuentra a una Latitud Sur 06°00' 28", Latitud Oeste 76° 00' 18" y a una Altitudde 315 msnm (Fig. 1).

2.2. Origen de los hongos endófitos

Durante el año 2008 y 2009, el Instituto deCultivos Tropicales, realizó dos expediciones por elAlto Amazonas, con la finalidad de colectar hongosendófitos (H-E) a partir de hojas y tallos de plantasde cacao nativo provenientes de 12 localidades:Aypena, Charupa, Chambira, Ungumayo,Urituyacu, Pastaza, Ungurahui, Nucuray, Morona,Santiago, Napo, Tigre (Fig. 2 y Anexo 1). Estosfueron aislados insitu a partir de secciones de hojas(1 cm²) y trozos de tallo (1 cm de largo) en mediosde cultivo papa sacarosa agar (PSA), y fueronenviados al Laboratorio de Fitopatología para supurificación hasta obtener un cultivo axénico. Estoscultivos fueron conservados en eppendorconteniendo glicerina al 20 % a - 20 °C, en laMicoteca del Laboratorio de Fitopatología - ICT.

2.3. Reactivación y siembra de hongos endófitosasociados a cacao nativo

Para este estudio se reactivaron un total de 68aislamientos de hongos endófitos (H-E),perteneciente a ocho géneros; siendo, onceaislamientos de Fusarium (F-E), nueve dePestalotiopsis (P-E), once de Clonostachys (Cl-E),doce de Trichoderma (T-E), once de Colletotrichum(Coll-E), ocho de Botryosphaeria (Bo-E), tres deAcremonium (Acr-E), y tres de Xylaria (X-E),(Anexo 1). Estos aislamientos fueron sembrados en

medio de cultivo PSA e incubados a temperaturaambiente (25 °C).

Para la caracterización morfológica y cultural delos H-E, se utilizó un cultivo joven de cadaaislamiento, del cual se obtuvo discos de medio conmicelio (0,3 cm), y se sembró en el centro de lasplacas petri (90x15mm) conteniendo medio PSA,estas se incubaron a 25 °C hasta la colonización delárea total de la placa. Por cada aislamiento, serealizaron tres repeticiones. A su vez se sembraronen otros medios de cultivos, para el caso deFusarium endófito, se preparó Banana Leaf Agar(BLA), con la finalidad de producir estructurasvegetativas y reproductivas (esporodoquios, macroy microconidias); Trichoderma endófito se sembróen medio Extracto de Malta Agar (EMA), paraevaluar coloración de colonia; Botryosphaeria sesembró en medio PSA, con 0,5 % de sacarosa, paraestimular la formación de cuerpos estromáticos ypicnidias.

Figura 1. Laboratorio de Fitopatología ubicada en la estaciónexperimental “Juan Bernito” – ICT.

Figura 2. Mapa de ubicación de las localidades y cuencastributarias del Amazonas.

2.4. Caracterización morfológica de hongosendófitos.

Para la caracterización morfológica de hongosendófitos se utilizó un total de 185 marcadores(Anexo 2), que representan las variables ycategorías de evaluación como característicasmicroscópicas y macroscópicas descritas en lasclaves taxonómicas de Barron (1968), Booth(1971), Pitt (1985), Bacon y Hill (1985), Barnett yHunter (1987), Klich y Pitt (1988), Koneman(1989), Hanlim (1990), Cotes (1993), Seifert(2001), Tsuneo Watanabe (2002), Leslie ySummerell (2005). A partir de cultivos axénicos opuros se caracterizaron macroscópicamente el colordel anverso y reverso, textura, forma y elevación dela colonia, y otras estructuras vegetativas yreproductivas. Para determinar el color de lascolonias se utilizó la guía Munsell Soil Color Chart(U.S. Soil Conservation Service, 2000) y MontanaColors (Clot del Tufau, 08295 Sant Vivenc deCastellet.). Así mismo, se evaluó la tasa decrecimiento micelial de las colonias cada 24 horas,hasta que la placa este colonizada completamente.

2.5. Evaluación de la capacidad antagónica dehongos endófitos hacia Moniliophthora perniciosa.

De acuerdo a los morfotipos formados en lacaracterización morfológica de los H-E, seseleccionaron un total de 14 aislamientospertenecientes a ocho géneros de H-E (Cuadro 1),para la evaluación de la capacidad antagónica dehongos endófitos hacia Moniliophthora perniciosa

mediante las pruebas de antibiosis ymicoparasitismo.

Cuadro 1. Aislamientos de hongos endófitos para las pruebasde antagonismo.

N°

AislamGénero

Código

AislamientoProcedencia Órgano

1 Acremonium Acr-E-4 Urituyacu Tallo

2Botryosphaeria Bo-E-93 Santiago Hoja

3 Botryosphaeria Bo-E-107 Santiago Hoja

4Clonostachys Cl-E-61 Ungurahui Tallo

5 Clonostachys Cl-E-119 Morona Tallo

6 Colletotrichum Coll-E-33 Pastaza Tallo

7Colletotrichum Coll-E-52 Santiago Hoja

8 Fusarium F-E-85 Urituyacu Tallo

9Fusarium F-E-190 Napo Hoja

10 Pestalotiopsis P-E-71 Charupa Hoja

11Pestalotiopsis P-E-168 Urituyacu Tallo

12 Trichoderma T-E-17 Pastaza Tallo

13Trichoderma T-E-136 Santiago Tallo

14 Xylaria X-E-76 Santiago Tallo

2.5.1. Antibiosis

Para esta prueba se produjo metabolitos solublesinhibitorios de los aislamientos de H-Eseleccionados. Estos se sembraron en placas petriconteniendo PSA e incubados a 25 ºC durante unasemana, para promover la esporulación. Lasconidias se colectaron de estas placas, agregandoagua destilada estéril sobre la superficie del cultivoy con una varilla de vidrio estéril se realizó elraspado, para obtener una suspensión de esporas.

Para la uniformización del inóculo se utilizó unhematocímetro y se obtuvo una concentración de 1x 106 conidias ml-1. Por cada aislamiento, se utilizótres matraces conteniendo 50 ml de medio MIN(caldo mínimo en sales) y 50 µl de asparagine, seadicionó 500 µl de suspensión de conidias a cadamatraz, estos fueron incubados a 25 ºC por 7 días enagitación a 110 rpm. Posteriormente, el micelio fue

removido por filtración con la ayuda de un trozo dealgodón estéril y el filtrado estéril se centrifugó por20 minutos a 1200 rpm, luego se colocó en BañoMaría a 90ºC por 2 horas, posteriormente se extrajo15 ml del filtrado y se adicionó un volumen igual dePSA con 3 % de agar y se vertió en placas petri (50x 15 mm).

