Formulario de autorización de publicación en el Repositorio Institucional

1. Identificación del documento y autor

Nombre del autor: Mariana Izaguirre Beltrán

Correo electrónico: mariana_iza@hotmail.es

Facultad:

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Región Veracruz

Programa académico:

Maestría en Ciencia Animal

Título del documento:

Evaluación de la actividad antibacteriana del plasma sanguíneo del cocodrilo de pantano (Crocodylus

moreletii) sobre cepas de Staphylococcus aureus.

Tipo de documento

Tesis de licenciatura:

Tesis de maestría:

( ) Tesis doctoral:

Otro:

( )

( X ) ( )

Parte de un libro ( ) Objeto de aprendizaje: ( )

Disertación ( ) Otro ( )

Temas del trabajo recepcional: (palabras clave de 5 términos):

Resistencia bacteriana, Staphylococcus aureus, Crocodylus moreletii, plasma sanguíneo

2. Autorización de la publicación de la versión electrónica del documento

En consonancia con lo dispuesto por El Abogado General de nuestra Universidad, en el Oficio AG/884/2106, en mi

carácter de Maestra, doy mi autorización a la Dirección General de Bibliotecas para que este trabajo recepcional

sea publicado en el repositorio institucional de la Universidad.

3. Tipo formato del documento:

PDF: ( X ) Otro,

especifique:

Tesis

Fecha de entrega:28/10/2020

MVZ Mariana Izaguirre Beltrán

Nombre y firma

I

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL PLASMA SANGUÍNEO

DEL COCODRILO DE PANTANO (CROCODYLUS MORELETII) SOBRE CEPAS DE

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

TESIS

COMO REQUISIO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE:

Maestra en Ciencia Animal

PRESENTA:

MVZ. Mariana Izaguirre Beltrán

Directora: Dra. Carolina Barrientos Salcedo

Co-Director: Dr. Alfonso Alexander Aguilera

Asesora: Dra. Concepción del Carmen Ahuja Aguirre

VERACRUZ, VER. DICIEMBRE DE 2020

1

2

DEDICATORIAS

A mi familia, por ser las personas que siempre me impulsan a continuar y nunca

rendirme. Por tenerme paciencia y comprenderme en esos momentos de estrés

constante, mil gracias.

3

INSTITUCIONES DONDE SE DESARROLLÓ EL TRABAJO DE TESIS

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana.

Laboratorio de Química Médica y Quimiogenómica, Facultad de Bioanálisis,

Universidad Veracruzana

DIRECTORES DE TESIS

Directora: Dra. Carolina Barrientos Salcedo

Co-Director: Alfonso Alexander Aguilera

Asesora: Concepción del Carmen Ahuja Aguirre

4

INSTITUCIÓN BECARIA

Durante el curso de los dos años del programa de Maestría en Ciencia Animal (1 de

Agosto de 2018 – 31 de julio de 2020), la autora de esta tesis contó con el apoyo en

forma de BECA DE MANUTENCIÓN por parte del CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y

TECNOLOGÍA (CONACyT), con número de becaria (CVU/Becario): 922695

5

RECONOCIMIENTOS

A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad

Veracruzana, por ser la institución que me brindó la oportunidad de la realización del

posgrado.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo financiero durante el

periodo en el que se llevó a cabo el proyecto.

Al Laboratorio de Química Médica y Quimiogenómica y al Cepario

Microbiológico de la Facultad de Bioanálisis de la Universidad Veracruzana, por

brindar las facilidades para que se llevara a cabo todo el trabajo del laboratorio y el

análisis de datos.

A la Dra. Carolina Barrientos Salcedo, por su todo lo que me enseñó y gran apoyo

durante el desarrollo del estudio.

A la Dra. Concepción del Carmen Ahuja Aguirre, por su asesoría, apoyo y por

escucharme siempre que lo necesité durante el tiempo de la maestría.

Al Dr. Alfonso Alexander Aguilera, por todos sus comentarios y críticas constructivas

durante el desarrollo del proyecto.

A las Dras. Patricia Cervantes Acosta y Lorena López De Buen, por todos los

comentarios y ayuda que me dieron en cada uno de los exámenes tutoriales.

Al Rancho El Colibrí de la Antigua, UMA Cacahuatal, en particular al MCA. Sergio

Alberto Viveros Peredo, por las facilidades otorgadas para los animales que se

utilizaron para este estudio.

A la Universidad Nacional de Quilmes (UNQ), Argentina y al equipo del

Laboratorio de Microbiología Molecular, por la oportunidad de hacer una estancia

de investigación en sus instalaciones y por toda la paciencia y los conocimientos

transmitidos.

Al Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo, por el

apoyo económico otorgado durante la estancia de investigación en la UNQ, en Buenos

Aires, Argentina.

6

7

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 14

1. ANTECEDENTES .......................................................................................... 16

1.1. Staphylococcus aureus: características y mecanismos de resistencia ............... 16

1.1.1. Estructura antigénica ............................................................................. 17

1.1.2. Enzimas y toxinas de Staphylococcus aureus ............................................. 18

1.1.3. Staphylococcus aureus en la salud humana ............................................... 20

1.2. Resistencia bacteriana ......................................................................... 21

1.3. Generalidades del sistema inmunológico ...................................................... 23

1.3.1. Sistema inmunológico innato (SII) ........................................................... 24

1.3.2. Sistema inmunológico adaptativo (SIA) .................................................... 24

1.4. Sistema inmune de los reptiles ................................................................... 26

1.4.1. Sistema inmune innato (SII) en reptiles ................................................... 26

1.4.1.1. Lisozimas ........................................................................................... 27

1.4.1.2. Proteínas antimicrobianas .................................................................... 27

1.4.1.3. Sistema del complemento .................................................................... 27

1.4.1.4. Leucocitos no específicos ..................................................................... 28

1.4.2. Respuesta inflamatoria ........................................................................... 29

1.5. Actividad de los componentes sanguíneos de los cocodrilianos sobre células de

mamíferos ...................................................................................................... 29

1.6. Actividad antimicrobiana de los componentes sanguíneos de cocodrilianos ....... 30

HIPÓTESIS ..................................................................................................... 32

OBJETIVO GENERAL ........................................................................................ 32

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 32

8

2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 33

2.1. Características del estudio ......................................................................... 33

2.2. Obtención del plasma sanguíneo de Crocodylus moreletii ............................... 33

2.2.1. Procesamiento de las muestras sanguíneas ............................................... 34

2.2.2. Cuantificación de proteínas del plasma sanguíneo de cocodrilo y humano ..... 35

2.2.3. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en presencia de sds .... 36

2.3. Conteo y evaluación de reactividad de linfocitos por ensayo MTT .................... 39

2.4. Aislamiento y confirmación de las cepas de Staphylococcus aureus ................. 41

2.4.1. Caracterización morfológica .................................................................... 45

2.4.2 Prueba de catalasa en lámina ................................................................... 45

2.4.3. Prueba de coagulasa .............................................................................. 46

2.4.4. Prueba de susceptibilidad y resistencia antimicrobiana ............................... 47

2.5. Evaluación de la actividad antibacteriana por el método de microdilución en caldo

.................................................................................................................... 49

2.6. Análisis estadístico .................................................................................... 50

3. RESULTADOS .............................................................................................. 51

3.1. Ensayo de microdilución en caldo ............................................................... 51

3.2. Ensayo MTT ............................................................................................. 53

4. DISCUSIÓN ................................................................................................ 55

5. CONCLUSIONES .......................................................................................... 58

REFERENCIAS ................................................................................................. 59

9

LISTA DE CUADROS

CUADRO 1. Cuantificación de proteínas de referencia BSA……………………………. 35

CUADRO 2. Valores de las densidades ópticas obtenidas con cada

concentración de plasma de cocodrilo para la cepa de referencia de S. aureus

ATCC 1556…………………………………………………………………………………………………………

50

CUADRO 3. Valores de las densidades ópticas obtenidas con cada

concentración de plasma de cocodrilo para la cepa de referencia del aislado

clínico humano de S. aureus………………………………………………………………………………

51

10

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Ejemplares de C. moreletii sacados de los estanques para la

toma de muestra sanguínea……………………………………………………………………….

33

FIGURA 2. Toma de muestra sanguínea de C. moreletii…………………………… 33

FIGURA 3. Plasma sanguíneo de C. moreletii alicuotado…………………………… 34

FIGURA 4. Cuantificación de proteínas de referencia (albúmina sérica

bovina)…………………………………………………………………………………...................

35

FIGURA 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida para lectura de

proteínas en plasma de C. moreletii con marcador de peso

molecular…………………………………………………………………………………………………….

37

FIGURA 6. Adición del Ficoll® Paque Plus GE, EE.UU a los tubos con

sangre heparinizada……………………………………………………………………………………

39

FIGURA 7. Linfocitos humanos observados por medio de microscopio

óptico y cámara de Neubauer…………………………………………………………………….

40

FIGURA 8. A) Preparando cajas de Petri de agar sal y manitol; B) Tubos

de cultivo con agar BHI; C) Cajas de cultivo con agar sal y manitol y agar

BHI……………………………………………………………………………………………………………..

42

FIGURA 9. Observación de cepas de Staphylococcus aureus 24 h en

estufa de cultivo………………………………………………………………………………………….

40

FIGURA 10. A) Siembra de S. aureus en tubos de cultivo para su

almacenamiento; B) Cepa de S. aureus en tubo de cultivo con aceite

mineral esterilizado…………………………………………………………………………………….

43

FIGURA 11. A) Staphylococcus aureus en agar sal y manitol; las colonias

doradas (flecha roja) representan la fermentación del manitol. B) S.

aureus en agar sangre; se observa la hemólisis beta en forma de halos

claros alrededor de las colonias………………………………………………………………….

43

FIGURA 12. Morfología colonial de Staphylococcus aureus……………………… 44

FIGURA 13. Realizando prueba de catalasa………………………………………………. 45

FIGURA 14. Formación de la fibrina (flecha roja) en fibrinógeno en

plasma humano………………………………………………………………………………………….

45

FIGURA 15. Halos de inhibición (mm) en cultivo de S. aureus con discos

de novobiocina (28 mm), sulfonamidas/trimetoprim (17 mm) y

vancomicina (19 mm) el halo gris que se observa indica la inhibición

bacteriana que provoca cada antibiótico……………………………………………………

47

11

FIGURA 16. Halos de inhibición (mm) en cultivo de S. aureus con discos

de penicilina (0 mm) y cefoxitín (0 mm); el halo gris que se observa

indica la inhibición bacteriana que provoca cada antibiótico……………………

47

FIGURA 17. Placa con las diferentes diluciones de plasma de cocodrilo…. 49

FIGURA 18. Inhibición bacteriana de la cepa de referencia ATCC 1556 de

S. aureus con plasma de cocodrilo, esto con respecto al control del

antibiótico Trimetoprim/Sulfametoxazol (SXT). No paramétrico, Kruskal-

Wallis test. (P < 0.05)………………………………………………………………………………..

51

FIGURA 19. Inhibición bacteriana del aislado clínico humano de S. aureus

20090127 con plasma de cocodrilo, esto con respecto al control del

antibiótico Trimetoprim/Sulfametoxazol (SXT). No paramétrico, Kruskal-

Wallis test. (P < 0.05)…………………………………………………………………………………

52

FIGURA 20. Porcentaje de viabilidad presente en el plasma sanguíneo de

C. moreletii incubado con células linfocíticas humanas tomadas de sangre

periférica…………………………………………………………………………………………………….

