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BIOQUIMICA HUMANA

Cadena de Transporte de Electrones

Fosforilación oxidativa

Mitocondriopatias

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Objetivos:

• Definir los conceptos de oxidado, reducido, oxidante, reductor. • Definir potencial redox • Describir las características morfológicas y fisiológicas de las mitocondrias. • Enumerar los componentes de la cadena respiratoria y de las moléculas

transportadoras de electrones • Describir los procesos de transferencia de electrones dentro de cada componente

de la cadena respiratoria • Enumerar los compuestos que específicamente bloquean el transporte de

electrones y localizar sus sitios de acción • Describir el modelo quimiosmótico de fosforilación oxidativa • Describir la localización mitocondrial, la estructura y funcionamiento de la ATP

sintasa. • Explicar el mecanismo propuesto para la síntesis de ATP por la ATP sintasa

durante el flujo de protones. • Describir l mecanismo de la ATP-ADP traslocasa • Estimar el rendimiento de ATP por cada molécula de NADH ó FADH2 que entrega

sus electrones en la cadena respiratoria • Explicar el control respiratorio • Explicar el efecto de desacoplantes sobre la fosforilación oxidativa y cómo este

mecanismo puede ser usado para la termogénesis. • Describir cadenas de transporte de electrones no fosforilantes • Analizar desde el punto de vista bioquímico las mitocondriopatias

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Oxidaciones biológicas

Las células necesitan energía para realizar el trabajo que representa mantenerse vivas, crecer y reproducirse. La habilidad para encauzar la energía en un trabajo biológico es una propiedad fundamental de los organismos vivos. La transferencia de electrones en las reacciones de óxido-reducción es una característica central del metabolismo. Estas reacciones involucran la pérdida de un electrón por una especie química, la cual será por lo tanto oxidada, y la ganancia de electrones por otra especie química, la cual será reducida. El flujo de electrones en las reacciones de óxido-reducción es responsable, directa o indirectamente, de todo el trabajo realizado por los organismos vivos. Es decir, las oxidaciones biológicas son reacciones que cumplen 2 funciones: 1) oxidar a ciertas moléculas orgánicas generando nuevos compuestos con propiedades diferentes. Por ej. el citocromo P450 hidroxila compuestos aromáticos haciéndolos más solubles en soluciones acuosas. También, los aminoácidos pueden ser oxidados para producir neurotransmisores. 2) producir energía para impulsar los procesos biológicos termodinámicamente desfavorables tales como la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos o la contracción muscular. La energía química potencial no es liberada en las reacciones biológicas, sino que en realidad se conserva en un enlace de alta energía en las moléculas de ATP.

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Se denomina respiración celular al proceso de oxidación total de todos los nutrientes a CO

2 y H

2O, con la participación del O

2 como aceptor final de los electrones provenientes

de las oxidaciones de los nutrientes y la consecuente generación de ATP a partir de ADP más fosfato (Pi). De modo que en la respiración celular, gran parte de la energía liberada en el proceso oxidativo se conserva en uniones químicas, que son las que se establecen entre los grupos fosfatos y las moléculas de ADP para generar moléculas de ATP.

Metabolismo respiratorio El metabolismo energético de los organismos quimiotróficos es una oxidación gradual de moléculas combustibles de naturaleza orgánica (glucosa, aminoácidos, ácidos grasos), siempre acompañado por la reducción de una coenzima de oxido-reducción, ya sea NAD+ o FAD, que actúa como aceptor de electrones y de H+. Por ejemplo, en el metabolismo de la glucosa se observan 6 procesos oxidativos diferentes: uno durante la glucólisis, otro durante la transformación de piruvato en acetil CoA y el resto en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CTC). Durante estos procesos, los 6 átomos de carbono de la molécula de glucosa se oxidan completamente a CO2 y 12 pares de electrones se transfieren al NAD+ y al FAD, generando las formas reducidas de estas coenzimas, NADH y FADH2. La oxidación de los ácidos grasos consiste en la remoción cíclica de unidades de 2 carbonos, como acetil CoA. Cada ciclo de oxidación está acompañado por la reducción de una molécula de NAD+ y otra de FAD. Adicionales moléculas de coenzimas reducidas se forman al oxidarse los restos de acetil CoA en el CTC. Los aminoácidos también se catabolizan por vías oxidativas que utilizan las mismas coenzimas como aceptores de electrones. De lo expuesto surge entonces que es necesario asegurar una disponibilidad continua de coenzimas oxidadas para permitir la constante oxidación de todos los nutrientes. La disponibilidad continua de moléculas de coenzimas oxidadas para actuar como aceptores de electrones depende de la reoxidación inmediata de las coenzimas reducidas, de manera que la reducción de las coenzimas durante la oxidación de los sustratos está acompañada y balanceada por un proceso simultáneo en el que se generan las formas oxidadas de las mismas. En estos procesos de reoxidación de las coenzimas es donde se pone en evidencia la necesidad del O2 para el metabolismo aeróbico, ya que es el aceptor final de electrones de las coenzimas reducidas durante la oxidación gradual de los combustibles metabólicos. La transferencia de electrones desde el NADH o el FADH2 al oxígeno es un proceso muy exergónico, por lo que la reoxidación de las coenzimas es responsable de la mayor parte del ATP que se forma durante el metabolismo (32 de los 36 ATP que se forman por oxidación aeróbica de la glucosa en las células eucariotas). Todos los procesos descriptos constituyen el metabolismo respiratorio, que puede considerarse como dos procesos separados pero íntimamente relacionados:

1) el metabolismo oxidativo, en el cual electrones y H+ se transfieren desde sustancias orgánicas a coenzimas oxidadas, con la consiguiente reducción de las mismas y

2) la reoxidación de las coenzimas reducidas por transferencia de los electrones al O2 acompañada indirectamente por la formación de ATP.

La transferencia de electrones desde las coenzimas reducidas hasta el oxígeno no se realiza en forma directa, sino que en este proceso participan una serie de moléculas que actúan como transportadoras de electrones. El proceso de transferencia de electrones desde las coenzimas reducidas hasta el oxígeno se denomina cadena respiratoria. En condiciones aeróbicas, la vía glucolítica es la fase inicial del catabolismo de la glucosa, como lo es la ß oxidación del catabolismo de los ácidos grasos. Los otros tres componentes del metabolismo respiratorio son:

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a) el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CTC), responsable de la oxidación total del acetil CoA ,

b) la cadena de transporte de electrones, necesaria para la reoxidación de las moléculas de coenzimas a expensas del oxígeno molecular y

c) la fosforilación oxidativa (FO) del ADP a ATP como consecuencia de un gradiente de protones que se genera durante el transporte de electrones.

A continuación se estudiará el mecanismo de reoxidación de las coenzimas por transferencia de electrones al oxígeno molecular, como así también el mecanismo que acopla la energía liberada durante el transporte de electrones con la fosforilación oxidativa del ADP que lleva a la síntesis de ATP. Sin embargo no debe olvidarse que en las células estos procesos no ocurren como eventos aislados, sino que integran el metabolismo respiratorio. Las cuatro etapas: fase inicial, CTC, transporte de electrones y fosforilación oxidativa tienen que realizarse en forma continua y muy integrada para que el metabolismo respiratorio pueda satisfacer las necesidades energéticas de las células, segundo a segundo. Características generales de las mitocondrias La mitocondria es la organela en donde ocurre la etapa final de la oxidación de los nutrientes. Así, la mitocondria es el sitio del metabolismo oxidativo de los eucariontes. Contiene, como demostraron A. Lehninger y E. Kennedy en 1948, la piruvato deshidrogenasa, las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, las enzimas que catalizan la oxidación de los ácidos grasos y las enzimas y proteínas redox que intervienen en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. Estos procesos generan la mayor parte de la energía celular en condiciones aeróbicas. Por ello se le describe como la “planta de energía” de la célula. El tamaño, número y forma de las mitocondrias varía de un tejido a otro, pero la estructura básica de las mismas es igual en todos ellos. El número y tamaño de las mitocondrias guarda estrecha relación con las necesidades energéticas de la célula. Los hepatocitos pueden contener más de 1000 mitocondrias cada uno, mientras que los eritrocitos maduros, que dependen totalmente de la glucolisis para obtener energía, no contienen ninguna. Las mitocondrias están constituídas por dos membranas concéntricas con propiedades y funciones biológicas marcadamente diferentes. La membrana mitocondrial externa está en contacto con el medio citoplasmático, en tanto que la interna delimita un espacio central denominado matriz mitocondrial. La membrana mitocondrial interna se presenta plegada, estos pliegues se denominan crestas. Las crestas son más abundantes en mitocondrias de células con intensa actividad respiratoria. La siguiente figura muestra un corte esquemático de una mitocondria.

