Producción de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500Análisis, diseño y optimización

28/02/2012

Contenido

1. INTRODUCCION..............................................................................................................................2

1.1 Estructura y función de las pectinas.........................................................................................2

1.2 Microorganismos que producen pectinasas............................................................................3

1.3 Las características de género Aspergillus.................................................................................4

1.4 Aspergillus flavipes FP-500.......................................................................................................4

2. OBJETIVOS......................................................................................................................................4

2.1 Objetivo General......................................................................................................................4

2.2 Objetivos Particulares...............................................................................................................4

3 INGENIERÍA BÁSICA.........................................................................................................................5

3.1 Bases del Diseño...........................................................................................................................5

Capacidad Instalada...................................................................................................................5

Factor de Servicio.......................................................................................................................5

Sistema de Fermentación...........................................................................................................6

Productividad del fermentador..................................................................................................6

Volumen de trabajo del fermentador........................................................................................6

Composición del Medio..............................................................................................................6

Rendimiento en la recuperación y producción...........................................................................7

3.2 Biosíntesis del producto...........................................................................................................7

Cinética de fermentación...........................................................................................................7

Modelamiento............................................................................................................................8

Simulación y optimización..........................................................................................................8

3.3 Recuperación y purificación del producto..................................................................................12

a) Información técnica sobre los diferentes bioprocesos existentes............................................12

Recuperación y purificación de pectinasas...................................................................................14

BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................................16

Anexo 1............................................................................................................................................16

1

1. INTRODUCCION

1.1 Estructura y función de las pectinas

La pectina es uno de los polisacáridos más complejos en la naturaleza. Su degradación es producto de un conjunto de enzimas llamadas pectinasas.

Considerando la complejidad estructural de la pectina y el tamaño, resulta difícil su acceso al interior de la célula microbiana. Los microorganismos deben secretar al medio las enzimas necesarias para degradar la pectina y así poder ser metabolizada.

La producción de las pectinasas es un proceso complejo, regulado por diversos factores, de los que destacan la naturaleza y cantidad de la fuente de carbono y el valor del pH del medio de cultivo.

Las pectinas es uno de los heteropolisacáridos más complejos de los que conforman a la pared celular de las plantas y especialmente de los materiales cítricos, su función es la de estabilizar a las microfibrillas de celulosa, así como a otros polímeros y proteínas. Es el componente principal de la lamela media, y se encarga de mantener unidos a los componentes de la misma. Las sustancias pécticas comprenden del 0.5 al 40% del peso seco de la planta (Singh Jayani et al, 2005)

La estructura de la pectina está constituida por dos grandes regiones homogalacturonano (Ilustración 1) y ramnogalacturonano (Ilustración 2). La región homogalacturonano es la de estructura más sencilla. Su cadena lineal esta constituida por unidades de acido D-galacturónico, unidas entre si por enlaces alfa 1-4. A lo largo de dicha cadena se encuentran grupos acetilo (en los grupos hidroxilo de los carbonos 2 y 3) o metilo (en el carbono 6), así como algunos iones de sodio, potasio o amonio (Jayani et al, 2005)

Ilustración 1. Homogalacturano

2

En la región del ramnogalacturonano, las unidades de ácido galacturónico se intercalan con las de L-ramnosa, mediante enlaces beta 1-2 y beta 1-4. Esta región se caracteriza por ramificaciones de azúcar de diversos tipos, que van desde largas cadenas de arabinanos y galactanos, hasta ramificaciones más pequeñas, conformadas por xilosa, ácido ferúlico, apiosa y fructosa, entre otros (de Vries y Visser, 2001)

La complejidad estructural de la pectina puede limitar el rendimiento de diversos procesos industriales que emplean como materia prima este elemento. Por otro lado, en la naturaleza este tipo de materia prima es los sustratos de los microorganismos saprófitos, debido a la capacidad de estos para producir pectinasas.

