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MOSCA DE LOS CUERNOS: ESTUDIOS HACIAEL DESARROLLO DE VACUNAS COMO

MÉTODOS ALTERNATIVOS DE CONTROL

Proyecto FPTA- 224. Identificación y obtención de antígenode la saliva de mosca de los cuernos (Haematobia irritans

irritans). Evaluación de los mismos como blancosde vacunas

Responsable del Proyecto: Martín Breijo*

Equipo de trabajo: Martín Breijo. Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación, Facultad deMedicina, UdelaR.Carmen Bolatto. Departamento de Histología, Facultad de Medicina, UdelaR.Cecilia Fernández. Cátedra de Inmunología, Facultad de Química/Ciencias, UdelaR.

Personal contratado: Lucía Pastro; Malvina Ocampo, Sergio Rocha, Valeria Anastasia, Mariana Balducci, Mariana Curto.

*DMTV, Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación, Facultad de Medicina, UdelaR.

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Título: Mosca de los cuernos: estudios hacia el desarrollo de vacunas como métodos alternativos de control

Responsable del Proyecto: Martín Breijo

Equipo de trabajo: Carmen BolattoCecilia FernándezMartín Breijo

Personal contratado: Lucía Pastro; Malvina Ocampo, Sergio Rocha, Valeria Anastasia, Mariana Balducci, Mariana Curto

Serie: FPTA N° 49

© 2013, INIA

Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia del Tecnología del INIA

Andes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguayhttp://www.inia.org.uy

Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podráreproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.

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Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria

Integración de la Junta Directiva

Ing. Agr., MSc., PhD. Álvaro Roel - Presidente

D.M.T. V., PhD. José Luis Repetto - Vicepresidente

Ing. Agr. Joaquín Mangado

Ing. Agr. Pablo Gorriti

D.M.V. Álvaro Bentancur

D.M.V., MSc. Pablo Zerbino

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FONDO DE PROMOCIÓN DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) fue instituido por elartículo 18º de la ley 16.065 (ley de creación del INIA), con el destino de financiarproyectos especiales de investigación tecnológica relativos al sector agropecuario delUruguay, no previstos en los planes del Instituto.

El FPTA se integra con la afectación preceptiva del 10% de los recursos del INIAprovenientes del financiamiento básico (adicional del 4o/oo del Impuesto a la Enaje-nación de Bienes Agropecuarios y contrapartida del Estado), con aportes voluntariosque efectúen los productores u otras instituciones, y con los fondos provenientes definanciamiento externo con tal fin.

EL FPTA es un instrumento para financiar la ejecución de proyectos de investiga-ción en forma conjunta entre INIA y otras organizaciones nacionales o internacionales,y una herramienta para coordinar las políticas tecnológicas nacionales para el agro.

Los proyectos a ser financiados por el FPTA pueden surgir de propuestaspresentadas por:

a) los productores agropecuarios, beneficiarios finales de la investigación, o por susinstituciones.

b) por instituciones nacionales o internacionales ejecutoras de la investigación, deacuerdo a temas definidos por sí o en acuerdo con INIA.

c) por consultoras privadas, organizaciones no gubernamentales o cualquier otroorganismo con capacidad para ejecutar la investigación propuesta.

En todos los casos, la Junta Directiva del INIA decide la aplicación de recursos delFPTA para financiar proyectos, de acuerdo a su potencial contribución al desarrollo delsector agropecuario nacional y del acervo científico y tecnológico relativo a lainvestigación agropecuaria.

El INIA a través de su Junta Directiva y de sus técnicos especializados en lasdiferentes áreas de investigación, asesora y facilita la presentación de proyectos a lospotenciales interesados. Las políticas y procedimientos para la presentación deproyectos son fijados periódicamente y hechos públicos a través de una amplia gamade medios de comunicación.

El FPTA es un instrumento para profundizar las vinculaciones tecnológicas coninstituciones públicas y privadas, a los efectos de llevar a cabo proyectos conjuntos.De esta manera, se busca potenciar el uso de capacidades técnicas y de infraestruc-tura instalada, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los recursos nacionalespara resolver problemas tecnológicos del sector agropecuario.

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria contribuye de esta manera ala consolidación de un sistema integrado de investigación agropecuaria para elUruguay.

A través del Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA), INIA hafinanciado numerosos proyectos de investigación agropecuaria a distintas institucio-nes nacionales e internacionales. Muchos de estos proyectos han producido resulta-dos que se integran a las recomendaciones tecnológicas que realiza la institución porsus medios habituales.

