Marcadores Genéticos y

Pruebas de Filiación

Cuáles fueron los hallazgos en el proyecto genoma humano ?

99.8% de identidad entre individuos ~ 1% de diferencia con el genoma

del chimpancé3% del DNA es codificante ~ 30-35.000 genes ~ 3 billones de pares de bases (3 X

109 bases)

EL GENOMA HUMANO

DNA EXPRESIVO 30%

DNA NO CODIFICANTE 70%

Secuencias repetidas en tándem 10%

SINEs:

Alu

LINEs:

L1

Minisatélites

Microsatélites

Satélites: Clásicos

Alfoides

Secuencias dispersas 15 -

20%

ADN REPETITIVO 20 – 30%

ADN PRESENTE EN EL GENOMA HUMANO

CUÁL ES EL APORTE DEL PROYECTO GENOMA HUMANO (1990-2003) ?

Conocimiento total de la secuencia de las moléculas de DNA presentes en el genoma humano

Comprensión de la función de la gran mayoría de nuestros genes, cuya utilidad desconocemos

Posibilidad de pronosticar enfermedades Diagnóstico temprano de las patologías y

eventualmente su corrección y posibilidad de curar enfermedades

El ADN varía de individuo a individuo?

Individuos no emparentados: una vez cada 103 pb.

Principalmente en el ADN no codificante. ADN no codificante es aprox. el 70% del

genoma. Presentes en el 1% de población:

Polimorfismos. De éstos polimorfismos surge lo que se

conoce como marcadores genéticos.

¿ Qué son marcadores genéticos?

Segmentos de ADN con una localización física identificable y reproducible que pueden ser fácilmente rastreados y usados para construir un mapa cromosómico.

Aplicación en mapeo genético, y en la elucidación de patrones humanos demográficos ancestrales.

Estudios en evolución: divergencia de especies, de poblaciones etc.

Los polimorfismos de regiones codificantes también son importantes y útiles

Por su relación con enfermedades y

desordenes genéticos. Causan alteraciones funcionales proteína Consecuencia: cambios fenotípicos

evidenciables y rastreables.Cómo se generan los polimorfismos?Mutación, Secuencias repetidas, Diferencias

en un nucleótido (SNPs), Inserción, Deleción, Recombinación.

Evolucionan por mecanismos de larga escala como intercambio desigual.

Igual que los microsatélites, evolucionan por unidad de repetición.

También se conocen como VNTRs variable nucleotide tandem repeats.

Se encuentran dentro o entre genes.

Las unidades de repetición son pequeñas: 50 > 200 pb.

MINISATÉLITES

EL número de copias en tandem de cada secuencia varia en cada individuo

Esta variación se genera durante la recombinación genética cuando las unidades de repetición no se alinean bien.

Altas tasa de intercambio genético sitios frecuentes durante la recombinación.

Se utilizan como marcadores y son la base de la huella genética o fingerprinting.

… MINISATÉLITES

Combinaciones de genotipos en seis individuos, para tres alelos VNTR, llamados A, B, C :

AA, BB, CC, AB, AC, BC

…MINISATELITES EJEMPLO

MICROSATELITES

MICROSATELITES

STRs Singel Tandem Sequence Repeats

Secuencias cortas y repetitivas de ADN (1 a 8 pb).

Regiones no codificantes del genoma. La diferencia en la cantidad de

repeticiones en determinados alelos para diferentes individuos, constituye la herramienta más importante de identificación forense y diagnóstico ofrecida por los micro-satélites

MICROSATELITES

Los polimorfismos de LONGITUD son losmás comunes en el ADN repetitivo, ypueden ser:

* Inserción: uno o más nucleótidos.* Deleción: uno o más nucleótidos.

Usualmente la inserción y la deleción ocurren según el número de nucleótidos de la repetición, es decir por unidad de repetición.

