GeneXpert Systems

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Cambio de Cultura

PCR en Tiempo Real ®

Dra. Yamile SandovalPruebas diagnósticasPROMED

Lic. Catherine HerreraAplicaciones de Biología MolecularPROMED

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PRESENTAMOS EL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR MAS PEQUEÑO DEL MUNDO

GeneXpert® System

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Sistema GeneXpert®

1). Primer instrumento de diagnóstico molecular homologado por la FDA

2). El sistema GeneXpert es el único en combinar una preparación de muestra abordo con PCR en tiempo real

3). Resultados de muestras no procesadas en aproximadamente una hora.

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PCR EN TIEMPO REAL

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PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

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TARGET

8 COPIES

4 COPIES

CYCLE 3CYCLE 2CYCLE 1

16 COPIES

CYCLE N =

2(N-1) COPIES

PCR CiclosPCR Ciclos

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Principios de PCR en Tiempo Real

1). Se monitoriza ciclo a ciclo el producto amplificado, a través de una señal de fluorescencia en el momento en que se está dando la reacción de PCR

La región “Blanco” será amplificada en presencia de un reportero.

El Instrumento excita el reportero, detecta la señal del reportero y colecta los datos fluorescentes.

2). La señal de fluorescencia incrementa en proporción al producto amplificado

3). La señal fluorescente será colectada en la fase exponencial de la PCR ciclo a ciclo.

4). La medición puede ser graficada en forma logarítmica o lineal.

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ENSAYO Taqman®

PRINCIPIO USADO EN LA PCR EN TIEMPO REAL

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BASELINE

LOG-LINEAR

PLATEAU

EXPONENCIALEXPONENCIAL

Curva de Amplificación de PCR en Tiempo RealCurva de Amplificación de PCR en Tiempo Real

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CICLAJE Threshold (Ct)

(fluorescence units)

CYCLE THRESHOLD

THRESHOLD LINE

END POINT FLUORESCENCE

178

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Tecnología GeneXpertTecnología GeneXpert

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Sistema de Diagnóstico GeneXpertSistema de Diagnóstico GeneXpert®®

Componentes del Sistema

GeneXpert

Módulo

Precisión de las fluídicas

Sistema térmico / Óptico

Cartucho

Contenedor seguro, y de un solo uso

Reactivos

Secos y Húmedos

Computadora

Software, código de barras, impresora, UPS

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Tecnología de Reactivos Cepheid

Perlas enzimáticas

Taq Polymerase

Componentes Generales de PCR

Perlas TSR

Primers y sondas dirigidas a las regiones blanco y secuencias conocidas

Perlas SPC

Bacillius globigii (Bg)

Control Interno Cepheid (CIC)

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Motor de la Jeringuilla

Tarjeta Madre

I-CORE

Uniframe

Motor de la válvula

Horno UltrasónicoPuerta del

Módulo

GeneXpertGeneXpert®® Módulo Módulo

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CÁMARAS DE PROCESAMIENTO

TUBO DE REACCIÓN

CUERPO DE LA VÁLVULA

Cartucho GeneXpertCartucho GeneXpert®®

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GeneXpert®: Un laboratorio de Biología Molecular en un cartucho

• Contiene todos los reactivos para una prueba en particular

• Control de contaminación:

• Ni la muestra ni el reactivo salen del cartucho

• Preparación universal de la muestra

• Corre nested PCR

• Capacidad de tests reflejo

• El material biológico se desecha fácilmente

Cartridge Bodywith Multiple ReagentReservoirs

PCR ReactionTube

Ultrasonic Interface

Rotary Valve

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I-CORE ModuloIntelligent Cooling/Heating Optical Reaction Module

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Kit GeneXpert

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GeneXpert® 6 Canales

Channel Excitation Range Emission Range Dyes

1 375-405 nm 420-480 nm CF1

2 450-495 nm 510-535 nm FAM

3 500-550 nm 565-590 nm Alexa Fluor® 532

4 555-590 nm 606-650 nm Texas Red®

5 630-650 nm 665-685 nm Alexa Fluor® 647

6 630-650 nm >700 nm CF6

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REPORTES SENCILLOS Y CON ACCESO A SISTEMAS LIS DEL LABORATORIO

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CUALIDADES DEL SISTEMACUALIDADES DEL SISTEMA

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GeneXpert® PCR en tiempo real

1). Extracción automatizada de ADN o ARN de una muestra biológica

2). Cartucho cerrado de un solo uso

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GeneXpert® Escalas posibles del sistema

GX-I GX-IV GX-XVI GeneXpert Infinity Series

GeneXpert Module

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Simple, Fácil, Walk-away

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FÁCIL

Uso

RÁPIDO

Respuestas

CONFIABLES

Resultados

Pruebas Moleculares en corto tiempo y con resultados confiables

Xpert MTB/RIF – Romain Prieur



Sources: Eveillard et.al., J Hosp Infect (v. 59, 2005); Salgado et.al., SHEA 2003, abstract 28, p. 61; Bhalla et a,

Infect Control Hosp Epidemiol (v. 25, 2004) – Special thanks to Becton, Dickinson and Company.