En esta serie de publicaciones, se han seleccionado los proyectos cuyos resulta-dos se considera contribuyen al desarrollo del sector agropecuario nacional. Surelevancia, el potencial impacto de sus conclusiones y recomendaciones, y su aporteal conocimiento científico y tecnológico nacional e internacional, hacen necesaria laamplia difusión de estos resultados, objetivo al cual se pretende contribuir con estapublicación.

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Página

CONTENIDO

ANTECEDENTES ..................................................................................................... 9

DESARROLLO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS ........................................... 10

1. Desarrollo de un sistema de producción y mantenimiento de moscasde los cuernos en condiciones de laboratorio ........................................... 10

2. Identificación de los componentes secretados por la saliva de la moscade los cuernos................................................................................................ 11

3. Pruebas de campo: evaluación de cargas de bovinos naturalmenteparasitados y su respuesta inmune natural e inducida a lasproteínas identificadas en la saliva .............................................................. 14

CONCLUSIONES ................................................................................................... 15

BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 15

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*Departamento de Histología, Facultad de Medicina, UdelaR.**Cátedra de Inmunología, Facultad de Química/Ciencias, UdelaR.***Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación, Facultad de Medicina, UdelaR. Proyecto FPTA 224

Período de Ejecución: Feb. 2007-Feb. 2010

Carmen Bolatto*

Cecilia Fernández**

Martín Breijo***

Mosca de los cuernos:estudios hacia el

desarrollo devacunas como

métodos alternativosde control

ANTECEDENTES

La mosca de los cuernos es un pará-sito hematófago que afecta principalmenteal ganado bovino. Si bien su distribuciónes mundial, la llegada a la región de losgrandes productores de carne de Améri-ca Latina (Argentina, Chile y Uruguay fueen la década de los años 90 (Oyarzun etal., 2008).

Cargas superiores a las 200 moscaspor animal llevan a que los mismos su-fran un importante estrés, reduciendosus ganancias de peso, su producciónde leche e incrementando la susceptibi-lidad a problemas sanitarios (Haufe et al1982). Se han reportado en Uruguay, quesolo las perdidas en la industria del cueroalcanzan los 3.5 millones de dólares porcada mil lón de cueros procesados(Vanzini et al., 1997). En Estados Uni-dos, las perdidas económicas alcanzanel billón de dólares (Cupp et al., 2004).

En la actualidad la principal herra-mienta para el control de este parásito esel uso de insecticidas, sin embargo lageneración de resistencia y los grandescostos asociados al desarrollo de nuevosproductos, ha llevado a varios grupos deinvestigadores a buscar métodos alter-nativos de control. La disponibilidad devacunas contra insectos hematófagostendría como ventajas, su fácil adminis-tración, su especificidad de especie ysería un método mucho más amigablecon el medio ambiente.

Se han descripto en la saliva de losinsectos hematófagos, componentes conpropiedades farmacológicas (principal-mente anticoagulantes y antinflamato-rias). Estos componentes son utilizadospara neutralizar los mecanismos natura-les de defensa y así poder alimentarse dela sangre su hospedero (Ribeiro, 1995).

Pocas han sido las moléculas des-criptas en la saliva de los dípteros hema-tófagos que afectan nuestra producciónagropecuaria. Recientemente describie-ron en la saliva de la mosca del establo(Stomoxys calcitrans) un total de 9 molé-culas, algunas anticoagulantes y otrascon capacidad de bloquear la respuestainflamatoria (Wang et al., 2009). En lamosca de los cuernos hasta la fecha solose ha descrito una molécula denominadathrombostasin; la misma posee actividadanticoagulante (Cupp et al., 2004).

En función de estos antecedentes,nuestro grupo se planteó una estrategiade trabajo (Figura 1) con el objetivo deencontrar nuevos componentes en lasaliva de la mosca de los cuernos yevaluar si estos pueden ser útiles para laconstrucción de vacunas contra esteparásito. Este grupo está integrado porun equipo multidisciplinario (Biólogos,Químicos y Médicos Veterinarios) de laUniversidad de la República.