1.2 Microorganismos que producen pectinasas

Las enzimas pectinolíticas son producidas por una extensa variedad de organismos, tales como nemátodos, protozoarios, levaduras, bacterias y hongos. De los anteriores destacan con potencial industrial los hongos filamentosos, debido a su fácil cultivo, y su alta producción de enzimas extracelulares. La diversidad de las enzimas producidas por estos microorganismos, así como su elevada actividad, provienen de su diversidad metabólica inherente, que se refleja en su habilidad para crecer sobre diversos sustratos bajo una gran variedad de condiciones. Los géneros más utilizados para la producción de las diversas polipectinasas de interés industrial son Trichoderma, Penicillium y Aspergillus, al ser clasificados generalmente como seguros para la salud humana (GRAS, por sus siglas en ingles).

3

Ilustración 2. Rhamnogalacturano

1.3 Las características de género Aspergillus

Los microorganismos del genero Aspergillus (Ilustración 3) son hongos filamentosos que crecen en materia orgánica bajo condiciones aerobias. Se encuentran en suelo, compostas y en materiales de plantas en descomposición. Se caracterizan por tener una estructura mórfica conformada por un conidiosporo, el cual tiene un tallo y una cabeza conidial de más de 700 µm de diámetro, que surge desde la delgada pared micelial, llamada célula pie.

Los hongos del genero Aspergillus crecen en un rango de temperaturas de 6-47 °C, con una temperatura optima entre 35-37 °C y un intervalo de valores de pH de entre 1.4 y 9.8. Tiene la capacidad para crecer en diversas fuentes de carbono.

1.4 Aspergillus flavipes FP-500

El grupo de los Aspergillus flavipes (Ilustración 4) está conformado por una sola especie. Aunque no representan una de las especies de Aspergillus más estudiadas se ha demostrado que producen enzimas degradadoras de polisacáridos como las α-galactosidasas y pectinasas.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo General Análisis, diseño y optimización de la producción de pectiansas mediante Aspergillus flavipes FP-500.

2.2 Objetivos Particulares

Determinación de las bases de diseño para la producción de pectiansas. Modelamiento y optimización de la cinética de fermentación para la síntesis del producto.

4

Ilustración 3. Aspergillus

Ilustración 4. Aspergillus flavipes

3 INGENIERÍA BÁSICA

3.1 Bases del Diseño

Capacidad Instalada

C. I (capacidad instalada) = (2.151gL∗h

¿( 50000 L1 )( 8400h1año )( 1TON1 x106 g )=¿

903.42 ton /año de AG

Memoria de cálculo:

Si sabemos que:1U es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1umol de Acido Galacturónico (Condiciones dadas)

Entonces: 1U 1 μmolde AG

11.03 x 10311080 μmol de AG

Por lo tanto:11080umol de AG= 0.01108 moles de AG

Peso molecular AG 194 g/mol C6H10O7

0.01108 moles(194 gmol

¿=2.151g de AG

2.151g/ L*h de AG

Factor de servicio=0.96

Los días de trabajo:

Año de trabajo dura 350 díasSi se trabaja 3 turnos de 24 horas

Por lo tanto: Se trabaja 8400 horas /año

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Factor de Servicio

De acuerdo a la Ley Federal del Trabajo (Última reforma publicada DOF 17-01-2006), en el artículo 74, son días de descanso obligatorio:

El 1o. de enero

El primer lunes de febrero en conmemoración del 5 de febrero

El tercer lunes de marzo en conmemoración del 21 de marzo

El 1o. de mayo

El 16 de septiembre

El tercer lunes de noviembre en conmemoración del 20 de noviembre

El 1o. de diciembre de cada seis años, cuando corresponda a la transmisión del Poder Ejecutivo Federal

El 25 de diciembre

Otros días:

