FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLÓGICAS BIOLOGICAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

Optimización en la Producción de Etanol por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza

AUTOR: Br. RUBEN MARTINEZ HARO PIZANGO

ASESOR: Dr. HEBER ROBLES CASTILLO

TRUJILLO – PERÚ

2015

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO DE:

BIÓLOGO

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO

Dr. Orlando Gónzales Nieves

RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dr. Rubén Vera Veliz

VICERECTOR ACADÉMICO

Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas

VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN



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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

Dr. José Mostacero León

DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. William Zelada Estraver

SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. Freddy Peláez Peláez

DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS



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PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado:

En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de

Grados y Títulos de la Escuela Académico Profesional de Ciencias

Biológicas de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y criterio el presente

trabajo de tesis titulado:

“Optimización en la Producción de Etanol por Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona

squamosa “anuna” y mosto de melaza”, con el cual pretendo obtener

el Título Profesional de Biólogo.

Trujillo, octubre de 2015

Br. Ruben Martinez Haro Pizango



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MIEMBROS DEL JURADO

Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido

ejecutada en concordancia con las normas de la Escuela Académico

Profesional de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.

Dr. Segundo Eloy López Medina PRESIDENTE

Dra. Gina Zavaleta Espejo SECRETARIA

Dr. Heber Robles Castillo VOCAL



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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del jurado examinador, declaran que

el presente Informe de Tesis titulado: “Optimización en la Producción de

Etanol por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir

de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza”, ha cumplido

con los requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por

UNANIMIDAD.

Dr. Segundo Eloy López Medina PRESIDENTE

Dra. Gina Zavaleta Espejo SECRETARIA

Dr. Heber Robles Castillo VOCAL



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DEL ASESOR

El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada: “Optimización en

la Producción de Etanol por Saccharomyces cerevisiae var. Ellipsoideus

MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de

melaza”

CERTIFICA:

Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la

Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando

en conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido

redactado acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.

Por lo tanto, autorizo al Sr. Ruben Martinez Haro Pizango, continuar con el

trámite del reglamento correspondiente.

Trujillo, octubre de 2015

Dr. Heber Robles Castillo ASESOR



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DEDICATORIA

A Dios, que es la palanca de empuje

en esos tiempos grises.

A mi Madre, Padre y Hermanos por su apoyo

desinteresado y por el aliento del día a día.

A Katherine C. P., por ser mí complemento

en esta y en las futuras etapas de mi vida.



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AGRADECIMIENTO

Agradezco sinceramente al Dr. Heber Robles Castillo, destacado y admirable

catedrático del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad

de Ciencias Biológicas, por el apoyo brindado y el tiempo invertido en la

asesoría de la presente tesis.



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ÍNDICE

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ii

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS iii

PRESENTACIÓN iv

MIEMBROS DEL JURADO v

APROBACIÓN vi

DEL ASESOR vii

DEDICATORIA viii

AGRADECIMIENTO ix

RESUMEN xiv

I. INTRODUCCIÓN 1

II. MATERIALES Y MÉTODOS 9 2.1 MATERIAL 9 2.1.1 material biológico 9 2.1.2 medios de cultivo 9

2.2 MÉTODOS 9 2.2.1 FASE PRE-FERMENTATIVA 9 2.2.1.1 Reactivación del cultivo y

verificación de la pureza 9 2.2.1.2 Propagación y estandarización del inóculo

de Saccharomyces cerevisiae MIT L-51 10 2.2.1.3 Preparación del mosto 11 2.2.1.4 Diseño, construcción, lavado y esterilización del

Biorreactor para la fermentación por Saccharomyces

cerevisiae MIT L-51 12 2.2.1.5 Corrección y suplementación de los mostos 12 2.2.1.6 Higienización del mosto 13 2.2.2 FASE FERMENTATIVA 13 2.2.2.1 Acondicionamiento de los Biorreactores

e inoculación 13 2.2.2.2 Inóculo 13 2.2.2.3 Monitoreo del Bioproceso 14



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2.2.3 FASE POSTFERMENTATIVA 14 2.2.3.1 Determinación de la productividad del etanol 14 2.2.3.2 Determinación de la producción de etanol 15 2.2.3.3 Análisis estadístico 15

III. RESULTADOS 16

IV. DISCUSIÓN 20 V. CONCLUSIONES 24 VI. RECOMENDACIONES 25 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 26 VIII. ANEXOS 30



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ANEXOS

8.1 Annona squamosa “anuna” fruto utilizado para la fermentación de Saccharomyces cerevisiae MIT L-51

8.2 Composición de Agar Papa Sacarosado (APS) utilizado para reactivar el cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 para el proceso fermentativo con Annona squamosa “anuna”

8.3 Composición (g/L) de Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA) utilizado

para la propagación y estandarización del cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 para el proceso fermentativo con Annona squamosa “anuna”.

8.4 Valor nutricional en 100 gramos de pulpa (según morton, 1987)

8.5 Reactivación de cultivo, observación macroscópica de Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Agar Papa Sacarosado (APS) inclinado, utilizando la técnica de siembra en estría después de ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.

8.6 Verificación de la pureza, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

MIT L-51, observación microscópica al fresco 100x.

8.7 Propagación del cultivo. Observación macroscópica de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA), utilizando la técnica de siembra en estría después de ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.

8.8 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer

8.9 Biorreactores conteniendo los mostos y los sedimentos de Annona

squamosa “anuna” y melaza utilizado como testigo, después de finalizada la fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51

8.10 Equipo de destilación para determinar el grado alcohólico

producido por Saccharomyces cerevisiae MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”.

8.11 Calculo del volumen de CO2 (técnica de las densidades).

8.12 Calculo de la productividad mediante el método de Davies-

Griffieth (1982) modificado.



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8.13 Productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo, durante 168 horas de fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).

8.14 Planteamiento de problema e hipótesis en la investigación de

fermentación con mosto de Annona squamosa “anuna”.

8.15 Análisis estadístico “t” de student de la optimización en la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza.