53

12

RESUMEN

Izaguirre Beltrán, Mariana. MCA. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia.

Universidad Veracruzana. Septiembre 2020. Evaluación de la actividad

antibacteriana del plasma sanguíneo del cocodrilo de pantano (Crocodylus

moreletii) sobre cepas de Staphylococcus aureus. Directora: Dra. Carolina

Barrientos Salcedo. Co-Director: Dr. Alfonso Alexander Aguilera. Asesora: Dra.

Concepción del Carmen Ahuja Aguirre.

El objetivo del estudio fue evaluar la actividad antibacteriana del plasma sanguíneo de

Crocodylus moreletii sobre aislados clínicos de Staphylococcus aureus, y determinar su

actividad citotóxica sobre cultivos de linfocitos humanos. Se obtuvieron muestras

sanguíneas del seno postoccipital de cocodrilos adultos, de las que se separó el plasma.

Se realizó un ensayo de reducción metabólica (MTT) usando diferentes concentraciones

de plasma crudo de cocodrilo (250-2000 mg/mL) para determinar su capacidad

citotóxica sobre cultivos de linfocitos humanos. A continuación, se realizó el ensayo de

microdilución en caldo en una placa de 96 pocillos para evaluar la actividad

antibacteriana de diversas concentraciones de plasma de cocodrilo (0.2-3.31 mg/mL)

sobre un aislado clínico humano de S. aureus y una cepa de referencia ATCC 1556,

ambos meticilino-resistentes; se dispuso de un pocillo para control de crecimiento con

medio de cultivo y bacterias y se utilizó otro pocillo como control del antibiótico

(trimetoprim con sulfametoxazol, 1.25 y 35.75 µg/mL) y bacterias. Los resultados se

analizaron mediante la prueba de Kruskall-Wallis. El ensayo de MTT mostró que el

plasma sanguíneo crudo de C. moreletii no tuvo efectos citotóxicos; por el contrario, se

observó proliferación celular de hasta 400%. El ensayo de microdilución en caldo

mostró que el plasma sanguíneo de cocodrilo tuvo actividad antibacteriana sobre las

cepas de S. aureus en la concentración más alta que fue 3.31 mg/mL de proteínas

totales respecto al control del antibiótico utilizado (P<0.05). En conclusión, el plasma

sanguíneo del cocodrilo de pantano tuvo actividad antibacteriana sobre S. aureus, y en

lugar de causar citotoxicidad hacia las células humana sanas estimuló su división.

13

ABSTRACT

Izaguirre Beltrán, Mariana. MCA. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia.

Universidad Veracruzana. September 2020. Evaluation of antibacterial activity

of swamp crocodile’s (Crocodylus moreletii) blood plasma on Staphylococcus

aureus strains. Director: Dr. Carolina Barrientos Salcedo. Co-Director: Dr.

Alfonso Alexander Aguilera. Advisor Dr. Concepción del Carmen Ahuja Aguirre.

The objective of this study was to evaluate the antibacterial activity of Crocodylus

moreletii blood plasma on clinical isolates of Staphylococcus aureus, and to determine

its cytotoxic activity on human lymphocyte cultures. Blood samples were taken from

the postoccipital sinus of adult crocodiles and the plasma was separated. A metabolic

reduction test (MTT) was carried out where different concentrations of crude crocodile

plasma (250-2000 mg/mL) were used to determine its cytotoxic capacity on human

lymphocyte cultures. Subsequently, the broth microdilution test was performed in a 96-

well plate to evaluate the antibacterial activity of different concentrations of crocodile

plasma (0.2-3.31 mg/mL) on a human clinical isolate of S. aureus and a reference

strain ATCC 1556, both methicillin resistant strains; one well was used for growth

control only with culture medium and bacteria, and another well was used as an

antibiotic control (trimethoprim with sulfamethoxazole, 1.25 and 35.75 µg/mL) and

bacteria. The MTT test showed that crude blood plasma of C. moreletii had no cytotoxic

effects; instead, it stimulated cell proliferation up to 400%. The broth microdilution test

showed antibacterial activity of the crocodile blood plasma on the S. aureus strains in

the highest concentration of plasma, which was 3.31 mg/mL of total proteins, compared

to the control of the antibiotic used (P <0.05). In conclusion, C. moreletii blood plasma

had antibacterial activity on S. aureus, and instead of causing cytotoxicity on healthy

human cells, it stimulated their division.

14

INTRODUCCIÓN

El poder que tienen los antibióticos para contribuir a la muerte bacteriana sin afectar al

huésped humano fue descubierto en 1940 (Waksman, 1947; Belloso, 2009). Sin

embargo, la resistencia a los antibióticos surgió una década después, cuando

Staphylococcus aureus dejó de ser sensible a la penicilina (Chambers y DeLeo, 2009),

dando como resultado un grave problema ocasionado principalmente por el uso

indebido de estos fármacos (OMS, 2001). Esto ha llevado a buscar agentes antibióticos

que resulten efectivos (Kommanee et al., 2012) y que no provoquen efectos

secundarios o toxicidad a largo plazo (Kollef, 2007; van Hal et al., 2012).

Staphylococcus aureus es un patógeno Gram positivo que en humanos es la principal

causa de infecciones septicémicas, osteoarticulares, pleuropulmonares, de piel y tejidos

blandos, endocarditis, e infecciones asociadas a dispositivos (Wertheim et al., 2005;

Tong et al., 2015). Las cepas de S. aureus resistentes a los antibióticos β-lactámicos

se conocen como S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) y se ha observado que

estas cepas son resistentes a múltiples fármacos como aminoglucósidos, macrólidos,

lincosamidas, estreptograminas, tetraciclinas, entre otros (Wang et al. 2008; Kumar et

al. 2010). Hasta hace unas décadas se consideraba que estas cepas se limitaban al

entorno hospitalario; sin embargo, desde principios de 1990 las cepas de MRSA se han

asociado a pacientes que no han tenido contacto previo con algún hospital, por lo que

se les ha denominado como cepas MRSA asociadas a la comunidad (David y Daum,

2010; DeLeo et al., 2010).

Por otro lado, el sistema inmune innato es la primera barrera de defensa del organismo

frente a agentes infecciosos (Hoffmann et al., 1999). Entre sus componentes se

encuentran péptidos antimicrobianos, células natural killer (NK), el sistema de

complemento, y leucocitos no específicos como macrófagos, neutrófilos, basófilos y

eosinófilos (Mondal y Rai, 2001; Merchant et al., 2003; Pata et al., 2011).

15

Los cocodrilianos son animales que habitan en ecosistemas con altas cargas de

patógenos potenciales (Johnston et al., 2010), pero no parecen ser susceptibles a ellos

(Merchant y Britton, 2006). Esto ha llevado a la idea de la existencia de compuestos

antimicrobianos altamente potentes en el sistema inmune de los cocodrilianos, por lo

que se han realizado estudios sobre las propiedades antibióticas de sus componentes

sanguíneos (Pata et al., 2011; Kommanee et al., 2012). Así, se ha demostrado actividad

antimicrobiana del plasma sanguíneo del cocodrilo siamés (Crocodylus siamensis) sobre

cepas de Staphylococcus aureus, Salmonella typhy, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus epidermidis y Vibrio cholerae (Kommanne et al., 2012).

La resistencia a antibióticos que presentan las cepas MRSA, tanto en humanos como

en animales, es una problemática a nivel mundial que hace necesario buscar

alternativas terapéuticas eficaces, como lo pueden ser ciertos componentes

encontrados en el plasma sanguíneo de los cocodrilianos.

16

1. ANTECEDENTES

1.1. Staphylococcus aureus: características y mecanismos de resistencia

Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, de forma esférica de

aproximadamente 1 µm de diámetro, dispuesta en racimos irregulares, no es móvil y

no forma esporas. Esta bacteria crece rápidamente en casi todos los medios

bacteriológicos bajo condiciones aerobias, desarrollándose con más rapidez a una

temperatura de 37 °C. Las colonias de S. aureus suelen ser de color gris a amarillo

dorado profundo (Jawetz et al., 1992).

Este patógeno es resistente a la desecación, aguantando temperaturas de 50 °C

durante 30 minutos y al cloruro de sodio al 9%. La resistencia de S. aureus se presenta

en varias clases: La primera es que en esta bacteria la producción de β lactamasa es

frecuente y está controlada por los plásmidos, lo que hace que este microorganismo

sea resistente a muchas penicilinas (penicilina G, ampicilina, ticarcilina, piperacilina)

(Novick et al., 2001). Los plásmidos son transmitidos mediante transducción de

bacteria a bacteria. La segunda forma se refiere a que la resistencia a la nafcilina,

meticilina y oxacilina es independiente de la producción de la β lactamasa; ésta es

regulada por una serie de genes que se encuentran en una región del cromosoma

denominada casete cromosómico estafilocócico mec (SCCmec por sus siglas en inglés)

(Chambers y DeLeo, 2009). Específicamente el gen mecA codifica una proteína fijadora

de penicilina (PBP2a) que es la que interviene en la resistencia (Archer y Climo, 1994).

Existen diferentes tipos de SCCmec; los tipos I, II y III se relacionan con infecciones

intrahospitalarias y pueden contener genes que codifican la resistencia a otros

antibióticos, mientras que el tipo IV se ha observado principalmente en cepas MRSA

extrahospitalarias (CA-MSRA) (Novick et al., 2001). Una tercera forma de resistencia

presentada por S. aureus se relaciona con un incremento de la síntesis de pared celular

y alteraciones de la misma; en este caso, en Estados Unidos de América (E.U.A.) S.

17

aureus se considera susceptible a la vancomicina si la concentración inhibitoria mínima

(MIC) es ≤2 µg/mL; de susceptibilidad intermedia si la MIC es de 4 a 8 µg/mL; y

resistente si la MIC es ≥16 µg/mL.(Wayne, 2011). En E.U.A. en 2002 se aislaron cepas

de S. aureus resistentes a vancomicina (VRSA), que contenían el gen de la resistencia

a la vancomicina VanA de los enterococos, junto con el gen mecA; este es un problema

importante en todo el mundo (van Hal et al., 2012). Finalmente, la resistencia mediada

por plásmidos a tetraciclinas, eritromicina, aminoglucósidos y otros fármacos es

frecuente en S. aureus (Read y Woods, 2014).

1.1.1. Estructura antigénica

Staphylococcus aureus contiene polisacáridos y proteínas antigénicos entre otras

sustancias importantes en la estructura de la pared celular. El peptidoglucano es un

polímero de polisacárido que contiene subunidades ligadas, lo que le proporciona rigidez

al exoesqueleto de la pared celular; éste es destruido por ácido potente o por la

exposición a lisozimas, desencadena la producción de interleucina-1 y anticuerpos

opsónicos por parte de los monocitos y puede ser quimioatrayente para los leucocitos

polimorfonucleares, y por su actividad endotoxínica activa el sistema del complemento

(Bronner et al., 2004).

