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GAUSSIA LUCIFERASA COMO MARCADOR BIOLGICO PARA MONITOREO DE LA PROGRESIN DEL TUMOR Y RESPUESTA AL TRATAMIENTO DE LAS METSTASIS A DISTANCIAIntegrantes:Crdenas Ramrez, VanessaCrdova Espinoza, LeidyGuardia Herrero, DavidPrez Paucar, PedroSallo Valenzuela, PattyRobles , PaolaYaranga Rojas, KathyaBIOLUMINISCENCIAluciferaseLUZ=

Es la luz producida por una reaccin qumica dentro de un organismo.Al menos 2 elementos se requieren. El que produce la luz "luciferina" y otro que cataliza la reaccin "luciferasa.la energa de una fuente de luz es absorbida y remitida como otro fotn.es una radiacin de vida media ms prolongada y est asociada con la intensidad de la luz absorbida.

fluorescenciafosforescenciaAlgunas especies con actividad bioluminiscente Bacterias, Hongos, dinoflagelados,radiolarios, Cnidarios, Hydrozoa, Anthozoa, Ctenforos, Nemertinos, udibranquios,pulpos, anlidos, picnognidos, Quetognatos, crustceos (Coppodos, Ostrcodos, Anfpodos, Eufsidos), Equinodermos, Tunicados, Larvceos, PecesCiempis, Milpis, InsectosGaussia, mide unos 27mm. Producen la luz cuando hacen un giro al escaparse.

Hidromedusa Aequorea victoria

Dinoflagelado Pyrocystis fusiformis.

Japetella sp. la hembra usa su bioluminiscencia alrededor de su boca, solo cuando busca pareja.

Poliqueto Tomopteris sp. Luminiscencia amarilla. Cuando es perturbado muestra la ioluminiscencia en sus parapodios.

Ctenforo batipelgico Bathyctena sp. (2000 m). La bioluminiscencia amarilla aparece cuando el animal es perturbado.

CoelenteracinaEs una luciferina, molcula responsable de la emisin de luz en algunas bacterias , algas, hongos y animales.Es el sustrato de muchas luciferasas y fotoproteinas incluyendo luciferasa de Renilla reniformis (Rluc), Gaussia luciferase (Gluc), aequorina y obelina.

Gaussia luciferaseEs una protena luminiscente con rendimientos cunticos ms altas que las luciferasas deRenilla sp.y lucirnaga.Es independiente de ATP, lo que requiere slo coelenteracina y O2como sustratos.

Luciferasa de lucirnaga

Cncer metastsicoCncer que se ha diseminado de su lugar de origen a otro lugar en el cuerpo.Los lugares ms comunes de metstasis del cncer son los pulmones, los huesos y el hgado.El tratamiento del cncer metasttico depende, usualmente, del tipo de cncer y del tamao, ubicacin y nmero de tumores metastticos.

GlosarioOrtotpico: Que est situado en su lugar normal.Se usa con frecuencia para describir un tejido u rgano que se trasplanta a su lugar normal en el cuerpo

MDA-MB-231: una sublnea de la lnea celular de adenocarcinoma de mama humano; es decir, clulas se cultivaron con el fin de estudiar el papel de la acetilacin y extra-celular ubicacin de 90alpha protena de choque trmico en la invasin de clulas tumorales.

Marcador biolgico: molcula biolgica que se encuentra en la sangre, otros lquidos o tejidos corporales, es un signo de un proceso normal o anormal, o de una afeccin o enfermedad

GlosarioInoculacin: introduccin de una sustancia en el cuerpo para producir o aumentar su inmunidad ante una enfermedad o proceso asociado a dicha sustancia.

Luminmetro: excelente para monitoreo de limpieza en planta, equipo porttil, su avanzado sistemapermite leer la cantidad de ATP, cuenta con un software para realizar anlisis estadsticos y llevar un control

RLU( unidad relativa de luz) : la luz emitida desde los hbridos ARN:ADN marcados se mide como seales de fotones en un luminmetro y se incluye en el informe como unidades deluz relativa.

Valor umbral: separa los objetos de una imagen que nos interesan del resto

HER2Receptor del factor de Crecimiento epidrmico Es el nombre de una protena producida por un gen especfico cuya alteracin puede producir cncerLas protenas HER2 son receptores en las clulas mamariasAyudan a controlar la manera en que una clula mamaria sana crece, se divide y se repara as misma

EGFRReceptor del factor de Crecimiento epidrmicoEs el receptor celularde la Superficie de la clulade los Miembros de la Familia del factor de crecimiento epidrmico(familia EGF) de los ligandos de las Protenas extracelulares.