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RESUMEN

Se optimizó la producción de etanol utilizando un cultivo de Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”

cultivados en la región de Loreto-Perú. Para ello los frutos se lavaron,

desinfectaron y se procesaron para obtener el mosto, el cual se pasteurizó y

suplementó. Se utilizaron Biorreactores tipo tanque de 2 litros. Los

Biorreactores fueron cargados con mosto de Annona squamosa “anuna” a

diferentes concentraciones (10%, 20% y 30% (p/v)) y con mosto de melaza de

caña como control, todos en un volumen de 940 ml de mosto con 60 ml de

inóculo propagada y estandarizada. El proceso fermentativo se llevó a cabo

durante 168 horas monitoreando cada 24 horas, en el monitoreo se hizo el

recuento total de levaduras y densidad. Al finalizar el mosto fue destilado para

obtener el etanol, luego se calculo el grado alcohólico utilizando la técnica del

densímetro y corroborando con un alcoholímetro tipo DENSIMETRE METER

DMA 35 “Anton Paar”. Se concluye que: La máxima productividad de etanol se

dio a las 72 horas de iniciada el proceso fermentativo, siendo mayor en mosto

de Annona squamosa “anuna” al 30% (p/v) y durante 168 horas de

fermentación la levadura produce 0.05 (v/v) etanol, 0.18 (v/v) etanol y

0.271(v/v) etanol, en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30%

(p/v) respectivamente.

Palabras clave: Etanol, Annona squamosa, Saccharomyces cerevisiae.



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I. INTRODUCCIÓN

La importancia de la producción de etanol ha surgido por la aparición de

nuevas necesidades del consumidor y por cambios económicos, esto hace que

hoy en día el etanol sea un combustible automotor, con gran potencial de

crecimiento en diversos países de América Latina. Este se puede obtener a

partir de la caña de azúcar, maíz, remolacha y de otros vegetales, pero la

tecnología más desarrollada para extraer este combustible está en base a la

caña de azúcar. En la mayoría de países latinoamericanos se produce etanol a

partir de azúcares y melazas (subproductos de la caña de azúcar), lo cual en

comparación con EE.UU. y en algunos países de Europa producen etanol a

partir de cereales como maíz (Ministerio de Agricultura Y Dirección General de

Competitividad Agraria, 2013).

En el Perú se ha fomentado la investigación de diversos sustratos para la

producción de etanol como es el caso de Ávila en el año 2012 en el cual

estudia la productividad de etanol en mostos de Passiflora edulis “maracuyá”,

Ananas comosus “piña” y Vitis vinífera var gross colman “uva” determinando

una productividad mayor en mosto de piña y menor en mosto de maracuyá; en

el cual afirma que el pico máximo de producción de etanol se da a las 24 horas

de fermentación, siendo mayor en el mosto de piña, y menor en el mosto de

uva y maracuyá; a lo que también afirma que durante las 96 horas de

fermentación, produce 6.24 x 10-2 g et/g lev/h en mosto de Vitis vinífera var.

gross colman “uva”, 5.04 x 10-2 g et/g lev/h en mosto de Passiflora edulis y 4.64

x 10-2 g et/g lev/h en mosto de Ananas comosus (Pedro, 2012).



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En el mismo año Mendocilla trabajó con los mismos mostos determinando la

velocidad de crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae obteniendo

de su estudio que en condiciones de fermentación alcohólica, crece a una

velocidad especifica de 0.0952 h-1 en mosto de Ananas comosus, 0.0825 h-1 en

mosto de Vitis vinífera var. gross colman y 0.0761 h-1 en mosto de Pasiflora

edulis (Mendocilla, 2012), coincidiendo con Ávila en que los mostos de piña y

uva contienen cantidades mayores de tiamina en relación al mosto de

maracuyá que se considera pobre en esta vitamina (Quispe, 2009); en

consecuencia las levaduras de Saccharomyces cerevisiae amplían y aceleran

su crecimiento.

Castro en el año 2009 investiga el efecto del pH y la temperatura sobre la

producción de etanol y dióxido de carbono utilizando como mosto malta de

Hordeum vulgare var. UNA La molina – 96 “cebada”, concluyendo que la

producción varía y no se ve afectada por efecto de las temperaturas de 5; 15 y

25oC y los valores de pH 4; 5 y 6, donde a 25oC la producción es mayor

(Castro, 2009). La cebada es un cereal con alto contenido en almidón, que es

la sustancia que da origen al extracto fermentescible; esto contiene la suficiente

cantidad de proteína para proporcionar aminoácidos necesarios para el

crecimiento de la levadura (Leal, 1990). Según Wiseman la velocidad de

fermentación se incrementa a temperaturas entre 15 y 22oC, siendo mayor

cuando mayor es la temperatura, debido que a temperaturas altas hace que se

incremente la actividad de la enzima, pero en detrimento de su estabilidad,



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hace que esto disminuya, teniendo en cuenta el periodo de tiempo en el que se

usa (Wiseman, 1991).

El mosto Annona squamosa no cuenta con trabajos anteriores realizados con el

tema fermentación debido a eso, es complicado determinar las propiedades

físico-quimicas de esta fruta, al igual del contenido de azucares naturales

fermentables, pero se puede asegurar la presencia de fuentes de nitrógeno,

esteroles, vitaminas, fosfolípidos, minerales, ácidos grasos insaturados

(Guerrero y Fischer, 2007), los cuales garantizan la producción del etanol.

El uso de la melaza como sustrato para la producción de etanol con

Saccharomyces cerevisiae presenta ventajas nutricionales frente a otros

medios de cultivos, pero una desventaja que recae es en el alto precio de esta

materia prima, que obliga a buscar nuevas alternativas para la obtención de

diferentes productos biotecnológicos por vías de fermentación (Apuntes

agroeconómicos, 2007).

En la fermentación ocurre un conjunto de cadenas de reacciones, que

comprende la oxidación de un compuesto a esto se le llama “vía bioquímica”.

Las vías para la oxidación de los compuestos orgánicos y la conservación de la

energía en el ATP se puede dividir en dos procesos principales: 1)

Fermentación, en el cual el proceso de oxido-reducción se efectúa en ausencia

de cualquier aceptor terminal de electrones y 2) Respiración, en el cual el

oxigeno molecular o cualquier otro oxidante actúa como el aceptor oxidante de

electrones. “En ausencia de aceptor de electrones, muchos organismos



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efectúan reacciones redox balanceadas de algunos compuestos orgánicos, con

liberación de energía. Este proceso se llama fermentación (Brock, 1982).