En el centro de las placas se colocó un disco (3mm de diámetro) de medio con el micelio delpatógeno M. perniciosa de una edad decrecimiento de siete días, se trabajó con tresrepeticiones por filtrado y las placas se incubaron a25 ºC. Para los controles se preparó solo con elfiltrado del correspondiente caldo sin el H-E(Anexo 20). La inhibición del crecimiento micelialde M. perniciosa se registró como la diferenciaentre la media del crecimiento radial en la presenciay ausencia del filtrado fungal.

2.5.2. Micoparasitismo

Se utilizó el método de placa pre-colonizado(utilizado por Bailey et al., 2008), de cada uno delos aislamientos, se extrajo un trozo de 2,5 x 0,5 cmde inóculo de una colonia joven esporulada dehongo endófito, se localizó en una placa (90 x15mm) conteniendo medio PSA pre-colonizada por elpatógeno M. perniciosa.

Se realizó tres réplicas por cada aislamiento deH-E. Al cabo de dos semanas de incubación a 25 ºCen oscuridad, con la ayuda de un sacabocado de5mm de diámetro se removió un total de 10muestras de cada réplica cerca al punto de inóculodel patógeno, y estos se localizaron en medio PSA eincubados a 25 ºC en oscuridad y se evaluó a lossiete días el crecimiento del hongo endófito o delpatógeno.

2.6. Parámetros de evaluación

2.6.1. Caracterización morfológica

Para la caracterización de cada aislamiento seutilizó variables y categorías, como característicasmicroscópicas (estructuras vegetativas,propagativas y de conservación) y macroscópicas(color, forma, aspecto de la colonia). La tasa decrecimiento, se obtuvo a través de la mediaaritmética del crecimiento micelial por día,expresada en centímetros; las medicionesmicroscópicas se realizaron utilizando el

micrómetro ocular, cuyos datos promedios semultiplicaron por el factor de conversión obtenidosen la calibración del microscopio, según objetivoocular empleado; para 10X (100,00 µ.), 40X (25,56µ.), y 100X (9,98 µ); expresados en micras.

2.6.2. Inhibición micelial del patógeno

Se tomaron mediciones del crecimiento micelialdel patógeno en el momento que el control hayasido colonizado por completo. El porcentaje deinhibición fue determinado por el promedio de ladiferencia de la media del control (ỹ control) conla media del biocontrolador (ỹ del biocontrolador)con respecto al control (ỹ control).

% de inhib. = (ỹ control – ỹ del biocontrolador) X100

ỹ control

2.6.3. Colonización de los hongos endófitos sobreel patógeno

Con la ayuda del estereomicroscopio, sedeterminó el crecimiento del patógeno o del hongoendófito de los discos extraídos de placascolonizadas por ambos hongos, de los cuales secontabilizó 30 discos por aislamiento querepresentan el 100 %; de esto se obtuvo elporcentaje de micoparasitismo de acorde con elparámetro de evaluación: Micoparasitó (+), sicreció solo el hongo endófito, y micoparasitó (-), sicreció el patógeno o ambos.

2.7. Análisis estadístico de los datos

El análisis de la caracterización morfológica fuecalculada con el coeficiente de DICE (Dice, 1945).Con las matrices generadas se realizó un análisis deagrupamiento mediante el algoritmo UPGMA(Unweighted Pair-Group Method usingn ArithmeticAverage) con el programa DARwin (DissimilarityAnalysis and Representation for Windows) CurrentReleased Version: 5.0.158 (2009-07-06), en base a185 marcadores. Para el uso del programa, lasvariables y categorías evaluadas fuerontransformadas a datos binarios (0 y 1),considerándose “1” como símbolo afirmativo o decorrespondencia y “0” como símbolo denegatividad o de no correspondencia.

Para las pruebas antagónicas de hongos endófitos(Antibiosis y Micoparasitismo) para el control deM. perniciosa, se utilizó un Diseño Completamenteal Azar (DCA); para lo cual se seleccionaron dosaislamientos de cada género a excepción de losgéneros Xylaria y Acremonium que se seleccionósolo un aislamiento, que representan a lostratamientos y cada uno de ellos con tresrepeticiones. Los datos obtenidos de las pruebas deantibiosis y micoparasitismo (% de inhibiciónmicelial y % de colonización), y la tasa decrecimiento, se analizaron utilizando el programaInfoStat/Profesional versión 1.1, para determinar elanálisis de varianza (ANVA), y diferencias demedias con la prueba de Duncan con un nivel designificancia de 0,01 para la tasa de crecimiento y0,05 para la prueba de antibiosis y micoparasitismo.Los datos expresados en porcentaje fuerontransformados a arcoseno de la raíz cuadrada de laproporción del porcentaje de inhibición,multiplicada por 180 /π.

3. RESULTADOS

3.1. Caracterización morfológica de hongosendófitos y su respectivo agrupamiento

La figura 3, nos muestra ocho grandes grupos A,B, C, D, E, F, G, H; que corresponden a losgéneros de Trichoderma, Clonostachys,Botryosphaeria, Xylaria, Pestalotiopsis,Acremonium, Fusarium y Colletotrichum;respectivamente, y estos a su vez se subdividen en20 morfotipos, (A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3, C1,C2, C3, D1, E1, F1, G1, G2, G3, G4, H1, H2, yH3), agrupados mediante el algoritmo UPGMA conel programa DARwin de acuerdo al coeficienteDICE según características morfológicaspresentados por los aislamientos. En la figura 4, semuestra el diagrama de dispersión de aislamientosde hongos endófitos en la cual se detalla elacercamiento y distanciamiento de los géneros, selogro formar cuatro grupos distantes entre sí. Elprimer grupo formado por los géneros Trichodermay Clonostachys, con un acercamiento estrecho entresí; del mismo modo el género Colletotrichumpresenta una ligera cercanía al género Fusariumformando el segundo grupo; el tercer grupoformado por los géneros Botryosphaeria, Xylaria yPestalotiopsis; el cuarto grupo formado por elgénero Acremonium, quien se encuentra muydistante a los otros géneros.

Figura 3. Agrupamiento de hongos endófitos mediante el programa de DARwin; donde se muestra a los géneros con sus respectivosmorfotipos: (A:Trichoderma, con cuatro morfotipos A1, A2, A3 y A4); (B: Clonostachys, con tres morfotipos B1, B2 y B3); (C:Botryosphaeria, con tres morfotipos C1, C2, y C3); (D: Xylaria, con un solo morfotipo D1); (E: Pestalotiopsis, con un solo morfotipoE1); (F: Acremonium, con un solo morfotipo F1); (G: Fusarium, con cuatro morfotipos G1, G2, G3 y G4); y (H: Colletotrichum, con tresmorfotipos H1, H2, y H3).

