AUTOFAGIA HEPÁTICA TRAS QUEMADURAS SEVERAS EN RESPUESTA AL ESTRÉS DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO

Juquan Song, MD, Jana de Libero, MD, and Steven E. Wolf, MD

Journal of surgical research, 2 de Octubre-2013

María Alejandra Aristizábal Giraldo y Juan José Garcés

PALABRAS CLAVE

Llamadas también descriptores o encabezamientos de materia

Constituyen la mejor herramienta con la que se puede clasificar la información y es una de las secciones que más se cuidan para la

publicación de cualquier artículo

¿Qué son?

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1. Dan una idea breve sobre el contenido del

artículo.

RAZONES POR LAS CUALES SON IMPORTANTES

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2. Indican al lector bajo qué nombre buscar más

información sobre el tema que trata el artículo.

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3. Sirven para estructurar el índice, por tema, llamado anual o

acumulativo

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4. Con ellas se lleva a cabo el análisis y clasificación del

artículo en los índices internacionales.

5. Facilita las entradas (descriptores) en los

sistemas de indización y de recuperación de la

información.

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6. Nos permite detallar la información usando palabras que sean

adecuadas.

No debe subestimarse su trascendencia, porque se puede dificultar la difusión del documento e incluso su total olvido por

problemas de identificación

De la buena elección de la palabra clave, el artículo será ubicado por mayor cantidad

de investigadores

Hígado de ratón

Retículo endoplásmico

Autofagia

Apoptosis

Lesión térmica

PALABRAS CLAVE

12

34

5

¿QUÉ SIGNIFICAN LOS PEQUEÑOS NÚMEROS DE LA INTRODUCCIÓN?

Los números sirven para remitir al lector a las referencias bibliográficas, y bases de datos que fueron usadas por los autores, para orientar y

sustentar su tesis, brindando una validez académica al artículo

Esta remisión bibliográfica tiene gran importancia para el lector. Pues con estas fuentes puede

profundizar los temas que de pronto no quedaron claros, o para tener una concepción

más global de la lectura.

INTRODUCCIÓNESTUDIOS

Calcio intracelular

Estrés del R.E

Mal plegamiento de proteínas

DISFUNCIÓN HEPÁTICA

Supervivencia de la célula a corto plazo

Autofagia

Estrés prolongado: Apoptosis

4 semanas

AUTOFAGIA(+) situación de estrés

inaniciónAusencia factores de crecimiento

infección Estrés oxidativo

hipoxia

Homeostasis

Ubiquitina

Proteínas ATG

Las proteínas ATG forman complejos funcionales que median las etapas básicas de la macroautofagia

Iniciación1 Activar el complejo fosfatidil inositol 3

Liberación de la beclin-1 (proteínas antiapoptóticas)

Se producen gracias a señales de supervivencia

Nucleación

Elongación de membrana

2

3

Movilización del complejo PI3 al sitio de la formación de la membrana limitante

ATG 5LC3 activada

(proteína asociada al microtúbulo)

ATG 7ATG 3

Fusión de el autofagosoma

con el lisosoma

5

Reconocimiento de carga

4Activación de las

quinasas tipo Unc-51 (UKL)

ATG13 y FIP200

FOSFORILA

OTROS TIPOS DE AUTOFAGIA

mTORAMP

Proteína quinasa ( AMPK)

(+)

(--)

Quinasa tipo Unc-51 (1 y 2) ( UKL desfosforiladas)

Homóloga a ATG1

AUTOFAGIA

Rapamicina

ATP(--)

(+)

ATG13 y FIP200

FOSFORILA

(+)

Proteína presente en las células de los

animales mamíferos

 Control del inicio de la transcripción

del ARN

Regulación del crecimiento,

proliferación y muerte celular

 Tráfico de membrana, la

formación de ribosomas.

CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y DE EXCLUSIÓN

Cada estudio clínico controlado aleatorizado

trata un tema de importancia para alguna

población con el trastorno en cuestión.

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Los autores de los estudios clínicos

generalmente restringen esta

población mediante el uso de criterios de

elegibilidad.

Los criterios de inclusión y exclusión son las normas para decidir a quién se le permite entrar o no en un ensayo.