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La membrana externa es permeable a pequeñas moléculas (de peso molecular menor a 5.000 Da) e iones. La permeabilidad de esta membrana se atribuye a la presencia en la misma de una proteína transmembrana llamada porina la cual forma canales o poros. Otras proteínas de esta membrana son las enzimas implicadas en la síntesis mitocondrial de lípidos y las enzimas que transforman en la matriz los sustratos lipídicos en formas metabolizables. En cambio la membrana interna, más rica en proteínas, es prácticamente impermeable a sustancias polares e iónicas. El agua, el CO2 y el O2 son algunas de las pocas moléculas que pueden atravesar libremente la membrana mitocondrial interna. La mayoría de las moléculas que atraviesan la membrana mitocondrial interna lo hacen únicamente por la mediación de proteínas transportadoras específicas. Por ejemplo, el ATP y el ADP no difunden libremente a través de la membrana mitocondrial. Una proteína transportadora específica, ATP-ADP translocasa permite que estas moléculas cargadas atraviesen la membrana. De manera similar el piruvato, los ácidos grasos, los aminoácidos y los cetoácidos son llevados por transportadores específicos a la matriz mitocondrial, donde se localizan los sistemas enzimáticos que participan en la degradación de los mismos. Los componentes de la cadena de transporte de electrones y el complejo enzimático responsable de la síntesis de ATP se hallan en la membrana mitocondrial interna. El espacio intermembrana contiene varias enzimas que utilizan la salida de ATP de la matriz para fosforilar otros nucleótidos. La matriz contiene una mezcla altamente concentrada de enzimas, incluyendo las que son necesarias para la oxidación del piruvato y los ácidos grasos y para el ciclo de Krebs. La matriz contiene también ADN llamado mitocondrial, ribosomas mitocondriales, tARN y varias enzimas requeridas para la expresión de genes mitocondriales. Al igual que el ADN bacteriano, y a diferencia del nuclear, el ADN mitocondrial es circular, no presenta los genes interrumpidos por secuencias no codificantes (intrones) y no está asociado con proteínas, es decir, se trata de ADN desnudo. Otro hecho sobresaliente es que la síntesis mitocondrial de proteínas puede bloquearse con antibióticos, como el cloranfenicol, la tetraciclina, y otros del grupo de los macrólidos; pero no se inhibe con la cicloheximida como los ribosomas citoplasmáticos. De todas maneras las mitocondrias no son genéticamente autosuficientes. La mayoría de las estructuras necesarias para que desarrollen su función, son codificadas por genes nucleares. El ADN mitocondrial sólo tiene información para la síntesis de sus propios ribosomas y para algunos de sus ARN de transferencia. En cuanto a las proteínas, codifica para algunas pocas subunidades de algunos complejos enzimáticos situados en la membrana interna de la organela. El resto de las proteínas involucradas en el ciclo de Krebs y en la fosforilación se sintetizan en el citoplasma y se transporta hasta la mitocondria para cumplir su función. En la figura siguiente se esquematizan los procesos mitocondriales más importantes.

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CONCEPTO DE OXIDO-REDUCCION Antes de seguir adelante con la cadena respiratoria vamos a hacer un breve repaso de las reacciones de óxido-reducción. OXIDACION: Cuando una sustancia química se oxida, pierde electrones. Los siguientes son ejemplos de reacciones de oxidación: Fe2+ ------------> Fe3+ + e R-CH2-OH ------------> R-C-H + 2H+ + 2 e O H2 ------------> 2 H+ + 2 e REDUCCION: Cuando una sustancia química se reduce, gana electrones. Ejemplos de reacciones de reducción: Fe3+ + e -----------> Fe2+ ½ O2 + 2 H+ --------> H2O CUANDO OCURRE UNA REACCION DE OXIDACCION, DEBE OCURRIR SIMULTANEAMENTE UNA REACCION DE REDUCCION. Los electrones liberados en la reacción de oxidación son captados inmediatamente por otra especie química, la cual se reduce, en la reacción de reducción, de manera que oxidación y reducción son procesos acoplados. Ejemplo: O O R-C-H + H2O --------> R-C-OH + 2 H+ + 2 e (Oxidación) ½ O2 + 2 H+ + 2 e ------> H2O (Reducción) ---------------------------------------------------------- O O R-C-H + H2O + ½ O2 + 2 H+ + 2 e --->R-C-OH + 2 H+ + 2 e + H2O Reacción global O O R-C-H + ½ O2 ------------> R-C-OH La reacción global que describe una reacción de óxido-reducción o redox es la suma de dos reacciones que deben ocurrir simultáneamente, una de ellas describe una reacción de oxidación y otra una de reducción. Cada una de ellas constituye una hemireacción. En la reacción del ejemplo anterior, el aldehído representado por la fórmula R-CO-H se oxida a ácido R-CO-OH, en tanto que el O2 se reduce a H2O, como se indica en cada hemireacción. Se dice que la especie que se oxida (es decir aquella que cede electrones) actúa como agente reductor, en tanto que la especie que se reduce (es decir aquella que acepta electrones) actúa como agente oxidante. Por lo tanto en este ejemplo el aldehído es el agente reductor, en tanto que el oxígeno es el agente oxidante. La tendencia de las sustancias reaccionantes, en una reacción de redox, a ceder o captar electrones, se expresa numéricamente como POTENCIAL REDOX.

Aspectos energéticos del flujo electrónico

En los sistemas biológicos podemos hablar de cuatro modalidades de transferencia de electrones:

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• Directamente como electrones (por ej. De Fe2+ a Fe3+)

• Como hidrógeno ( H+ + e-) (reacciones en las que interviene el FAD)

• Como hidruro ( H - ) (deshidrogenadas ligadas a NAD)

• Por combinación directa de un reductor orgánico con O2 (hidroxilación de esteroides)

A igual concentración de reactantes y productos, los electrones tenderán a fluir espontáneamente desde un transportador con un valor de Eo’ más negativo hacia otro con Eo’ positivo. La secuencia lineal de los distintos transportadores que está propuesta en los modelos aceptados coincide con este razonamiento y puede verse en diferentes representaciones. Podemos concluir entonces que la posición de los transportadores en la cadena depende del valor de su Eo’.

Debemos tener en cuenta que debido a que las concentraciones de reactivos y productos raramente son iguales, lo que determinará la dirección del flujo electrónico no será el potencial estándar, sino el potencial real teniendo en cuenta las concentraciones de todas las moléculas participantes en el proceso del transporte, y su estado de oxidación.

Los electrones se desplazarán entonces en la dirección de un Eo’ más positivo, si los reactivos (las formas reducidas de los dadores de electrones y las formas oxidadas de los aceptores), están presentes en una concentración suficientemente alta relativa con sus productos (dadores oxidados y aceptores reducidos). Esto es simplemente aplicar la ley de Acción de Masas.

Finalmente, aún si el proceso es termodinámicamente favorable, puede que no ocurra a menos que los transportadores estén lo suficientemente cerca. Los contactos entre transportadores en la cadena respiratoria dependerá de cómo están ubicados los Hemos, flavinas, quinonas y centros Fe-S en las proteínas a las que se unen, y de cómo están acomodadas las proteínas en las membranas

Transportadores de electrones de la cadena respiratoria. Características generales de la cadena respiratoria

Como todos sabemos, vivimos en un baño de 20% de oxígeno. Desde un punto de vista termodinámico, la materia viva es muy inestable con respecto a la combustión por oxígeno. Pero desde un punto de vista cinético el oxígeno es estable. Así es que para que las células consuman oxígeno activamente y a una velocidad compatible con la vida, se requieren enzimas que lo activen. La molécula de oxígeno es muy estable y por ello es energéticamente desfavorable añadir un electrón para formar el radical aniónico Superóxido: O2

- . Por esta razón el ataque oxidante por oxígeno tiende a ser lento. Luego que ha adquirido un electrón, resulta fácil a los electrones adicionarse a la estructura.

Organización y componentes de la cadena respiratoria:

A partir de la membrana interna mitocondrial pueden ser aislados cuatro complejos enzimáticos denominados I, II, III y IV. Además, se puede aislar y caracterizar el complejo V ó ATPasa o ATP sintasa que sintetiza ATP en un proceso denominado fosforilación oxidativa. Los complejos I-IV contienen a la cadena de transporte de electrones, mientras que el complejo V cataliza la síntesis de ATP por lo que no es propiamente un componente de la cadena de transporte de electrones. Cada complejo acepta o dona electrones a acarreadores ó transportadores relativamente movibles como la coenzima Q y el citocromo c. Cada acarreador de la cadena de transporte de electrones puede recibir electrones de un donador y subsecuentemente

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pueden donarlos al siguiente acarreador de la cadena, finalmente se combinan con Oxígeno y protones formando agua. Este requerimiento por Oxígeno hace que este proceso de transporte de electrones se denomine también cadena respiratoria, la cual utiliza la mayoría del Oxígeno consumido por un organismo aerobio.