Figura 4. Diagrama de dispersión de aislamientos de hongos endófitos. A(Trichoderma), B(Clonostachys), C(Botryosphaeria),D(Xylaria), E(Pestalotiopsis), F(Acremonium), G(Fusarium), y H(Colletotrichum). El acercamiento o el distanciamiento entre géneros,se debe a las similitudes o discrepancias de las características que posee cada género.

3.1.1. Trichoderma

a) Morfotipo A1

Comprendido por los aislamientos: T-E-33, 83,50, 5, 166, 126, 179, 17 y 66, cuya tasa decrecimiento fue de 1,55-2,32 cm. Coloración de lacolonia en el anverso a las 72 h fue RV60, aexcepción de los aislamientos T-E-17 y T-E-126 decolor RV130 y R6018 respectivamente. Losaislamientos T-E-17, 66 y 126, presentaron texturaalgodonosa, y textura vellosa los demásaislamientos; con presencia de dos anillosconcéntricos de color verde y pústulas formadas enmedio PSA. Conidióforo hialino, recto yramificado. Masas de esporas apicales en fiálidesverticiladas. Fiálides cortos y gruesos. Conidiafialospora hialina y ovada. Clamidospora terminal eintercalar subglobosa, con excepción de T-E-17, 50y 66, quienes no presentaron esta estructura (Fig.5).

Dimensiones: Pústula 0,395-1,175 mm dediámetro, fiálides 5,65-8,5 µm X 1,95-2,4 µm,conidia 2,75-3,9 X 2,05-3 µm; clamidospora 5-7,5µm de diámetro.

Figura 5. Características morfológicas del morfotipo A1. A.Anverso y B. Reverso de la colonia (T-E-33) en medio EMA,C. Colonia con anillos concéntricos en medio PSA, D. Pústulas(T-E-5), E. Clamidospora (T-E-5), F. Conidias (T-E-17), G-H.Conidióforo conteniendo a las fiálides, masas de esporas yconidias (T-E-17).

b) Morfotipo A2

El aislamiento T-E-136 fue el único queperteneció a este morfotipo, con tasa decrecimiento de 1,13 cm, coloración de colonia a las72 h RV187 tanto en el anverso como en el reverso.Textura plumosa con presencia de dos anillosconcéntricos de color verde, presencia de pústulasblancas y verdes por toda la placa. Conidióforohialino, erecto y ramificado. Masas de esporas enfiálides verticiladas. Fiálides cortos y gruesos.Conidia fialospora, hialina, ovada. Clamidosporaterminal subglobosa (Fig. 6).

Dimensiones: Pústula 0,53 mm, fiálides 7,1 X2,35 µm, conidia 3,2 X 3,2 µm, clamidospora 7,5µm de diámetro.

Figura 6. Características morfológicas de morfotipo A2. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio EMA, C. Coloniacon anillos concéntricos en medio PSA, D. Pústulas, E.Conidióforo, F. Clamidospora.

c) Morfotipo A3

El aislamiento T-E-131 fue el único queperteneció a este morfotipo, con una tasa decrecimiento de 1,55 cm. Textura algodonosa,colonia a las 72h de color RV60 en el anverso yRV179 en el reverso con presencia de tres anillosconcéntricos de color verde, con pústulas presentesen toda la placa apreciando en mayor cantidad enlos bordes, tonalidad verde. Conidióforo hialino,ramificada, erecto. Masas de esporas en fiálidesverticiladas. Fiálides cortos y gruesos, Conidiafialospora, hialina, globosa y clamidosporaintercalar (Fig. 7).

Dimensiones: Pústulas 0,75 mm de diámetro,fiálides 8,5 X 2,4 µm, conidia 3,4 X 3 µm,clamidospora 7,0 µm de diámetro.

Figura 7. Características morfológicas del morfotipo A3. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio EMA, C. Coloniacon anillos concéntricos en medio PSA, D. Pústulas, E.Conidióforo conteniendo a las fiálides, F. Clamidospora.

d) Morfotipo A4

El aislamiento T-E-175 fue el único queperteneció a este morfotipo, con tasa de crecimientomicelial de 2,01 cm. Colonia a las 72h de colorRV60 en el anverso y RV179 en el reverso, texturavellosa, con presencia de dos anillos concéntricosde color verde, con pústulas presentes en formaregular toda la placa, presencia de gliosporas entoda la placa. Conidióforo hialino, erecto,ramificado. Masas de esporas en fiálidesverticiladas. Fiálides cortos y gruesos. Conidiafialospora, hialina, ovada y clamidospora ausente(Fig. 8).

Dimensiones: Pústula 0,76 mm de diámetro;fiálides 8,2 µm X 2,3 µm, conidia 3,55 µm X 2,7µm.

Figura 8. Características morfológicas del morfotipo A4. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio EMA, C. Coloniacon anillos concéntricos en medio PSA, D. Pústulas, E.Conidióforo conteniendo a las fiálides, F. Gliosporas.

3.1.2. Clonostachys

a) Morfotipo B1

A este morfotipo pertenecieron los aislamientosCl-E-123, 136, 104, y 43, con tonalidades en elanverso de la colonia de 10YR 8/1, 5Y 8/4, y 2,5Y8/2 respectivamente. Tasa de crecimiento de 0,2 a0,25 cm, textura algodonosa. Conidióforo simple yramificado, septado, hialino, ramificado en el ápicecon tendencia penicilada. Fiálides divergentes,forma de botella, frecuentemente más convexo enun lado; presencia de masas de esporas.Clamidospora globosa a subglobosa. Conidiahialina y ovada (Fig. 9).

Dimensiones: Conidióforo 98,7 - 136,6 µm X 3,0µm, conidia 6,2 - 7,0 µm X 2,1 - 3,15 µm, fiálides18,65 - 26,2 µm X 2,1 - 2,35 µm, masas de esporas36,15 -74,1 µm de diámetro; clamidospora 13,9 -14,3 µm de diámetro.

Figura 9. Características morfológicas del morfotipo B1. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA (Cl-E- 43),C. Clamidospora, D. Conidióforo, fiálides y masas de esporas,E. Conidióforo, fiálides y conidias.

b) Morfotipo B2

Los aislamientos Cl-E-109, 61, 55, y 33 fueronlos que pertenecieron a este morfotipo, contonalidades en el anverso de la colonia de 10YR 8/1en los tres primeros aislamientos y 5YR 8/1 paraCl-E-33. Tasa de crecimiento de 0,28 a 0,3 cm,textura algodonosa. Conidióforo simple yramificado, septado, hialino, ramificado en el ápicecon tendencia penicilada. Fiálides divergentes,forma de botella, frecuentemente más convexo enun lado; presencia de masas de esporas.Clamidospora globosa a subglobosa. Conidiahialina y ovada (Fig.10).