Por su parte, la proteína A es un componente de la pared celular de las cepas de S.

aureus que Se encuentra situada en la superficie bacteriana; pertenece a un grupo de

adhesinas denominadas componentes de superficie microbianos que reconocen las

moléculas de matriz adhesiva (MSCRAMMS) (Winn et al., 2006). La adherencia

bacteriana a las células del hospedador es mediada por los componentes antes

mencionados y éstos son factores de virulencia importantes; entonces, la proteína A se

une a la porción Fc de las moléculas de IgG, en donde la porción Fab de la IgG unida a

la proteína A está libre para combinarse con un antígeno específico (Bronner et al.,

2004; Winn et al., 2006).

Algunas cepas de S. aureus tienen cápsulas que inhiben la fagocitosis por los leucocitos

polimorfonucleares a menos que haya anticuerpos específicos presentes; la mayor

parte de las cepas de S. aureus tienen coagulasa, que es un factor de aglutinación en

la superficie de la pared celular que permite que se una de manera no enzimática al

fibrinógeno, generando agregación de estas bacterias (Weems et al., 2006).

18

1.1.2. Enzimas y toxinas de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus produce enfermedad a través de su capacidad para multiplicarse

y diseminarse rápidamente y por la producción de sustancias extracelulares, como

enzimas y toxinas que pueden funcionar como enzimas (Jonas et al., 2002).

1.1.2.1. Enzimas

Muchas de las enzimas producidas por S. aureus están sujetas al control de los

plásmidos y algunas otras están sujetas al control cromosómico y extracromosómico.

Al respecto, la catalasa es una enzima que convierte el peróxido de hidrógeno en agua

y oxígeno. La prueba de catalasa diferencia a los estafilococos de los estreptococos

(Weems et al., 2006). Por su parte, la coagulasa es una proteína semejante a una

enzima, que coagula el plasma oxalado o citratado uniéndose a la protrombina; en

conjunto inician la polimerización de fibrina. La coagulasa deposita esta fibrina en la

superficie de los estafilococos, alterando su ingestión por las células fagocíticas o su

destrucción dentro de estas células, por lo que la producción de coagulasa es sinónimo

del potencial invasor del patógeno (Chapman et al., 1934; Weems et al., 2006). Por

otro lado, el factor de aglutinación interviene en la adherencia de los microorganismos

al fibrinógeno y a la fibrina, y cuando se mezcla con el plasma el S. aureus forma

racimos que desencadenan una respuesta inmune potente en el hospedador (Weems

et al., 2006).

Existen otras enzimas producidas por S. aureus como la hialuronidasa o factor de

propagación; una estafilocinasa que produce fibrinólisis pero que tiene una acción

mucho más lenta que la estreptocinasa; proteinasas, lipasas y β lactamasa (Rivera et

al., 2007).

1.1.2.2. Toxinas

Dentro del grupo de las exotoxinas producidas por S. aureus están las toxinas α, β, δ

y γ. La toxina α es una proteína heterogénea que ejerce acción sobre una gran gama

de membranas celulares eucariotas, por lo que es considerada una hemolisina potente

(Bronner et al., 2004). La toxina β degrada esfingomielina, lo que la hace tóxica para

muchos tipos de células incluidos los eritrocitos humanos. La toxina δ destruye

19

membranas celulares y participa en las enfermedades diarreicas La hemolisina γ se

conforma por tres proteínas que interactúan con las dos proteínas que componen la

leucocidina de Panton-Valentine, formando seis potenciales toxinas de dos

componentes. La principal función de estas toxinas es producir lisis eficiente de los

leucocitos al causar la formación de poros en las membranas de las células,

incrementando la permeabilidad y desencadenando la liberación masiva de mediadores

inflamatorios, leucotrienos e histaminas (Bronner et al., 2004; Moreillon et al., 2005).

La toxina leucocidina de Panton-Valentine tiene dos componentes que pueden destruir

leucocitos humanos actuando sobre su membrana ; éste es un factor de virulencia

importante en el caso infecciones extrahospitalarias por MRSA (Moreillon et al., 2005).

Las toxinas exfoliativas incluyen a las toxinas epidermolíticas A y B, que son dos

proteínas. La primera es termoestable y es producto de un gen cromosómico, mientras

que la segunda es termolábil y es mediada por plásmidos; ambas producen la

descamación generalizada propia de la epidermólisis estafilocócica aguda, lo que ocurre

cuando disuelven la matriz de mucopolisacáridos de la epidermis, por lo que se

consideran superantígenos (Bronner et al., 2004; Francis et al., 2005).

La toxina-1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1) se une a moléculas del complejo

mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II estimulando a los linfocitos T y

favoreciendo las diversas manifestaciones del síndrome del choque tóxico. El gen de

TSST-1 se detecta en casi 20% de las cepas de S. aureus incluyendo MSRA (Francis et

al., 2005).

Las enterotoxinas A-E, G-J, K-R y U, V son producidas una o más de ellas, por

aproximadamente el 50% de las cepas de S. aureus producen una o más de ellas; estas

toxinas son termoestables y resistentes a la acción de las enzimas intestinales. Las

enterotoxinas, las toxinas exfoliativas y la TSST-1, se encuentran en un elemento

cromosómico denominado isla de la patogenicidad, que interacciona con elementos

genéticos como bacteriófagos para producir las toxinas (Francis et al., 2005).

20

1.1.3. Staphylococcus aureus en la salud humana

Staphylococcus aureus es una bacteria oportunista y patógena en el humano, de la que

aproximadamente el 30% de la población humana es portadora (Werthein et al., 2005).

Es la causa principal de septicemia, así como de infecciones osteoarticulares, de piel y

tejidos blandos, pleuropulmonares y relacionadas con dispositivos (Wertheim et al.,

2005; Tong et al., 2015). La resistencia a la penicilina surgió en este patógeno en 1950

debido a que sus plásmidos codificaron y adquirieron una betalactamasa,

diseminándose rápidamente; se dice que el 90 % de los aislamientos de S. aureus son

resistentes a este antibiótico (Chambers y DeLeo, 2009). Durante la década de 1950

se creía conocer los mecanismos bacterianos para generar resistencia a antibióticos, y

se pensaba que siempre existiría la posibilidad de sobrepasar este efecto mediante la

síntesis de nuevos antibióticos, lo que llevó en 1960 a la creación de la meticilina, un

antibiótico betalactámico del grupo de las penicilinas; sin embargo, para 1961 se

reportó la aparición de cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) (Jevons,

1961; Crisóstomo et al., 2001). La resistencia a la meticilina fue mediada por la

adquisición del gen mecA de origen cromosómico; esta resistencia se diseminó

rápidamente en los hospitales de todo el mundo y se considera una epidemia en algunos

países (Arias et al., 2008; Chambers y DeLeo, 2009).

Los hospitales de humanos fueron los primeros en informar la presencia de MRSA como

un agente patógeno nosocomial; estas cepas de S. aureus asociadas a hospitales se

han vuelto resistentes a la mayoría de los antibióticos comunes y su tratamiento

representa un desafío (Katayama et al., 2000; Crisóstomo et al., 2001; Napolitano,

2009). Existen cepas de S. aureus resistente a la meticilina asociado a la comunidad

(CA-MRSA) (Dickinson y Archer, 2000; Crisóstomo et al., 2001; Gradelski et al., 2001;

Ito et al., 2001), detectadas por primera vez en poblaciones de alto riesgo como

consumidores de drogas intravenosas, personas en sanatorios y personas con

enfermedades crónicas, aunque también se han informado casos en niños sanos

(Archer y Climo, 1994; Nishi et al., 1995). En México, en hospitales de tercer nivel la

frecuencia de cepas de SARM es elevada (50- 85 %) (Novales, 2011).

Hasta hace algunos años las cepas MRSA eran susceptibles a gran cantidad de

antibióticos diferentes de los betalactámicos, como la vancomicina, un glucopéptido

que inhibe la síntesis de la pared celular, que ha sido el antibiótico de primera línea en

21

el tratamiento de infecciones asociadas al MRSA en los últimos 40 años (van Hal y

Fowler, 2013). Sin embargo, existen diversas problemáticas asociadas al uso de este

antibiótico, tales como la aparición de cepas de S. aureus con sensibilidad disminuida

a la vancomicina y el desarrollo de insuficiencia renal aguda como efecto secundario

(Kollef, 2007; van Hal et al., 2012). Se ha reportado que la resistencia intermedia de

MRSA sobre la vancomicina sigue aumentando y han comenzado a aparecer cepas

resistentes a gran cantidad de antibióticos (Tenover y Goering, 2009; Boucher et al.,

2010; CDC, 2018).

1.2. Resistencia bacteriana

La resistencia que adquieren las bacterias a los antibióticos se define como el

mecanismo mediante el cual una bacteria disminuye la acción de los agentes

antibióticos; es decir, la bacteria tiene la capacidad de sobrevivir y crecer en presencia

de uno o más antibióticos, haciendo que dicha bacteria continúe causando la infección.

(Jackson et al., 1998). Esta capacidad puede ser intrínseca o adquirida; la primera es

una propiedad específica de las bacterias y su aparición es anterior al uso de

antibióticos. Por su parte la resistencia adquirida se produce cuando las bacterias son

sometidas al estrés que les produce un antibiótico y la adquieren a través de

mutaciones, o bien, por la transmisión de material genético producido por otras

bacterias (Couvalin, 1988).

La era moderna de los antibióticos comenzó con el descubrimiento de la penicilina por

Sir Alexander Fleming en 1928 (Piddock, 2012). Los antibióticos se recetaron por

primera vez para tratar infecciones graves en la década de 1940 (CDC, 2013). Sin

embargo, poco después, la resistencia a éstos se convirtió en un problema clínico

importante, por lo que se desarrollaron nuevos agentes terapéuticos (Sengupta et al.,

2013; Spellberg y Gilbert, 2014). Así, desde finales de la década de 1960 hasta

principios de la década de 1980 la industria farmacéutica introdujo antibióticos nuevos

para resolver el problema de la resistencia, pero al cabo del tiempo dejaron de ser

eficaces, y como resultado, las infecciones bacterianas se convirtieron nuevamente en

una amenaza (Spellberg y Gilbert, 2014). En septiembre de 2016 la Organización de

las Naciones Unidas (ONU) reconoció el aumento mundial de la resistencia bacteriana

a los antibióticos como una amenaza para la salud y el desarrollo humano (ONU, 2016).

22

La resistencia bacteriana a los antibióticos es un proceso biológico natural que puede

darse por transferencia genética o por mutación; así, los genes resistentes codifican

algunos mecanismos por los cuales los microorganismos pueden resistir los efectos

inhibitorios de antibióticos específicos (OMS, 2001). En las bacterias, la herencia de los

genes puede darse en la misma familia y entre diferentes familias, a través de la

transferencia de elementos genéticos móviles conocidos como plásmidos; esta

transferencia horizontal de genes (HGT por sus siglas en inglés: horizontal gene

transfer) permite transmitir resistencia a antibióticos, aún entre diferentes especies de

bacterias. Por su parte, la resistencia a través de mutaciones llega a ocurrir

espontáneamente (Gould y Bal, 2013).