El ejemplo más clásico de fermentación es el catabolismo de la glucosa por

levaduras en ausencia de oxigeno. En esta reacción parte de los átomos de

carbono terminan en CO2, una forma más oxidada que la de los átomos de

carbono de la molécula que partió, mientras que los otros átomos de carbono

terminan en etanol, que es más reducido que la glucosa (Hough, 1990). La

energía liberada en la reducción de la glucosa a etanol es -238.8 Kj/mol y se

conservan por fosforilaciones a nivel de sustrato en forma de enlaces fosfato de

alta energía en el ATP, con una producción neta de dos de estos enlaces

(Brock, 1982).

Anuna (Annona squamosa L.) pertenece a la familia de las anonáceas, la más

importante ya que cuenta con 150 especies; otras de interés comercial como la

guanábana (Annona muricata L.), la chirimoya (Annona cherimola Mill.) y más

recientemente el híbrido atemoya (A. squamosa x A. cherimola) proveniente del

cruce entre anuna y chirimoya (Guerrero y Fischer, 2007). El fruto es globoso-

oviforme, casi de forma acorazonada, de 5 a 12 cm de diámetro, color verde-

amarillento pero se conocen variedades de color púrpura. Externamente la

unión de los carpelos es laxa, con toda su superficie marcadamente

prominente, dándole al fruto apariencia tuberculada. La pulpa es blanca o

amarillenta entre la unión de los carpelos; los frutos son del tipo sincarpo

formados por numerosos pistilos de una flor; cada escama pertenece a un

carpelo fecundado, además de ser aromática, mantecosa, comestible, y de



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agradable sabor (Nakasone, 1998). Las semillas son oblongas, negro-lustrosas

o café-oscuras y constituyen entre el 31% y 41% del total del fruto y contienen

entre 14% y 49% de aceite (Leal, 1990; Morton, 1987).

El fruto de “anuna” tiene un alto contenido de proteína y azúcares. Es una

fuente importante de minerales como Fe, Ca y P y vitaminas como el ácido

ascórbico (Anexo 8.4)

Una fermentación alcohólica se debe a las actividades de ciertos

microorganismos, los cuales se encargan de procesar azúcares, como la

glucosa, la fructosa, etc., dando como resultado un alcohol a modo de etanol,

CO2 (gas) y ATP (adenosín trifosfato), moléculas que son utilizadas por los

propios microorganismos en sus metabolismos energéticos (Fermentación

alcohólica, 2000). En la presente investigación se reactivo adecuadamente el

cultivo puro de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 y

estandarizando el volumen de inoculo adicionado al mosto de Annona

squamosa “anuna”; esto permite garantizar que la producción de etanol

obtenida en el mosto sea consecuencia de su variada composición en fuentes

de nitrógeno, esteroles, ácidos grasos insaturados, minerales, vitaminas,

fosfolípidos(Guerrero y Fischer, 2007).

Saccharomyces cerevisiae es la levadura más conocida y de importancia

industrial puesto que es la especie de levadura más utilizada para la obtención

de etanol a nivel industrial debido a su fácil manipulación y recuperación, no es

exigente en cuanto a su cultivo, presenta un bajo costo, tolera altas

concentraciones de etanol, produce bajas concentraciones de subproductos en



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la fermentación, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de

azucares, presenta alta viabilidad celular para el reciclaje y características de

floculación y sedimentación para el procesamiento posterior (Fajardo y

Sarmiento, 2007).

Las levaduras al ser células vivas necesitan los mismos elementos químicos

que otros seres vivos como es el carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno,

fosforo, potasio, azufre, magnesio, hierro, zinc, manganeso, cobre y molibdeno;

de estos los últimos cinco elementos se requieren en cantidades mínimas como

componentes o activadores de enzima (Carpenter, 1969). La concentración de

nutrientes puede afectar tanto a la velocidad como al rendimiento del

crecimiento del organismo. Si el nutriente se convierte en material celular,

cuanto más nutriente haya, mayor será la producción de células. La razón para

reducir la velocidad de crecimiento a concentraciones muy bajas de nutriente,

es porque no se puede transportar ese nutriente al interior de la célula con

suficiente rapidez para satisfacer las demandas metabólicas del nutriente y la

velocidad de crecimiento es proporcional a la concentración de dichos

nutrientes; sin embargo, a estas concentraciones bajas, el nutriente es utilizado

para la proliferación (Brock, 1982).

En el proceso de fermentación alcohólica es necesario brindar las condiciones

adecuadas de operación y optimización. Desde el punto de operación es

importante decidir las siguientes variables: temperatura, pH, °Brix, nutrientes y

productividad entre otras (Fajardo y Sarmiento, 2007).



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La temperatura ejerce un marcado efecto sobre la velocidad metabólica del

organismo. La temperatura tiene una influencia directa sobre la velocidad de

reacción y esta puede cambiar la configuración de los constituyentes celulares,

especialmente de las proteínas y de los componentes de la membrana

(Doran, 1998). La temperatura óptima de crecimiento de las levaduras

especialmente de Saccharomyces cerevisiae es de 30 a 35°C. La temperatura

afecta al organismo de manera notable ya que los organismos de una especie

dada solo pueden crecer en un rango de temperatura y esto afecta de manera

notable al organismo (Fajardo y Sarmiento, 2007).

La acidez o alcalinidad de una solución se expresa por su índice de pH en una

escala de 0 a 14. Es importante recordar que el pH es una función logarítmica,

un cambio en una unidad de pH representa un cambio de diez veces en la

concentración de iones hidrogeno (Brock, 1982). El pH tiene un marcado efecto

en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento. El pH óptimo para algunos

organismos en especial para las levaduras se encuentra en un rango de 4.0 a

6.0. El pH tiene una gran influencia en los productos finales del metabolismo

anaerobio (Fajardo y Sarmiento, 2007).

El °Brix o grados Balling es otra escala del hidrómetro utilizada en la industria

azucarera. Normalmente las escalas °Brix se calibran de 15.6 °C a 20°C. Con

la escala a 20°C, cada °Brix indica 1 gramo de sacarosa por cada 100 gr de

líquido (Doran, 1998).

En la presente investigación se determinó la producción óptima de etanol por

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona



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squamosa “anuna” en comparación con mosto de melaza de Saccharum

officinarum “caña de azúcar” cuyos resultados serán utilizados con la finalidad

de apoyar a generar nuevos sustratos a menor precio y brindar resultados

semejantes, pretendiendo utilizar los frutos de “anuna” como mosto para un

proceso óptimo de fermentación alcohólica y que estos resultados sean

aplicados en los siguientes trabajos experimentales.