Con la excepción de la coenzima Q, todos los miembros de esta cadena son proteínas. Estas proteínas pueden funcionar como enzimas como en el caso de varias deshidrogenasas, pueden contener hierro como parte de su centro hierro-azufre o pueden contener cobre, como en el caso de los citocromos a y a3.

Complejo Nombre No. de Proteínas

Grupos prostéticos

Complejo I NADH Dehidrogenasa 46 FMN, 7 Fe-S centros

ComplejoII Succinato-CoQ Reductasa

5 FAD, cyt b560, 3 Fe-S centros

Complejo III CoQ-cit c Reductasa 11 cit b, cit b, cit c1, Fe-S

Complejo IV Citocromo Oxidasa 13 cit a, cit a3, CuA, CuB

COENZIMAS DE OXIDO REDUCCION La fosforilación oxidativa comienza con la entrada de electrones en la cadena respiratoria. La mayoría de esos electrones provienen de la acción de ciertas enzimas llamadas deshidrogenasas que colectan los electrones de diferentes vías catabólicas y las canalizan en los aceptores universales de electrones que son los: (1) nucleótidos de nicotinamida (NAD+ ó NADP+) y (2) los nucleótidos de flavina

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Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) Participa en reacciones del tipo: Sustrato reducido + NAD+ sustrato oxidado + NADH + H+ Las deshidrogenadas que usan NAD+ como cofactor remueven 2 atomos de hidrogeno de sus sustratos. Uno de ellos es transferido como ion hidruro (:H-) al NAD+; el otro es liberado como H+ al medio. Fosfato del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NADP+): tiene una estructura similar al NAD+, pero el hidroxilo 2' del NAD+ se halla esterificado con ácido fosfórico. Participa en generalmente en reacciones anabólicas. Tanto el NAD+ como el NADP+ se asocian reversiblemente a las enzimas y ninguno de ellos puede atravesar la membrana mitocondrial interna. Deshidrogenasas dependientes de NAD+: Isocitrato DH, Etanol DH, Gliceraldhido 3 fosfato DH, Lactato DH, Dihidrolipoil DH, L-β-Hidroxiacetil-CoA DH, D-β- hidroxibutirato DH, Glicerol 3 fosfato DH, L-malato DH Deshidrogenasas dependientes de NADP+: Isocitrato DH, D-glucosa 6 fosfato DH Deshidrogenasas dependientes de NAD+ o NADP+: L-glutamato DH Mecanismos de las deshidrogenaciones dependientes de NAD+: El siguiente esquema muestra las transformaciones que experimenta el anillo de la nicotinamida en el transcurso de una reacción redox. El caso particular representado corresponde a la oxidación de un alcohol primario, R-CH2-OH, a aldheído, R-COH. El centro reactivo del NAD+ es un anillo de nicotinamida. Este centro reactivo se reduce incorporando en su núcleo dos electrones, los que son aportados por el sustrato que se oxida, en forma de ion hidruro (H-). Recordamos que el ion hidruro contiene un protón y dos electrones y por lo tanto tiene carga negativa. La forma oxidada de la coenzima tiene una carga positiva, al incorporar en su estructura los equivalentes de reducción en forma de ión hidruro, la molécula queda eléctricamente neutra.

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Nucleótidos de flavina: Flavina mono nucleótido (FMN) y Flavina adenina dinucleótido (FAD). Están unidos covalentemente a la enzima. Los nucleótidos de flavina oxidados pueden aceptar uno ó dos electrones cuando estan oxidados y ceder uno ó dos electrones cuando están reducidos. El potencial de reducción estándar de un nucleótido de flavina depende de la proteína con la que esté asociado Estructura Deshidrogenasas y oxidasas flavin dependientes Enzima Coenzima NADH DH FMN Succinato DH FAD Dihidroxilipoil DH FAD Acetil CoA DH FAD Xantin oxidasa FAD D-amino-acido oxidasa FAD Aldehido oxidasa FAD

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Reducción del anillo de isoaloxacina de los nucleótidos flavínicos Mecanismo de reducción del anillo de isoaloxacina El núcleo isoaloxacina comprende dos dobles enlaces conjugados capaces de fijar dos átomos de H en forma reversible sobre los 2 átomos de N extremos, N1 y N5 , señalados en la figura. En este caso la molécula se reduce incorporando los equivalentes de reducción en forma de átomos de H. Sobre cada átomo de N se fija un protón y un electrón. Cada electrón del átomo de H que se incorpora interactúa con un electrón del átomo de N y permite que se establezca entre ambos átomos una unión covalente. Los dos átomos de H que toma el anillo de isoaloxacina en el proceso de reducción provienen del sustrato que se oxida. Debe quedar claro que una especie química que se reduce acepta electrones. Sin embargo, esos electrones se pueden incorporar como electrones libres (como en el caso de la reducción del átomo de Fe3+), como iones hidruro (por ejemplo en el caso de la reducción del NAD+) donde la especie queíomica que se reduce incorpora 2 electrones y un protón o como átomos de hidrógeno (como ocurre en la reducción del FAD) donde la especie oxidada incorpora los electrones unidos a protones. El esquema siguiente muestra el mecanismo de reducción del anillo de isoaloxacina presente en los nucleótidos de flavina. COENZIMA Q (CoQ) : También llamada ubiquinona, es una quinona con una larga cadena isoprenoide. Las características hidrofóbicas de esta molécula determinan su alta movilidad dentro de la membrana mitocondrial. Los grupos carbonilo que están presentes en la forma oxidada de la molécula se reducen aceptando cada uno de ellos un electrón y un protón, de modo que cada una de las dos funciones cetona se transforman en función alcohol. La forma reducida de la molécula se denomina ubiquinol.

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PROTEINAS con Fe Y AZUFRE: Otras proteínas participan en el transporte de electrones en el complejo NADH DH y entre los citocromos. Son proteínas con hierro (hierro no heminico) y S. Algunas de estas estructuras se muestran en la siguiente figura, donde los grupos R unidos a las cisteinas representan el resto de las cadenas polipeptídicas. Los átomos de Fe, que se unen a los grupos sulfhidrilo de cisteinas de las proteínas, participan en la transferencia de electrones pasando del estado ferrico al estado ferroso y viceversa: Citocromos: Son proteínas que poseen la característica de absorber determiando longitud de onda de la luz visible debido a que contienen un hemo como grupo prostético. Las mitocondrias contiene 3 clases de citocromos: a, b y c. EI grupo hemo del citocromo b es del tipo que se encuentra en la hemoglobina y en la mioglobina. EI grupo hemo del citocromo a difiere del grupo hemo del citocromo b en las cadenas laterales unidas a los C2 y C8: en el C2 presenta una cadena isoprenoide y en C8 un grupo formilo, en lugar del grupo vinilo y del grupo metilo que presenta el hemo del citocromo c en los C 2 y 8 respectivamente. Ambos grupos hemo están unidos fuertemente pero de manera no covalente a la proteína. En el grupo hemo del citocromo c al C2 y al C4 se unen grupos tiometilos, en vez de los grupos vinilo que posee el citocromo b. Los grupos hemo de los citocromos del tipo c están unidos covalentemente a la proteína a través de residuos de cisteína.

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Como ocurre con las flavoproteinas, el potencial de reducción estándar del Fe en el hemo de un citocromo depende en gran medida del entorno proteico, esto determina que si bien la especie que se oxida y reduce reversiblemente en todos los citocromos es la misma (el Fe 2+/Fe 3+), el potencial de reducción es diferente para cada uno de ellos, aún cuando contengan el mismo tipo de grupo hemo.

El citocromo C es una proteína soluble de bajo peso molecular y muy conservada en los seres vivos. Se comporta como una molécula móvil que conecta los componentes III y IV de la cadena respiratoria.

Flujo de electrones a través de los transportadores Observando los valores de los potenciales de reducción de los distintos transportadores de electrones (Tabla 1) se deduce que en la cadena respiratoria los electrones fluyen en el mismo sentido que se incrementan los potenciales de reducción de los diferentes transportadores: desde los componentes de menor potencial de reducción hacia los de mayor potencial de reducción. Por lo tanto, la trayectoria que siguen los electrones desde las coenzimas reducidas hasta llegar al 02 está determinada por los potenciales de reducción de los distintos transportadores más que por un ordenamiento espacial de los mismos. Obviamente estos tienen que estar dispuestos de manera que los electrones puedan ser transferidos en el orden indicado por los potenciales de reducción. AI fluir los electrones a través de los transportadores desde el NADH hasta el 02 se producen descensos bruscos de energía libre, que están señalados en la figura siguiente. Estos ocurren a nivel del complejo NADH-Coenzima Q reductasa, Coenzima Q-citocromo c reductasa y citocromo oxidasa. Simultáneamente a la transferencia de electrones a través de estos complejos, se produce un bombeo de protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana, lo cual genera un gradiente electroquímico. La energía que genera la transferencia de electrones hacia el oxigeno es almacenada en el gradiente de protones que se forma simultáneamente.