Dimensiones: Conidióforo 106 - 136,6 µm X3,0 - 3,15 µm; conidia 5,6 - 6,55 µm X 2,0 - 3,0µm; fiálides 20,1 - 30,7 µm X 2 µm; masas deesporas 36,9 - 58,85 µm de diámetro; clamidospora10,0 - 18,2 µm de diámetro.

Figura 10. Características morfológicas del morfotipo B2. Aanverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA (Cl-E-55). C.Clamidospora, D. Conidióforo conteniendo a las fiálides yconidias, E. Masas de esporas.

c) Morfotipo B3

A este morfotipo pertenecieron los aislamientosCl-E-146, 119, y 83; con tonalidades en el anversode la colonia de 5Y 8/2 para Cl-E-146 y 119; y2,5Y 8/2 para Cl-E-83. Tasa de crecimiento de 0,25a 0,36 cm, textura algodonosa, excepto elaislamiento Cl-E-146 de textura vellosa.Conidióforo simple y ramificado, septado, hialino,ramificado en el ápice con tendencia penicilada.Fiálides sometidos divergentes, forma de botella,frecuentemente más convexo en un lado; presenciade masas de esporas. Conidia hialina y ovada; nopresentaron clamidosporas (Fig.11).

Dimensiones: Conidióforo 107,8 - 153,2 µm X2,8 - 3,0 µm; conidia 5,8 - 6,45 X 2,0 - 2,2 µm.fiálides 21,3 - 23,15 µm X 2,0 - 3,0 µm; masas deesporas 41,75 - 57,8 µm de diámetro.

Figura 11. Características morfológicas del morfotipo B3. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA (Cl-E-119),C. Estructura micelial de la colonia en medio PSA, D.Conidióforo conteniendo a las fiálides y conidias, E. Masas deesporas.

3.1.3. Botryosphaeria

a) Morfotipo C1

A este morfotipo pertenecieron los aislamientosBo-E-107, 131, 176, 184, 199, con tasa decrecimiento de 2,48-2,7cm. Colonia de texturaalgodonosa, con tonalidades de 5Y 5/1 en elanverso a diferencia de Bo-E-176 con tonalidad 5Y7/1, y Bo-E-199 con tonalidad 5Y 3/1. Presencia decuerpos estromáticos, conteniendo a las picnidias,de paredes negras y ostioladas. Conidia inmadurahialina, sin septa, con paredes engrosadas. Conidiamadura de color marrón oscura con dos células, deforma elipsoidal (Fig.12).

Dimensiones: Conidia inmadura 24,23- 28,77µm. X 13,35- 14,73 µm. conidia madura 23,53-25,91 µm. X 13,25- 14,19 µm. picnidia 0,53- 1,4mm de diámetro.

Figura 12. Características morfológicas del morfotipo C1. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA (Bo-E-107),C. Picnidias dentro de cuerpos estromáticos en medio PSA

(Bo-E-176), D. Picnidia liberando masa de conidias (Bo-E-107), E. Conidias inmaduras, F. Conidias maduras e inmaduras(Bo-E-176).

b) Morfotipo C2El aislamiento Bo-E-93 fue el único que

perteneció a este morfotipo, con tasa de crecimientomicelial de 2,08 cm. Colonia de textura algodonosa,con tonalidades de 5Y 7/1 en el anverso y 5Y 6/1 enel reverso. Presencia de cuerpos estromáticos,conteniendo a las picnidias de paredes gruesas yostiolada. Conidia inmadura hialina, sin septa, conparedes engrosadas. Conidia madura de colormarrón oscuro con dos células, de forma elipsoidal(Fig.13).

Dimensiones: Conidia inmadura de 23,14 µm X13,89 µm, conidia madura de 24,82 X 14,19 µm.Picnidia 1,58 mm de diámetro.

Figura 13. Características morfológicas del morfotipo C2. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA, C. Cuerposestromáticos en medio PSA, D. Picnidia liberando masa deconidias, E. Conidias inmaduras, F. Conidias maduras.

c) Morfotipo C3

Los aislamientos que pertenecieron a estemorfotipo fueron Bo-E-65 y Bo-E-72, con tasa decrecimiento micelial de 2,71 y 2,59 cmrespectivamente. Colonia de textura algodonosa,con tonalidades de 5Y 3/2 en el anverso, y negro enel reverso para ambos aislamientos. Presencia decuerpos estromáticos, conteniendo a las picnidias,de paredes gruesas y ostioladas. Conidia inmadurahialina, sin septa, con paredes engrosadas. Conidiamadura de color marrón oscuro con dos células, deforma elipsoidal, solo presento Bo-E-72 (Fig.14).

Dimensiones: Conidia inmadura de 15,47 y 18,88µm X 5,78 y 7,86 µm para cada aislamientorespectivamente, conidia madura de 25,12 X 13,1

µm. Picnidia 0,79 mm (Bo-E-72) y 1,69 mm dediámetro (Bo-E-65).

Figura 14. Características morfológicas del morfotipo C3. A.anverso y B. reverso de la colonia en medio PSA, C. Cuerposestromáticos en medio PSA, D. Picnidias liberando masas deconidias, E. Conidias inmaduras, F. Conidias maduras (Bo-E-65).

3.1.4. Xylaria

a) Morfotipo D1

Los aislamientos que pertenecieron a este morfotipofueron X-E-32, X-E-55, y X-E-76, quienespresentaron tasa de crecimiento de 0,39; 0,87; y0,21 cm, respectivamente. Colonia de color blancotanto en el anverso como en el reverso, estructurasestromáticas con tonalidades blancas y negras, de7,06 – 8,82 mm de longitud formadas en medioPSA a partir de los 20 días expuestas bajo luzartificial continua. Conidios de color salmón sobrelos cuerpos fructíferos, que al desprenderse, son deapariencia polvorienta sobre el micelio. Conidiasubhialinas de 5 X 2,97 µm (Fig. 15).

3.1.5. Pestalotiopsis

a) Morfotipo E1.

Este es el único morfotipo que se formó en estegrupo encontrándose en ella los aislamientos P-E-68, 71, 92, 133, 168, 251, 277, 350, y 352, y, conuna coloración en el anverso de colonia 2,5 YR 6/0(P-E-92, 168, 251, 277, y 352), 10YR 8/1 (P-E-68,71, y 350), y 7,5YR 8/0 (P-E-133). Tasa decrecimiento de 0,57 a 0,67 cm. Textura algodonosaen los aislamientos P-E-68, 133, 251, 277, y 352,mientras que P-E-71, 92, 168, y 350, con texturavellosa. Micelio inmerso, ramificado, septado,

hialino a marrón pálido. Conidióforo hialino, cortoy simple. Conidia fusiforme, lisa ligeramentecurvada, septada, con cinco células, las trescentrales son pigmentadas de color marrón pálido ylas células extremas son hialinas; en la célulaapical, 2-3 apéndices (sétulas); y un apéndice corto(pedicelo) en la célula basal (Fig.16).