Lapatinib

Es un agente quimioteraputico, un inhibidor dual de la tirosina quinasa de EGFR y HER2Acta sobre una enzima especfica que se encuentra en las clulas cancerosas y detiene el crecimiento de las clulas.

Se usa en forma de ditosilato de lapatinib.

INTRODUCCCION

Ratones de laboratorioLos ratones fueron anestesiados con ketamina/xilazina(100/10mg/kg), Inyeccin intraperitonial

Lnea celular y cultivo celular

Lnea celular humana 231 Br y HER2 con sobreexpresin de contraparte, donde ambos expresan la protena verde fluorescenteLas clulas 231 BR y 231BR Her2 se mantuvieron en Dulbecco modificado por Eagle, complementado con suero fetal bovino al 10%1% de penicilina estreptomicina solucin

Gluc TransfeccionEl vector lentiviral lleva un cassette de expresin que codifica la protena Gluc y ceruleo flurescente, separados por un sitio interno de entrada ribosomal que se ha generado con anterioridad. Las clulas 231BR y 231BR Her2 fueron transducidas con LV-Gluc-PPC 231BR-G y 231BR-HER2-G a una multiplicidad de infeccin.

Modelo de almohadilla de grasa mamaria

Se ha diseado clulas MDA-MB-231BR (231BR), la cual se administra en un volumen de 200 a 300 mm3 en la almohadilla de la grasa mamaria (MFP)

Ratones femeninos de 5 7 semanas de edad El tamao del tumor se midi mediante una pinza

Los tumores se resecaron y se utiliza para H &E tincin Ratones femeninos de 6 -7 semanas de edad desnudos fueron inyectados con: 0.25 x 106 231 BR- HER2-G clulas en 0,1 ml de PBS a travs del ventrculo izquierdo.

Fueron sacrificados los ratones que mostraron sntomas clnicos de dolor prolongado

Modelo de metstasis experimental (modelo de inyeccin intracardiaca) El cerebro, los huesos y los dems rganos se recogieron y se evalan de inmediato para GFP mediante microscopa de fluorescencia. Ensayo Gluc De Sangre / OrinaSe extrajo sangre de hacer una ligera incisin en al vena de la colaLa orina se recoge directamente de las aberturas de la uretra10 L de sangre se recogi y se mezcl con 2L de 50 mM de EDTA.Las muestras de sangre u orina se transfiri luego a una placa de 96 pocillos.La actividad de la Glu se midi utilizando un luminmetro placa.

Cuantificacin de tumor viableSe utilizo la tincin hematoxilina-eosina (H & E) la cual nos permite contrastar el ncleo del citoplasma, tiendo el ncleo de color azul y el citoplasma de un color rosado.

MATLABMatlab esta diseado para la computacin interactiva y automatizada mediante las funciones matemticas y graficas incorporadas , herramientas donde se podr analizar y visualizar los datosExploracin y anlisis de datos ,visualizacin y procesado de imgenes

Biolumiscencia de Imgenes (BLI)Es una tecnologa la cual representa una poderosa herramienta para su uso con bacterias modificadas para expresar genes reporteros como lux (unidad del nivel de iluminacin).BLI se utiliza tradicionalmente como una modalidad 2D que resulta en imgenes que estn limitados en su capacidad para localizar anatmicamente las poblaciones de clulas.

26Biolumiscencia de Imgenes

Ratn anestesiadoLnea celular MDA-MB-231 BR(231BR)Inyeccin de ctz 4mg/kgEl tiempo de adquisicin de la imagen se encontraba en el intervalo de 15 segundos a 1 minutoSistema IVIS acoplado a un software de imagen resultadosRESULTADOSResultado n 1Comparacin de la actividad Gluc en sangre, plasma y orina

Resultado n 2Seguimiento de la actividad Gluc en la sangre, la orina e imgenes de bioluminiscencia (BLI) del modelo ortotpico de cncer de mama.

Resultado n 3La sangre de ensayo Gluc refleja la carga tumoral viable.

Resultado n 4Monitorizacin en tiempo real de progresin del tumor metastsico con Gluc sangre y localizacin de la metstasis, con imgenes de Bioluminiscencia

Metstasis de columna vertebral

metstasis cerebrales

Resultado n5El ensayo Gluc en sangre Ofrece monitoreo en tiempo real de respuesta al tratamiento de la progresin del metstasis sistmico.

CONCLUSIONESLa deteccin del tumor viable primario se puede detectar antes que se desarrolle la proliferacin celular, por medio del biomarcador Gaussia luciferasa solo se da a travs en ensayo de sangre.La Gaussia luciferasa es el regulador que ayuda detectar la formacin y actividad de las clulas tumorales, tanto en tratamiento como en el control.

Muchas gracias