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COMPLEJO I ó NADH deshidrogenasa ó NADH:ubiquinona oxido reductasa: Cataliza 2 procesos acoplados simultáneos

(1) la transferencia exergónicas de un ion hidruro desde el NADH y un protón desde la matriz a la ubiquinona (CoQ). NADH + H+ + CoQ _____ NAD+ + CoQH2

(2) La transferencia endergónica de 4 protones desde la matriz al espacio intermembrana cada 2 electrones transferidos.

El Complejo I actúa por lo tanto como una bomba de protones impulsada por la energía de la transferencia de electrones, moviendo los protones desde la matriz (que comienza a estar negativamente cargada) al espacio intermembrana (que comienza a estar positivamente cargado).

El dominio que contiene el FMN con el cual interacciona el NADH penetra en la matriz mitocondrial. La CoQ reacciona dentro del dominio de membrana. Los centros hierro-azufre están en el dominio de unión al NADH en un dominio conector cercano al

segmento de membrana.Las reacciones redox que ocurren son:

NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2

FMNH2 + (Fe-S)ox FMNH· + (Fe-S)red + H+

Después, el FMNH es reoxidado por transferencia de electrones con el siguiente centro hierro–azufre: FMNH· + (Fe-S)ox FMN + (Fe-S)red + H+

Los electrones pasan a través de una serie de centros Fe-S dentro del complejo I hasta que son transferidos a la CoQ, la cual acepta 2 electrones y toma 2 H+ para dar la CoQ reducida: QH2.

COMPLEJO II ó Succinato – Co Q deshidrogenasa: pertenece al ciclo de Krebs. El aceptor inicial de electrones es el FAD, el cual es reducido a FADH2 durante la oxidación del succinato a fumarato. El FADH2 es luego reoxidado por transferencia de electrones a través de una serie de 3 centros Fe-S a la CoQ, generando CoQH2 : FAD FeScentro 1 FeScentro 2 FeScentro 3 CoQ

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IMPORTANTE: Otros sustratos de las deshidrogenadas mitocondriales también pasan electrones a la cadena respiratoria a nivel de la ubiquinona (CoQ), pero no a través del Complejo II.

Estos son:

a) El primer paso en la beta-oxidación de los ácidos grasos (Acil CoA ) por la flavo proteína Acil CoA deshidrogenasa es la transferencia de electrones desde el sustrato al FAD de la enzima. A continuación, los electrones son cedidos a la proteína transferidora de electrones (ETFP) quien a su vez pasa los electrones a la ETFP-Ubiquinona óxido reductasa. Esta reductasa es una proteína Fe-S que también tiene unido un nucleótido de flavina y pasa los electrones a la cadena respiratoria al reducir al CoQ

b) El glicerol que viene de la degradación de los triglicéridos, se convierte por fosforilación en dihidroxiacetona fosfato (DHAP) por la glicerol 3-

fosfato deshidrogenasa, enzima localizada en la cara externa de la membrana mitocondrial interna, que reduce a la CoQ (lanzadera del glicerol fosfato)

COMPLEJO III ó Ubiquinona-cit c oxido reductasa: acepta electrones de la CoQH2 que se generó por la transferencia de electrones en los complejos I y II. Dentro de su compleja estructura, los electrones son transferidos por los citocromos b y por el Fe3+

de proteinas férricas no hémicas. Finalmente el Complejo III acopla la transferencia de electrones de QH2 al citocromo c con el transporte de cuatro protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Así, se puede plantear la siguiente ecuación:

QH2 + 2 cit c (oxidados) + 2 H+ -- Q + 2 cit c (reducidos) + 4 H+

El grupo prostético del complejo III es el cit c1, el cual reduce al citcromo c que es el donor de electrones al complejo IV.

COMPLEJO IV ó citocromo oxidasa: acepta los electrones del cit c y los transfiere al oxigeno para realizar la siguiente reacción irreversible:

O2 + 4 H+ + 4 e -------- 2 H2O El complejo citocromo oxidasa contiene hemo a, hemo a3, CuA (que consiste en 2 átomos de Cu adyacentes) y CuB. El O2 reacciona en un centro binuclear que consiste en hemo a3 y CuB. Por cada dos electrones que pasan a través del complejo IV se transfieren 2 H+ hacia el espacio intermembrana

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La energía de la transferencia de electrones es conservada como un gradiente de protones (energía potencial) La reacción neta de transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria es altmente exergónica (∆G < 0). La finalidad del transporte de electrones a través de la cadena no es solamente reoxidar las coenzimas reducidas (NADH ó FADH2), sino también generar ATP a partir de ADP + Pi. La energía liberada en la transferencia de electrones entre determinados componentes de la cadena es utilizada para la síntesis de ATP. En el esquema están indicados los sitios de la cadena donde se libera energía suficiente para la síntesis de ATP. Tabla 1: Potenciales de oxido-reducción estandar de algunos pares redox conjugados (A pH 7 y a 25°C)

Ecuación del electrodo EO' (V)

2 H+ + 2 e ----------- H2 - 0.421

NAD+ + 2 H+ + 2 e----- NADH + H+ - 0.320

Piruvato + 2 H+ + 2 e----- Lactato - 0.185

Oxaloacetato + 2 H+ +2 e-- malato - 0.166

Fumarato + 2 H+ +2 e----- Succinato - 0.031

Ubiquinona + 2 H+ + 2 e--- ubiquinol + 0.100

2 citocromo b (Ox.) + 2 e -- 2 cit b (red.) + 0.030

2 citocromo c (Ox.) + 2 e --- 2 cit c (red.)

+ 0.254

2 citocromo a3 (ox.) + 2 e --- 2 cit3 (red.)

+ 0.385

½ O2 + 2 H+ + 2 e------- H2O + 0.816

Etapas de la transferencia de electrones que permiten la formación de ATP

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La cadena de transporte de electrones puede ser inhibida en sitios específicos Una serie de compuestos químicos tienen efectos tóxicos debido a que inhiben en sitios específicos, el transporte de electrones de la cadena respiratoria. Como puede observarse en la figura presentada a continuación, la rotenona (insecticida) y el amital (un barbiturato) inhiben a nivel de la NADH deshidrogenasa. Por lo tanto los electrones o equivalentes de reducción derivados de la deshidrogenasa unida al NAD no son oxidados por la cadena de transporte de electrones en presencia de rotenona, mientras que los derivados de las deshidrogenasas unidas al FAD son libremente oxidados. El antibiótico antimicina A inhibe la transferencia de electrones a nivel de citocromo b, mientras que el paso terminal catalizado por la citocromo c oxidasa es inhibido por cianuro, azida o monóxido de carbono. El cianuro y la azida se combinan con el Fe3+ del hemo en los citocromos a y a3 e impiden su reducción por los electrones que derivan del citocromo c reducido. El monóxido de carbono se une al Fe2+ de citocromo oxidasa. Por lo tanto la inhibición del transporte de electrones mitocondrial resulta en una alteración de la funciónnormal generadora de energía y lleva a la muerte del organismo. FOSFORILACION OXIDATIVA: SINTESIS DE ATP ASOCIADA AL FLUJO DE ELECTRONES EN LA CADENA RESPIRATORIA. Hasta ahora vimos como se realizaba el flujo de electrones a través de los componentes de la cadena respiratoria. La pregunta que se plantea ahora es: de que modo este flujo de electrones a través de la cadena respiratoria conduce la energía hacia la síntesis de ATP? Es decir, cual es el mecanismo por el cual la energía liberada en una reacción exergónica (oxidación de NADH y reducción de O2) se canaliza hacia (o bien se acopla con) una reacción endergónica (condensación de ADP y Pi). Teoría Quimiosmótica Volvamos ahora a la búsqueda de una teoría que permita responder ¿De qué manera la transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria coopera con la ATP-Sintetasa para producir la fosforilación de ADP produciendo ATP? Se plantearon varias hipótesis para contestar este interrogante. Entre ellas, por analogía con los mecanismos de “fosforilación a nivel de sustrato”, que vieron en la glucólisis, se postuló la existencia de un intermediario químico de alta energía. En la vía glucolítica, por ejemplo, el gliceraldehído 3-fosfato se oxida y se convierte en 1,3 difosfoglicerato, un compuesto con un grupo de alta energía en el sitio de oxidación. Cuando este compuesto transfiere el Pi activado al ADP, se produce la síntesis de ATP.