24 de diciembre

31 de diciembre

1 de Enero

3 días de arranque

El artículo 78 dice que los trabajadores deberán disfrutar en forma continua seis días de vacaciones. Sin embargo, la planta no dejara de laborar esos días pues las vacaciones serán asignadas en periodos diferentes para cada trabajador. Los trabajadores gozaran de un día a la semana de descanso, la ley marca de preferencia un domingo, aunque puede ser cualquier otro día, no obstante la planta tampoco dejara de funcionar ya que se manejaran turnos diferentes para los trabajadores. No se considerarán días no laborales para mantenimiento ya que este se realizara periódicamente. En base a esto el factor de servicio es:

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Sistema de Fermentación

FERMENTACIÓN SUMERGIDA

El cultivo sumergido también llamado fermentación liquida es el que se refiere a un sistema en el cual los sustratos están disueltos o suspendidos en un medio acuoso y son agitados para conservar al homogeneidad del sistema (Ilustración sumergida).

Productividad del fermentador

En la simulación del proceso de producción en el fermentador se obtuvo la siguiente productividad:

Cultivo por lote 6.843 KU/L *h Cultivo por lote alimentado 11.08 KU/L*h

Volumen de trabajo del fermentador

Se propuso que el volumen de operación del fermentador de producción será de 50m 3= 50,000 L.

Composición del Medio.Aspergillus flavipes FP-500 se hizo crecer en medio basal que contenía en g/L: como fuente de carbono pectina; K2HPO4; KH2PO4; (NH4)2SO4. El pH del medio de cultivo se mantuvo constante durante toda la fermentación y se trabajó a 5 (se ajusto con ayuda de soluciones de NaOH o H2SO4 a 2M).

El medio se esterilizó a 121°C y 1.5 psi durante 20 min.

Rendimiento en la recuperación y producción

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Ilustración 5. Fermentación sumergida

Tabla 1. Purificación y recuperación en tres diferentes procesos de separación. (Anexo 1)

Fracción Proteína Total (mg)

Actividad Total(U)

Actividad específica(U/mg)

Purificación(veces)

Recuperación(%)

Filtrado 523.0 3818 7.30 1.0 100Precipitación con etanol

67.8 2205 32.53 4.45 57.77

Sephadex G-100(12%)

6.3 918 145.84 17.24 48.12

3.2 Biosíntesis del producto

Cinética de fermentación

La fermentación de Aspergillus flavipes sobre pectina como fuente de carbono para la producción de pectinasas en un cultivo en lote presenta los valores mostrados en la tabla 1 de biomasa, sustrato y producto

Tabla 2. Cinética de fermentación

Con los valores anteriores fue posible calcular las constantes cinéticas (tabla 2) necesarios para modelar la fermentación.

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t (h) x (g/L) s (g/L) p (kU/L)0 0.1 10 05 0.15 9.6 0.110 0.2 9.5 0.515 0.25 9.3 2.120 0.5 8.5 5.525 1 6.6 1330 2 3.9 24.535 2.7 1.9 3340 3.1 0.6 3845 3.2 0.2 3950 3.25 0.1 39.5

Tabla 3. Constantes cinéticas

Constante Valorμmax 0.11h-1

Ks 0.49g/Lms 0.01gsust/gcel hYg 0.40gcel/gsust

N 1Α 10 kU/gcel

Β 0 kU/gcel h

ModelamientoSe modelo la cinética de fermentación experimental utilizando el software matemático Mathcad utilizando las constantes cinéticas previamente calculadas. El siguiente gráfico muestra la correlación entre los datos experimentales y el modelo calculado.

Se modeló la cinética de fermentación experimental utilizando el software matemático Mathcad utilizando las constantes cinéticas previamente calculadas. La ilustración 6 muestra la correlación entre los datos experimentales y el modelo calculado. Podemos observar en la gráfica que los datos experimentales se ajustan bastante bien a la gráfica del modelo calculado.

Ilustración 6. Relación entre los datos experimentales y el modelo calculado. Línea continua: modelo calculado y Línea punteada: datos experimentales.