MICROSATELITES SIMPLES → * Repeticiones contiguas e idénticas * Unidad repetitiva dinucleótica, flanqueda por

una secuencia de nucleótidos diferente a la repetición.

TCGATATATATATCAG COMPUESTOS → * Repeticiones contiguas diferentes, de baja

heterogocidad, flanquedas por secuencias distintas a la repetición.

TCGAAAATAAAAATACAG COMPLEJOS →• Repeticiones de longitud y secuencia variable,

con una alta tasa de mutación. TCGAAAGTAGAAAGTAGTCTC

MICROSATELITES

Los diferentes alelos se generan por el número de repeticiones →

SECUENCIAS DISPERSAS ADN moderadamente repetitivo Hay dos familias: LINES (Long interspersed nucleotide

elements) y SINES (Short interspersed nucleotide elements)

Representados en humanos por los elementos L1 y Alu respectivamente.

Se considera que son elementos retrotransponibles: pueden replicarse vía una copia de ARN reinsertada como ADN mediante transcripción reversa.

Papel en función genómica y en evolución. Posiblemente tiene un origen proviral, especialmente los

LINES: retrovirus insertado en el genoma que quedó inactivo.

Pruebas de Filiación

Qué son las pruebas de filiación y para qué sirven ?

Serie de pruebas biológicas destinadas a realizar la identificación de uno de los progenitores, partiendo del estudio del otro y del hijo cuestionado, abuelos, presuntos tíos, identificación materna, presuntos hermanos paternos biológicos.

Establecer relaciones familiares y paternidad en casos de delitos como la violación, el aborto, el cambio de bebe en los Hospitales, el secuestro y la identificación de restos humanos entre otros.

Tarjetas FTA Matriz cargada positivamente No hay cuantificación.

Área de extracciónCalidad y aseguramiento

Cabina de flujo laminar

Pipetas debidamente calibradas y uso de puntas anti-aerosol

Trabajo en parejas

Equipo de protección

DNA cadena templado

Forward primer

Reverse primer

Amplificación con sets de primers específicos en multiplex P C R

Cómo se detectan las Short Tandem Repeats (STRs) – microsatélites ?

7 repeats

AATG

8 repeats

170 bp170 bp195 bp195 bp

Diferentes sets de primers generan difentes productos de PCR

TCAT repeat unitTCAT repeat unit

Cuáles son las características de la PCR multiplex para microsatélites ?

Amplifica hasta 16 marcadores a la vez Niveles de sensibilidad > 1 ng of DNA Diferentes Fluorescencias Usadas para distinguir

STR with rangos de tamaños que se sobrelapen.

ABI Prism 3100 Equipo analizador genético

Electroforesis de capilarSet de 16 capilares

Corrido electroforético capilar, en acrilamida,Determinación de perfilesAnálisis de bandas por tamaños y fluorescencia

Cómo lee los amplificados en el equipo 3100 ?

Electroforogramas Con ladder

Power Plex 16 Genotipificación Power Plex 16 Genotipificación (mujer) (mujer)

3 sistemas genéticos, uno exclusión3 sistemas genéticos, uno exclusión

Genotipificación (trio) Genotipificación (trio)

Presunto padre: 11, 12Madre: 13, 14Hijo: 12, 13

Cómo se determinan los AOPs ?

AOP = 12

Comparando los alelos del hijo con los de la madre, se establece el alelo heredado de la madre y por descarte el paterno

DIVERSIDAD POBLACIONA

L

Por qué se requiere de cálculos estadísticos ?

Cada grupo tiene diferente frecuencia de sus alelos

Población de

ReferenciaMuestreo poblacional

13 Loci STR 13 Loci STR

La frecuencia de los alelos de un sistema son típicas para cada población

STRs Frecuencias alélicas

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

6 7 8 9 9.3 10

Pob. Caucasica

Pob. negra

Pob. Hispanicas

HUM-TH01

*Proc. Int. Sym. Hum. ID (Promega) 1997, p. 34

Alelos: # de repeticiones

Fre

qu

enci

as

ADN

Que tan probable es que sea el padre una vez se ha demostrado que posee todos los

AOPs.