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Esta idea dio origen a la llamada teoría de acoplamiento químico, según la cual, a partir de la energía liberada en la transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria, se produce algún intermediario químico de alta energía. La energía de este posible intermediario podría ser utilizada para la síntesis de ATP. A pesar de los múltiples esfuerzos invertidos en la búsqueda de este posible intermediario químico, no se pudo identificar ningún compuesto capaz de cumplir con esta función. Durante la década del 60, Peter Mitchell, postuló una hipótesis alternativa que permite explicar los resultados experimentales, y aún hoy, luego de más de cuatro décadas de exhaustiva experimentación con técnicas cada vez más sofisticadas, es la teoría más ampliamente aceptada. Según la teoría de Mitchell, también llamada teoria quimiosmotica, la transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria es acompañada por el bombeo de protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana. Este mecanismo tiene como consecuencia la generación de una diferencia en la concentración de protones a través de la membrana, es decir un gradiente de pH (∆pH). Según la teoría quimiosmótica, esta energía del gradiente electroquímico se utiliza para la síntesis de ATP catalizada por F1 cuando los protones retornan pasivamente a la matriz mitocondrial a través del poro de protones del componente Fo de la ATPsintasa. En estas condiciones, el medio presente en la matriz mitocondrial se alcaliniza (se hace menos ácida) respecto al medio presente en espacio intermembrana, ambos separados por la membrana mitocondrial interna. Dado que el protón es una especie química con carga eléctrica, se genera en realidad, un gradiente electroquímico (o sea de concentración y de carga). La energía electroquímica inherente a esta diferencia en la concentración de protones y a la separación de cargas, se denomina fuerza protón-motriz y representa la conservación parcial de la energía de oxidación de los combustibles. La ATP-Sintasa es un complejo enzimático localizado en la membrana mitocondrial interna, que está formado por dos componentes principales llamados fracción F1 y fracción Fo (atención aquí el subíndice se refiere a que es el componente sensible a oligomicina de la enzima y por lo tanto es la letra o y no el número 0 (cero)).

El componente F1 proyecta hacia la matriz mitocondrial y el Fo forma un poro o canal través de la membrana mitocondrial interna. La porción F1 purificada y aislada no sólo no cataliza la síntesis de ATP, sino que también cataliza la reacción inversa, es decir la hidrólisis del ATP formando ADP + Pi, por lo que originalmente se la denominó F1-ATPasa. F1 está constituida por seis subunidades (tres pares de subunidades α y β) que tiene varios sitios de unión de ADP y ATP y que forman como “una cabeza” apoyada sobre un tallo constituido por las subunidades δ (delta), γ (gama), y ξ (épsilon). Este complejo proteico está ubicado en la

periferia de la membrana y se mantiene unida a ésta mediante su interacción con la porción Fo de la enzima. Fo es, a su vez, un complejo proteico integral de membrana formado por cuatro o más subunidades diferentes que conforman un canal transmembrana a través del cual pueden pasar los protones. El complejo completo F1 Fo, al igual que F1 aislada, puede catalizar la hidrólisis de ATP, pero su función biológica es la reacción inversa, es decir la condensación de ADP y Pi, para formar ATP. Por lo tanto el complejo F1 Fo se denomina correctamente ATP-Sintasa.

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Cómo se logra la síntesis de ATP? Paul Boyer propuso el mecanismo de catalisis rotacional. Como mencionamos en párrafos anteriores la parte principal del complejo F1 está formado por los tres dimeros αβ, esta unidad tiene forma de hexamero. La actividad catalitítica de este hexamero está localizada en las subunidades β. Las subunidades γ y ε están unidas al anillo c, y giran con él. Cada rotación de 120º de la subunidad γ induce la aparición de cambios de conformación en los centros catalíticos de las unidads β del los dímeros αβ, provocando la alteración de los centros de fijación de los nuceótidos situado en β. Así, los centros de fijación de nucleótidos van alternando entre tres estados: Estado O = estado abierto, L = unión libre y T= unión tensa (en inglés, tight)

Aunque la composición de aminoácidos de las tres subunidades β es idéntica, sus conformaciones difieren en parte por la asociación a la subunidad γ. Los dímeros αβ son asimétricos, cada uno de ellos presenta una conformación diferente en cada estado. Las tres subunidades β interaccionan de tal modo que, cuando una adopta la conformación O, otra ha de adoptar la conformación L y la del otro una conformación T. La conformación T posee mayor afinidad para ATP que para ADP + Pi y disminuye con ello la constante de velocidad de la reacción en valores cercano a uno; es decir, substrato y producto se encuentran en condiciones estándar, cerca de la equimolaridad.

H+N: H+ en la matriz mitocondrial (negativamente cargada)

H+P: H

+ en el espacio intermembrana (positivamente cargado) La síntesis de ATP se inicia en el estado L con la unión de ADP y Pi. El siguiente estado es la conformación T que sigue la condensación del ADP y Pi a ATP con la formación de un enlace fosfodiéster. Finalmente, el estado O deja libre el producto ATP, y vuelve nuevamente al estado L iniciando nuevamente la siguiente ronda de síntesis. Por lo tanto, una rotación completa de la subunidad γ provoca que cada subunidad β se cicle a través de sus tres conformaciones posibles y en cada rotación se sintetizan y se liberan de la superficie del enzima tres moléculas de ATP. La interconverción conducida por protones, direccional y cíclica, de los estados O, L y T, permite una producción continua. Este mecanismo se conoce como mecanismo de cambio de la fijación.3

El paso dependiente de energía no es la síntesis de ATP sino su liberación de un lugar de unión compacta. Esta liberación se produce por la rotación de γ que requiere energía, que impulsa los cambios conformacionales de los dímeros αβ. Está liberación se produce simultáneamente con la unión del ADP y el Pi, que se habían unido previamente, se unen a un lugar T para experimentar una conversación espontánea a ATP, mientras que el lugar O, del que se liberó el ATP, une otro ADP y Pi para empezar de nuevo el proceso

Inhibidores y desacoplantes de la Fosforilación oxidativa: Como ya mencionamos, la teoría quimiosmótica permite explicar la dependencia de la transferencia de electrones con la síntesis mitocondrial de ATP. Cuando la síntesis de ATP se bloquea, por ejemplo en presencia de oligomicina, los protones no pueden fluir hacia la matriz a través del complejo F1Fo (que está bloqueado por la oligomicina). Por lo tanto, sin la posibilidad del retorno de protones hacia la matriz mitocondrial y a medida

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que continúa el bombeo de protones por la actividad de la cadena de transporte de electrones, el gradiente no sólo no se disipa sino que se va incrementando hasta que la energía que se necesita (cada vez mayor) para bombear un protón hacia afuera en contra de su gradiente, iguala o supera la energía que se obtiene en el transporte de electrones. En esa situación, se interrumpe la transferencia de electrones, la energía libre del proceso completo del flujo de electrones y el bombeo de protones se hace igual a cero y por lo tanto se alcanza el estado de equilibrio. Esta teoría también permite explicar el mecanismo de acción de los desacoplantes químicos. Como ya dijimos, algunos de estos desacoplantes son ácidos débiles hidrofóbicos que pueden difundir fácilmente a través de la membrana mitocondrial. Luego de entrar a la matriz mitocondrial en estado no disociado, pueden disociarse, liberar protones y con ello, disipar el gradiente de pH. Dado que se produce un “cortocircuito”, los protones no atraviesan la ATP-Sintetasa y por lo tanto no hay síntesis de ATP. Los ionóforos, como ya dijimos, interaccionan con iones inorgánicos rodeándolos de un medio hidrofóbico y los complejos formados atraviesan fácilmente la membrana mitocondrial interna. Por ejemplo, la valinomicina forma un complejo lipídico con iones

K+, que atraviesa la membrana mitocondrial. La entrada de cargas positivas neutraliza el exceso de cargas negativas dentro de la matriz, disipa el gradiente eléctrico (aunque no el químico) y por lo tanto, disminuye la fuerza protón-motriz. Por lo tanto, la valinomicina disminuye significativamente la síntesis de ATP sin bloquear la transferencia de electrones al O2. Mecanismos de Transporte Activo en la Membrana Mitocondrial Interna El rol primario de la transferencia de electrones es proveer energía para la síntesis de ATP, sin embargo, esta energía también se utiliza en otros procesos esenciales para la fosforilación oxidativa. La membrana mitocondrial interna es impermeable a especies cargadas pero contiene dos sistemas específicos para el transporte de ADP y Pi hacia la matriz mitocondrial y de ATP hacia el citosol. La translocasa de nucleótidos de

adenina se extiende a través de la membrana mitocondrial interna, une ADP3- del lado citosólico, lo transporta hacia el interior de la matriz, intercambiándolo simultáneamente

por ATP4- que se transporta hacia el citosol. Como este mecanismo de contra-transporte, mueve cuatro cargas negativas hacia afuera y tres hacia adentro (es decir el balance es la salida de una carga negativa neta), su acción se favorece por el gradiente electroquímico (que tiene más cargas negativas adentro que afuera). Por lo tanto, la fuerza protón-motriz favorece el intercambio de ATP/ADP a nivel mitocondrial. Existe un inhibidor específico de este transportador, el atractilósido, un glicósido altamente tóxico. La toxicidad de este compuesto reside, precisamente, en su capacidad de inhibir la llegada del ATP al citosol y por ello la inhibición de los procesos citosólicos que requieren ATP.