El uso excesivo o inapropiado de antibióticos es la principal causa de resistencia

bacteriana (CDC, 2013; Read y Woods, 2014). Diversos estudios han demostrado una

relación directa entre el consumo de antibióticos y la aparición y diseminación de cepas

bacterianas resistentes; en muchos países, los antibióticos no están regulados y están

disponibles sin prescripción médica (Nature, 2013; Michael et al., 2014). Esta falta de

regulación da como resultado antibióticos de fácil acceso, abundantes y baratos, lo que

promueve su uso excesivo; la posibilidad de comprar dichos productos en línea también

los ha hecho accesibles en países donde están regulados (Michael et al., 2014). De

igual manera, los antibióticos prescritos incorrectamente también contribuyen a la

aparición de bacterias resistentes (CDC, 2013). Se ha demostrado que las indicaciones

de tratamientos, la elección de los antibióticos y la duración del tratamiento son

incorrectos en 30 a 50 % de los casos (CDC, 2013; Luyt et al., 2014). Las

concentraciones sub-inhibitorias y terapéuticas de antibióticos pueden promover el

desarrollo de resistencia a éstos al apoyar las alteraciones genéticas, como los cambios

en la expresión génica, la HGT y la mutagénesis. Los cambios en la expresión génica

inducida por antibióticos pueden aumentar la virulencia, mientras que el aumento de

la mutagénesis y la HGT promueven la resistencia a los antibióticos y su propagación

(Viswanathan, 2014).

Por otro lado, la gran cantidad de antibióticos utilizados en la producción animal es la

causa principal de la acumulación de genes de resistencia dañinos en el reservorio

animal (Aarestrup, 2015). El uso de antibióticos en el ganado, que en muchos países

supera el consumo humano (FDA, 2016), se asocia principalmente con su uso rutinario

como promotores del crecimiento o como sustitutos de bajo costo de medidas de

23

higiene para prevenir infecciones en los animales. La evidencia que vincula la

resistencia bacteriana a antibióticos entre animales y humanos, mediante el consumo

de productos cárnicos, es particularmente fuerte para los patógenos resistentes a las

quinolonas, como Campylobacter spp. y Salmonella spp. (Engberg et al., 2001). Se

estima que la resistencia de las bacterias a los antibióticos aumentará los brotes de

enfermedades infecciosas en el ganado, reduciendo su productividad y perturbando el

comercio internacional (Lowder et al., 2016).

1.3. Generalidades del sistema inmunológico

El sistema inmunológico es el conjunto de estructuras y procesos biológicos en el

interior de un organismo que le permite mantener la homeostasis o equilibrio interno

frente a agresiones externas, ya sean de naturaleza biológica (agentes patógenos) o

físico-químicas (contaminantes o radiaciones), e internas (p. ej., células cancerosas)

(Lozano-Soto et al., 2012).

El sistema inmunológico de los vertebrados tiene como objetivo combatir partículas

extrañas y mantener la integridad de los tejidos mediante sus cuatro funciones

centrales: 1) reconocimiento de células propias y extrañas; 2) discriminación entre

células propias y extrañas; 3) protección de las células propias; y 4) muerte o

eliminación de las partículas extrañas (Tizard, 2013).

El sistema inmunológico reconoce componentes de los microorganismos como

lipopolisacáridos, peptidoglicanos, lipoproteínas, proteínas flagelares y ciertas

secuencias de ADN no metiladas conocidos como patrones moleculares asociados a

patógenos o PAMP (por sus siglas en inglés: patogens associated to molecular

patterns); éstos pueden generar rápidamente una respuesta inmune no específica

denominada inmunidad innata y al mismo tiempo estimular a las células inmunes

específicas desarrollando una respuesta eficaz, duradera y protectora, lo que se conoce

como inmunidad adaptativa (Siroski, 2011).

Así, el sistema inmunológico de los vertebrados está compuesto por dos grandes

subsistemas que se relacionan entre sí: el sistema inmunológico innato y el sistema

inmunológico adaptativo (Medzhitov y Janeway, 2000; Siroski, 2011).

24

1.3.1. Sistema inmunológico innato (SII)

El SII se define como el conjunto de todas las defensas de un organismo que no tienen

memoria inmunológica y ha evolucionado a partir de las asociaciones entre el huésped

y el patógeno. La inmunidad innata está basada en mecanismos de defensa activos y

pasivos menos específicos y poco sofisticados de un hospedador; es considerada la

primera línea de defensa e interviene en la activación de la respuesta inmune

adaptativa, respondiendo rápidamente a la presencia de patógenos (minutos a horas)

(Medzhitov y Janeway, 2000; Siroski, 2011).

Los componentes del SII son las células fagocíticas, como los neutrófilos y macrófagos,

y las células natural killer. Los macrófagos pueden reconocer directamente a los

patógenos por medio de la identificación de los PAMP (Ulevitch y Tobias, 1999), que

son compartidos por un gran número de patógenos debido a que realizan funciones

esenciales en los microorganismos (Medzhitov y Janeway, 1997). El reconocimiento de

los PAMP por receptores específicos que se encuentran sobre los fagocitos lleva a la

absorción de los microorganismos así como a la activación de las células fagocíticas,

resultando en la liberación de proteínas bactericidas y enzimas que se encuentran pre-

almacenadas en gránulos dentro de los neutrófilos y también a la liberación de

quimoquinas y citoquinas a partir de los monocitos y macrófagos. Mientras que los

fagocitos actúan para combatir patógenos que existen libremente en el torrente

circulatorio o los tejidos, las células natural killer combaten a los virus que se alojan en

las células por medio de la destrucción de las células infectadas (Biron, 1997). Debido

a la falta de capacidad del SII para reconocer específicamente a los patógenos y proveer

una inmunidad específica, se desarrolla la respuesta inmune adaptativa (Siroski, 2011).

1.3.2. Sistema inmunológico adaptativo (SIA)

El SIA puede tardar varios días o semanas en activarse completamente y requiere de

exposición previa a un antígeno para generar una respuesta inmunológica completa,

utilizando respuestas tanto humorales como mediadas por células (Coico y Sunshine,

2015). El SIA tiene una gran variedad de receptores que reconocen específicamente a

los antígenos y posee una flexibilidad superior al SII en su adaptación a los cambios

moleculares que presentan los diferentes patógenos, lo que significa que la respuesta

25

se va adaptando para asegurar una respuesta inmune eficaz, generando una memoria

inmunológica de larga duración contra posibles reinfecciones (Andersson et al., 1981).

Esta respuesta inmune, mediada por linfocitos B y T, se desarrolla en alrededor de diez

días y responde a las características específicas expresadas por el patógeno invasor; a

estas células inmunitarias también se le conoce como inmunógenos y funcionan casi

exclusivamente contra el patógeno contra el cual se generaron dada la especificidad de

sus determinantes antigénicos (Robert y Ohta, 2009). Esto sucede cuando en el SII las

células dendríticas y los macrófagos ingieren a los microorganismos y presentan los

antígenos derivados de los mismos a los linfocitos T, lo que desencadena una expansión

clonal de linfocitos T específicos para cada antígeno (Ulevitch et al., 2004). A su vez,

las citoquinas y quimoquinas de las células T regulan la proliferación de células B y la

producción de anticuerpos, así como la actividad de las células del SII. Estas

intercomunicaciones entre el SIA y el SII facilitan una respuesta inmune amplia y

flexible (Siroski, 2011).

En las fases iniciales de la infección, las respuestas inflamatorias se derivan

exclusivamente del SII, mientras que conforme avanza el proceso infeccioso, las

respuestas inflamatorias surgen del efecto cooperativo entre ambos sistemas (Siroski,

2011). En el caso de producirse una reinfección, la respuesta inmune es rápida. Cuando

los anticuerpos disponibles son insuficientes para prevenir la reinfección se activa la

memoria inmunológica, en este caso, las células con memoria se activan y la respuesta

adaptativa se induce en un tiempo más corto y con mayor intensidad que en la infección

primaria, sin que aparezca algún signo o síntoma de infección (Ulevitch et al., 2004).

En general, la respuesta del SIA puede dividirse en dos tipos: 1) inmunidad humoral,

e 2) inmunidad mediada por células (IMC).

1.3.2.1. Inmunidad humoral

Este tipo de inmunidad se refiere a la producción de anticuerpos. La respuesta humoral

es más eficaz contra los patógenos extracelulares. Los anticuerpos específicos cumplen

tres funciones principales en la defensa del hospedador. La primera función es la de

neutralización, que implica la unión de los anticuerpos específicos a adhesinas

bacterianas para impedir la adhesión del patógeno a las células diana o tejidos

(Janeway y Medzhitov, 2002). La segunda función es la de opsonización, mediante la

26

cual los agentes patógenos ubicados en los espacios extracelulares son reconocidos por

los macrófagos y se produce la unión entre el receptor en la superficie del macrófago y

de la molécula del anticuerpo en la superficie del patógeno, que luego es ingerido y

degradado. La tercera función es la de activación del sistema del complemento, que se

refiere a que los componentes específicos del complemento que reconocen los

complejos antígeno-anticuerpo inducen la cascada del complemento que puede resultar

en la muerte directa del patógeno (Schmidt y Colten, 2000).

1.3.2.2. Inmunidad mediada por células (IMC)

Las respuestas de la IMC son más eficaces contra los patógenos intracelulares que

pueden encontrarse dentro de las vesículas fagocíticas o libres en el citoplasma de la

célula hospedera (Siroski, 2011). Los linfocitos T son las células encargadas de esta

respuesta; ésta sucede cuando las células presentadoras de antígenos procesan y

presentan dichos antígenos en su membrana mediante el Complejo Mayor de

Histocompatibilidad (CMH). Los linfocitos T citotóxicos (CD8+) reaccionan con el CMH

I y los linfocitos T colaboradores o helper (CD4+) con el CMH II que son reconocidos

por el receptor T que dichos linfocitos presentan en su membrana. Entonces, los

linfocitos T activan toda la cascada de señales y reacciones que hacen frente a la

infección (Abbas et al., 2002).

1.4. Sistema inmune de los reptiles

Los reptiles son los únicos amniotas ectotérmicos y, por lo tanto, se convierten en un

grupo fundamental para el estudio de la evolución del sistema inmune y del

funcionamiento del sistema inmune en un entorno ecológico (Zimmerman et al., 2010).

1.4.1. Sistema inmune innato (SII) en reptiles

El SII está compuesto por diversas moléculas y células que actúan como una primera

línea de protección no específica contra patógenos e incluye lisozimas, proteínas

antimicrobianas, el sistema del complemento y leucocitos no específicos (Siroski,

2011).

27

1.4.1.1. Lisozimas

Las lisozimas son enzimas que pueden causar la lisis de las bacterias por hidrólisis de

la pared celular y se han aislado de lagartos y varias especies de tortugas (Gayen et

al., 1977; Ingram y Molyneux, 1983; Araki et al., 1998; Thammasirirak et al., 2006).

Al comparar lisozimas de la tortuga china de caparazón blando (Pelodiscus sinensis), la

tortuga asiática de caparazón blando (Amyda cartilagenea) y la tortuga verde (Chelonia

mydas), se observó que, aunque cada una tenía diversos grados de capacidad lítica

frente a varias cepas de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, ninguna fue

efectiva contra las cepas de bacterias de las especies más patógenas para reptiles

(Thammasirirak et al., 2006).