En qué consiste el Cotejo de paternidad ?

Contrastar los resultados obtenidos con dos hipótesis

CALCULOS PROBABILISTICOSSI HAY NO EXCLUSION SE REALIZAN

La primera hipótesis: X Es que ese trio o ese caso sea verdadero.

La segunda Hipótesis: Y

Asumimos que el padre puede haber sido otro individuo dentro de la población que tenga el mismo alelo obligado paterno, del individuo que estamos analizando.

Cómo encontramos el X ?

Asumimos un cruce mendeliano: PP MADRE HIJOD8 10,11 13,13 11,13

Posibles Hijos de esta pareja: 10, 13 11, 13

10, 13 11, 13

1 3

10

13

11

10,13

11,13

Cómo la encontramos Y ?

PP MADRE HIJO AOPD8 10,11 13,13 11,13 11

Y = 1(frecuencia del AOP, dentro de la población).

INDICE DE PATERNIDAD

Indice de paternidad IP = X / Y

Probabilidad de paternidad W = X/(X+Y)

X: probabilidad de que el presunto padre sea el padre del menor en cuestión

Y: Probabilidad de que el presunto padre sea cualquier individuo tomado al azar en la

población

Cómo se informan los resultados ?NO EXCLUSION

Se observa que PP posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debería tener el padre biológico de la menor H. Se calculó entonces la probabilidad que tiene de ser el padre biológico comparado con otro individuo tomado al azar en la población de la región Andina de Colombia.

CONCLUSIÓN: PP no se excluye como el padre biológico de la menor YYYYYYY. Probabilidad de Paternidad: 99.99999%. Es 26658202,74 veces más probable que XXXXX sea el padre biológico de la menor H a que no lo sea.

EXCLUSION

Se observa que PP no posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debería tener el padre biológico de la menor H en DOCE (12) de los sistemas genéticos analizados: D21S11, HUMCSF1P0, D3S1358, HUMTH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, HUMVWA31, D18S51, D5S818 y HUMFGA.

 CONCLUSIÓN: PP queda excluido de la paternidad de la menor H.

Casos simples: PP, M, H ó Presunto Padre fallecido - ADN extraído de sus restos óseos.

Cuáles son los casos que normalmente se procesan para

pruebas de filiación ?

Determinar todo los posibles genotipo de un hijo de esta

pareja de presuntos abuelos paternos

Posibles hijos

Caso complejo: PP no disponible. Presuntos Abuelos Paternos, Madre, Hijo

Deducir el perfil genético del presunto padre con los AOPs

de los hijos reconocidos.

Perfil genético del PP

Caso complejo: PP no disponible. Disponibles los hijos reconocidos del PP, Madre, Hijo

Cálculo de un índice de paternidad comparando

únicamente la frecuencia de los alelos compartidos

padre-hijo.

ResultadosPRUEBA DE Paternidad

DNA TEST

ResultadosPRUEBA DE Paternidad

DNA TEST

Caso complejo: Ausencia de uno de los progenitores.

Índice de paternidad o maternidad

Caracteristicas deseables de los Caracteristicas deseables de los STRS en la identificación ForenseSTRS en la identificación Forense

CASOCASO

Planteamiento del Problema:Planteamiento del Problema:

Establecer la filiación entre una Establecer la filiación entre una hija demandante con un presunto hija demandante con un presunto padre, se cuenta con madre padre, se cuenta con madre biológica.biológica.

RESULTADOS STR’s AUTOSÓMICOSRESULTADOS STR’s AUTOSÓMICOS

H AOP

PROBABILIDAD DE PATERNIDAD

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

Con los resultados obtenidos del análisis Con los resultados obtenidos del análisis de los STR’s autosómicos no es posible de los STR’s autosómicos no es posible excluir al presunto padre (excluir al presunto padre (PPPP) de ser el ) de ser el padre biológico de la hija padre biológico de la hija H.H.