Simulación y optimización Cultivo por lote

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Se realizó una simulación del modelo anterior en un cultivo por lote, cambiando las variables de operación biomasa y sustrato inicial (x0 y s0 respectivamente), entre un rango de valores de 0.1 a 1 g/L, para la biomasa y de 10 a 50g/L para la pectina, los valores de esta ultima estuvieron limitados por la solubilidad de la pectina en agua. (50g/L a 25°C)

La función objetivo para optimizar el cultivo por lote fue la productividad, así los valores de x0 y s0 con los cuales se alcanza la máxima productividad son:

x0=1 g/L

s0=50 g/L

Con los valores anteriores se alcanza una productividad de 6.843kU/L h, la cual es significativamente mayor que la alcanzada en el cultivo sin optimizar que fue de 1.018 kU/L h. Además el tiempo del cultivo disminuyo de 37.5 horas en el cultivo sin optimizar a 28 horas en el cultivo optimizado. En la ilustración 7 se muestra el gráfico obtenido del cultivo por lote optimizado, en el que se marca el término del cultivo y la productividad a lo largo del mismo.

Ilustración 7. Cultivo por lote que muestra el término de éste a las 28 horas después de iniciado el cultivo.

Cultivo por lote alimentado

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Una vez que se optimizó el cultivo por lote, se procedió a la simulación y optimización de un cultivo por lote alimentado. Los valores de biomasa, sustrato, producto y productividad al término del cultivo por lote, y por lo tanto al inicio del cultivo por lote alimentado son:

Biomasa =20.161 g/L Sustrato= 0.266 g/L Producto=191.611 kU/L Productividad=6.843 kU/L h

El gráfico obtenido del cultivo por lote alimentado, con una SF=50g/L y una F=1m3/h se muestra en la ilustración 8.

Ilustración 8. Cultivo por lote alimentado sin optimizar.

Como se puede observar el producto y por lo tanto la productividad disminuyen, esto se debe a la baja concentración del sustrato alimentado, 50g/L, que como explicamos antes esta limitado por la solubilidad de la pectina. Al realizar la simulación variando SF nos damos cuenta que a un valor de SF de 200g/L la productividad aumenta significativamente. Por lo tanto se hace necesario aumentar la solubilidad de la pectina hasta mínimo 200g/L para que el uso de un cultivo alimentado sea factible de realizar. Una forma de aumentar la solubilidad de la pectina, que podríamos utilizar, es mezclando la pectina con sacarosa previo a la solubilización.

El comportamiento del cultivo cuando SF=200g/L y F=1 m3/h se muestra en la ilustración 9.

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Ilustración 9. Cultivo por lote alimentado con una SF=200g/L y F=1m3/h.

Se optimizó el flujo de alimentación del cultivo por lote alimentado con base en la misma función objetivo que en el cultivo por lote, es decir maximizando la productividad, el flujo optimizado es de 1.6m3/h, con el cual los valores de biomasa, sustrato, producto y productividad al término del cultivo son:

Biomasa = 47.879 g/L Sustrato= 2.191 g/L Producto= 473.8 kU/L Productividad=11.08 kU/L h

En la ilustración 10 se muestra el grafico del cultivo optimizado con SF=200g/L y F=1.7g/L.

I

lustración 10. Cultivo por lote alimentado optimizado, con SF=200g/L y F=1.7m3/h.

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3.3 Recuperación y purificación del producto

a) Información técnica sobre los diferentes bioprocesos existentes

Los procesos fermentativos pueden dividirse en:

Fermentaciones líquidas sumergidas (ilustración 11) (FS)

Contenido de agua del medio 90-95 %

Fermentaciones en sustrato sólido (ilustración 12) (FSS)

El medio son partículas húmedas con ausencia o casi ausencia de agua libre. El sustrato no está ni disuelto ni en suspensión en un gran volumen de agua.

Hay dos formas básicas de cultivos sólidos. • Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos agroindustriales). • Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo (perlita, bagazo,

poliuretano).

.

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1. Preparación y esterilización del medio de cultivo y el inoculo.