1.4.1.2. Proteínas antimicrobianas

Los reptiles tienen proteínas antimicrobianas que son similares en estructura y función

a las defensinas; son proteínas que tienen un pliegue característico rico en lámina β,

así como seis cisteínas ligadas a disulfuro y se han encontrado en mamíferos y en aves

(Ganz, 2004). La clara de huevo de la tortuga boba (Caretta caretta) carece de lisozima

pero contiene una pequeña proteína catiónica estructural y funcionalmente similar a

una subfamilia de defensinas conocidas como β-defensinas. Estas proteínas muestran

una fuerte actividad antibacteriana contra Escherichia coli y Salmonella typhimurium,

así como actividad antiviral contra el virus Chandipura (Chattopadhyay et al., 2006).

También se encontró un péptido de tipo β-defensina, pelovaterina, en la cáscara de

huevo de la tortuga china de caparazón blando (Lakshminarayanan et al., 2008). Al

igual que en los mamíferos, las proteínas del complemento de cocodrilo pueden actuar

como opsoninas, aumentando la eficacia fagocítica. Aree et al. (2011) demostraron

estos efectos del suero del cocodrilo siamés (Crocodylus siamensis) sobre

Staphylococcus aureus y Escherichia coli. La incubación con suero indujo aumentos de

2 y 4 veces en la captación fagocítica de S. aureus y E. coli, respectivamente.

1.4.1.3. Sistema del complemento

El sistema del complemento consiste en una serie de proteínas que existen en el plasma

y matan a las bacterias invasoras, ya sea a través del proceso de opsonización o por

lisis. En la opsonización las proteínas cubren la membrana bacteriana permitiendo que

28

las bacterias sean reconocidas por los macrófagos, que luego envuelven a las bacterias

a través de la fagocitosis. En la lisis, las proteínas del complemento rompen la

membrana bacteriana y matan a las bacterias invasoras directamente (Seelen et al.,

2005). La cascada del complemento se puede lograr mediante tres vías diferentes: vía

clásica, alternativa y lectina. La vía clásica se activa con inmunoglobulinas IgG e IgM.

La ruta alternativa es activada por moléculas como un virus o un lipopolisacárido en la

superficie de las bacterias y no requiere anticuerpos; se denomina ruta alternativa sólo

porque la vía clásica se descubrió primero (Seelen et al., 2005). La ruta de la lectina

se activa por residuos de manosa de proteínas que se encuentran en la superficie de

las bacterias (Coico y Sunshine, 2015). Se ha confirmado la presencia de vías

alternativas y clásicas en reptiles y aunque no se ha encontrado evidencia directa para

la vía de lectina, se cree que los reptiles también la tienen debido a su presencia en

peces sin mandíbula, tiburones, teleósteos, anfibios, aves y mamíferos (Sunyer y

Lambris, 1998).

1.4.1.4. Leucocitos no específicos

Existe una serie de leucocitos no específicos presentes en los reptiles, incluidos

macrófagos, monocitos, heterófilos, basófilos y eosinófilos. Los monocitos y macrófagos

son células fagocíticas que procesan y presentan antígenos y también liberan citocinas

(Coico y Sunshine, 2015). La temperatura puede afectar la actividad fagocítica de los

macrófagos en los reptiles. Se ha reportado que los niveles más altos de fagocitosis y

citotoxicidad de los macrófagos esplénicos de los lagartos de pared (Hemidactylus

flavivis) ocurrieron a 25 °C, con función macrófaga alterada tanto a temperaturas más

altas como más bajas (Mondal y Rai, 2001). Los heterófilos son equivalentes a los

neutrófilos de mamíferos y pueden variar ampliamente entre especies; éstos ayudan a

suprimir la invasión microbiana y también participan en la respuesta inflamatoria en

reptiles (Montali, 1988). Los basófilos contienen inmunoglobulinas específicas de

antígeno en sus superficies y cuando se activan por un antígeno, se degranulan y

liberan histamina, pero esta liberación depende de la concentración y la temperatura

del antígeno. Por otro lado, los eosinófilos se han descrito en reptiles, pero se sabe

poco acerca de su función en este grupo. En los mamíferos, los eosinófilos juegan un

papel en la defensa contra las infecciones parasitarias produciendo radicales de

peróxido y superóxido, pero no se ha determinado si desempeñen o no un papel similar

en reptiles (Coico y Sunshine, 2015).

29

1.4.2. Respuesta inflamatoria

Una función importante del sistema inmune innato es responder a una lesión o infección

a través de la respuesta inflamatoria. La respuesta varía según el tipo de patógeno

invasor. En reptiles, los patógenos extracelulares inducen la formación de granulomas

heterofílicos, donde los heterófilos se acumulan, degranulan y sufren necrosis, lo que

estimula una fuerte respuesta de macrófagos (Montali, 1988). Por el contrario, en

respuesta a un patógeno intracelular, los reptiles forman un granuloma histiocítico,

formado por los macrófagos que se centralizan y experimentan necrosis. Los

granulomas crónicos pueden formarse a partir de granulomas heterófilos e histiocíticos

(Montali, 1988). A diferencia de los mamíferos, los reptiles no forman un exudado de

pus líquido como parte de la respuesta inflamatoria, sino que forman una masa caseosa

que consiste principalmente en heterófilos degranulados y degenerados (Montali,

1988). Las primeras etapas de la respuesta inflamatoria después de la lesión son

similares a las de los mamíferos, con gran migración de heterófilos a la zona. Sin

embargo, estos heterófilos pueden durar mucho más tiempo en el sitio de la lesión que

los neutrófilos de mamíferos (Tucunduva et al., 2001).

La respuesta inflamatoria está dirigida por una serie de citoquinas y quimiocinas que

incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), la interleucina-6 (IL-6) y la

interleucina-1 (IL-1) en los mamíferos. Las citoquinas son sustancias de bajo peso

molecular producidas por diferentes tipos celulares que median las interacciones

celulares, mientras que las quimioquinas son un tipo de citocinas pequeñas que dirigen

la migración de células y linfocitos fagocíticos (Coico y Sunshine, 2015). Sin embargo,

la información sobre citoquinas y quimiocinas en reptiles es limitada (Zimmerman et

al., 2010).

1.5. Actividad de los componentes sanguíneos de los cocodrilianos sobre

células de mamíferos

Se han realizado estudios acerca de la citotoxicidad que pudieran tener los

componentes sanguíneos de los cocodrilianos sobre células humanas. Al respecto,

Jangpromma et al. (2016) estudiaron la viabilidad y proliferación celular del plasma y

del suero sanguíneo del C. siamensis sobre una línea celular de keratinocitos humanos

(HaCaT) y reportaron que a una concentración de 3.9-1000 µg/mL no se observaron

30

efectos citotóxicos en un ensayo MTT; además, se descubrió que el plasma y el suero

promueven la proliferación celular en un 114-155% y 119-146% respectivamente. Es

importante señalar que, según la temporada, los cocodrilos con frecuencia pelean entre

sí, lo que a menudo provoca heridas graves en la piel; sin embargo, estas lesiones

parecen sanar rápidamente y están casi libres de infección, aunque estos animales

pueden transportar una gran carga de coliformes fecales de su entorno acuático

(Buthelezi et al., 2012; Van-Hoek, 2014) Considerando estos hechos, parece factible

que el plasma y el suero de C. siamensis contengan una variedad de sustancias con

propiedades antimicrobianas o cicatrizantes (Jangpromma et al. 2016).

Otro estudio realizado por Kommanee et al. (2012), en donde a pesar de que el objetivo

fue determinar la actividad antibacteriana del plasma sanguíneo crudo igualmente del

C. siamensis, se realizó también un ensayo de MTT, donde se probó la citotoxicidad del

plasma sobre células de macrófagos de ratones (RAW264.47) y reportaron que no era

tóxico ya que las células tuvieron una viabilidad del 99%.

1.6. Actividad antimicrobiana de los componentes sanguíneos de cocodrilianos

Los cocodrilos viven con infecciones causadas por bacterias oportunistas, y aunque no

son totalmente inmunes a éstas, normalmente no sufren efectos adversos, lo que

sugiere que la resistencia a estos microorganismos es efectiva (Merchant et al., 2003,

2004). Al ser animales temperamentales, los cocodrilos frecuentemente presentan

heridas graves como consecuencia de disputas sociales (Webb et al., 1987; Piña et al.,

2003), incluyendo la pérdida de extremidades enteras. A pesar de la gravedad de

muchas heridas, generalmente hay pocos signos de infección, lo que ha llevado a

preguntarse cómo es que estos animales a veces sobreviven a heridas tan graves sin

mostrar signos evidentes de enfermedad, particularmente cuando viven en ambientes

que contienen microorganismos que potencialmente pueden causar infección (Merchant

et al., 2003; 2005; Siuntawineti et al., 2004; Merchant y Britton, 2006).

Existen reportes acerca de la eficacia antimicrobiana de algunos componentes

sanguíneos de los cocodrilianos. Siroski et al. (2010) realizaron un estudio en donde se

demostró que el plasma sanguíneo del caimán de hocico ancho (Caiman latirostris)

presentó actividad antibacteriana sobre la cepa de Escherichia coli ATCC 11105,

comparándose con la actividad antibacteriana del plasma de gallo bankiva (Gallus

31

gallus) y de humano, demostrándose que la actividad del plasma del caimán fue

superior al inhibir completamente la proliferación de E. coli. En un estudio similar,

Leelawongtawon et al. (2010) demostraron que el suero fresco y el suero liofilizado del

cocodrilo siamés (Crocodylus siamensis) tiene actividad antimicrobiana sobre cepas de

Klebsiella aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium,

Pseudomonas aeruginosa, y sobre cepas fúngicas de Cryptococcus neoformans y

Aspergillus niger. Kommanee et al. (2012) demostraron actividad antimicrobiana

significativa del plasma sanguíneo semipurificado del cocodrilo americano sobre cepas

bacterianas humanas como Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhy

ATCC 11778, Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae non01, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella typhy y Vibrio cholerae.

Pata et al. (2011) purificaron cuatro péptidos antibacterianos, denominados Leucrocin

I a IV, a partir de extractos de glóbulos blancos de cocodrilo siamés y observaron que

estas leucrocinas exhibieron fuerte actividad antibacteriana sobre Staphylococcus

epidermidis, Salmonella typhy y Vibrio cholerae. Por su parte, Machha et al. (2011)

demostraron la actividad inhibitoria del extracto de leucocitos refinado del cocodrilo

americano (Alligator mississippiensis) sobre aislamientos de patógenos resistentes a

antibóticos como Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium y Klebsiella

pneumoniae. Barksdale et al. (2016) observaron fuerte actividad in vitro de péptidos

antimicrobianos catiónicos del plasma de cocodrilo americano contra cepas

de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter

baumannii resistentes a múltiples fármacos.

Por otro lado, Prajanban et al. (2017) estudiaron los efectos antimicrobianos de los

nuevos péptidos cOT2 y sOT2 derivados de las ovotranferrinas de Crocodylus siamensis

y demostraron actividad antibacteriana potente sobre Bacillus megaterium, B. pumilus,

E. coli ATCC25922, E. coli O157: H7 y Vibrio cholerae (aislado clínico de Tailandia, con

un rango de CIM 7-32.2 µM). Por otro lado, recientemente Tankrathoj et al. (2018)

identificaron el primer gen de catelicidina de Crocodylus siamensis y el péptido RN15

derivado del dominio de catelina exhibiendo actividad antibacteriana contra bacterias

Gram positivas como Bacillus megaterium y Bacillus subtilis y Gram negativas como E.

coli exhibiendo una concentración inhibitoria mínima CIM baja 12.5 y 25 µg/mL para

las Gram positivas respectivamente; también se observaron cambios en las morfologías

celulares de las bacterias después de estar expuestas al péptido 15 minutos.