Los cultivos de bacteriología solo captan

““la punta del Iceberg”la punta del Iceberg”

La transmisión se da no solo por pacientes La transmisión se da no solo por pacientes infectados, sino también por pacientes infectados, sino también por pacientes

colonizadoscolonizados

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PRUEBAS DISPONIBLES

Análisis Clínicos (IVD-Enfermedades virales e infecciosas)



Xpert® vanA/vanB

Xpert® MRSA

complete

Xpert® MRSA/SA

SSTI

Xpert® MRSA/SA

Nasal

Xpert® MRSA/SA BC

Xpert® MTB/RIF

Xpert® C. Difficile

Xpert® GBS

Xpert® EV

Xpert® Flu A Panel

Xpert® HemosIL® FII & FV

Xpert® BCR-ABL



Xpert® MTB/RIFPrueba de PCR en tiempo real que permite detectar cepas

del complejo M. Tuberculosis y de las cepas resistentes a la Rifampicina

Permite un análisis semicuantitativo in vitro de muestras de esputo y concentrado de lavado bronquial

Preparación : 2 minutos

Tiempo de incubación :15 minutos

Resultado: 90 minutos vs 1-2 sems en cultivos líquidos y 4-6 sems en los sólidos


MTB/RIF - Xpert® permite

1- 1- La detección del ADN del complejo MTB en muestras de esputo o sedimento concentrado ya sea de esputo o LBA, BAAR + o BAAR -

2- La detección de la mutación del gen rpoB /región 81bp que esta

asociada a la resistencia a la rifampicina en pacientes de alto riesgo

3- La prueba MTB/RIF-Xpert® esta indicada en pacientes con sospecha clínica de TBC y en pacientes que no han recibido tratamiento, pacientes con menos de 7 días de tx. o pacientes que no han recibido tx en los últimos 60 días


Cepheid Confidential & Proprietary

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Sensibilidad de las Pruebas de susceptibilidad Genotípicas

Droga Blanco Sensibilidad

Rifampicina rpoB 98%INH (katG), inhA 85%PZA pncAEtambutol emB

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Xpert® vanA/vanB

Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico

Detección de los genes VanA y VanB que confieren al enterococcus la resistencia a la Vancomicina

1:8 de las infecciones hospitalarias son por enterococcus y de estas 30% resistentes a la Vancomicina

Pacientes de mayor riesgo UCI e inmunocomprometidos

Resultado: 45 minutos

Tipo de muestra: hisopado rectal y perianal



Xpert® SA/MRSA complete Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico

>60% de las infecciones hospitalarias son por staphilococcus aureus

Alta mortalidad

Ha demostrado tener una mayor sensibilidad diagnóstica que los métodos de cultivo cromogénico

Resultado: 56 minutos

Muestra: Hisopado nasalPruebas que demandan en Control de Infecciones Nosocomiales

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• Causa la mayor morbilidad y mortalidad neonatal1

• Afecciones neurológicas • Fatal en el 5% de los infantes infectados

• Las guías del CDC especifican que se debe hacer la prueba a todas las pacientes embarazadas

• La única prueba aceptada hasta el momento ha sido el cultivo

• Los cultivos toman tiempo – no es una opción para los nacimientos antes de término, ni para las mujeres sin control del embarazo o cuando los resultados no están disponibles (15 al 30% de los nacimientos)

• Antibióticos profilácticos — la resistencia cada vez es mayor

Xpert® GBS

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BOX 2. Procedures for processing clinical specimens for culture of group B Streptococcus (GBS ---Detection of GBS can be determined directly from broth media using latex agglutination, probes or nucleic acid amplification tests (NAAT) such as PCR.

Comprison of culture and 2 real-time polymerase chain reaction assays to detect group B Streptococcus during antepartum screening. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;59:17–22. Block T, Munson E, Culver A, Vaughan K, Hryciuk JE.

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Para que una prueba sea considerada clinicamente útil en el período intraparto como método de tamizaje para GBS debe poder ser realizada de manera sencilla al lado de la cama del paciente, ya sea por el personal de la sala de labor o parto, deben obtenerse resulatdos en menos de 30 min y debe poseer una sensibilidad y especificidad >90%Revisión de las Guías CDC, 2010

Preparación : 2 minutosPreparación : 2 minutosResultado: 30 minutosResultado: 30 minutosMuestra: hisopado Muestra: hisopado

vaginal y vaginal y rectalrectal



Xpert® C. difficile


Prueba diagnóstica rápida ~56 min.

Detección de cepas toxigénicas y epidémicas de Clostridium difficile 027/NAP1/B1

Pacientes de riesgo: hospitalizados, exposición a AB, edad avanzada

Tipo de muestra: heces fecales



Xpert® EVDiagnóstico molecular rápido de meningitis causada por enterovirus

GeneXpert – Test de 2 horas Puede reducir la necesidad de otras pruebas y el uso de antibióticos

Acceso a la prueba 24/7Tipo de muestra: LCR Volumen de muestra 140µLPreparación: 5 minutosResultado: 2.5 horas

***Detectará 60 serotipos de Enterovirus

La secuencia Target está en el 5’ UTR del RNA del enterovirus



Xpert® Influenza


Prueba diagnóstica rápida ~menos de 1 hora, resultados en tiempo real STAT

Detecta especímenes Flu A y H1N…diseño múltiplex

Mejor desempeño que pruebas rápidas EIA, que no detectan hasta 70% de las infecciones

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1) Poca manipulación de las muestras: no más de 6 minutos

2) Aprobación del FDA

3) Aprobación CE (Comunidad Europea)

4) Resultados: entre 30 minutos a 2 horas dependiendo de la prueba

5) No se requiere de espacios especiales

6) No se requiere de personal especializado en biología molecular

7) Descarte de material biológico sin riesgo de contaminación

Sistema GeneXpert®

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GRACIAS

Cambio de ParadigmaSistema GeneXpert®

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