2. Biotransformacion. 3. Concentración y purificación.

Ilustración 12. Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato sólido.

Ilustración 11. Reactores empleados en fermentaciones líquidas sumergidas

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Tabla 4. Comparación de dos bioprocesos existentes. Ver Anexo 1 para más información

PRODUCCION DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACION SÓLIDA

A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON

Fermentación sólida (30°C).Aspergillus foetidus.Inóculo 105 esporas. Residuos orgánicos: naranja, maracuya y limón.Altos niveles de actividad pectinolitica con sustratos orgánicos; RESPECTO AL USO DE PECTINA COMERCIAL.La FS permite mayor superficie de intercambio aire/sustrato y el uso de mayor concentración de pectina en el medio favorece la síntesis de pectinasa debido a que no existe el problema de elevado viscosidad.

PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PECTINASA A PARTIR DE

PENICILLIUM CHRYSOGENUM

Fermentación sumergida (35°C, pH 6.5)Penicillium chrysogenumInóculo 106 esporas/mLDistintas fuentes de carbono: pectina, galactosa, sacarosa , manitol y glucosa.pH 6.5, 50°C y hasta 60 minutos para la mayor actividad enzimática.El proceso de purificación donde se obtuvo mejor recuperación fue precipitación con etanol (57.7%). El proceso este proceso se especifica en la “Propuesta 1” del apartado de Recuperación y Purificación de Pectinasas.

Recuperación y purificación de pectinasas

Propuesta 1.

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Propuesta 2.

FiltraciónDiálisis contra agua

destilada(24 h, 4 °C)

Liofilización(polvo)

Resuspensión del polvo en Solución

tampón de acetato de sodio pH 5 0.1 M, saturado a 20%

sulfato de amonio

Centrifugación (8,000 x g por 30 minutos)Saturado a 80% sulfato de

amonioRecuperación precipitado

centrifugación

Resuspensión en el mínimo volumen de solución tampón de

acetato de sodio

Diálisis(contra agua destilada y

luego contra solución tamón de acetato de

sodio)

Cromatografía Ultragel AcA 34

Cromatografía en CM Biogel-A

Cromatografía en DEAE Bio-gel A

Cromatografía en Ultragel Aca 44

ElectroforesisSDS-PAGE

Centrifugación (10,000 x g, 15 minutos a 4°C) Recuperación del

sobrenadante

Precipitación con etanol(3 volúmenes de etanol

incubado durante la noche a 4°C)

Disolución del precipitado en 10 mL de solución tampón de

citrato de sodio (pH 6.5).

Diálisis (contra agua destilada)

Liofilización a 5 mL(para mayor purificación)

Filtración en gel (SEPHADEX G-100 12%,

columna de 1.5 x 45 cm, equlibrada con solución

tampón de citrato de sodio pH 6.5 y eluida con la misma

solución, 10 mL/h)

Propuesta 3.

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Técnicas de extraccion y purificacion. PECTINASAS

(Enzima Extracelular)

A partir del caldo de fermentación, separado por

centrifugación y/o filtración del micelio.

Se inició el proceso de extracción por fraccionamiento salino, con sulfato de amonio al 80% en frío

(4ºC) bajo agitación.

Cuando se disolvió completamente la sal, se dejó en reposo durante 12 horas y luego se centrifugó a 6500 rpm por 30

min.

El sobrenadante fue descartado y el sedimento fue lavado con sulfato de amonio al 80% .

Resuspendido en buffer Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM; NaCl 350 mM y

Glicerol al 2%; extracto parcialmente purificado.

Dicho extracto fue sometido a una cromatografía de exclusión molecular, en Sephadex G-25, para eliminar el exceso de sal.

La columna fue equilibrada en el buffer de resuspensión y a las fracciones obtenidas se les determinó la presencia de sulfato de amonio, la cantidad de proteínas por estimación 260-280 nm y la actividad enzimática.