El otro sistema de transporte esencial en la fosforilación oxidativa es la translocasa de

fosfatos, que transporta conjuntamente H2PO4- y H+ hacia la matriz a través de un

mecanismo de cotransporte que también está favorecido por el gradiente de protones.

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Rendimiento del acoplamiento entre la cadena respiratoria y açla fosforilación oxidativa

Esta teoría predice, entonces, la existencia de un gradiente de pH transmembrana. Esto se puede comprobar experimentalmente. Cuando se agrega un sustrato oxidable (succinato, por ejemplo) y O2 a una suspensión de mitocondrias aisladas, se puede detectar la acidificación del medio. Las determinaciones estequiométricas indican que cuando se transfiere un par de electrones a partir del NADH a través del complejo I se translocan 4 H+ y los complejos III y IV translocan 6 H+ entre ambos. Además, se ha detectado que por cada ATP sintetizado se toman 3 ó 4 H+ del espacio intermembrana que son utilizados para transportar ADP, ATP y Pi a través de la embrana mitocondrial interna. Cuando se calcula la relación P/O no da un número exacto y actualmente se considera que el rendimiento de la cadena respiratoria acoplada a la fosforilación oxidativa es de 2,5 cuando se oxida un NADH (10/6)y de 1,5 cuando se oxida un FADH2 (6/4). Regulación de la Fosforilación Oxidativa La velocidad de la respiración celular está sujeta a diversos mecanismos de control y generalmente está limitada por la disponibilidad de ADP como sustrato para la fosforilación. En ausencia de ADP, el consumo de O2 es muy bajo y se incrementa luego de su agregado. Se denomina “control por aceptor” a la dependencia de la respiración con la concentración de ADP. En algunos tejidos el ADP puede aumentar hasta 10 veces el consumo de O2. La concentración intracelular de ADP es una medida del estado energético celular. También puede utilizarse como índice, la relación: [ATP]/[ADP] x [Pi]. Este cociente es normalmente muy alto porque predomina el compuesto más fosforilado. Cuando aumenta la velocidad de algunos procesos que requieren energía (por ejemplo la síntesis de proteínas) aumenta la velocidad de hidrólisis de ATP y por lo tanto el cociente de las concentraciones disminuye. Cuanto mayor es la disponibilidad de ADP para la fosforilación oxidativa, la velocidad de la respiración aumenta, causando la regeneración de ATP. Este proceso continúa hasta que el cociente de concentraciones alcanza los niveles normales altos y entonces la respiración celular se hace más lenta. La velocidad de la oxidación de los distintos combustibles celulares está regulada con tal sensibilidad y precisión que el cociente ATP/ADP x Pi fluctúa muy ligeramente aún frente a variaciones extremas de demanda energética. Es decir, el ATP se genera prácticamente, a la misma velocidad que se utiliza en los procesos celulares que lo requieren. Curvas de consumo de oxígeno: Hay varios experimentos que demuestran el acoplamiento entre la cadena de transporte de electrones y la síntesis de ATP. Cuando mitocondrias aisladas se suspenden en una solución a pH regulado que contiene ADP y Pi, y luego se agrega un sustrato oxidable como el succinato o el malato se producen tres procesos:

1.- El sustrato se oxida 2.- se consume O2 y 3.- se sintetiza ATP.

Se puede observar sin embargo que cuando se usa malato como sustrato oxidable, se producen 3 moles de ATP/mol de malato mientras que con el succinato se obtienen 2 moles de ATP/mol de succinato. Esta experiencia nos indica que aún en condiciones aisladas, las mitocondrias presentan consumo de O2 y son capaces de realizar síntesis de ATP.

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Si ahora en un nuevo experimento se utiliza un electrodo de O2 que nos permita medir los niveles de esta molécula en la suspensión de mitocondrias, es decir el consumo de O2 mitocondrial y a distintos intervalos de tiempo a mas de determinar la cantidad de O2 se toman muestras de la suspensión para determinar el contenido de ATP. Los resultados transferidos a un eje de coordenadas serán (ver figura) Cuando se agrega una mezcla de ADP y Pi, no se modifican ni el consumo de O2 ni la

síntesis de ATP. Cuando se agrega succinato, rápidamente aumenta la respiración (es decir crece el

consumo de O2) y se sintetiza ATP.

Cuando se agrega cianuro (CN-), que bloquea la transferencia de electrones entre la citocromo oxidasa y el O2, ambos procesos se detienen.

Dado que la energía de oxidación del sustrato (succinato, en este caso), es necesaria para la síntesis de ATP, no debería sorprendernos que un inhibidor del pasaje de electrones al O2 (el cianuro), bloquee la síntesis de ATP. Otro procedimiento es verificar si la inhibición de la síntesis de ATP bloquea la transferencia de electrones en las mitocondrias aisladas. Para realizar dicha experiencia lo más sencillo sería utilizar una suspensión de mitocondrias en una solución de pH regulado en presencia de O2 con el agregado de un sustrato oxidable pero sin el agregado ADP es decir sin sustrato. En estas condiciones se observará que además de la falta de formación de ATP, la transferencia de electrones al O2, se reduce drásticamente.

También se puede comprobar el acoplamiento entre la oxidación y la fosforilación mediante el uso de oligomicina, un antibiótico tóxico que inhibe la ATP sintetasa mitocondrial. Como se observa en la siguiente figura, cuando se agrega oligomicina a una suspensión de mitocondrias, se detienen tanto la síntesis de ATP como el consumo de O2.

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Dado que la oligomicina sólo actúa directamente sobre la síntesis de ATP, la demostración de que esta droga también bloquea el consumo de O2, implica que, en condiciones fisiológicas, ambos procesos están obligatoriamente acoplados, es decir, cada uno de estos procesos (transporte de electrones o síntesis de ATP) no ocurre si el otro se ve alterado (síntesis de ATP o transporte de electrones) por algún motivo particular. Existen, sin embargo, ciertas condiciones y/o reactivos que permiten desacoplar la oxidación de las coenzimas de la fosforilación del ADP. Por ejemplo, cuando las mitocondrias aisladas se rompen mecánicamente o por el uso de detergentes, en los fragmentos de membrana obtenidos se puede observar que persiste la transferencia de electrones al O2, pero que no se produce la síntesis de ATP. Asimismo, ciertos compuestos químicos pueden desacoplar ambos procesos sin romper la estructura mitocondrial. Estos desacoplantes químicos incluyen ácidos débiles con propiedades hidrofóbicas, como por ejemplo el 2,4-dinitrofenol (DNP) y compuestos denominados ionóforos que se unen a iones inorgánicos y los rodean de una estructura hidrofóbica que fácilmente atraviesa la membrana. Como se observa en la figura, cuando se agrega DNP a una suspensión de mitocondrias, aún en presencia de oligomicina (que interrumpe la síntesis de ATP), se restablece el consumo de O2. Tejido Adiposo Pardo En la mayoría de los mamíferos, incluyendo el hombre, los recién nacidos tienen un tipo de tejido adiposo muy particular, llamado tejido adiposo pardo, en el cual la oxidación de combustibles no se utiliza para la síntesis de ATP sino para generar calor y mantener la temperatura corporal. Los animales que hibernan, aún en estado adulto, tienen también grandes cantidades de grasa parda. Este tejido especializado está localizado en la parte posterior del cuello de los recién nacidos y tiene color marrón debido a la presencia de un gran número de mitocondrias y por lo tanto de citocromos cuyos grupos hemo absorben fuertemente la luz visible. Las mitocondrias de este tejido oxidan combustibles, fundamentalmente ácidos grasos, transfieren sus electrones a través de la cadena respiratoria y como consecuencia se bombean protones hacia afuera de la matriz mitocondrial, análogamente a lo que ocurre en otros tipos celulares. Sin embargo, las mitocondrias de este tejido poseen una proteína particular en la membrana interna, la termogenina, también llamada proteína desacoplante. Es una proteína integral de membrana a través de la cual los protones pueden volver a la matriz mitocondrial sin atravesar el complejo F1Fo. Como consecuencia de este “cortocircuito” de protones, la energía de oxidación no se conserva en la síntesis de ATP, sino que se disipa como calor y contribuye a mantener la temperatura corporal. Regulación de los niveles de ATP en el corazón El músculo cardíaco que tiene una alta demanda de ATP, tiene un contenido de mitocondrias mayor que la mayoría de los tejidos. Las crestas densamente empaquetadas en las mitocondrias cardíacas tienen un alto contenido de enzimas del ciclo de Krebs, proteínas de la cadena respiratoria, ATP-Sintetasa, ATP/ADP-translocasa, y otros componentes del metabolismo energético. Particularmente, el músculo cardíaco tiene un alto contenido de la enzima creatina-kinasa (CK), que cataliza la transferencia del enlace de alta energía del último fosfato del ATP a la creatina. El rol de la creatina-fosfato en el corazón (también en el cerebro y el músculo esquelético) es de ser un amortiguador y un transportador energético. La isoenzima mitocondrial de la CK está localizada en la membrana mitocondrial interna. Allí utiliza rápidamente el ATP para sintetizar creatina-fosfato y regenerar ADP en un sitio próximo a la ATP/ADP-translocasa. La cretina-fosfato y el ATP difunden hacia la membrana plasmática y allí pueden acceder