OBJETIVOS

Optimizar la Producción de Etanol por Saccharomyces cerevisiae var.

ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna”

y mosto de melaza.

Determinar la productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae

var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”.

Determinar la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae var.

ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”.



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II. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 MATERIAL

2.1.1 Material biológico

Cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 del

Laboratorio de Biotecnología del Departamento Académico de

Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de

la Universidad Nacional de Trujillo.

Frutos maduros de Annona squamosa “anuna” cultivados en la

Región de Loreto-Perú.

2.1.2 Medios de cultivo

Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA)

Agar Papa Sacarosado (APS)

2.2 MÉTODOS

2.2.1 FASE PRE-FERMENTATIVA

2.2.1.1 Reactivación del cultivo y verificación de la pureza

Del cultivo conservado de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

MIT L-51 se realizó una suspensión al decimo en agua destilada estéril y se

observó al fresco en microscopio para corroborar la pureza.



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Una vez verificados su pureza se procedió a sembrar el cultivo axénico

tomando de 2 a 4 asadas en frasquitos conteniendo medio APS inclinado e

incubando a temperatura ambiente durante 72 horas para reactivar el cultivo.

Las levaduras reactivadas se conservaron en frio a 4 oC hasta el momento

de su uso.

2.2.1.2 Propagación y estandarización del inóculo de Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51

Se tomó asadas del cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

MIT L-51 reactivadas y se sembró por estría en placas Petri y frasquitos

conteniendo medio OGA inclinado, y se incubaron a temperatura ambiente

durante 72 horas con el fin de propagar. Transcurrido el tiempo de

incubación, la biomasa desarrollada se “cosecho” utilizando de 20ml de agua

destilada estéril en total. La suspensión total de lo “cosechado” se recolectó

en un frasco de vidrio estéril. Se hizo una dilución al centésimo para luego

determinar la concentración celular por mililitro (cel./ml) mediante recuento

en cámara de Neubauer (Flores, 2009; Gómez, 2009; Mendocilla, 2012).

Con los datos obtenidos se realizaron los cálculos para determinar la

concentración de la levadura, obteniendo una concentración celular de 3.26x

106células/ml.



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2.2.1.3 Preparación del mosto

2.2.1.3.1 Annona squamosa “anuna”

Mediante la ayuda de un cepillo de dientes de primer uso se lavaron los

frutos con agua corriente y luego se desinfectaron con una solución de

hipoclorito de sodio al 0.5% durante 15 minutos; a continuación se

hicieron lavados sucesivos con abundante agua potable estéril hasta la

eliminación del olor característico del hipoclorito y luego se enjuagaron

con agua destilada estéril. Posteriormente los frutos se pelaron, se

separaron las pepas, y la pulpa fue estrujada y machacada; la fibra se

separo por filtración y el mosto medido y acondicionado para su posterior

higienización y suplementación. El mosto de Annona squamosa “anuna”

se utilizó para los Biorreactores problema.

2.2.1.3.2 Melaza de Saccharum officinarum

Se diluyo la melaza bruta con agua destilada estéril calentando y agitando

hasta diluirla totalmente. Posteriormente, se centrifugó tres veces con el

fin de retirar gran parte de las impurezas y contaminantes; se llevó al

autoclave por 20 minutos a 20 libras de presión y a 121oC. Por último, se

adicionó ampicilina a una concentración de 300 ml/L (Fajardo y

Sarmiento, 2007).



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2.2.1.4 Diseño, construcción, lavado y esterilización del Biorreactor

para la fermentación con Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

MIT L-51

Para la construcción del Biorreactor de fermentación, se utilizaron doce

botellas de vidrio de 2000 ml de capacidad, los cuales se hicieron dos

orificios en la tapa de teknoport uno para los muestreos respectivos y otro

para la liberación de gases, a este último se le conectó 60 cm de manguera

de acuario, el cual fue insertado en otra botella de plástico con una solución

de cloruro de sodio al 23% con la finalidad de recepcionar los gases emitidos

durante el proceso (Mendocilla, 2012).

Luego de ensamblar el Biorreactor, se procedió a lavar por separado cada

una de las partes utilizando detergente y cepillo de lavado, se enjuagó con

abundante agua, se desinfectó con solución de hipoclorito de sodio al 2.5%

durante una hora para luego enjuagar con agua de caño estéril y con agua

destilada estéril, finalizando con alcohol de 70o (Geldres, 2007).

2.2.1.5 Corrección y suplementación de los mostos

Para corregir la densidad se adicionó azúcar rubia domestica hasta llegar a

una densidad equivalente a 25o °Brix. La medición se hizo con un

Brixómetro.

Para corregir el pH se adicionó bicarbonato de sodio o acido cítrico según

sea el grado de acidez o alcalinidad de los mostos; se llevó a un valor de

3,5. Estos datos fueron medidos cualitativamente mediante tiras reactivas



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Para corregir la fuente nitrogenada se adicionó 200 mg de sulfato de amonio

por litro de mosto (Yeramian,et al. 2001).

2.2.1.6 Higienización del mosto

El mosto de Annona squamosa “anuna” al igual que el mosto de melaza

fueron acondicionados en un recipiente estéril y se higienizaron con 120 mg

de bisulfito de sodio por litro de mosto; luego el contenido se homogenizó

dejando actuar por 15 minutos para destruir todo organismo no deseable en

el mosto. Esto se comprobó sembrando 0.15 ml de mosto sulfitado, por

superficie, en una placa conteniendo Agar Papa Sacarosado e incubándola

a temperatura ambiente durante 72 horas (Mendocilla, 2012).

2.2.2 FASE FERMENTATIVA

2.2.2.1 Acondicionamiento de los Biorreactores e inoculación

Los mostos de “anuna” y melaza previamente suplementados, fueron

distribuidos en los Biorreactores estériles a razón 940ml de mosto en cada

uno y rotulados adecuadamente, “10%”, “20%” y “30%” para mosto de

Annona squamosa “anuna” y “20% MELAZA” para el mosto de melaza de

Saccharum officinarum como testigo. Se hicieron tres repeticiones del

experimento.

2.2.2.2 Inóculo

En condiciones de asepsia utilizando mecheros, se agregó un volumen de

60 ml de inóculo reactivado y estandarizado por litro de mosto.