IP acumulado es de : 127. IP acumulado es de : 127. 545,0257545,0257 W(Po:0.5) = 99.9992 %W(Po:0.5) = 99.9992 %

IP: Indice de PaternidadIP: Indice de PaternidadW: Probabilidad de PaternidadW: Probabilidad de Paternidad

Probabilidad de Paternidad - PW

SI HAY NO EXCLUSIÓN: la PW debe llegar a 99.99%, (considerando el valor de creencia a priori de paternidad 0.5)

SI HAY EXCLUSIÓN: Mínimo tres exclusiones, siempre se repiten el proceso desde la extracción de ADN. No hay necesidad de hacer cálculos de IP y/o PW.

RELACIÓN DE IP Y W

Un IP de 1000, implica una probabilidad de 99,9%, un IP de 10000, implica un W de 99,99%.

EN GENERAL EL GRAN RETO DE LA PRUEBA EN GENÉTICA FORENSE ES LA CORRECTA VALORACIÓN DE LA PRUEBA, SU CORRECTA COMUNICACIÓN A LOS TRIBUNALES Y EL CORRRECTO ENTENDIMIENTO POR ESTOS DEL SIGNIFICADO DE LA PROBABILIDAD

Angel Carracedo

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)

Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)

Definición: Los SNP o polimorfismos de un solo nucleótido.

Este cambio puntual en una

base del ADN puede presentarse por: Sustitución, inserción o deleción.

International HapMap Project

Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la población para ser considerada como un SNP.

Se estima que existen 5 millones de SNPs reportados y 4 millones validados a lo largo del genoma (Sobrino et al., 2005).

1. Los SNP son muy abundantes en el genoma humano y son la base de la individualidad genética.

2. Presentan un mayor potencial que los STRs para el desarrollo de sistemas múltiplex.

3. Su análisis permite aumentar el poder de discriminación.

4. Son muy convenientes para el análisis en equipos y plataformas de alta tecnología.

5. No presentan el fenómeno de bandas “stutters”, por lo que permite discriminar mas fácilmente si una muestra es de origen único o proviene de una mezcla.

Cuáles son las Características de los SNPs?

Dónde se localizan los SNP?

SNP cromosoma Y

SNP autosómicos

SNP ADN mitocondrial región codificante y región control

Genoma Humano

Para qué sirven de los SNPs? Genética Medica: Diagnóstico de enfermedades y

respuesta farmacológica para tratamiento con medicamentos - cáncer, la artritis, Alzheimer, diabetes, las enfermedades autoinmunes o las cardiovasculares.

Alzheimer: gen para la apolipoproteína E (ApoE). Contiene dos SNPs que resultan en tres posibles alelos

que son: E2, E3, y E4. Cada alelo difiere por una base y el producto de cada alelo difiere por un aminoácido. Cada individuo hereda un alelo de ApoE de la madre y otro del padre. Individuos que heredan al menos un alelo E4 tienen una alta probabilidad de padecer la enfermedad.

Aplicaciones de los SNPs Genética Forense: Análisis de SNPs de cromosoma Y (Ej.

mezclas en casos de delitos sexuales), SNPs de ADN Mt (útil en muestras degradadas como restos óseos antiguos, pelo sin bulbo, muestras con escaso DNA, alto numero de copias de ADNmt por célula). SNPs Autosómicos pruebas de paternidad o identificación humana.

Genética de Poblaciones: Las mutaciones son grabadas en la molécula y transferidas de generación en generación como una huella genética en la historia de la evolución.

Haplotipo de ADNmt: Secuencia de marcadores o alelos en un mismo cromosoma.

Haplogrupo de ADNmt: Grupo de haplotipos que tienen un mismo motivo (motif) y comparten un ancestro común.

Por qué es importante el ADN Mitocondrial en identificación humana?