a la Na+/K+ ATPasa, a la miosina y otras enzimas. A nivel de las miofibrillas, otra isoenzima de la CK cataliza la regeneración de ATP a través de la reacción inversa. El corazón es particularmente sensible a los efectos de la anoxia isquémica y a los compuestos que interfieren con el metabolismo energético. La pérdida de ATP en la

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membrana celular provoca el influjo de iones, especial-mente de sodio y calcio

aumentando el volumen tisular. Las mitocondrias cardíacas pueden secuestrar el Ca2+, que en baja concentración estimula el ciclo de Krebs y otras reacciones del metabolismo oxidativo, pero a altas concentraciones activa una fosfolipasa que degrada lípidos de membrana. El resultado es el hinchado de las mitocondrias y la pérdida de nucleótidos de adenina y nicotinamida. CADENAS DE TRANSPORTE DE ELECTRONES NO-FOSFORILANTES Además de la cadena de transporte de electrones mitocondrial ya descripta, cuya función es la de sintetizar ATP utilizando la energía liberada por el flujo de electrones a través de los distintos transportadores, existen otras cadenas que transportan electrones desde coenzimas reducidas hasta el O2 con liberación de energía que es utilizada con otros fines. Los transportadores de todos estos sistemas se hallan siempre asociados a membranas. Las oxidasas son enzimas que catalizan la oxidación de diferentes sustratos utilizando O2 como aceptor de electrones. El oxígeno no se incorpora en la molécula oxidada. Un ejemplo de este tipo de enzimas es la citocromo oxidasa de la cadena respiratoria que hemos descripto. En este caso el oxígeno recibe 2 electrones e incorpora 2 H+ del medio y forma H2O. Una gran mayoría de las oxidasas son flavoproteínas. Las oxigenasas catalizan reacciones de oxidación en las que un sustrato se oxida a expensas del oxígeno, pero a diferencia de las oxidasas, en este caso el oxígeno se incorpora en la molécula oxidada. Las dioxigenasas catalizan reacciones en las que los dos átomos de oxígeno del O2 se incorporan en el sustrato. Las monooxigenasas tienen un mecanismo de acción más complejo. Catalizan reacciones donde uno sólo de los átomos del O2 se incorpora en el sustrato, en tanto que el otro átomo de oxígeno se reduce a H2O. Las monooxigenasas requieren dos sustratos que actúan como reductores de los dos átomos del O2: el sustrato principal acepta uno de los dos átomos de O2, el cosustrato aporta los átomos de hidrógeno para reducir el otro átomo de oxigeno a H2O. La ecuación general de las reacciones catalizadas por monooxigenasas es la siguiente: AH + BH2 + O - O ------> A- OH + B + H2O donde AH es el sustrato principal y BH2 es el cosustrato. Debido a que gran parte de las monooxigenasas catalizan reacciones en las que se hidroxila el sustrato principal, a este tipo de enzimas se las denomina también hidroxilasas u oxigenasas de función mixta (e incluso se las llama oxigenasas de función mixta, si bien esta denominación no es estricta). Las diferentes monooxigenasas utilizan distintos cosustratos: nucleótidos de flavina reducidos (FADH2, FMH2), NADH, NADPH. Las reacciones de hidroxilación que catalizan estos complejos enzimáticos implican la transferencia de electrones desde el cosustrato hacia el átomo de oxígeno que se reduce a H2O. Esta transferencia no es directa sino que participan diferentes transportadores de electrones. Estos transportadores se organizan formando una cadena de transporte de electrones, pero en este caso como consecuencia de la transferencia de electrones a través de estos intermediarios no se produce la síntesis de ATP. Por tal motivo a estos complejos enzimáticos se los conoce como "cadena de electrones no fosforilantes". Un gran número de estos sistemas utilizan como transportador de electrones a una hemoproteína llamada citocromo P-450. Las reacciones de hidroxilación catalizadas por monooxigenasas que emplean citocromo P-450 utilizan NADPH2 ó NADH. Estas coenzimas transfieren los electrones hacia el citocromo P-450 a través de otro transportador de electrones, generalmente una proteína Fe-S.

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Sistema de monooxigenasas del citocromo P450 microsomal Localización celular: Fracción microsómica hepática (retículo endoplásmico). Dador de equivalentes reductores: NADPH o NADH. Componentes: Flavoproteínas- Citocromo P450- proteínas ferrrosulfuradas- Citocromo b5. Función:Catalizan la hidroxilación de diferentes sustratos, como aminoácidos, escualeno , fármacos como fenobarbital, anfetaminas, morfina. Intervienen además en la desaturación de ácidos grasos. El citocromo P450 es inducible, es decir la síntesis de todas las enzimas que integran este complejo se incrementa cuando se ingieren drogas, por ejemplo anfetaminas o barbitúricos, que son metabolizadas por este complejo. En estos casos se ha observado proliferación del retículo liso. Esto explica porqué aquellas personas que habitualmente consumen por ejemplo barbitúricos, los metabolizan más rápidamente y deben aumentar la dosis para mantener el efecto deseado. Sistema de monooxigenasas del citocromo p450 mitocondrial Localización celular: MMI de tejidos esteroidogénicos: corteza suprarrenal, testículo, ovario, placenta. Dadores de equivalentes reductores: NADPH. Componentes: Citocromo P450 - Proteína ferrosulfurada (adrenodoxina)- Adrenodoxina reductasa (flavoproteína) Función: Hidroxilación de esteroides.

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MUTACIONES DEL ADN MITOCONDRIAL

La gran mayoría de las enfermedades genéticas están causadas por defectos en el genoma nuclear. Además, un pequeño número de enfermedades se deben a mutaciones en el ADN mitocondrial. Dadas las propiedades únicas de las mitocondrias, estas enfermedades presentan un modo de herencia característico y un amplio grado de variaciones fenotípicas. Todas las células humanas contienen varios cientos de mitocondrias. Estas organelas contienen sus propias moléculas de ADN y requieren ribosomas y ARN de transferencia propios debido a que poseen su propia versión del código genético. La transcripción del ADN mitocondrial se produce en forma independiente del núcleo. El ADN mitocondrial está formado por 16560 pares de bases distribuidos en una molécula circular de doble cadena, es compacto. En su secuencia están codificados dos ARN ribosomales, 22 ARN de transferencia y 13 polipéptidos que intervienen en la cadena de transporte de electrones y en la fosforilación oxidativa. Sólo una pequeña región es no codificante y representa los orígenes de replicación y los promotores para la síntesis de ARN. El ADN mitocondrial tiene herencia materna: A diferencia del ADN nuclear, el ADN mitocondrial se hereda exclusivamente de la madre a través de las mitocondrias del óvulo. Los hombres heredan el ADN mitocondrial de sus madres, pero no pueden pasarlo a sus hijos puesto que los espermatozoides no aportan sus mitocondrias al fecundar el óvulo. El ADN mitocondrial es heteroplásmico: dado que cada célula tiene un contenido variado de moléculas de ADN mitocondrial, una única células puede tener algunas moléculas de ADN mitocondrial con una mutación y otras sin mutación. Esta heterogeneidad en la composición del ADN se denomina heteroplasmia y es una causa importante de la expresión diferencial de las enfermedades mitocondriales. La proporción de moléculas de ADN mitocondrial mutante puede modificarse por la segregación, cuando se dividen las células y proliferan las mitocondrias. Aunque la célula progenitora duplica el número de mitocondrias y de moléculas de ADN mitocondrial antes de dividirse, y provee cantidades aproximadamente iguales a cada célula hija, la progenitora no determina cuáles mitocondrias irán a cada célula hija. Esto quiere decir que si un óvulo fecundado lleva una mutación en su ADN mitocondrial, una célula hija puede heredar una proporción mayor de mitocondrias que porten un ADN mutante y otra heredará una proporción mayor de ADN normal. Cuanto mayor sea la proporción de moléculas de ADN mitocondrial mutante, más grave es la expresión de la enfermedad. La variación en la expresión de las mutaciones afecta tanto a los diferentes tejidos de un individuo como a los distintos hijos de la misma madre. Un niño formado a partir de una cigota heteroplásmica puede tener algunos tejidos enriquecidos en ADN mitocondrial mutante y sus hijos pueden diferir en la gravedad y síntomas que presentan. Las alteraciones del ADN mitocondrial tienen un umbral de expresión: Cada tipo celular requiere para su funcionamiento normal una determinada cantidad de ATP producido por las mitocondrias. Aunque puede tolerarse alguna variación en los niveles de ATP, existe un nivel umbral por debajo del cual las células comienzan a degenerar y a morir. Los sistemas orgánicos con grandes requerimientos de ATP y umbrales elevados tienden a ser los más afectados. Por ejemplo, el sistema nervioso central (SNC) consume cerca del 20% de la producción de ATP del organismo y, por lo tanto, es afectado a menudo por mutaciones del ADN mitocondrial. Los tejidos que son principalmente afectados por una disminución en la producción de energía son el SNC, músculo cardíaco y esquelético, riñones y glándulas endocrinas.