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DESARROLLOEXPERIMENTAL Y

RESULTADOS

1. Desarrollo de un sistema deproducción y mantenimiento de

moscas de los cuernos encondiciones de laboratorio

En el ciclo biológico de la mosca delos cuernos, los parásitos adultos per-manecen sobre sus hospedadores, aban-donándolos solo para poner sus huevos.En las heces frescas de los bovinos, seefectúa la ovoposición y el desarrollolarvario hasta el estado de pupa, de don-de emergen nuevos insectos adultos (Fi-gura 2). En condiciones adecuadas detemperatura y humedad el ciclo duraentre 10-14 días, aunque puede alargar-se hasta 50 días en condiciones climáti-cas adversas (Mendes y Linhares, 1999).

Para nuestra estrategia de trabajo,era fundamental disponer de los diferen-tes estadios larvarios e insectos adultosen condiciones de laboratorio. Esto nos

Figura 1. Estrategia experimental desarrollada por el equipo de investigadores del proyecto INIA FPTA 224.

permitiría realizar ensayos in vivo, tomarmuestras de tejidos y disponer de mos-cas adultas a lo largo del año. En nuestrolaboratorio, logramos optimizar un siste-ma de cultivo de larvas, pupas y adultosvírgenes, basado en el desarrollo de unmedio de cultivo a partir de una mezclade alfalfa, cascara de arroz y hecesbovinas (Figura 3).

Paralelamente, en el Campo Experi-mental del Instituto de Higiene, Facultadde Medicina, se construyeron dos boxesadaptados para mantener bovinos para-sitados con moscas. Esto permitió quese pudieran desarrollar ensayos de in-vestigación sobre la biología del parásito.Por ejemplo, evaluamos si las moscaspodían ser vectores de enfermedadesvirales como la Rinotraqueítis Bovina In-fecciosa (IBR). En ese marco, tres bovi-nos fueron estabulados y dos de ellosfueron infectados experimentalmente con107 partículas infectante de cultivo detejido 50 (TCID 50) de Herpesvirus bovino 1(BoHV-1.1). Desde el día 0 hasta el día12 posinfección, se realizo diariamentela captura de aproximadamente 2000 mos-cas en el rodeo del campo, las cuales

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fueron liberadas en el box de los bovinosinfectados. A las 24 h de estar en contac-to con los bovinos infectados, las mos-cas fueron recapturadas y se procedió ala identificación de partículas virales enlas mismas así como en las secrecionesnasales y oculares tomadas de los bovi-nos. Como se puede observar en la figura4, si bien pudimos identificar virus en lassecreciones nasales y oculares de losbovinos desafiados, no pudimos demos-trar la presencia del virus en moscas queparasitaban los animales enfermos.Estos resultados señalan que la probabi-lidad de que la mosca oficie de vector deeste patógeno es muy reducida.

2. Identificación de loscomponentes secretados por la

saliva de la mosca de loscuernos

Las fuentes de información para poderidentificar los componentes de la salivade la mosca de los cuernos básicamentefueron dos: el aislamiento de la glándulasalival y la propia obtención de saliva dela mosca.

Figura 2. Ciclo biológico de la mosca de los cuernos.

Figura 3. Producción de moscas de los cuernos en el laboratorio. A. captura de moscas salvajes; B.preparación de medio de cultivo de larvas; C. puesta de huevos de moscas; D.,E. y F. procedimientode recuperación de pupas por flotación.

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Figura 4. Evaluación de la mosca de los cuernos como vector de IBR en bovinos 1. Imágenes deinfección experimental 2.A) PCR convencional de controles positivos. Carril 1, marcador100pb Invitrogen; carril 2, control negativo (H2O); carril 3, control positivo 50ng de ADN viral;carril 4, control positivo 100ng de ADN viral. 2.B) PCR convencional de muestras de infecciónexperimental. Carril 1, marcador 100pb; carril 2,3, moscas infectadas 423; carril 4,5, hisopoocular 423; carril 6,7, hisopo ocular 417; carril 8, control positivo; carril 9, control negativo.

Figura 5. Identificación de la glándula salival de la mosca de los cuernos. A. mosca previo a su disección; B.apertura de abdomen e identificación de glándulas salivales (flecha); C. corte de glándula salivalpor microscopía de transmisión.

A B

La glándulas salivales de la mosca delos cuernos, fueron identificadas comodos estructuras tubulares de aproxima-damente 2 mm de longitud adosadas alos costados del intestino. Histológica-mente, están compuestas por una mono-capa de células poliédricas que tapizanun único conducto interno. Cuando ana-lizamos esa estructura por microscopíaelectrónica de transmisión, observamosque las células se encuentran organiza-das formando un tubo simple que presen-ta un lumen central dentro del cual lasaliva es aparentemente secretada (Fi-gura 5).