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2.2.2.3 Monitoreo del Bioproceso

El proceso fermentativo se llevó a cabo durante 168 horas a temperatura

ambiente y se monitoreo a las 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas. Durante

el monitoreo se hizo el recuento total de levaduras y se midió la densidad de

cada uno de los Biorreactores luego terminado el proceso fermentativo, se

procedió a calcular la productividad de etanol, producción de etanol y

densidad final.

2.2.3 FASE POSTFERMENTATIVA

2.2.3.1 Determinación de la productividad de etanol

La productividad de etanol se determinó por el método de Davies y Griffieth

modificado, para ello se calculo los mililitros de CO2 producido cada 12

horas mediante la técnica de las densidades (Anexo 8.11), se midió la

temperatura y con estos datos se realizaron los cálculos de productividad de

etanol (Anexo 8.12).

La productividad de etanol se expresa en gramos de etanol por levadura por

hora.



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2.2.3.2 Determinación de la producción de etanol

Culminada la fermentación, el volumen de etanol producido en cada

Biorreactor, se obtuvo mediante destilación.

El grado alcohólico se midió mediante la técnica de las densidades y

corroborando con un alcoholímetro tipo DENSIMETRE METER DMA 35

“Anton Paar”.

2.2.3.3 Análisis estadístico

Los datos fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de

Student para comparación de promedios (Geldres, 2007).



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III. RESULTADOS

Al determinar la Productividad de etanol por Saccharomyces cerevisiae var.

ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%,

30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo durante 168

horas de fermentación a temperatura ambiente; se observa en la figura 01 la

Productividad de etanol en los tres mostos de “anuna” en comparación con el

testigo (melaza al 20%), y la máxima productividad se da entre las 48 y 72

horas en las tres diferentes concentraciones de mostos de “anuna”, y entre los

72 y 96 horas para el mosto de melaza al 20%. Luego la productividad

disminuye entre las 96 y 120 horas y progresivamente hasta las 168 horas de

fermentación.

En la figura 02 se presenta la producción de etanol durante las 168 horas de

fermentación, observándose una mayor producción en mosto de “anuna” al

30% en comparación con las otras concentraciones.

El cuadro 01 muestra la productividad durante las primeras 72 horas de iniciada

la fermentación en mosto de “anuna” al 10%, 20% y 30% de concentración; así

como también la producción máxima de etanol durante las 168 horas del

proceso fermentación



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Fig. 01. Productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus

MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30% (p/v) y

mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo, durante 168 horas de

fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).

La productividad de etanol se expresa en gramos de etanol por levadura por

hora

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

24 48 72 96 120 144 168

pro

du

ctiv

idad

x1

0-1

horas

10%

20%

30%

20% MELAZA



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Fig. 02. Producción de Etanol (v/v) por Saccharomyces cerevisiae var.


30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo durante 168

horas de fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).

La producción de etanol se expresa en ml de etanol por volumen total.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Annonasquamosa 10%

Annonasquamosa 20%

Annonasquamosa 30%

solucion melaza20%

0.052 0.18 0.271

2.392 P

RO

DU

CC

ION

ETA

NO

L (V

/V)

Etanol (v/v)



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Cuadro 01. Productividad y Producción máxima de etanol a las 72 y 168 horas

de fermentación por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en

mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30% (p/v) y mosto de

melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo durante 168 horas de fermentación

Productividad x10-1

(g et/g lev/h)

Producción

(ml/L)

72 Horas 168 Horas

“anuna” 10% 3.18 0.05

20% 36.87 0.18

30% 72.25 0.27

Melaza 20%

MELAZA

380.82 2.39



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IV. DISCUSIÓN

Los datos obtenidos en el cuadro 01, figura 01 y figura 02 muestran la

capacidad del mosto de Annona squamosa “anuna” para ser fermentado por

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 y en cantidad mayor en

mosto de melaza utilizada como testigo en esta investigación para la

producción de etanol.

Al determinar la productividad del etanol de Saccharomyces cerevisiae var.

ellipsoideus MIT L-51 en la Figura 01, se observa mayor productividad de

etanol en el mosto de melaza al 20% (p/v), seguido por el mosto de Annona

squamosa “anuna” al 30% (p/v) y luego por el de Annona squamosa “anuna”

20% (p/v). Esta gran ventaja se debe a que la melaza posee sacarosa (60%-

63% peso), glucosa (6%- 9% peso), fructosa (5%- 10% peso) y rafinosa, los

cuales son azucares fermentables (Fajardo y Sarmiento, 2007), en

comparación con mosto de Annona squamosa “anuna” que contiene

aproximadamente 21.5% de azucares totales (Roig, 1998).

Al ser analizada la productividad de etanol durante 168 horas de fermentación,

en el cuadro y figura 01, se observa que la máxima productividad se da a las 72

horas, luego disminuye bruscamente a las 96 horas y progresivamente hasta

las 120 y 144 horas de fermentación respectivamente. En mosto de Annona

squamosa “anuna” al 30% se observa un lento crecimiento a las 48 horas para

luego aumentar a un pico máximo bruscamente a las 72 horas, superando así

al mosto de Annona squamosa “anuna” al 20% que empezó un crecimiento

rápido en las primeras 48 horas y mantenerse durante las 96 horas siguientes



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hasta su eventual descenso, siendo estos resultados estadísticamente

significativos.

Suelen emplearse mezclas que incluyen biotina, tiamina, inositol y ácido

pantoténico, esenciales para el desarrollo metabólico de la célula y la

fermentación. La tiamina y el contenido de acido pantoténico en el mosto de un

fruto cumplen funciones muy importantes en el proceso de fermentación;

Annona squamosa “anuna” contiene 0,10 – 0,13 mg de tiamina por cada 100

gramos de pulpa (Guerrero y Fischer, 2007), lo cual, según hidalgo es

primordial por muchas descarboxilaciones y transformación de acido pirúvico a

etanol (metabolismo de los glúcidos); de igual modo el acido pantoténico al ser

constituyente de la coenzima A interviene en las reacciones de acetilación

(Hidalgo, 2003). A todo esto se resalta el aporte vitamínico de tiamina y de

acido pantoténico los cuales tienen un efecto estimulante sobre el crecimiento

de las levaduras asegurando una fermentación óptima (Pedro, 2012).