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El ADN mitocondrial está afectado por mutaciones somáticas Las alteraciones del ADN mitocondrial suelen heredarse pero, en algunos casos, son también el resultados de mutaciones espontáneas durante el desarrollo embrionario o de mutaciones somáticas en el curso de la vida. La acumulación de mutaciones somáticas explica porque frecuentemente las enfermedades tardan años en manifestarse y se agravan con el paso del tiempo. Pero la acumulación aleatoria de mutaciones somáticas disminuye más la producción de energía hasta que el nivel de energía desciende hasta valores no compatibles con el funcionamiento normal. Es decir, existe un umbral de deterioro del ADN mitocondrial por encima del cual la manifestación fenotípica de la enfermedad aumenta marcadamente. El ADN mitocondrial tiene una velocidad de mutación elevada. La tasa de mutación del ADN mitocondrial es 10 veces mayor a la del ADN nuclear, y esto se debe en parte a la ausencia de los sistemas de reparación y en parte a la generación de radicales libres en las mitocondrias afectadas. Los radicales libres se generan como subproductos de la cadena de transporte de electrones, más aún si existe un mal funcionamiento de este proceso por una mutación inicial en el ADN mitocondrial. Los radicales libres pueden atacar a los componentes celulares y en particular a las proteínas que participan en el transporte de electrones y al ADN mitocondrial. Esto significa que basta una mutación para iniciar un ciclo que produzca la acumulación de mutaciones somáticas en el ADN mitocondrial. La teoría mitocondrial del envejecimiento propone que la acumulación de mutaciones somáticas en el ADN mitocondrial generada por los radicales libres y otros factores en el transcurso de la vida, aún en personas que nacieron con ADN mitocondrial normal, lleva a un descenso en la producción de energía. Esta alteración de la función mitocondrial contribuiría al deterioro del envejecimiento, como por ejemplo la pérdida de vista, del oído, de la memoria, etc. Esto coincide en que en patologías producidas por mutaciones heredadas en el ADN mitocondrial aparecen características propias de la vejez: diabetes, sordera, miopatías y problemas motores. MITOCONDRIOPATIAS

Las mitocondriopatías son un grupo de enfermedades que resultan de la alteración estructural, bioquímica o genética de las mitocondrias, como resultado de mutaciones localizadas en los genes nucleares o en los genes mitocondriales. Las mitocondriodriopatías, también conocidas como miopatías mitocondriales o enfermedades mitocondriales, son un grupo diverso de alteraciones que resultan de la alteración genética, estructural o bioquímica de las mitocondrias. Las manifestaciones clínicas de estas enfermedades son muy variadas, entre las más comunes se encuentran: deterioro de funciones mentales, alteraciones motoras, fatigabilidad, intolerancia al ejercicio, accidentes cerebrovasculares, epilepsia, oftalmoplegía, ptosis, retinitis pigmentaria, hipoacusia, ceguera, cardiopatía, falla hepática y pancreática, anemia sideroblástica, pseudo-obstrucción intestinal, acidosis metabólica y otras.

En general se considera que afectan principalmente a los órganos que dependen predominantemente de la energía mitocondrial (sistema nervioso central, músculo, riñones, sistema endocrino), sin embargo, como se encuentran mitocondrias en todos los tejidos, otros sistemas pueden estar también afectados.

¿Qué pasa cuando hay un defecto en la producción de energía? Cuando existe un defecto en la producción de energía las reacciones metabólicas que la requieren no funcionan eficazmente, ni tampoco lo hacen los órganos y sistemas de nuestro organismo, especialmente aquellos que necesitan más energía para su función cerebro y sistema nervioso en general, músculo, hígado, riñón).

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¿Qué ocurre en el caso de un niño/a que nace con una enfermedad mitocondrial? El niño puede ya nacer con problemas, ya que la energía es necesaria para todos los procesos vitales. No obstante, las enfermedades mitocondriales pueden manifestarse a cualquier edad, en cualquier órgano o tejido que requiera energía, aún cuando los síntomas predominantes son neuromusculares. Posibles manifestaciones clínicas son la hipotonía, dificultad respiratoria, acidosis láctica, cardiopatía, miopatía, ataxia, retinitis, etc… Encefalomielopatía necrotizante subaguda: Esta patología es conocida como enfermedad de Leigh. Se manifiesta en infantes como una severa acidosis láctica y anormalidades neurológicas. Está caracterizado por lesiones simétricas en el ganglio basal, cerebro y médula espinal detectables por tomografía. La condición es frecuentemente fatal. Comúnmente hay una disfunción de la cadena de transporte de electrones a nivel de la citocromo c oxidasa. Disfunciones a nivel de los complejos I (NADH - deshidrogenasa) y II (succinato deshidrogenasa), F1-F0 ATPasa., o piruvato deshidrogenasa producen el mismo cuadro clínico. Es claro que la condición es genéticamente heterogénea, y puede provenir de una serie de mutaciones en los genes nucleares que codifican para las proteínas de la matriz mitocondrial o la membrana interna, o de los genes mitocondriales. La enfermedad de Leigh puede ocurrir sin una historia familiar de una enfermedad similar o bien puede ser transmitida como un defecto autosómico recesivo cuando la mutación es en un gen nuclear o bien por herencia materna cuando la mutación es en un gen mitocondrial. Como se diagnostica este tipo de patologías?

Para el diagnóstico, la evaluación incluye la determinación de ácido láctico sérico, que puede encontrarse elevado (>2.5mM) con una relación lactato/piruvato elevada (>20). Los niveles de CPK pueden estar normales o discretamente elevados. Los exámenes disponibles para determinar posibles alteraciones metabólicas incluyen a la prueba de esfuerzo y la espectroscopia por resonancia nuclear con fósforo. La biopsia muscular constituye probablemente la principal arma para el diagnóstico de miopatía mitocondrial. El análisis del tejido muscular incluye el estudio de la morfología de las fibras musculares, el estudio bioquímico de la cadena respiratoria y finalmente el análisis molecular para la búsqueda de mutaciones del ADNmt. No hay un tratamiento dirigido disponible. Sin embargo, medidas de soporte como mejoría de la nutrición, la implantación de marcapaso cardiaco cuando esté indicado, la corrección quirúrgica de la ptosis y el tratamiento de epilepsia se deben utilizar para mejorar la calidad de vida de los pacientes. El tratamiento metabólico incluye el uso de productos como: creatina,

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coenzima Q, idebenone, succinato, menadion, riboflavina, nicotinamida, vitamina E, ácido ascórbico, tiamina y L-carnitina.

Qué tratamientos se aplican a las enfermedades mitocondriales? El tratamiento de las enfermedades mitocondriales se basa en 1) modificar la función de la cadena respiratoria administrando transportadores o aceptores de electrones (ubiquinona, vitaminas C), 2) reducir el acúmulo de metabolitos tóxicos (carnitina) y 3) administrar antioxidantes (vitaminas A,E,C y ubiquinona) para reducir el estrés oxidativo causado por la mala función la cadena respiratoria.