Dimensiones: Conidia excluyendo a losapéndices 21,1-33,3 µm X 5,25-6,4 µm, apéndiceapical 15,85–33,5 µm de longitud, apéndice basal5,1-10,75 µm de longitud, célula media 4,65-6,35µm de longitud, células pigmentadas 13,5-21,0 µmde longitud.

Figura 15. Características morfológicas del morfotipo D1. A.anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA, C-D.Cuerpos estromáticos en medio PSA, F. Conidias de X-E-32.

Figura 16. Caracterización morfológica del morfotipo E1. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA, C-D.Conidias mostrando sus apéndices.

3.1.6. Acremonium

a) Morfotipo F1

A este morfotipo pertenecieron los aislamientosAcr-3, Acr-4, y Acr-6 con tasa de crecimiento de0,23 cm, para los dos primeros aislamientos y 0,22cm, para Acr-6. Coloración de colonia 2,5Y 7/2 enel anverso como en el reverso. Textura vellosa conelevación micelial. Micelio hialino septado.Conidióforos (fiálides), hialina, erecta, simples yramificadas, aspecto esférico. Masa de esporasterminal. Conidia, hialina, unicelular, cilíndrica aelipsoidal, punteaguda en uno o en ambos extremos(Fig. 17). Dimensiones: Conidióforo (fiálides) 17,9– 27,64 μm X 1,78 – 2,23 μm; masas de esporas21,71 – 33,43 μm de diámetro; conidia 3,66 – 3,96μm X 1,63 – 1,93 μm.

Figura 17. Caracterización morfológica del morfotipo F1. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA, C-D.Estructura micelial en medio PSA, E-F. Conidióforo simple yramificado conteniendo masas de esporas.

3.1.7. Fusarium

a) Morfotipo G1

En este morfotipo los aislamientos agrupadosfueron: F-E-195, 85, 176, 187, y 182, contonalidades en el anverso de la colonia de 10YR8/1; 7,5R 3/6; 5Y 8/2; 10YR 7/4; y 2,5 8/2,respectivamente. Tasa de crecimiento de 0,43 a0,56 cm. Conidióforo hialina, erecta y elongada;Micelio septado blanco. Microconidias únicas, encadenas y de forma oval. Macroconidia con 5 y 6septas, cuyas formas son, delgada, recta, casiparecida a una aguja; en los aislamientos F-E-85 Y195, y los otros aislamientos dorsalmenteensanchada y ventralmente curvada; las formas dela célula apical son poco afilada, enbotado,papilada; en forma de gancho y la célula basalapenas diferenciada; en forma de pie.Clamidosporas globosa, únicas, emparejadas y encadenas (Fig.18).

Dimensiones: Conidióforo 44,4 - 119,87 µm X1,0 - 2,6 µm, microconidia 5,9 - 9,9 µm X 2,0 - 2,3µm, macroconidia 47,95 - 65,3 µm X 5,1 - 5,9 µm;clamidospora 5,6 - 8,2 µm de diámetro.

b) Morfotipo G2

A este morfotipo pertenecieron los aislamientosF-E-153, 38, 104, y 184; con las siguientescaracterísticas. Color de la colonia en el anverso de2,5Y 7/2; 2,5YR 6/6; y 7,5R 4/2, respectivamente.Tasa de crecimiento de 0,54 a 0,56 cm. Conidióforohialina, erecta y elongada. Micelio septado blanco.

Microconidias únicas, y de forma oval.Macroconidia con 3 setas en el aislamiento F-E-184 y 6 septas en los aislamientos restantes, cuyasformas son, típicas; delgada, recta, casi parecida auna aguja; dorsalmente ensanchada y ventralmentecurvada; las formas de la célula apical son pocoafilada, enbotado, papilada; en forma de gancho y lacélula basal apenas diferenciada; en forma de pie.Clamidosporas únicas, globosa (Fig.19).

Dimensiones: Conidióforo 44,5 - 89,7 µm X 1,5 -2,0 µm, microconidia 7,5 - 9,4 µm X 2,0 - 3,0 µm,macroconidia 39,05 - 52,35 µm X 2,2 - 4,0 µm,clamidospora 3,8 - 7,1 µm de diámetro.

Figura 18. Características morfológicas del morfotipo G1. A-B-C-D-E. Anverso de la colonia en medio PSA, mostrando lastonalidades de los aislamientos F-E-85, 176, 182, 187 y 195, F.Esporodoquio en CMA, G. Conidióforo conteniendo a lasconidias, H. Macroconidias (F-E-176), I. Clamidospora (F-E-195).

c) Morfotipo G3

El aislamiento F-E-143 fue el único pertenecientea este morfotipo, con color de colonia 10YR 5/8tanto en el anverso como en el reverso, con tasa decrecimiento micelial de 0,48 cm. Texturaalgodonosa. Micelio septado blanco.Microconidias en forma oval. Macroconidia con 4septas, con una forma típica, la célula apical enforma papilada y la célula basal apenasdiferenciada. Clamidospora globosa, en cadena(Fig. 20).

Dimensiones: Conidióforo 11,67 µm X 2 µm;Conidia: macroconidia 68,95 µm X 4 µm; ymicroconidia 7,4 µm X 3,2 µm; clamidospora 7,6µm de diámetro.

d) Morfotipo G4

A este morfotipo perteneció únicamente elaislamiento F-E-190, con las característicassiguientes. En medio PSA, se observó colonia decolor 2,5Y 6/8 tanto en el anverso como en elreverso. Tasa de crecimiento micelial de 0,65 cm,con textura vellosa; en medio de esporulación(BLA), presencia de esporodoquios al borde de lostrocitos de hoja de plátano y una texturaalgodonosa. Micelio septado marrón amarillento.Microconidias únicas y forma oval. Macroconidiascon 4 septas, con forma delgada, recta, casiparecida a una aguja, la célula apical en forma degancho y la célula basal en forma de pie.Clamimidosporas únicas y emparejadas (Fig.21).

Dimensiones: Conidia: macroconidias 45,45 µmX 3,7 µm; y microconidias 9,6 µm X 3 µm;clamimidosporas 8,4 µm de diámetro.