Una vez identificadas las glándulas,se procedió a la construcción de unagenoteca de glándula salival según elprocedimiento descripto por Fernándezet al., 2002. Brevemente, a partir de 90pares de glándulas, se realizo la extrac-ción de ARN total, el cual se utilizó enuna única reacción de «oligo-capping»(GeneRacer, Invitrogen). Una vez obteni-do el ARN con «oligo-cap», se preparóADN copia y se lo amplificó en su totali-dad por PCR. El producto amplificado fueclonado en el vector TOPO, y una alícuo-ta de la mezcla de ligación se utilizó paratransformar E. coli TOP 10. Se obtuvieronvarios clones de ADN copia ligadas a

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TOPO con las bacterias transformadasquímicamente. Un total de 120 clones seenviaron a secuenciar al servicio de se-cuenciación de Macrogen (Korea).

Las secuencias obtenidas (ESTs),fueron ensambladas y agrupadas, parapoder identificar finalmente 5 secuenciascompletas de cDNA con distintos gradosde homología con antígenos de glándulasalival de Stomoxys calcitrans y otrosinsectos (Cuadro 1).

Luego de analizar desde el punto devista teórico, el potencial farmacológicoe inmunógeno de las secuencias, defini-mos en una primer etapa, producir lasproteínas recombinantes de dos de ellas:PS (familia HYP16) y Ag5 (familia Antí-geno 5).

Para ello se diseñaron parejas deprimers con los que se amplificaron porPCR las secuencias codificantes y losproductos de estas reacciones fueron

clonados en el vector pGEM-T Easy (Pro-mega). Se transformaron células compe-tentes y se confirmó la presencia de losinsertos correspondientes por PCR delas colonias seleccionadas.

Las bacterias transformadas fueroncultivadas y se indujo la expresión de lasrecombinantes con IPTG. El análisis porSDS-PAGE (12% de acrilamida) de ex-tractos totales de los cultivos mostróque, en los cultivos inducidos, se obser-van bandas, de aproximadamente 28 kDay 17 kDa, que no están presentes en loscultivos no inducidos. El tamaño de es-tas bandas fue similar al esperado paralas recombinantes correspondientes aAg5 (27 kDa) y PS (16 kDa), respectiva-mente. Las proteínas recombinantes fue-ron purificadas por afinidad con matricesde Ni2+-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA).En la Figura 6 se muestra el análisis porSDS-PAGE de las purificaciones deambas proteínas.

Figura 6. Análisis por SDS-PAGE de la purificación de Ag5 y PS (geles de poliacrilamida 12% teñidos con azulde Coomassie). Carril 1, marcador de peso molecular (Fermentas); carril 2, extracto bacterianototal previo a la inducción; carril 3, extracto bacteriano total, luego de la inducción; carril 4, fraccióninsoluble del extracto total luego de la inducción; carril 5, fracción no retenida en la matriz de afinidad;carril 6, lavado; carriles 7 al 10, cada una de cinco eluciones realizadas a pH 4,5.

ProteínaFamilia Posible función Identificada en1 Q-rich secreted protein activación de factores Drosophila

de transcripción2, 3 Thrombostasin anti coagulante (anti trombina) H. irritans4 PS HYP 16 antinflamatoria Aedes stephensi

Aedes albopictus

5 Ag5 Antígen 5 Bloqueadores de canales Stomoxys calcitransiónicos, unión ainmunoglobulinas

Cuadro 1. Proteínas identificadas en la glándula salival de H. irritans. Fueron denominadasPS y Ag5 a las secuencias 4 y 5 respectivamente obtenidas a partir de la genotecade glándula salival.

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1000

800

600

400

200

0

Figura 7. Distribución de cargas de moscas de los cuernos en la época estival.Dic. Ene. Feb. Mar. May.

N°

de m

osca

s/bo

vino

3. Pruebas de campo:evaluación de cargas de

bovinos naturalmenteparasitados y su respuesta

inmune natural e inducida a lasproteínas identificadas en la

saliva

Con el fin de estudiar el potencial dePS y Ag5 como blancos de vacunas, serealizaron ensayos de campo donde seregistro la carga de moscas de los bovi-nos y se determino su respuesta deanticuerpos contra estas proteínas. Parala identificación de los anticuerpos espe-cíficos, se sensibilizaron placas de ELI-SA con las respectivas proteínas recom-binantes.