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Los criterios típicos de selección pueden estar relacionados con la edad, el sexo,

el diagnóstico clínico y las patologías

CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Son un conjunto de propiedades cuyo cumplimiento identifica a un

individuo que pertenece a la población en estudio. Su objetivo es delimitar a la

Población ouniverso de discurso.

CRITERIOS DE EXCLUSIÓN

Son un conjunto de propiedades cuyo cumplimiento identifica a un

individuo que por sus características podría generar sesgo en la estimación de la relación

entre variables, aumento de la varianza de las mismas o presentar un riesgo en su salud

por su participación en el estudio. Su objetivo es reducir los sesgos, y aumentar la eficiencia en la

estimación.

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Además, los criterios de exclusión se utilizan para garantizar la seguridad de

los pacientes.

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EjemplosCriterios de inclusión

Pacientes consecutivos hospitalizados luego de una mordedura de serpiente que necesitaron un antídoto debido a un envenenamiento sistémico o localizado grave.

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Criterios de exclusión• Los pacientes serán excluidos del estudio si:• Están embarazadas.• Son menores de 12 años o mayores de 70.• Declaran haber recibido antisueros, incluso

antídotos.

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Sirve para recoger, organizar, resumir y

analizar datos y así sacar conclusiones válidas y

tomar decisiones razonables basadas en el

análisis hecho

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

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Se realiza un muestreo es decir una muestra representativa de la

población.

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Se recolectan datos de cada elemento muestreado. Finalmente se infiere

estadísticamente algo sobre la población y se concluye sobre alguna característica de la población en la que se realizó el estudio.

Los análisis estadísticos sirven para comparar lo que se observa con lo

que se espera.

Es fundamental para que exista un consenso mundial.

Si la P ( significancia estadística) es menor a 0,05;

nadie puede refutar y se afirma que se presentan diferencias estadísticas

significativas

MATERIALES Y MÉTODOLOGÍA

Masculinos

6-8 semanas de edad (adulto)

16 ratones

Jackson laboratory (Bar Harbor)

Incubados en cubículos

12h

12h

MUESTRA

A) QUEMA DE RATONES

Avertin 1,2%(250mg/ Kg peso)

1 2

Superficie dorsal y lateral

31ml de

solución salina al 9%

16 ratones16

ratones

8 ratones

48 ratones

12% del área

corporal

5

8 ratones: los quemados

8 ratones: los no quemados

97ºC 25ºC

6 1ml de solución lactato Ringer y 0,05 mg/Kg peso de buprenorfina

8 ratones: los quemados

7

24 horas

8 9

B) MÉTODO DE TUNEL Y TINCIÓN CON INMUNOFLUORESCENCIA

1 PARAFINA:PRESERVAR

Método de TUNELA) Se removió la parafina de 5 micrómetros del tejido.B) Se trató con 100 microlitros de solución de proteinasa k, cuyo objetivo es degradar las membranas celulares, liberando las proteínas. (20microgramo/ ml) por 10 minutos.C) Se fijó en metanol al 4%.D) Se incubó con 50 microlitros de terminal deowynucleotidy i transferasa (dUDP) durante una hora a 37ºC

2Es un método para detectar la fragmentación del ADN marcando el extremo terminal de los ácidos nucleicos

3 10 microlitros de Prolong Gold antifade

Preserva fluorescencia

DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol)

Marcador fluorescente

C) HEPATOCITOS IN VITRO

1

Dulbecco's modified eagle's medium ( DMEM)

Hepatocito de carcinoma humano

2

Confluencia celular

Ácido etilendiaminotetraacético (tripsina al 0,25%)

Facilita liberación individual de la célula

3 Placa microtituladora

100 nmol/ L de Thapsigargin (TG)

24 horas

Induce estrés en el retículo

4 5

SE REALIZÓ 4 VECES DE FORMA INDEPENDIENTE

Se recoge el lisado celular y se extrae las

proteínas para su posterior

análisis

D) ACTIVIDAD DE LA CASPASA 3 EN EL CITOSOL

MÉTODO FLUOROMÉTRICO

20 microgramos de la proteína extraída se incuban con 5 mmol/L de rodamina 110 (Z-DEVD-R110) durante 30 min a temperatura de un cuarto

sin luz.

sustrato las proteasas principalmente de la caspasa 3 y 7

520 nm

Lector de fluorescencia

Fluostar

Absorbancia

E) NIVELES DE ATP EN EL CITOSOL

No especifican el procedimiento.