Figura 19. Características morfológicas del morfotipo G2. A-B-C-D. Anverso de la colonia en medio PSA mostrando lastonalidades de los aislamientos F-E-38, 104, 153 y 184, E-F.Esporodoquio en CMA y PSA (F-E-104), respectivamente, G.conidióforo y conidias (F-E-153), H. Micro y macroconidia, I.Clamidospora (F-E-104).

Figura 20. Características morfológicas del morfotipo G3. A.anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA, C.Microconidias, D. Micro y macroconidia, E. clamidospora.

Figura 21. Características morfológicas del morfotipo G4. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA, C.Conidióforo y microconidia, D. Macroconidias, E-F.Clamidosporas.

3.1.8. Colletotrychum

a) Morfotipo H1

A este morfotipo pertenecieron los aislamientosColl-E-9, 11, 23, 28, 48 y 70; con tasa decrecimiento de 0,75 cm a 0,98 cm. Texturaalgodonosa, coloración de la colonia en medio PSAa los ocho días, 5Y 6/2 en el anverso para Coll-E-11, 23 y 48; 5Y 8/2 para Coll-E-11 y Coll-E-70; yColl-E-28 con coloración 5Y 5/1. Presencia deesporodoquio hemisferical de color amarillo claro,con ausencia de setas. Conidióforo hialino, simple yerecto. Conidia fialospora, hialina, cilindrical.Apresorio de color marrón, subglobosa (Fig. 22).

Dimensiones: Conidióforo 36,33 µm a 49,2 µmde largo. Conidia 12,41-14,09 µm X 3,46-4,0 µm.Esporodoquio 139,3-194,6 µm de diámetro.Apresorio 7,17-8,35 µm de diámetro.

Figura 22. Características morfológicas del morfotipo H1. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA (Coll-E-9),C-D. esporodoquio (Coll-E-11), E. Conidias (Coll-E-9), F.Conidióforo, conidia y apresorio (Coll-E-9).

b) Morfotipo H2

El aislamiento Coll-E-33 fue el único queperteneció a este morfotipo, con un tasa decrecimiento de 0,96 cm. Coloración de la colonia enmedio PSA a los ocho días 2,5Y 7/4 tanto en elanverso como en el reverso. Textura algodonosa.Esporodoquio ausente. Conidióforo hialino, simpley erecto usualmente con dos conidias en elapéndice. Conidia fialospora, hialina, cilindrical.Apresorio de color marrón, subglobosa (Fig. 23).

Dimensiones: Conidióforo 52,0 µm de largo.Conidia 13,45 µm X 3,95 µm. Apresorio de 7,71µm de diámetro.

Figura 23. Características morfológicas del morfotipo H2. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA, C.Apresorio, D-E. Conidias, F. Conidióforo y conidias.

c) Morfotipo H3

A este morfotipo pertenecieron los siguientesaislamientos: Coll-E-50, 52, 67 y 73; con tasa decrecimiento de 0,88 cm a 1,04 cm. Coloración de lacolonia en medio PSA a los ocho días 2,5Y 8/2tanto en el anverso como en el reverso para losaislamientos Coll-E-50 y 52, de color blanco en elanverso como en el reverso para Coll-E-67, y Coll-E-73 con 5Y 8/2 en el anverso como en el reverso.Textura algodonosa, con presencia de esporodoquiohemisferical de color amarillo claro. Conidióforosimple, hialino y erecto presente solo en elaislamiento Coll-E-50. Conidia fialospora, hialina,cilindrical. Apresorio subglobosa de color marrón.Seta marrón, de pared gruesa, agudo en el ápice.(fig.24)

Dimensiones: Conidióforo 34,67 µm de largo.Conidia 12,41-13,35 µm X 3,11-3,95 µm.Apresorio de 8,04-9,09 µm de diámetro.Esporodoquio 134,2-376,5 µm de diámetro. Seta54,32-147,36 µm X 2,04-3,29 µm.

Figura 24. Características morfológicas del morfotipo H3. A.Anverso y B. Reverso de la colonia en medio PSA (Coll-E-67),C. Esporodoquio (Coll-E-73), D-E. Conidias (Coll-E-67), F.Setas (Coll-E-73).

3.2. Capacidad antagónica de hongos endófitoshacia Moniliophthora perniciosa in-vitro.

El análisis de Varianza (cuadro 3), indica queexisten diferencias significativas entre lostratamientos (hongos endófitos) con nivel designificancia de 0,05. Así mismo, la figura 25muestra el efecto de los metabolitos inhibitorios deaislamientos de hongos endófitos a Moniliophthoraperniciosa causante de la enfermedad escoba debruja; siendo T-E-17, el aislamiento del géneroTrichoderma el que inhibió completamente elcrecimiento micelial con diferencia estadísticasignificativa con respecto a los otros aislamientos,seguido del aislamiento Bo-E-107 del géneroBotryosphaeria con 42,23% de inhibición, sindiferencias estadísticas con el aislamiento Bo-E-93,quien a su vez presenta similitud estadística con X-E-76, P-E-168, P-E-71, Acr-E-4 y Coll-E-52, conporcentajes de inhibición de 34,12%; 33,98%;33,69%; 32,9%; y 30,38% respectivamente; estos asu vez sin diferencia estadística con T-E-136(28,08%), y F-E-85 (27,08%); quienes nopresentaron diferencias estadísticas significativascon F-E-190 (20,75%), y los aislamientos que noinhibieron el crecimiento micelial de M. perniciosay difirieron estadísticamente con los otrosaislamientos fueron Cl-E-61, Cl-E-119, y Coll-E-33de los géneros Clonostachys y Colletotrichum,teniendo como negativo a los valores de porcentajede inhibición, el cual indica que los metabolitos deestos aislamientos favorecieron el crecimientomicelial del patógeno quien colonizó toda la placaantes que lo hiciera el testigo.

Cuadro 2. Análisis de la Varianza del porcentaje (%) deinhibición micelial de M.perniciosa en medio de cultivoconteniendo metabolitos inhibitorios de hongos endófitos.

CV: 10,38 R²:0,99

Cuadro 3. Prueba de Duncan del porcentaje (%) de inhibiciónmicelial de M.perniciosa en medio de cultivo conteniendometabolitos inhibitorios de hongos endófitos.

Aislamiento Medias n Test DuncanT-E-17 100 3 aBo-E-107 45.2 3 bBo-E-93 37.43 3 b cX-E-76 34.12 3 c dP-E-168 33.98 3 c dP-E-71 33.69 3 c dAcr-E-4 32.9 3 c dColl-E-52 30.38 3 c dT-E-136 28.08 3 d eF-E-85 27.08 3 d eF-E-190 20.75 3 eCl-E-61 -5.43 3 fCl-E-119 -5.43 3 fColl-E-33 -5.57 3 f

Letras distintas indican diferencias significativas (p<= 0,05)

Figura 25. Porcentaje de inhibición micelial de M. perniciosaen medio de cultivo conteniendo metabolitos inhibitorios dehongos endófitos.