Un total de 15 bovinos biotipo carnice-ro (cruzas Hereford, Aberdeen Angus yLimousin) entre 24 y 36 meses de edadfueron alojados en el Campo Experimen-tal del Instituto de Higiene, Facultad deMedicina Canelones, Uruguay (34º38´S,55º 55´W). Entre los meses de noviem-bre 2009 y mayo 2010, la carga de mos-cas de cada animal fue registrada sema-nalmente a través de un registro fotográ-fico y el posterior análisis del mismo porprocesadores de imagen. Paralelamente,cada 15 días a esos bovinos se lesextrajo sangre para evaluar el desarrollode anticuerpos específicos contra antí-genos salivales.

Tal como fue descrito por otros auto-res, observamos que la carga de parási-tos está influenciada fundamentalmentepor el peso y el color, teniendo una menorincidencia el sexo.

El número de moscas a lo largo de laestación estival resultó no ser homogé-neo. La oferta de moscas se inició enoctubre, alcanzando su pico máximo endiciembre (promedio de 487 ± 322 mos-cas por animal). Luego los valores me-dios de moscas cayeron significativa-mente en los meses de enero y febrero(promedios de 209 ± 156 and 133 ± 103respectivamente). En el mes de marzo,observamos un nuevo incremento demoscas significativamente mayor a fe-brero pero menor al de diciembre (233 ±221) (Figura 7).

Cuando analizamos los títulos de an-ticuerpos específicos contra Ag5 y PSdemostramos por primera vez, que todoslos bovinos desarrollaron respuestas es-pecíficas contra dichos antígenos. Losmayores títulos se alcanzaron en el mesde diciembre y luego fueron declinandohasta desaparecer completamente en elmes de julio (Cuadro 2).

No pudimos encontrar una correlaciónentre carga de moscas y título de anti-cuerpos, por lo cual no hallamos eviden-cia de que la respuesta inmune frente a laexposición natural de bovinos a las mos-cas sea capaz de reducir directamentelas cargas parasitarias.

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Sin embargo, la respuesta de anti-cuerpos contra antígenos salivales de lamosca podría contribuir a explicar lasvariaciones en la oferta de parásitos en elcampo a lo largo de la estación estival,tal como fue planteado por otros autores(Harvey y Launchbaugh, 1982; Baron yLysyk,1995).

Nuestros resultados señalan que lue-go que los bovinos alcanzan su picomáximo de anticuerpos, la oferta demoscas cae en el rodeo general. Ade-más existe un segundo pico en marzo(menor al inicial), luego de la reducciónparcial del título de anticuerpos en elrodeo en el mes de febrero (donde 80% y60% de los animales redujo su título paraAg5 y PS respectivamente).

Un elemento adicional es que ha sidodescrito que las hembras de la mosca delos cuernos reducen su puesta de hue-vos, si se les reduce la oferta de sangre(Cupp 2004). Si consideramos que losanticuerpos específicos contra antíge-nos salivales podrían bloquear la acciónde los mismos, podría haber una limita-ción de la capacidad de alimentarse cuan-do los anticuerpos llegan a sus nivelesmáximos.

Para evidenciar que los antígenos dela saliva pueden controlar el desarrollo dela ofertas de moscas en un rodeo, debe-remos continuar realizando estudios.

CONCLUSIONESEn el presente trabajo se ha alcanza-

do la identificación de moléculas presen-tes en la saliva de la mosca de loscuernos.

Estas moléculas para las moscastienen un rol preponderante a la hora de

Niveles de anticuerpos (UA)Mes Nº bovinos Anticuerpos Anti rPS Anticuerpos anti rAg5

Diciembre 15 133 (± 82) 965 (±1000)Enero 15 110 (± 71) 1002 (± 1450)Febrero 15 97 (± 87) 513 (± 276)Mayo 15 4 (± 5) 51 (± 35)

Cuadro 2. Niveles de anticuerpos específicos contra PS y Ag5 de bovinos naturalmenteparasitados.

tomar su alimento del bovino, por lo cualdebemos seguir estudiando su potencialcomo blancos de vacunas.

Si bien en el presente estudio, noobservamos que la respuesta de anti-cuerpos contra dos de los antígenos iden-tificados controlara directamente la car-ga parasitaria de los animales, existenindicios que podría existir una regulaciónde la oferta de moscas en un rodeo apartir de una elevación de la respuesta deanticuerpos. Para confirmar esto, nuevosestudios serán necesarios.

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