No siempre el nitrógeno asimilable incrementa el crecimiento celular, porque

puede ser acumulado intracelularmente en las vacuolas celulares, como

reserva en la fase estacionaria donde sería empleado en la síntesis de

proteínas (Henschke y Jiranek, 1993). Esto puede reprimir el consumo de

aminoácidos, con lo que se ve reducido la eficiencia de la fermentación. Por lo

cual Sablayrolles 2009, indica que cuando se tienen elevadas concentraciones

de nitrógeno y bajos niveles de tiamina se genera un detenimiento de la

fermentación (Sablayrolles, 2009). Del mismo modo Bartra et al. 2010 señala

que la ausencia de procesos de la vía metabólica de la tiamina se asocian al



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incremento de sulfuro de hidrogeno dentro de la fermentación (Bartra, et al.

2010).

La productividad de etanol a las 24 horas (fig. 01), en los mostos de “anuna” al

20% y al 30% presenta la misma tendencia debido al amonio presente en

forma natural y suplementado equivalentemente con sulfato de amonio. El

proceso de asimilación del nitrógeno inicia en la conversión del amoníaco a

glutamato, por la deshidrogenasa presente. Seguido de esto, parte del

glutamato es convertido en glutamina, que representa una fuente importante de

nitrógeno celular (Cooper, 1982).

Durante las 120 hasta las 168 horas la productividad de etanol (fig. 01) en los

tres mostos de “anuna” disminuye progresivamente; por el contrario el testigo

vuelve aumentar su productividad durante las 144 horas, en los mostos de

“anuna” podría deberse a factores fisiológicos por parte de la levadura como la

concentración alcohólica intracelular que afecta su funcionamiento, pues la

composición lípidica de la membrana celular de la levadura, se relaciona

directamente con la tolerancia al etanol, ya que mientras incrementa su

concentración, modifica esta composición, variando su polaridad, de modo que

la hidratación de la superficie de los grupos hidrófilos de la superficie de las

membranas, afecta el transporte de nutrientes y productos de dicha membrana

(Morris, et al. 1983). Por el contrario el incremento de la productividad en el

mosto de melaza a partir de las 144 horas posiblemente se deba a que

Saccharomyces cerevisiae se adapta muy bien en este medio, ya que presenta

un requerimiento energético en condiciones anaerobias de 0,036 gramos de



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célula por gramo de sustrato-hora, y en función de la cepa empleada se tiene

un contenido residual de azúcar de 10-56 g/L, lo que influencia el tiempo de

fermentación, el cual va de 119 a 170 horas (Sablayrolles, 2009).



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V. CONCLUSIONES

La mayor productividad de etanol por Saccharomyces cerevisiae var.

ellipsoideus MIT L-51 se alcanzó a las 72 horas y fue de 72.25 x10-1 g

et/g lev/h en mosto de Annona squamosa “anuna” a concentración de

30% (p/v).

La mayor producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae var.

ellipsoideus MIT L-51, se alcanzó en mosto de Annona squamosa

“anuna” a concentración de 30% (p/v) y fue de 0.27 ml/L.

Se optimizó el proceso de producción de etanol por Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 utilizando mosto de Annona

squamosa “anuna”, manteniendo la máxima concentración de mosto de

“anuna”, temperatura y pH de 3.5.

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 durante 168 horas

de fermentación produce un grado alcohólico de 1.611%etanol, 8.380

%etanol y 12.504 %etanol, en mosto de Annona squamosa “anuna” al

10%, 20%, 30% (p/v) respectivamente.



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VI. RECOMENDACIONES

Esta investigación permitió determinar aspectos críticos en la cual se podrían

mejorar asegurando un mayor nivel de optimización si se investigan otros

aspectos, por lo cual se recomienda:

Evaluar pruebas experimentales utilizando mayores concentraciones del

fruto de “anuna”.

Controlar la temperatura de fermentación.

Determinar un patrón de grado de madurez del fruto de “anuna” así

mismo implementar un protocolo de características organolépticas para

mejores resultados.

Controlar el CO2 liberado para resultados más precisos.

Experimentar con equipos de alta precisión para la obtención de

mejores resultados.



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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Apuntes agroeconómicos. La industria del etanol. FAUBA. Disponible en: www.agro.uba.ar/apuntes/no_6/etanol.htm 1

Bartra, E., Casado, M., Carro, D., Campama, C. 2010. "Differential expression of thiamine biosynthetic genes in yeast strains with high and low production of hydrogen sulfide during wine fermentation." Journal of applied microbiology 109(1): 272-281. Brock, T., Madigan, M. 1982. Microbiología Sexta Edición. Printice Hall Hipanoamerica S.A. Castro, J. 2009. Efecto del pH y la temperatura sobre la producción de etanol y dióxido de carbono por Saccharomyces cereviceae a partir de la malta de Hordeum vulgare. Tesis para Obtener el Título Profesional de Biólogo– Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo – Perú. Carpenter, P. 1969. Microbiología Segunda Edición. Mexico, DF. Editorial Interamerica, S.A. Cooper, T. 1982. Metabolismo del nitrógeno. The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae. 2da Ed. Doran, P. 1998. Principios de ingeniería de los bioprocesos. Zaragoza, España. Editorial Acribia, S.A. Fajardo, E., Sarmiento, S. 2007. Evaluación de la melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces cerevisiae. Trabajo de grado para la obtención del título de Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Microbiología Industrial. Extraído en 17 de Noviembre de 2008, del sitio Web de Pontificia Universidad Javeriana. Disponible en: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis26.pdf.



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cerevisiae. Tesis para Optar el Titulo de Biólogo – Microbiólogo. Universidad Nacional de Trujillo – Perú. Gómez, K. 2009. Producción de etanol por dos cultivos de Saccharomyces

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Yeramian, N., Verela, F., Calderón, F., Colomo, B., Morata, A., Suarez, J., Sancho, E. 2001. Acidificación del mosto por Saccharomyces spp. VI jornadas científicas. Grupo de investigación enológica.



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ANEXOS



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Anexo 8.1. Annona squamosa “anuna” fruto utilizado para la fermentación de

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.



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Anexo 8.2. Composición de Agar Papa Sacarosado (APS) utilizado para

reactivar el cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51

para el proceso fermentativo con Annona squamosa “anuna”

Agar agar 4.5 gramos

Suero de papa 75 gramos

Azúcar 12 gramos

H2O destilada 300 ml

Disolver y llevar a ebullición, esterilizar en autoclave a 15 lb. de presión a 121

0C y durante 15 minutos.



