Ficha de Cultivo y Aislamiento de Arthrobotrys Oligospora
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UNAH | FACULTAD DE CIENCIAS | ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA 2014 Página 1 de 3 AGENTES NEMATÓFAGOS EVALUADOS Arthrobotrys oligospora NEMÁTODOS UTILIZADOS Haemonchus contortus FORMAS DE CULTIVO & AISLAMIENTO (CONDICIONES Y RESULTADOS) A. OBTENCIÓN DE HONGOS NEMATÓFAGOS DEL SUELO TÉCNICA: SIEMBRA DIRECTA & INOCULACIÓN DIRECTA (Larsen et. al, 1991) MEDIO: CHF-WA (Cloranfenicol [0.05%] Agar Agua [2%]), Agar Agua [2%] MUESTRA: Muestra de suelos de pastoreo, Heces fecales de oveja. FORMA DE SIEMBRA 1. 10 g de muestras + 50 mL agua destilada, mezclada vigorosamente por 30 minutos y reposo por 10 minutos adicionales. 2. Se tomo sobrenadante y se inoculo 1 mL en placas de CHF-WA, incubándose a 25°C / 3 días. 3. Se tomo 2 g de heces fecales, se homogenizaron y se inocularon directamente en Agar Agua, incubándose a 25°C / 3 días. B. INFECCIÓN DE LARVAS (NEMÁTODOS: NOMBRE) 1. Se agrego a ambos cultivos de la sección A.2 y A.3, aproximadamente 500-1000 larvas de Haemoncus contortus. Las larvas fueron obtenidas por la técnica de Baermann y mediante experimentación IN VIVO en oveja. 2. Ambos cultivos fueron incubados posteriormente a 25°C / 2 meses. 3. Monitoreo 3-4 veces por semana hasta completar 2 meses. C. EVALUACIÓN DE LARVAS & HONGOS NEMATÓFAGOS C.1 EVALUACIÓN DE LARVAS E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS NEMATÓFAGOS 1. Se utilizo estereoscopio para visualización de conidias, estructuras miceliales y trampas nematofágicas. 2. Se realizo transferencia de piezas de 2x2 mm de cultivo de sección B en Agar CHF-WA 3. Se utilizo cepas de referencia para identificación de hongos 4. Los aislamientos identificados con las claves y criterios de la sección C.3 fueron resembrados en AGAR PDA, incubándose a 25°C / 3 semanas. C.3 CRITERIOS DE IDENTIFICACIÓN PARA LOS HONGOS NEMATÓFAGOS 1. Uso de claves (Cooke, R.C. and Godfrey, B.E.S. (1964); Haard, K. (1968)) a. Tamaño de conidias y clamidosporas b. Formas c. Número y configuración de conidias d. Presencia o ausencia de clamidosporas e. Tipo de estructura con actividad nematófaga y forma de acción.
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Serie: Hongos Nematofagos y su aplicación en CBP y Veterinaria
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AGENTES NEMATÓFAGOS EVALUADOS
Arthrobotrys oligospora
NEMÁTODOS UTILIZADOS
Haemonchus contortus
FORMAS DE CULTIVO & AISLAMIENTO (CONDICIONES Y RESULTADOS)
A. OBTENCIÓN DE HONGOS NEMATÓFAGOS DEL SUELO
TÉCNICA: SIEMBRA DIRECTA & INOCULACIÓN DIRECTA (Larsen et. al, 1991)
MEDIO: CHF-WA (Cloranfenicol [0.05%] Agar Agua [2%]), Agar Agua [2%] MUESTRA: Muestra de suelos de pastoreo, Heces fecales de oveja. FORMA DE SIEMBRA
1. 10 g de muestras + 50 mL agua destilada, mezclada vigorosamente por 30 minutos y reposo por 10 minutos adicionales. 2. Se tomo sobrenadante y se inoculo 1 mL en placas de CHF-WA, incubándose a 25°C / 3 días. 3. Se tomo 2 g de heces fecales, se homogenizaron y se inocularon directamente en Agar Agua, incubándose a 25°C / 3 días.
B. INFECCIÓN DE LARVAS (NEMÁTODOS: NOMBRE)
1. Se agrego a ambos cultivos de la sección A.2 y A.3, aproximadamente 500-1000 larvas de Haemoncus contortus. Las larvas fueron obtenidas por la técnica de Baermann y mediante experimentación IN VIVO en oveja.
2. Ambos cultivos fueron incubados posteriormente a 25°C / 2 meses. 3. Monitoreo 3-4 veces por semana hasta completar 2 meses.
C. EVALUACIÓN DE LARVAS & HONGOS NEMATÓFAGOS C.1 EVALUACIÓN DE LARVAS E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS NEMATÓFAGOS 1. Se utilizo estereoscopio para visualización de conidias, estructuras miceliales y trampas nematofágicas. 2. Se realizo transferencia de piezas de 2x2 mm de cultivo de sección B en Agar CHF-WA 3. Se utilizo cepas de referencia para identificación de hongos 4. Los aislamientos identificados con las claves y criterios de la sección C.3 fueron resembrados en AGAR PDA, incubándose a 25°C / 3 semanas.
C.3 CRITERIOS DE IDENTIFICACIÓN PARA LOS HONGOS NEMATÓFAGOS 1. Uso de claves (Cooke, R.C. and Godfrey, B.E.S. (1964); Haard, K. (1968))
a. Tamaño de conidias y clamidosporas b. Formas c. Número y configuración de conidias d. Presencia o ausencia de clamidosporas e. Tipo de estructura con actividad nematófaga y forma de acción.
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C.5 RESULTADOS Se obtuvieron los aislamientos a partir de PDA, según la descripción de la sección C.1.4 identificándose las siguientes especies:
1. Arthrobotrys oligospora variantes IRAN 877 C, IRAN 878 C & IRAN 879 C 2. Se evaluó el efecto de la temperatura para la velocidad y calidad de crecimiento del hongo nematófago, obteniéndose
mejores tasas de crecimiento a 15-25 °C.
SECCIÓN MORFOLOGÍA CELULAR & COLONIAL
EN FOTOGRAFÍA (A). IRAN 878 C (B). CBS 111.37 (C). Contaminación con macroconidia multicelular curvada
con Fusarium spp. (flecha) (D). IRAN 879 C (E). CBS 251.82 (F). IRAN 877 C. (G). Conidia en forma de gota (flecha simple) y
clamidosporas características en forma circular u ovoide de CBS 583.91 D. flagrans (flecha doble).
(H). Clamidospora intercalaria (flecha) (I). Formación de trampa (flecha).
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Ghahfarokhi, M. et. al. Screening of Soil and Sheep Faecal Samples for Predacious Fungi: Isolation and Characterization of the Nematode-Trapping Fungus Arthrobotrys oligospora. Iranian Biomedical Journal 8 (3): 135-142 (July 2004)
2. Larsen, M., Wolstrup, J., Henriksen, S.A., Dackman, C., Gronvold, J. and Nansen, P. (1991) In vitro stress selection of nematophagous fungi for biocontrol of parasitic nematodes in ruminants. J. Helminthol. 65: 193-200.