Este volumen fue concentrado por ultrafiltración usando

membranas de corte en 10 kD (AMICON).

El concentrado fue sometido a cromatografía en una columna

de DEAE-Sephacel (Sigma) equilibrada en Tris-HCl (pH 7,5)

10 mM. La elución de la proteína se efectuó mediante un gradiente optimizado

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Rendimientos de purificación ver anexo 1

BIBLIOGRAFIA

Martínez trujillo, Aurora; Aranda, Juan S y Aguilar Osorio, Guillermo (2008). Kinetic study on inducibility of polygalacturonases from Aspergillus flavipes FP-500. Electron. J.

Biotechnol. [online]. 2008, vol.11, n.4, pp. 8-9. ISSN 0717-3458. Jayani, Ranveer Singh; Saxena, Shivalika and Gupta, Reena; Microbial pectinolytic

enzymes: a review Process Biochemistry, vol 40, no. 9, pp: 2931-2944. Visser, J. and Vorgen, A.G.J. eds (1996); Pectin sans pectinases: Proceeding of an

International Symposium (December 3er to 7th, 1995, Wageningen, The Netherland). Progress in Biotechnology, 1996, vol 14, pp: 915-920

A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V. Pradeep and M. Palaniswamy (2010). Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium chrysogenum. Indian Journal of Science and Technology Vol. 3 No. 4 (Apr. 2010) ISSN: 0974- 6846

Elizabeth Viguria, Giuliana Noratto, David Campos (2005). PRODUCCION DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACION SOLIDA A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON. SMBB Veracruz, México.

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Anexo 1ARTICULO 1. BIOTRANSFORMACIÓN.

PRODUCCION DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACION SOLIDA A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON.Elizabeth Viguria, Giuliana Noratto, David Campos. UNALM

Las enzimas pectinoliticas, poligalacturonasas (PG), pectinmetilesteras (PE) y pectinliasas (PL) son utilizadas en la industria para la extraccion y clarificacion de jugos.

Estas son producidas a nivel industrial a partir de Aspergillus foetidus y principalmente mediante fermentacion sumergida. La tecnica de la fermentacion solida en los ultimos tiempos ha despertado el interes de muchos investigadores, ya que constituye una alternativa importante por sus requerimientos en equipos y sistemas de control menos costoso, menosres gastos de energia, menor generacion de efluentes y los metabolitos son mas concentrados reduciendo costos en la purificacion.

El objetivo del trabajo fue desarrollar un proceso de fermentación en sustrato sólido (FSS) para producción de pectinasas a partir de residuos de naranja, maracuyá y limón.

Metodología.

Se inoculo 105 esporas de Aspergillus foetidus NRRL 341/ de medio preparado con residuos de naranja, maracuyá y limón, previamente acondicionados y adición de fuente de nitrógeno y sales minerales.

La fermentación se realizo a 30°C y se evaluó la influencia de la humedad (60, 70 y 80%), fuente de pectina (comercial o procedente de los residuos) y concentración (0.125, 0.5, 1 y 2 %); presencia de azucares reductores en el medio, fuente de nitrógeno y técnica de fermentación: FSS, respecto a la fermentación sumergida FS.

Resultados y discusión.

El uso de residuos de naranja, maracuyá y limón con 80% de humedad permitió obtener mayor actividad de PG, PL y PE debido a su complejidad y alto contenido de pectina con respecto a la mezcla de pectina comercial. La actividad pectolítica se incremento en proporción a la concentración de pectina comercial utilizada, demostrando el carácter inducible de la enzima.

La presencia de azucares reductores no ejerció efecto represor en la síntesis de pectinasas, más bien favoreció el crecimiento y ello se reflejo en la mayor producción de pectinasas. Se logro la mayor actividad PL a las 48 hrs de fermentación para los tres sustratos estudiados; PG entre 72 y 96 hrs y PE entre 48 y 96 hrs dependiendo del sustrato utilizado.