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Anexo 8.3. Composición (g/L) de Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA)

utilizado para la propagación y estandarización del cultivo de Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 para el proceso fermentativo con Annona

squamosa “anuna”

Extracto de levadura 5.0 gramos

D(+) glucosa 10.0 gramos

Agar agar 15.0 gramos

Oxitetraciclina 0.1 gramos

Gentamicina 0.05 gramos

Disolver 30 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min. A 121ºC), dejar enfriar hasta

unos 50ºC, incorporar 0.1 g/litro de Oxitetraciclina en forma de solución acuosa

y 0.05 g/litro de Gentamicina (1 mL/litro de Gentamicina en solución) y verter en

placas a pH: 6.5 ±0,2



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Anexo 8.4. Valor nutricional en 100 gramos de pulpa (según morton, 1987)

COMPONENTES CONCENTRACIÓN

Calorías 88,9 – 95,7

Humedad 69,8 – 75,18 g

Grasa 0,26 – 1,10 g

Carbohidratos 19,16 – 25,19 g

Azúcares totales 21.50 g Proteína 1,53 – 2,38 g

Fibra 1,14 – 2,50 g

Cenizas 0,55 – 1,34 mg

Fósforo 23,6 – 55,3 mg

Calcio 19,4 – 44,7 mg

Hierro 0,28 – 1,34 mg

Triptofano 9 – 10 mg

Metionina 7 – 8 mg

Lisina 54 – 69 mg

Caroteno 5 – 7 U.I.

Tiamina 0,10 – 0,13 mg

Riboflavina 0,113 – 0,167 mg

Niacina 0,654 – 0,931 mg

Ácido ascórbico 34,7 – 42,2 mg

FUENTE: Eugenio de Jesús Guerrero, Gerhard Fischer;

Manejo integrado en el cultivo de anuna.



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Anexo 8.5. Reactivación de cultivo, observación macroscópica de

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Agar Papa

Sacarosado (APS) inclinado, utilizando la técnica de siembra en estría

después de ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.

Anexo 8.6. Verificación de la pureza, Saccharomyces cerevisiae var.

ellipsoideus MIT L-51, observación microscópica al fresco 100x.



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Anexo 8.7. Propagación del cultivo. Observación macroscópica de

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Oxitetraciclina

Gentamicina Agar (OGA), utilizando la técnica de siembra en estría después de

ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.



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Anexo 8.8. Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer

Se coloca 1 ml de la muestra en un tubo de ensayo. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentradas será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica.

Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.

Tomar inmediatamente una muestra con una pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultara la evaluación precisa de la población microbiana.

Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco débil (10x) la zona cuadriculada que se muestra en la figura 03.

Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se muestra divido en 5x5 cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su vez se encuentran divididos en 16 cuadros más pequeños (C3) de 0.05mm de lado.

Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40x), contando el número de células que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites de los cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las posibilidades de contar células dos veces.

Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por ml. En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican:

Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente x 104 para reportar el número de células por ml.

Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar de los cuadros de las esquinas (1x1 mm de lado y divididos en 4x4). De esta manera se cuantificaran mas 200 células. Después dividir el número total de



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células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio por cuadro grande. Después multiplicar este valor por x 104 para reportar el número de células por ml.

En el caso de que se observen más de 200 células por grande (C1), se deberán contar las células de los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de cuadros usados para la cuenta y para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar x 104 para reportar el número de células por ml.

El factor de 104 por el cual se debe multiplicar el número de células por cuadrado grande (C1) es porque este cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm3 (mide 1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1 mm)

# Células/cuadro C1 (25 cuadros C2) = # células/0.1 mm3 x104 = # células/mL

En el caso de que el # de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y se hará la corrección como sigue:

# células/mL. En la muestra diluida x (factor de dilución) = # células/mL. En la suspensión original

Anexo 8.8.1. Cuenta en cámara de Neubauer. Extraído de: María de los

Ángeles Aquiahuati Ramos y Col. 2004. Manual de prácticas del laboratorio de

microbiología general. Universidad Autónoma Metropolitana- unidad iztapalapa.

Primera edición. México, D.F.



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Anexo 8.8.2. Observación microscópica, en fresco, de Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en cámara de Neubauer a 100x



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Anexo 8.9. Biorreactores conteniendo los mostos y los sedimentos de Annona

squamosa “anuna” y melaza utilizado como testigo, después de finalizada la

fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.



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Anexo 8.10. Equipo de destilación para determinar el grado alcohólico

producido por Saccharomyces cerevisiae MIT L-51 en mosto de Annona

squamosa “anuna”



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Anexo 8.11. Calculo del volumen de CO2 (técnica de las densidades)

Para esta técnica se utilizó un densímetro calibrado a 20 0C.

Sabiendo que:

La Densidad de un líquido es la relación entre su masa y su volumen.

Donde P es la densidad, m la masa, y V el volumen.

La densidad del agua pura es 1. Dado que 1 Kg de agua tiene un volumen de 1 Litro. Por lo que un líquido azucarado (como el mosto) tendrá una densidad siempre mayor a 1.

El peso molecular del Etanol o Alcohol Etílico es: 46.0688 y por otro lado el peso molecular del dióxido de carbono es: 44.0098 y la densidad del etanol es 0.79 Kg por Litro.

Por los pesos moleculares que mencionamos anteriormente, entonces, por cada 44.0098 gramos de CO2 que se escapan, 46.0688 gramos de Alcohol Etílico han sido formados. O bien, por cada gramo de CO2, 1.05 gramos de Alcohol Etílico han sido ganados.

Entonces:

%ABV= (OG-FG)*131 Vol. de CO2 en el fermentador= OG-FG

Donde:

%ABV: porcentaje de alcohol en volumen

OG: densidad inicial

OF: densidad final

Extraído de: García, J. 2013. BREWMASTERS. Insumos, equipo, cerveza y

amigos. Cómo Medir el Contenido de Alcohol en la Cerveza. Disponible en:

http://www.brewmasters.com.mx/como-medir-el-contenido-de-alcohol-en-la-

cerveza/



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http://www.brewmasters.com.mx/como-medir-el-contenido-de-alcohol-en-la-cerveza/

http://www.brewmasters.com.mx/como-medir-el-contenido-de-alcohol-en-la-cerveza/

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Anexo 8.12. Calculo de la productividad mediante el método de Davies-

Griffieth (1982) modificado.