32

HIPÓTESIS

El plasma sanguíneo del cocodrilo de pantano (Crocodylus moreletii) presenta actividad

antibacteriana sobre cepas de Staphylococcus aureus.

OBJETIVO GENERAL

Establecer la actividad antibacteriana del plasma sanguíneo del cocodrilo de pantano

(Crocodylus moreletii) sobre cepas de Staphylococcus aureus.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1 Conocer la actividad antibacteriana del plasma sanguíneo del cocodrilo de

pantano sobre cepas de Staphylococcus aureus con resistencia a la meticilina

de importancia clínica.

2 Determinar la citotoxicidad del plasma sanguíneo del cocodrilo de pantano sobre

cultivos de linfocitos humanos de sangre periférica.

33

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Características del estudio

Se realizó un estudio experimental que se llevó a cabo de febrero de 2019 a marzo de

2020, de manera conjunta en las Facultades de Medicina Veterinaria y Zootecnia y de

Bioanálisis de la región Veracruz en la Universidad Veracruzana. El estudio comprendió

de cuatro fases: 1) Obtención del plasma sanguíneo de C. moreletii; 2) Evaluación de

la reactividad de linfocitos humanos al plasma de cocodrilo; 3) Aislamiento y

confirmación de las cepas de S. aureus y evaluación de susceptibilidad y resistencia

antimicrobiana; y 4) Evaluación de la actividad antibacteriana del plasma sanguíneo de

cocodrilo sobre S. aureus.

2.2. Obtención del plasma sanguíneo de Crocodylus moreletii

Se obtuvieron muestras sanguíneas de 10 ejemplares adultos de cocodrilo de pantano

(Crocodylus moreletii) aparentemente sanos, mantenidos en cautiverio en la Unidad de

Manejo Ambiental (UMA) Cacahuatal (INE/CITES7DGVS-CR-IN-0434-VER/99),

localizada en el municipio de La Antigua, Veracruz.

Los animales fueron sacados de los estanques y se colocaron en jaulas de contención

(Fig. 1). Las muestras se obtuvieron mediante punción del seno venoso postoccipital

utilizando aguja calibre 22 y jeringa desechable de 10 mL, desinfectando previamente

el área con iodopovidona (Fig. 2). La sangre se colocó en tubos de plástico de 10 mL

heparinizados. Las muestras se invirtieron delicadamente de 8 a 10 veces para

homogeneizar el anticoagulante con la sangre; posteriormente fueron trasladadas en

red fría al laboratorio para su procesamiento dentro de las 2-4 h después de recolectada

la muestra.

34

FIGURA 1. Ejemplares de C. moreletii sacados de los estanques para la toma de

muestra sanguínea.

FIGURA 2. Toma de muestra sanguínea de C. moreleti.

2.2.1. Procesamiento de las muestras sanguíneas

Las muestras se mantuvieron durante todo el procesamiento a 4 °C y se centrifugaron

a 1100 g x 10 min para obtener el plasma. Se evitó mezclar o agitar la muestra después

35

de centrifugarlas para evitar la re-suspensión del pellet celular. Se tomó el plasma que

corresponde a la parte superior del tubo centrifugado, evitando acercarse a la capa de

la interfase. El plasma obtenido se alicuotó y se almacenó a 4 °C para su posterior uso

(Fig. 3) (ISBER, 2008)

FIGURA 3. Plasma sanguíneo de C. moreletii alicuotado.

2.2.2. Cuantificación de proteínas del plasma sanguíneo de cocodrilo y

humano

Para determinar la cantidad de proteína en el plasma sanguíneo se utilizó el protocolo

del kit comercial PierceTM BCA Protein Assay Kit de Thermo ScientificTM y las muestras

fueron analizadas por espectrofotometría. Tomando como referencia la curva de

proteínas totales de la albúmina (Cuadro 1 y Fig. 4), se pudo determinar la

concentración de proteínas totales de los plasmas de humano y cocodrilo (Cuadro 2).

Los valores puntuales de proteínas totales de C. moreletii y humano fueron expresados

en miligramos por mililitro, donde para C. moreletii tuvo un valor de 66.3 mg/mL,

mientras que para humano fue 56.1 mg/mL de proteínas totales.

36

CUADRO 1. Cuantificación de proteínas de referencia BSA.

REFERENCIA

µg/ml Absorbancia final

2000 0.585666667

1500 0.522333333

1000 0.4

750 0.328666667

500 0.262666667

250 0.169333333

125 0.136

25 0.103333333

FIGURA 4. Cuantificación de proteínas de referencia (albúmina sérica bovina).

2.2.3. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en presencia de

sds

Con el fin de determinar la calidad de las muestras obtenidas de C. moreletii, también

se llevó a cabo el ensayo de electroforesis en gel de poliacrilamida, en donde lo primero

que se preparó fue la poliacrilamida en concentraciones de 30% acrilamida y 0.8% de

bisacrilamida y después se prepararon los buffers que se utilizaron para realizar los

y = 0.0003x + 0.1041R² = 0.9953

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Ab

sorb

anci

a fi

nal

µg/ml

Referencia albúmina sérica bovina

37

geles, uno de 1.5 M tris-HCl pH 8.8 y otro de 0.5 M tris HCl pH 6.8, así como el buffer

amortiguador de la cámara y el buffer de muestra reductor; todos estos reactivo se

hicieron de acuerdo a los protocolos descritos por Coligan et al. (1992).

Con los reactivos listos, se procedió a realizar los geles. El primero fue el gel separador

al 15%. Para éste, se colocaron en un vaso de precipitado de 10 mL 3.75 mL de

poliacrilamida, 1.875 mL de buffer 4X Tris-HCl/SDS pH 8.8, 1.875 mL de H2Od, 25 µl

de persulfato de amonio al 10% y finalmente 10 µl de TEMED; todos los reactivos se

homogeneizaron y con ayuda de una pipeta de transferencia se vertió la preparación

entre los cristales del molde y de inmediato se agregó una delgada capa de 1-2 mm de

agua destilada dejando polimerizar durante 15-20 min. Una vez que la interfase del

polímero y el agua se tornó visible, se decantó el exceso y se enjuagó con agua

destilada. Posteriormente, en ese mismo molde se realizó el gel de apilamiento al 5%,

para el que en un vaso de precipitado de 10 mL se agregaron 700 µl de poliacrilamida,

1.5 mL de H2Od, 250 µl de buffer 4X Tris HCl/SDS pH 6.8, 2.5 µl d TEMED y finalmente

20 µl de persulfato de amonio al 10%; los reactivos se homogeneizaron y la mezcla se

vertió con una pipeta de transferencia al molde de cristal rápidamente, acomodando el

peine de manera que no quedaran burbujas y se dejó polimerizar de 15-20 min.

Después, se retiró el peine y se lavaron los pozos del gel con agua destilada. El molde

con el gel se colocó en la cámara de electroforesis y ésta se llenó con el buffer

amortiguador de cámara 1X, sumergiendo totalmente el tanque interior entre los

cristales y de esta manera el gel quedó listo para ser cargado con las muestras.

La preparación de la muestra se realizó de manera independiente y el primer paso fue

la extracción de proteínas por medio del reactivo ProteoJet Mammalian Cell Lysis

(Thermo Fisher). Para esto, el plasma liofilizado de cocodrilo se diluyó en agua destilada

por medio de un sonicador BransonTM; el plasma diluido se colocó en viales en diferentes

concentraciones para un volumen final de 1 mL por vial. Las concentraciones de plasma

utilizadas fueron: 250, 128, 64, 32, 16, 8, 4 y 2 mg por vial. Los viales se centrifugaron

a 2500 g por 10 min y se les retiró el sobrenadante; se les agregó el reactivo ProteoJet

Mammalian Cell Lysis (Thermo Fisher) a razón de 1 mL por cada 100 µl de pellet

húmedo, se homogeneizó de manera suave durante 1 min y se centrifugó a 14000 g

por 15 minutos. Finalmente, se tomó el sobrenadante de cada muestra para analizarlo.

Una vez teniendo las muestras listas, se mezclaron con el buffer reductor tomando 15

µl de muestra y 15 µl de buffer reductor para reducir o romper los enlaces de disulfuro

38

de las proteínas, se incubó cada vial a 95 °C por 5 minutos y una vez pasado este

tiempo las muestras estaban listas para ser montadas en los pozos de gel.

Finalmente se colocaron las muestras en los pozos del ge. En el primer pozo se

colocaron 3 µl del marcador de peso molecular de proteínas de la marca Fermentas

PageRulerTM Unstained Protein Ladder, mientras que en los siguientes pozos se

colocaron las muestras de manera descendente comenzando con la de mayor

concentración de proteína, mencionadas anteriormente. Con el gel listo se cerró con la

tapa y se conectaron los electrodos a la fuente de poder, dejando correr el gel 90

minutos a 200 V, se sacó el molde de cristal y con mucho cuidado se separaron los

cristales y el gel se colocó en un recipiente con azul de Coomassie R-250 para teñirse,

en donde se dejó 24 horas El gel teñido se colocó en una solución fijadora con ácido

acético glacial durante 2 horas y finalmente se observó en un pequeño negatoscopio

(Fig. 5).

FIGURA 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida para lectura de proteínas en plasma

de C. moreletii con marcador de peso molecular.

39

2.3. Conteo y evaluación de reactividad de linfocitos por ensayo MTT

Primero se evaluó la viabilidad y reactividad de linfocitos humanos tomados de sangre

periférica después de ser mezclados con el plasma sanguíneo de cocodrilo. Para esto,

se hizo un cultivo de linfocitos humanos separados con Ficoll® Paque Plus GE, EE.UU

por gradiente de centrifugación a partir de 10 mL de sangre total, utilizando medio de

cultivo RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%, antibiótico-antimicótico

1% y glutamina 1%. El cultivo se incubó en atmósfera de CO2 al 5% y humedad

constante.

Para el cultivo de linfocitos de sangre periférica humana, se obtuvieron 10 mL de sangre

periférica humana y se almacenaron en tubos con heparina sódica (5 mL por tubo);

posteriormente se realizó la separación de los mononucleares por gradiente de Ficoll

1:1. Para esto, en la campana de flujo laminar se colocaron 5 mL de ficoll en dos tubos

Falcon de 15 mL y a continuación se depositaron 5 mL de sangre periférica por tubo,

esto se hizo de manera muy suave a través de las paredes del tubo con una pipeta de

transferencia estéril de 3 mL (Fig.6). Los tubos con sangre y Ficoll se centrifugaron a

3500 rpm por 60 min. Después, con una pipeta de transferencia estéril se tomó de la

parte superior del tubo el plasma sanguíneo y éste se depositó en un tubo Falcon para

ser almacenado a -4 °C. El resto de cada muestra que quedó en cada tubo Falcon se

transfirió a otro tubo Falcon de 15 mL, al que se le adicionaron 2 mL de solución PBS

1X y se centrifugó a 1100 rpm por 10 min. Después se retiró el sobrenadante con una

pipeta de transferencia y el pellet resultante se depositó en una botella de cultivo de

25 cm3 con 10 mL de medio de cultivo RPMI, previamente atemperado a 37 °C y

suplementado. Se homogeneizó suavemente y se dejó incubar en una estufa de cultivo

celular a 37 °C con 5% de CO2 por 24 h.