Midieron los niveles de ATP in vitro acorde a las instrucciones del productor (Biovision, Milpitas, Ca)

F) INMUNOTRANSFERENCIA

30 mg de tejido se homogeniza con la extracción proteica

Inhibidor de la proteasa (Halt protease inhibitor cocktail)

20000g por 30 min a 4ºC

Se descarta el sedimento

Para que las proteínas no sea destruidas, es decir para que permanezcan

Se toman muestras de 30 microgramos de cada

proteína

Es analizado bajo la prueba

SDS-PAGE 

para separar las proteínas de interés 

ATG3 ATG5

LC3A LC3B

Beclin-1

ULK1

mTOR

AMPK

GAPDH

B-actin

CONTROL

Western blot

Electroforesis en gel

Uso de anticuerpos

específicos contra ella.

G) ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se usó el método analítico Student T test

Se aplica cuando la población estudiada sigue una distribución normal pero el tamaño muestral

es demasiado pequeño

P<0,05 (SIGNIFICANCIA ESTADISTICA)

RESULTADOS

DISCUSIÓNCon este estudio, los autores observaron

la expresión de señales de autofagia. Las más evidenciables y reconocibles en su proyecto fueron la ATG3, ATG5 y LC3, que aumentaron significativamente en el hígado de un ratón quemado, 24 horas después de la lesión.

En el modelo in vitro, se encontró que el estrés del retículo inducido por la TG, disminuía los niveles de ATP en el citosol, activando las señales de AMPK/ MTOR en el hepatocito, induciendo así la autofagia.

NUESTRA CONCLUSIÓNEste trabajo nos pareció muy enriquecedor, fructífero y

determinante para nuestra formación porque:

1) Aprendimos la composición estructural básica para la elaboración de una artículo científico y la importancia de conocer los parámetros de publicación

de las revistas.

2) Comprendimos la importancia de la publicación de un articulo científico, que es básicamente la contribución al desarrollo de la

sociedad y la disminución de tiempo invertido para próximas investigaciones

3) Entendimos que la investigación es un componente fundamental de todas las áreas de conocimiento.

NORMAS DEL ARTÍCULONORMAS VANCOUVER

Dan las pautas para la publicación de artículos científicos en revistas

biomédicas

Existe una relación entre los documentos

consultados y citados en el texto

Las referencias bibliográficas son organizadas por el

número de cita que les fue asignado en el texto

Cumple con la numeración de divisiones y subdivisiones; para

clarificar la secuencia e importancia de las mismas

Las referencias bibliográficas se enumeran consecutivamente en el orden de aparición en el

texto. Y se identifican mediante números arábigos entre paréntesis (1), corchetes [1], superíndice 1, o una combinación de corchetes más superíndice [1].

Los decimales están separados por un punto y

no una coma.

Cuando citan a un autor en el cuerpo del texto, citan primero a el autor y luego

ponen “et al.” en itálica. (Ejemplo: Según González et al. en su artículo…).

El título REFERENCIAS debe ir en mayúscula y en negrita, no se debe poner Bibliografía o Referencia

bibliográficas.

BIBLIOGRAFÍA• Juquan Song, Jana de Libero, Steven E. Wolf. Autofagia hepática tras

quemaduras severas en respuesta al estrés del retículo endoplásmico. JRS. 2 de Octubre del 2013. 128-132

• Cooper, Geoffrey M; Hausman, Robert E. La célula. Editorial Marbán. 4º edición.

• Esta entrada fue publicada el 25/10/2011,Disponible en Internet: http://nutricionpersonalizada.wordpress.com/2011/10/25/macroautofagia_regulacion_metabolismo_lipidos/#top

• Esta página fue actualizada por última vez el 8/6/2011. Disponible en Internet: https://globalhealthtrials.tghn.org/site_media/media/articles/trialprotocoltool_sp/SOURCE/Checklist/StudyPop/Inclusion%20y%20exclusion.html