Figura 26. Efecto de metabolitos inhibitorios de hongosendófitos en el crecimiento micelial de M. perniciosa.

F.V. SC gl CM F p-valor

Aislamiento 19903,15 13 1531,01 149,95 <0,0001

matraz 74,55 2 37,28 3.65 0.0401

Error 265,47 26 10,21

Total 20243,17 41

La figura 27 muestra el porcentaje demicoparasitismo de hongos endófitos donde elaislamiento T-E-17, resultó ser el micoparásito masagresivo, colonizando completamente el cultivo delpatógeno M. perniciosa, a tal punto que este nopudo ser recuperado a diferencia de los otrosaislamientos que no tuvieron efecto micoparasítico.

Figura 27. Porcentaje de micoparasítismo de hongos endófitoshacia M. perniciosa.

Figura 28. Colonización de hongos endófitos en placas precolonizadas por M. perniciosa.

Figura 29. Reaislamiento de M. perniciosa de cultivoscolonizados por T-E-17 en medio PSA. (A), discos de medioconteniendo Mp+T-E-17; (B) crecimiento de T-E-17 a los sietedías de evaluación.

4. DISCUSION DE RESULTADOS

4.1. Caracterización morfológica de hongosendófitos y su respectivo agrupamiento

Según las características morfológicaspresentados entre aislamientos de hongos endófitos,el programa de DARwin (figura 3), logró formarocho grandes grupos A, B, C, D, E, F, G, H; quecorresponden a los géneros de Trichoderma,Clonostachys, Botryosphaeria, Xylaria,Pestalotiopsis, Acremonium, Fusarium yColletotrichum; respectivamente, y estos a su vezse subdividen en 20 morfotipos, (A1, A2, A3, A4,B1, B2, B3, C1, C2, C3, D1, E1, F1, G1, G2, G3,G4, H1, H2, y H3).

Según las características morfológicasmacroscópicas y microscópicas de especies deTrichoderma descritos por Watanabe (2002) ySamuels (2004), los morfotipos del géneroTrichoderma, A2 difiere de A1 únicamente porpresentar textura plumosa, a diferencia de A1 contextura algodonosa y vellosa; así mismo elmorfotipo A3 difiere de los otros morfotipos porpresentar conidia globosa y tres anillos concéntricosen la colonia, el morfotipo A4 se diferencia de losotros morfotipos por presentar gliosporas, estructuraausente en los otros morfotipos.

En el caso de Clonostachys, el morfotipo B1presenta menor tasa de crecimiento micelial (0,2-0,25 cm), a comparación de los otros dosmorfotipos (B2: 0,28-0,3 y B3: 0,25-0,36), a su vezel morfotipo B3, difiere de los otros morfotipos encuanto al diámetro de las masas de conidias (41,75– 57,8 µm) siendo esta mayor que las otras, comotambién este morfotipo no presenta clamidospora adiferencia de B1 y B2 que si lo presentan. Estascaracterísticas coinciden con las descritas porWatanabe (2002), a excepción de la tasa decrecimiento que no menciona.

Los morfotipos del género Botryosphaeria sediferencian marcadamente por la tasa decrecimiento, siendo el morfotipo C3 (2,71 – 2,59cm) el de mayor tasa de crecimiento, seguido delmorfotipo C1 (2,48 – 2,7 cm) y el de menor tasa decrecimiento el morfotipo C2 (2,08 cm); y así mismoel morfotipo C2, difiere del morfotipo C1, porpresentar picnidia de diámetro mayor (C2: 1,58 mmy C1: 0,53-1,4 mm); y el morfotipo C3 difiere delos otros dos morfotipos por presentar conidiasinmaduras de menor tamaño (15,47-18,88 X 5,78-7,86 µm). La evaluación de estas características

fueron consideradas de acuerdo a los trabajos decaracterización realizados por Hanlin (1990); yCrous et al. (2006).

En los géneros Xylaria, Pestalotiopsis, yAcremonium, solo se formó un solo morfotipo (D1,E1, y F1 respectivamente), debido a que entreaislamientos no se presentó diferencias marcadas,para formar otros morfotipos. Sin embargo, en elgénero Xylaria se logró formar en medio PSAestructuras estromáticas, y de estas sedesprendieron estructuras de reproducción asexual(conidias), tal como lo describe Medel et al. (2010)y Espola (2005). En el caso de Pestalotiopsis selogró observar y evaluar esporodoquios y conidiaselipsoidales pigmentadas en las células centrales,conteniendo pedicelo y las sétulas tal como lodescriben Sutton (1980) y Watanabe (2002). Lascaracterísticas morfológicas microscópicas deacremonium están enmarcadas en lo descrito porWatanabe (2002).

En el género Fusarium, se encuentran cuatromorfotipos, siendo el morfotipo G4, el que presentómayor tasa de crecimiento (0,65 cm), yclamidospora con mayor diámetro (8,4 µm); a suvez, el morfotipo G3 fue el que presentó menortamaño de conidióforo (11,67 X 2 µm) y mayortamaño de macroconidias (68,95 X 4 µm). Asímismo, el morfotipo presentó clamidosporas únicas,emparejadas y en cadenas, siendo estas lasdiferencias más notorias para discrepar entremorfotipos. Todas estas características fueronevaluadas conforme a lo descrito por Watanabe(2002) y Leslie y Summerell (2006), quienesincluyen como descriptores a la forma de lamacroconidia, la forma de la base y ápice de lamisma.

Los morfotipos del género Colletotrichum, sediferencian por el tamaño de conidióforo, siendoH2, el de mayor longitud (52 µm), seguido de H1(36,33-49,2 µm), y el de menor longitud elmorfotipo H3 (34,67 µm); así mismo, este últimodifiere de los otros dos morfotipos por la presenciade setas y por presentar esporodoquios de mayordiámetro (134,2-376,5 µm), estructura ausente en elmorfotipo H2. Estas diferencias morfológicas estánen conformidad a lo descrito por Sutton (1980) yWatanabe (2002).

El cuadro de dispersión (Fig. 4), nos muestra elacercamiento y distanciamiento de los géneros, selogró formar cuatro grupos distantes entre sí. Elprimer grupo formado por los géneros Trichoderma

y Clonostachys, con un acercamiento estrecho entresí; debido, a las características estructuralessimilares que presentan estos géneros, tal como,forma de conidióforo, fiálides, conidias y masas deesporas; sin embargo, las diferencias morfológicasobservadas entre estos géneros se debe a lacoloración de las colonias y de las conidias. Existenreportes que algunas especies de Trichoderma yGliocladium (Clonostachys), que presentancaracterísticas morfológicas muy similares, tal es elcaso de T. virens que inicialmente era consideradouna especie perteneciente al género Gliocladium:sin embargo, pertenece al género Trichodermasegún Samuels (2004).