40

FIGURA 6. Adición del Ficoll® Paque Plus GE, EE.UU a los tubos con sangre

heparinizada.

Después del cultivo por 24 h se realizó el conteo celular con azul de Trypan al 0.4%.

Esta tinción permitió además distinguir los linfocitos vivos de los muertos. En un tubo

Eppendorf de 1.5 mL se agregaron 10 μl de azul de Trypan al 0.4% y 10 μl del cultivo

homogeneizado, dejándolo incubar durante 1 min; a continuación, se colocó sobre la

cámara de Neubauer un cubreobjetos y se depositaron 10 μl de la suspensión celular

premezclada con azul de Trypan en la entrada superior y los otros 10 μl en la entrada

inferior, hasta que se alcanzó la confluencia para examinarse al microscopio óptico

(Olympus®, E.U.), y se contaron las células presentes (Fig. 7). Posteriormente, los

linfocitos teñidos de azul en su totalidad o su membrana se consideraron muertos (azul

de Trypan positivos, AT+), mientras que los que no teñidos se consideraron vivos (azul

de Trypan negativos, AT-). Este conteo se realizó cada 24 h para obtener una curva de

crecimiento y establecer las mejores condiciones de estabilidad del cultivo, que fueron

las que se emplearon para todos los conteos de linfocitos posteriores.

41

FIGURA 7. Linfocitos humanos observados por medio de microscopio óptico y cámara

de Neubauer.

Para determinar el efecto citotóxico del plasma de cocodrilo sobre los linfocitos

humanos de sangre periférica se realizó un ensayo de la reducción metabólica del

Bromuro de 3-(4,5- dimetiltazol-2-ilo) -2,5- difeniltetrazol (MTT) (Mosmann, 1983).

Para esto, se emplearon cultivos óptimos de 160,000 células por pocillo, en placas de

cultivo de 96 pozos; se colocaron 100 µl de células y se adicionaron 100 µl de plasma

de cocodrilo con seis diferentes concentraciones, se dejó incubar por 1 h en estufa de

cultivo a 37 °C, y una vez pasado el tiempo, se le añadió a cada pozo 10 µl de reactivo

MTT dejándose incubar 4 h a 37 °C. Posteriormente, se le añadió a cada pozo 100 µl

de detergente y se volvió a incubar 4 h a 37 °C. Finalmente, se midió la citotoxicidad

por medio de espectrofotometría a 570 nm; se realizaron dos repeticiones

independientes por cada muestra.

2.4. Aislamiento y confirmación de las cepas de Staphylococcus aureus

En esta sección es importante señalar que se obtuvieron seis aislados clínicos de S.

aureus de importancia clínica que fueron proporcionados por el Cepario Microbiano de

la Facultad de Bioanálisis de la UV región Veracruz; sin embargo, para los ensayos de

microdilución en caldo descritos más adelante, solamente se utilizó el aislado MRSA

20090127 y una cepa de referencia ATCC 1556.

42

Dado que estos aislados no estaban almacenados correctamente, se prepararon los

agares sólidos para su debido almacenamiento. Para esto, se realizó el pesaje de los

agares sal y manitol y BHI, y se preparó un litro de cada uno. El agar sal y manitol se

vertió en cajas de cultivo individuales, mientras que el agar BHI se vertió en tubos de

16 x 100 a razón de 5 mL por tubo los cuales una vez esterilizados y solidificados se

almacenaron en refrigeración a -4 °C para su posterior uso (Fig. 8).

Por otro lado, en las placas que tenían agar sal y manitol se hizo una resiembra de las

cepas de S. aureus que estaban en refrigeración y se incubaron a 37 °C por 24 h, para

observar el crecimiento y asegurar que no hubiera contaminación (Fig. 9).

Posteriormente se hizo una siembra de esas cepas en los tubos de cultivo con agar BHI,

se dejaron incubar a 37 °C por 24 h (Fig. 10) y finalmente se hizo el almacenamiento,

cubriendo el crecimiento bacteriano de los tubos con aceite mineral estéril como se

puede observar en la Figura 10.

Ahí mismo fueron identificados los aislados bacterianos por los métodos tradicionales

de siembra en gelosa. Para su reactivación, los cultivos fueron inoculados en caldo de

infusión de cerebro-corazón (BHI), el cual fue incubado en estufa de cultivo a 37 °C por

4 h hasta observar turbidez en el medio, esto se realizó por duplicado. Posteriormente,

éstos aislados fueron inoculados por medio de un hisopo que se humedeció con el

medio líquido y se sembró en, en agar sangre y se incubaron a 37 °C por 24 h en estufa

de cultivo para reactivar su metabolismo. Al terminar el período de incubación se

tomaron las colonias aisladas para re-suspenderlas y fomentar su crecimiento en agar

sal y manitol por 24 h a 37 °C, donde se observó la morfología colonial, la fermentación

del manitol y en agar sangre se pudo observar la presencia de hemólisis (Fig. 11 y 12).

Para poder confirmar que los aislados clínicos fueran de S. aureus se llevaron a cabo

diferentes pruebas como tinción de Gram, para observar la caracterización morfológica,

las pruebas de catalasa, coagulasa, y finalmente la prueba de la susceptibilidad y

resistencia antimicrobiana.

43

FIGURA 8. A) Preparando cajas de Petri de agar sal y manitol; B) Tubos de cultivo con

agar BHI; C) Cajas de cultivo con agar sal y manitol y agar BHI.

FIGURA 9. Observación de cepas de Staphylococcus aureus después de 24 h en estufa

de cultivo.

A B C

44

FIGURA 10. A) Siembra de S. aureus en tubos de cultivo para su almacenamiento; B)

Cepa de S. aureus en tubo de cultivo con aceite mineral esterilizado.

FIGURA 11. A) Staphylococcus aureus en agar sal y manitol, donde las colonias doradas

(flecha roja) representan la fermentación del manitol; B) S. aureus en agar sangre

donde se observa la hemólisis beta. En forma de halos claros alrededor de las colonias.

A B

45

2.4.1. Caracterización morfológica

Se realizó una tinción de Gram (Fig. 12), a cada uno de los aislados clínicos para

confirmar que las bacterias tuvieran las características morfológicas de Staphylococcus

aureus, para esto se tomaron con ayuda de un aplicador de madera 3 a 4 colonias de

la placa con agar sal y manitol y se colocaron sobre un portaobjetos y se fijaron a este

pasando el portaobjetos por la flama del mechero rápidamente, posterior a eso se

empleó cristal violeta como primer colorante durante 1 min y se enjuagó con agua

corriente, después se utilizó yodo-Lugol como fijador y dejó 1 min y se enjuagó con

agua corriente, después se decoloró con alcohol-cetona por 15 seg, se enjuagó con

agua corriente y finalmente como colorante de contraste se utilizó safranina por 1 min

y se enjuagó con agua corriente, la morfología colonial se observó bajo el microscopio

óptico.

FIGURA 12. Morfología colonial de Staphylococcus aureus.

2.4.2 Prueba de catalasa en lámina

Por otro lado, se llevó a cabo la prueba de catalasa (Fig. 13), para lo que se colocó una

gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) sobre un portaobjetos y se tomó con un aplicador

de madera de 3 a 4 colonias de la placa de cultivo de sal y manitol y se homogeneizó

hasta observar la descomposición del peróxido convirtiéndolo en agua, más oxígeno el

cual se evidencia en forma de burbujas.

46

FIGURA 13. Realizando prueba de catalasa.

2.4.3. Prueba de coagulasa

Se realizó la prueba de coagulasa. En un tubo de ensaye de 13 x 100 se colocaron 100

µl de plasma humano citrado y se le agregó 100 µl de caldo BHI inoculado con S.

aureus; el tubo se tapó con una torunda de algodón y se dejó incubar a 37 °C por 24

h, finalmente se observó el coágulo que forma la enzima coagulasa característico de S.

aureus (Fig. 14).

FIGURA 14. Formación de la fibrina (flecha roja) en fibrinógeno en plasma humano.

47

2.4.4. Prueba de susceptibilidad y resistencia antimicrobiana

La identificación de la susceptibilidad y resistencia antimicrobiana se realizó a los

aislados clínicos de S. aureus, y se midió mediante el método de difusión en agar

de Kirby-Bauer (Bauer et al., 1966). Primero se prepararon los inóculos para la escala

McFarland en medio líquido, se propagaron de 3 a 5 colonias de cada cepa en caldo de

infusión cerebro-corazón y se incubaron a 35 °C de 2 a 4 h, hasta observar turbidez,

misma que se midió a través de un espectrofotómetro de luz visible Genesys 20 a una

longitud de onda de (λ) de 625 nm, utilizando como blanco el caldo inocuo, con un

marco de absorbancia de 0.08 a 0.13 nm, el equivalente a 0.5 en la escala de

McFarland, con una replicación de precisión ± 0.10, ya a que a dicha lectura presenta

una óptima distribución de la cepa en el medio sólido.

Posteriormente, ya con el inóculo listo para cada cepa, se prepararon dos cajas de Petri

para cada aislado de S. aureus, con medio agar Mueller-Hinton (HM) pues este medio

permite un crecimiento óptimo de S. aureus así como una correcta expresión del

fenotipo de resistencia bacteriana. Entonces, un hisopo humedecido del patrón de

McFarland se deslizó por todo el agar tres veces, rotando la caja de Petri en un ángulo

de 90°, formando un césped uniforme, dejando cada caja de Petri de 3 a 5 minutos.

Posteriormente se colocaron los discos con los antibióticos (ATB) con pinzas estériles,

se presionaron ligeramente sobre el agar y se dejaron incubar a 35 °C por 24 h; en

una caja de Petri se aplicaron los antibióticos de sulfametoxazol/trimetoprim (SXT) en

concentración de 1.25 y 35.75 µg/mL respectivamente (Fig. 15); y en otra se aplicó

cefoxitín (FOX) en concentración de 30 µg/mL (Fig. 16). La lectura de los halos de

inhibición se midió en mm con ayuda de una regla y las medidas se compararon con

los puntos de corte descritos en el manual CLSI-2018-M100-S28ed Performance

Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, establecidos para la especie de

Staphylococcus aureus que sean resistentes a la meticilina o su equivalente actual a

oxacilina.

Los puntos de corte que considera el CLSI en cultivos de S. aureus son: para

sulfametoxazol/trimetoprim <10 mm resistente, >16 mm sensible; y para cefoxitín

<21 mm resistente, >22 mm sensible.

48

FIGURA 15. Halos de inhibición (mm) en cultivo de S. aureus con discos de

sulfonamidas/trimetoprim (17 mm), donde el halo gris que se observa indica la

inhibición bacteriana que provoca cada antibiótico.

FIGURA 16. No se observaron halos de inhibición (mm) en cultivo de S. aureus con

discos de cefoxitín.