Cuando se evaluó la influencia de la técnica de fermentación, se encontró que con FS la producción de PG, PL y PE fue inferior que con FSS, al respecto, menciona que esta técnica permite

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mayor superficie de intercambio aire/sustrato y el uso de mayor concentración de pectina en el medio favorece la síntesis de pectinasas debido a que no existe el problema de elevado viscosidad que se genera en medio liquido lo que dificulta la agitación del medio e incorporación del oxigeno.

Conclusiones.

El uso de residuos de naranja, maracuyá y limón con 80% de humedad en FSS permite obtener elevados niveles de actividad pectinolítica; RESPECTO AL USO DE PECTINA COMERCIAL. La técnica FSS, permite obtener mayores niveles de actividad enzimática PG; PL y PE con respecto a la técnica de fermentación sumergida.

PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PECTINASA A PARTIR DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM

A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V. Pradeep and M. Palaniswamy Department of Microbiology, Karpagam University, Coimbatore - 641 021, Tamil Nadu, India m.palaniswamy@gmail.com

La utilización de enzimas microbianas ha encontrado una amplia aplicación en diferentes procesos industriales. Entre la variedad de enzimas comercializadas muchas son producto de la fermentación de hongos filamentosos (Piccoli-valle et al., 2001). El género de Penicillium es mundialmente conocido por la producción de metabolitos secundarios y enzimas extracelulares de alto valor comercial, incluyendo las pectinasas.

El objetivo de este artículo era producir enzimas pectinolíticas a partir de una nueva cepa aislada de Penicillium chrysogenum por fermentación sumergida y la evaluación de proceso. Además, las características físico-químicas de la enzima también se reportaron.

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Especificaciones de la Fermentación:

250 mL de medio de cultivo (Erlenmeyer 500 mL)

Inóculo 10% (106 esporas/mL) Temperatura: 35 °C pH: 6.5 Agitación: 175 rpm Duración: 5 días Medio de cultivo:

Compuesto g/LSacarosa 10citrus pectin 10(NH4)2SO4 1.4

K2HPO4 6

KH2PO4 2

MgSO4.7H2O 0.1

Resultados:

Distintas fuentes de carbono y nitrógeno fueron estudiadas para la optimización del medio de cultivo. Dichas fuentes se evaluaron respecto a la actividad enzimática. La sacarosa y el persulfato de amonio la mejor fuente de carbono y nitrógeno respectivamente.

De igual forma se estudiaron los efectos del pH y la temperatura sobre la producción de pectinasas, siendo un pH de 6.5 y una temperatura de 35°C las condiciones que optimizan la producción (Gráfica 2).

Se determinaron las condiciones óptimas para maximizar la actividad enzimática tales como el pH, la temperatura y el tiempo de incubación con resultados de 6.5, 50°C y hasta 60 minutos respectivamente.

Por último se determinó el peso molecular de la enzima mediante SDS-PAGE siendo de 31 kDa el peso molecular de las pectinasas

En forma de resumen a los resultados obtenidos se presentan en la tabla las propiedades de la enzima pectinasas y la proteína total producida y recuperada después del proceso de recuperación y purificación (Tabla 2). El proceso de purificación en este proceso se especifica en la “Propuesta 1” del apartado de Recuperación y Purificación de Pectinasas

Tabla 1. Propiedades de la Pectinasa

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Propiedades P. chrysogenumpH óptimo 6.5Temperatura optima (°C) 50Termoestabilidad (min) 60Vmax (U/ mg de proteína) 85Km (mg/mL( 1.0Peso Molecular (Kda) 31

Tabla 2. Purificación de la pectinasa a partir de P. chrysogenum

Fracción Proteína Total (mg)

Actividad Total(U)

Actividad específica(U/mg)

Purificación(veces)

Recuperación(%)

Filtrado 523.0 3818 7.30 1.0 100Precipitación con etanol

67.8 2205 32.53 4.45 57.77

Sephadex G-100(12%)

6.3 918 145.84 17.24 48.12

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