1. Medir el volumen de CO2 producido en un tiempo determinado, en

base a la técnica de las densidades.

2. Calcular los ml de CO2 producido por hora.

3. Calcular los ml de CO2 producido por gramo de levadura.

4. Calcular la productividad:

- Considerando que 1mol de CO2 ocupa 22.4 L a 1 atmosfera

de presión y a 298 0K, calcular el volumen en base a las

condiciones trabajadas.

Utilizar la siguiente equivalencia:

=

- Calcular el número de moles de CO2 producido, que es

equivalente al número de moles de etanol.

- Convertir el numero de moles de etanol a gramos de etanol,

considerando que: numero de moles = W (g)/PM del etanol.

- Los resultados se expresan en gramos de etanol por gramo

de levadura por hora.

Extraído de: Villanueva E., Robles H. y Otiniano M. 2007. Guía de Practicas de

Microbiología Industrial. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú.



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Anexo 8.13. Productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae var.


30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo, durante 168

horas de fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).

CC

Hora Annona squamosa “anuna” MELAZA

10% 20% 30% 20%

24 2.05 2.24 4.11 46.75

48 4.17 29.57 18.65 233.38

72 3.18 36.87 72.25 380.82

96 4.73 32.63 50.62 383.33

120 3.05 24.86 38.37 350.41

144 1.44 8.61 17.14 311.52

168 0.75 4.84 8.37 340.87



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Anexo 8.14. Planteamiento de problema e hipótesis en la investigación de

fermentación con mosto de Annona squamosa “anuna”.

PROBLEMA

¿Cuál será la producción óptima del etanol por Saccharomyces cerevisiae var.

Ellipsoideus MIT-L51 en mosto de Annona squamosa “anuna” en comparación

con mosto de Saccharum officinarum “caña de azúcar”?

HIPÓTESIS

La producción óptima de etanol obtenida a la concentración en mosto de

Annona squamosa al 10% no difiere a la producción optima de etanol obtenida

a la concentración de Annona squamosa al 20%

HO: µ1 - µ2 = 0

Hi : µ1 - µ2 ≠ 0




HO: µ1- µ3 = 0

Hi : µ1 - µ3 ≠ 0



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HO: µ2- µ3 = 0

Hi : µ2 - µ3 ≠ 0


Annona squamosa al 10% no difiere a la producción de etanol obtenida a la

concentración de melaza al 20%

HO: µ1- µm = 0

Hi : µ1- µm ≠ 0




HO: µ2- µm = 0

Hi : µ2- µm ≠ 0




HO: µ3- µm = 0

Hi : µ3- µm ≠ 0



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ANEXO 8.15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO “t” DE STUDENT DE LA OPTIMIZACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL POR

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 A PARTIR DE MOSTO DE Annona squamosa “anuna” Y MOSTO DE

MELAZA

ANÁLISIS DE VARIANZA:

Numero de tratamientos: t=4

Número de repeticiones por cada ensayo: rj=3

Numero de total de tratamientos: N=12

Desarrollo de datos para el análisis de varianza: cantidad de etanol producido en el proceso de optimización por

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza

Biorreactor R1 R2 R3 Tj (Tj)2 (R1)2 (R2)2 (R3)2 Anuna 10% 0.065 0.026 0.039 0.130 0.0169 0.004225 0.000676 0.001521 Anuna 20% 0.129 0.193 0.219 0.541 0.2927 0.016641 0.037249 0.047961 Anuna 30% 0.258 0.233 0.297 0.788 0.6209 0.066564 0.054289 0.088209 Melaza 20% 2.299 2.098 2.768 7.165 51.337 5.285401 4.401604 7.661824 ∑ 2.751 2.550 3.323 8.624 52.2675 5.372831 4.493818 7.799515

∑Y2ij 17.666164



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A=∑Tj =8.624 B= A2/N = 6.198 ∑Y2ij = 17.666164

Base de datos del análisis de varianza: optimización del proceso a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” por

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.

FUENTE SUMA DE CUADRADOS GRADOS DE LIBERTAD EMC (Esperanza media de cuadrados)

TRATAMIENTO St =∑Tj2/rj –B= 11.225 t-1=3 Mt= St/(t-1)= 3.742 ERROR Se =∑Y2ij - ∑Tj2/rj= 0.244 N-t=8 Me= s2= Se/(N-t)=0.031 TOTAL St + Se=11.469 N-1=11

FO= Mt/Me= 120.71

HO: [ENSAYO]i =0

Hi : [ENSAYO]i ≠ 0

Según la tabla: F(t-1), (N-t), 5% = F3, 8, 5% = 4.07 FO > FTABLA = se rechaza HO

Los tratamientos tienen una diferencia significativa, las condiciones de los ensayos no son nulas y afectan la optimización del proceso de producción de etanol a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51



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DIFERENCIA MINIMA SIGNIFICATIVA (DLS):

I. HO: µX = µY : Las condiciones del ensayo surten el mismo efecto II. H1: µX ≠ µY : Las condiciones del ensayo surten diferente efecto III. DLS = t N-t, 1-α/2 x (2S2/r)1/2

. Cuando: α = 0.05

t N-t, 1-α/2 = t8, 0.975 = 2.306 (2S2/r)1/2 = (2 x 0.031/3)1/2 = 0.144

DLS: 2.306 x 0.144= 0.332

Concentración de etanol en la optimización del proceso a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” por Saccharomyces

cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.

Experimentos R1 R2 R3 Ppromedio Anuna 10% (E10) 0.065 0.026 0.039 0.043 Anuna 20% (E20) 0.129 0.193 0.219 0.180 Anuna 30% (E30) 0.258 0.233 0.297 0.263 Melaza 20%(M20) 2.299 2.098 2.768 2.388



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µ10=µ20, como I E10-E20 I = I - 0.137 I < 0.332, entonces se acepta HO » µ10=µ20,

No existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 10% anuna y 20% anuna

µ10=µ30, como I E10-E30 I = I - 0.220 I < 0.332, entonces se acepta HO » µ10=µ30


µ10=µM20, como I E10-M20 I = I -2.345 I >0.332, entonces se rechaza HO » µ10≠µM20

Existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 10% anuna y 20% melaza

µ20=µ30, como I E20-E30 I = I -0.083 I < 0.332, entonces se acepta HO » µ20=µ30



Existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 20% anuna y 20/% melaza


Existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 30% anuna y 20% melaza



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