49

2.5. Evaluación de la actividad antibacteriana por el método de microdilución

en caldo

Se realizó el ensayo de microdilución en caldo con dos cultivos MRSA, la cepa de

referencia ATCC 1556 y el aislado clínico MRSA 20090127, este último procedente del

Hospital Regional de la Ciudad de Veracruz. Se tomaron con el asa bacteriológica de 3

a 4 colonias de cada cultivo y se propagaron en caldo BHI, dejándolas en la estufa de

cultivo 3 horas a 37 °C hasta observar turbidez; esta turbidez se midió a través de un

espectrofotómetro de luz visible Genesys 20 a una longitud de onda de (λ) de 625 nm,

utilizando como blanco el caldo inocuo, con un marco de absorbancia de 0.08 a 0.13

nm, el equivalente a 0.5 en la escala de McFarland. Ya con el inóculo listo se hizo una

dilución 1/100, donde se colocaron 100 µl del caldo con bacterias en 9900 µl de caldo

nutritivo inocuo.

Una vez con el inóculo listo se procedió a cargar la placa de 96 pozos con fondo plano,

agregándole 100 µl de caldo nutritivo a cada pocillo, y posteriormente a la primera

columna se le agregó 100 µl de plasma de cocodrilo, se homogenizó con ayuda de la

micropipeta y se hicieron 5 diluciones seriadas; esto se hizo tomando 100 µl del primer

pocillo y agregándolo al siguiente, y de ese segundo pocillo se tomaron 100 µl y se

agregaron al pocillo siguiente y así consecutivamente hasta terminar las diluciones;

desechando los últimos 100 µl restantes. El siguiente paso consistió en agregar 100 µl

de caldo nutritivo con 1.5x106 UFC/mL de bacterias. Las concentraciones finales de

plasma de cocodrilo quedaron de la siguiente manera, 3315 µg/mL, 1657 µg/mL, 828

µg/mL, 414 µg/mL y 207 µg/mL. Los controles positivos o control del antibiótico se

colocaron en la columna siguiente con 100 µl de caldo nutritivo inoculado con bacterias

más el antibiótico trimetoprim con sulfametoxazol en concentración de 1.25 y 35.75

µg/mL respectivamente; y como control negativo o control de crecimiento en la

siguiente columna se utilizaron 100 µl de caldo nutritivo inoculado con bacterias más

100 µl de caldo nutritivo inocuo. La placa se dejó incubar 20 horas a 37 °C y se leyó

por espectrofotometría a 600 mn (Fig. 17).

50

FIGURA 177. Placa con las diferentes diluciones de plasma de cocodrilo.

2.6. Análisis estadístico

Las variables a analizar fueron las diferentes concentraciones de plasma de cocodrilo y

la presencia o ausencia de actividad antimicrobiana. El análisis estadístico de los datos

se realizó mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis.

Donde:

ni= Tamaño de la muestra para la población i

Ti= Suma de rangos para la población i

n= Número total de observaciones

𝐻 =12

𝑛(𝑛 + 1)∑

𝑇𝑖2

𝑛𝑖

𝑘

𝑖=1

− 3(𝑛 + 1)

51

3. RESULTADOS

3.1. Ensayo de microdilución en caldo

El plasma sanguíneo crudo de C. moreletii mostró actividad antibacteriana (p<0.05) en

la concentración más alta aplicada que fue de 3.31 mg/mL; esto ocurrió tanto para la

cepa de referencia de S. aureus ATCC 1556 (Cuadro 3 y Fig. 18) como para el aislado

clínico de MRSA (Cuadro 4 y Fig. 19). Sin embargo, las demás concentraciones no

tuvieron actividad antibacteriana (P>0.05)

CUADRO 2. Valores de las densidades ópticas obtenidos con cada concentración de

plasma de cocodrilo para la cepa de referencia de S. aureus ATCC 1556.

Ensayo ATCC 1556

3.31

mg/mL

1.65

mg/mL

0.82

mg/mL

0.41

mg/mL

0.2

mg/mL

Control

ATB

Control

crecimiento

0.381 0.475 0.575 0.668 0.695 0.184 0.8706

0.401 0.555 0.469 0.629 0.545 0.1843 0.87

0.408 0.505 0.379 0.653 0.681

0.395 0.522

52

S. aureus ATCC 1556

3.31

1.65

0.82

0.41 0.

2

Ctrl s

xt

Ctrl C

rec

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

*

Concentración de proteínas plasma cocodrilo (mg/mL)

Den

sid

ad

óp

tica

FIGURA 18. Inhibición bacteriana de la cepa de referencia ATCC 1556 de S. aureus con

plasma de cocodrilo, esto con respecto al control del antibiótico

Trimetoprim/Sulfametoxazol (SXT). No paramétrico, Kruskal-Wallis test. (P < 0.05).

* = (P < 0.05)

CUADRO 3. Valores de las densidades ópticas obtenidos con cada concentración de

plasma de cocodrilo para la cepa de referencia del aislado clínico humano de S aureus.

Ensayo aislado clínico 20090127

3.31

mg/mL

1.65

mg/mL

0.82

mg/mL

0.41

mg/mL

0.2

mg/mL

Control

ATB

Control

crecimiento

0.318 0.549 0.692 0.604 0.5 0.1823 0.8246

0.303 0.349 0.447 0.605 0.502 0.1822 0.849

0.295 0.301 0.378 0.378 0.485

53

S. aureus aislado clínico humano20090127

3.31

1.65

0.82

0.41 0.

2

Ctrl s

tx

Ctrl C

rec

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

*

Concentración de proteínas plasma cocodrilo (mg/mL)

Den

sid

ad

óp

tica

FIGURA 19. Inhibición bacteriana del aislado clínico humano de S. aureus 20090127

con plasma de cocodrilo, esto con respecto al control del antibiótico

Trimetoprim/Sulfametoxazol (SXT). No paramétrico, Kruskal-Wallis test. (P < 0.05).

* = (P < 0.05)

3.2. Ensayo MTT

La citotoxicidad del plasma crudo de C. moreletii se determinó por el ensayo MTT,

después de que las células se cultivaran con 0-2000 µg/mL de proteínas totales de

plasma. No se observaron efectos citotóxicos de los componentes sanguíneos de C.

moreletii. Además, se observó que el plasma promovió la proliferación celular hasta un

400% (Fig. 20).

54

MTT linfocitos humanos

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000100

200

300

400

500

600

Concentraciones plasma crudo cocodrilo (µg/ml)

Via

bilid

ad

(%

)

FIGURA 20. Porcentaje de viabilidad presente en el plasma sanguíneo de C. moreletii

incubado con células linfocíticas humanas tomadas de sangre periférica.

55

4. DISCUSIÓN

La actividad antibacteriana del plasma sanguíneo de cocodrilianos ha sido reportada en

algunas especies como el C. siamensis, en el que Kommanee et al. (2012) observaron

que a concentraciones de 50 µg/mL de plasma semipurificado hubo inhibición de más

del 80% del crecimiento de algunas cepas bacterianas patógenas como Salmonella

typhi ATCC 11778, Vibrio Cholerae non01, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, un

aislado clínico de Pseudomonas aeruginosa y un aislado clínico de Salmonella typhi. En

el presente estudio se observó que el plasma sanguíneo crudo de C. moreletii resultó

eficaz como antimicrobiano sobre cepas MRSA en la concentración de 3.31 mg/mL de

proteínas totales del plasma. No existen datos previos sobre la actividad antibacteriana

del plasma sanguíneo de C. moreletii con los que comparar los resultados de este

estudio. Algunos autores sugieren que el compuesto antibacteriano del plasma podría

entrar progresivamente en el espacio citoplasmático, perturbando y dañando la

superficie bacteriana (Kommanee et al., 2012; Barksdale et al., 2016).

En este estudio se utilizaron concentraciones de proteínas totales del plasma sanguíneo

de C. moreletii, lo que podría explicar por qué la concentración que tuvo una actividad

antibacteriana significativa (3.31 mg/mL) fue mucho más alta que las reportadas por

Kommanee et al. (2012), quienes sólo utilizaron 50 µg/mL de plasma que había sido

semipurificado. Se infiere que al ser plasma completo existen una gran variedad de

componentes presentes y que sólo un porcentaje de éstos serían los responsables de

la actividad antibacteriana.

Los péptidos antimicrobianos se han aislado de una amplia variedad de organismos, así

que se podría suponer que ciertos péptidos presentes en el plasma de C. moreletii sean

responsables de la actividad antibacteriana mostrada en este estudio. El contacto inicial

entre el péptido y el organismo objetivo sería electrostático, ya que la mayoría de las

superficies bacterianas son aniónicas, por lo que la membrana bacteriana sería

propensa a ser atacada por dichos péptidos cargados positivamente (Leelawongtawon

et al., 2010).

56

Existen datos de péptidos catiónicos aislados en C. siamensis como el Apo 1, Apo2 y

A1P, que mostraron actividad antibacteriana de amplio espectro sobre aislados clínicos

de E. coli, P. aeruginosa, e inclusive sobre S. aureus resistente a antibióticos (Barksdale

et al. 2016).

La resistencia a los antibióticos ha aumentado constantemente durante las últimas

décadas, y los péptidos antimicrobianos se consideran una terapia alternativa ya que

poseen una alta actividad bactericida y disminución de la capacidad que tienen las

bacterias para volverse resistentes. En general, este hallazgo sugiere una nueva

perspectiva sobre la viabilidad de utilizar los componentes que ofrece el plasma

sanguíneo de C. moreletii como una opción alternativa para combatir infecciones

causadas por bacterias. En ese sentido, se considera que el siguiente paso en la

investigación de las propiedades de los componentes del plasma sanguíneo de C.

moreletii puede ser aislar péptidos con posible actividad antimicrobiana.

Los datos del ensayo de citotoxicidad demostraron que las diferentes concentraciones

(250-2000 µg/mL) de proteínas totales del plasma de C. moreletii no tuvieron efecto

citotóxico sobre los cultivos de linfocitos humanos. Este resultado no se había reportado

anteriormente para esta especie de cocodriliano. Sin embargo, coincide con lo que

observaron Kommanee et al. (2012) al evaluar el efecto de diferentes concentraciones

de plasma de C. siamensis (6.2-1000 µg/mL) sobre cultivos de células fagocíticas de

ratones RAW264.7 en un ensayo MTT, dado que no tuvieron efecto sobre las mismas.

En el presente estudio, además de no causar citotoxicidad, los componentes del plasma

sanguíneo de C. moreletii promovieron la proliferación celular de los linfocitos humanos

hasta un 400%. Al respecto, en un estudio realizado por Jangpromma et al. (2016),

donde se probó la capacidad citotóxica del plasma sanguíneo de C. siamensis sobre

queratinocitos humanos, se demostró que aparte de no causar citotoxicidad, hubo

proliferación celular de hasta 155%. Esto podría deberse a que el plasma de los

cocodrilianos tendría propiedades pronunciadas de cicatrización relacionadas con una

mayor proliferación y migración celular y podría estar relacionado con las plaquetas

suspendidas en el plasma.

Hasta donde se sabe, todavía no se han divulgado informes que cubran la actividad

proliferativa de componentes sanguíneos de esta especie, este es el primer informe;

57

sin embargo, la reparación de heridas ocurre en todo tipo de tejido, por lo que el plasma

sanguíneo de C. moreletii mostró una capacidad de proliferación celular que podría

apoyar a la regeneración celular de tejidos dañados.

58

5. CONCLUSIONES

El plasma sanguíneo crudo de C. moreletii mostró actividad antibacteriana contra cepas

de Staphylococcus aureus. Cuando fue puesto en contacto con linfocitos humanos sanos

no sólo no causó citotoxicidad, sino que estimuló la multiplicación de estas células.

59

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