Del mismo modo, el género Colletotrichumpresenta una ligera cercanía al género Fusariumformando el segundo grupo, debido a la presenciade esporodoquio (forma y color) y masas de esporasque ambos géneros presentan. El tercer grupoformado por los géneros Botryosphaeria, Xylaria yPestalotiopsis, debido a que las conidias sonrelativamente de mayor tamaño, así mismo, seaprecia un ligero acercamiento entre los dosprimeros géneros debido a que ambos presentanestructuras estromáticas a diferencia dePestalotiopsis, quien a su vez presentaesporodoquio; motivo por el cual, se encuentradistante que estos dos géneros. El cuarto grupoformado por el género Acremonium, se encuentramuy distante a los otros géneros, debido a que éstepresenta conidias de menor tamaño con respecto alos siete géneros anteriores.

4.2. Capacidad antagónica de hongos endófitoshacia Moniliophthora perniciosa in-vitro

Según los resultados de las pruebas de antibiosisy micoparasitismo nos indica que el aislamiento T-E-17, resultó ser un agente con gran potencial debiocontrol hacia M. perniciosa.

Los antagonistas fúngicos pueden controlar eldesarrollo de fitopatógenos a través de mecanismossemejantes a los que utilizan las bacterias, los quese pueden complementar con mecanismosadicionales de control como el micoparasitismo,inducción de resistencia en la planta y tolerancia aestrés, competencia por nutrientes y espacio,secreción de inactivadores de los sistemas deinfección del patógeno y de enzimas que hidrolizana los componentes de las paredes celulares de lospatógenos (Harman, 2004). Como también Mont(2002), menciona que las variantes de Trichoderma

usadas como agentes de biocontrol pueden actuar,colonizando el suelo o partes de la planta, ocupandoel espacio físico y evitando la multiplicación de lospatógenos; produciendo enzimas fungitóxicas quedegradan la pared celular de los patógenos;produciendo antibióticos que pueden matar a lospatógenos; promoviendo el desarrollo de la planta;e induciendo mecanismos de defensa de la planta.Así mismo se reportó que aislamientos del géneroTrichoderma son considerados como agentepotencial de control biológico de M. perniciosa;(Michel-Aceves et al., 2001; Samuels, 2004).Además, el género Trichoderma ha sido estudiadopor muchos investigadores por su eficacia en elbiocontrol de hongos patógenos de plantas (Beagley Papavizas, 1985). Existen reportes donde indicanque T. harzianum, T. virens, y T, teobromicola,tienen la mayor capacidad biocontroladora in vitrosobre M. perniciosa (Rivas y Maniscalco, 2010).

El aislamiento T-E-17 inhibió el crecimiento deM. perniciosa probablemente por los metabolitosfúngicos que fueron liberados, entre estos seencuentran los antibióticos. Chugh y Wallace(2001) mencionan que los mecanismos deantagonismo que usan los hongos biocontroladores,en especial los relacionados con la secreción deantibióticos, permiten la formación de canalesiónicos en la membrana plasmática de losfitopatógenos, como consecuencia de la interacciónde péptidos antibióticos, los peptaiboles (Whitmorey Wallace, 2004), con dicha membrana y laformación de estos canales permite el vaciamientocelular.

Además T-E-17 micoparasitó completamente aM. perniciosa, probablemente por la secreción deenzimas como endoquitinasas, β -1,3-glucanasas(Migheli et al., 1998) y proteasas (Elad y Kapat,1999; De Marco y Félix, 2002), que permiten ladegradación de los componentes de la pared celulardel fitopatógeno y se considera como uno de losmecanismos importantes del control biológico(Howell, 2003). Así mismo, Ordóñez (2000)menciona que T. harzianum produce sustanciascomo Trichodermina, Dermadina, Sequisterpeno,Suzukacillina, Alamethicina, richotoxina yAcetaldehido, todas con propiedades antifungosas yantibacteriales; así como las enzimas β-1,3glucanasa, quitinasa y celulasa los cuales facilitan lahabilidad del antagonista para atacar un ampliorango de patógenos ejerciendo su efecto sobre lasparedes celulares. Además, Lieckfeldt y Nirenberg(1999), mencionan que Trichoderma viride produceenzimas que tienen efectos fúngicos y puede

parasitar Rizoctonia solani, Sclerotium rolfsi,Pythium sp, Phytohpthora parasítica.

El éxito de los antagonistas en la planta puedetambién ser gobernada por su capacidad decolonizar y utilizar los sustratos en la superficie dela planta, permitiendo que compita efectivamentecon los patógenos (Mont, 2002).

5. CONCLUSIONES

5.1. Se logró caracterizar morfológicamente 68aislamientos de hongos endófitos asociadosa cacao nativo procedentes del AltoAmazonas.

5.2. Con el análisis de agrupamiento, se logróformar ocho grandes grupos (A, B, C, D,E, F, G y H) que corresponden a losgéneros: Trichoderma, Clonostachys,Botryosphaeria, Xylaria, Pestalotiopsis,Acremonium, Fusarium y Colletotrichum;respectivamente, y estos a su vez sesubdividen en 20 morfotipos (A1, A2, A3,A4, B1, B2, B3, C1, C2, C3, D1, E1, F1,G1, G2, G3, G4, H1, H2, y H3), agrupadosasí, por poseer similitudes en lascaracterísticas.

5.3. En el análisis de dispersión, se logró formarcuatro grupos distantes entre sí. Losgéneros Trichoderma y Clonostachys,muestran un estrecho acercamiento y ligeroacercamiento entre los génerosColletotrichum y Fusarium, así mismoBotryosphaeria, Xylaria y Pestalotiopsis;sin embargo, el género Acremonium seencuentra muy distante a los demásgéneros.

5.4. El aislamiento T-E-17, resultó ser unpotencial biocontrolador in vitro, logróinhibir (100%) el crecimiento micelial deM. perniciosa, seguido del aislamiento Bo-E-107 que inhibió el 45,2 % a comparaciónde los aislamientos Cl-E-61, Cl-E- 119 yColl-E-33 no tuvieron efecto en lainhibición micelial del patógeno. Asímismo, T-E-17 resulto ser el únicomicoparásito más agresivo (100% decolonización), a comparación de los demásaislamientos de hongos endófitos que notuvieron efecto en micoparasitar a M.perniciosa.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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