- Región Control (No codificante)

Región Codificante

HV I HV II

16024-16365 73-340

Es una molécula circular Posee 16.569pb.

Se localiza dentro de la matriz de la doble membrana de la mitocondria.

La Región Control es responsable de la

regulación de la replicación y transcripción.

La región codificante es donde se encuentran todos sus genes y mide 15.447pb.

No recombinación

Usualmente varían entre el 1-2% de las secuencias de ADN mitocondrial de individuos no relacionados en esa región hipervariable

Transmite línea materna

Alto número de copias por célula:

250-1000

Alta tasa de mutación:5-10 veces mayor que el ADN

nuclear

Por qué es importante el ADN Mitocondrial en identificación humana?

Investigación biológica de la maternidad Criminalística: el rendimiento del estudio de ADN

mitocondrial frente al nuclear en el caso de muestras difíciles es manifiestamente superior debido a su mayor cantidad y a la más elevada posibilidad de que alguna copia esté conservada.

Identificación de restos humanos y razas

Los SNPs son detectados comparando la secuencia de la Región Control que interesa con la Secuencia de Referencia de Anderson (1981)

Por qué es importante el ADN Mitocondrial en identificación humana?

SNPs de ADN Mitocondrial

Amplificación y Secuenciación directa de los fragmentos de interés

ADN mitocondrial: Interpretación y valoración de resultados

ADN mitocondrial: Interpretación y valoración de resultados - Heteroplasmia:

El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, en un individuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no es así siempre y por el contrario a lo que cabría esperar podemos encontrar individuos en los que coexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamos heteroplasmia

La teoría de bottleneck o cuello de botella

La teoría de bottleneck o cuello de botella

Un número de genomas de ADNmt se reduce a un número relativamente pequeño durante un paso de la oogénesis.

Este subgrupo de la población de moléculas de ADNmt es trasmitida por el proceso de bottleneck, y esta población fundadora se replicará hasta producir aproximadamente 100.000 copias de ADNmt en el óvulo maduro.Este subgrupo, podría por tanto, contener una población homogénea de moléculas de ADNmt o una población heterogénea de genomas mitocondriales.La mezcla transmitida puede manifestarse presentando diferentes proporciones entre las distintas poblaciones de genomas mitocondriales para distintos descendientes y/o a lo largo de diferentes genes

La secuencia de una muestra problema es inequívocamente diferente de una muestra de referencia, es decir, al menos se presentan dos puntos de discrepancia diferentes, en este caso podemos excluir que el cabello proceda del sospechoso.

Ambas muestras presentan numerosas discrepancias con respecto a la secuencia deAnderson, concretamente 6 para MD y otras 6 discrepancias para MR, a su vez entrelas muestras MD y MR existen 8 puntos discrepantes entre ambas muestras.

La muestra dubitada, pelo (MD), como nuestra muestra de referencia, sangre del sospechoso (MR), presentan los mismo puntos de discrepancia con respecto la secuencia de Anderson y por tanto coinciden entre si nucleótido a nucleótido. En este caso no podemos excluir que dicho pelo pueda proceder del sospechoso. Será obligatorio en este caso de coincidencia evaluar el peso de dicha coincidencia.

Métodos para el Análisis de SNPs

Pirosecuenciación Plataforma LightCycler

(Roche). Sistema Microarray DNA

microarrays D-HPLC , Espectrofotometría

MALDI-TOF. Genotipificación TaqMan

(Applied Biosystems) Análisis de Curvas Melting

usando DASH. Detección de Productos de

extensión de Primer basada en Electroforesis tales como: SNaPshot.

Primer Extension Analysis: SNaPshot kit

1. Se basa en el uso de primers específicos (sin marcar) adyancentes a la base a determinar.

Análisis de SNPs

SNP

Molde

Primer

Figura 1. Diseño de Primer para SNaPshot.

Primer Extension Analysis: SNaPshot kit 2. Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 dideoxinucleótidos (ddNTP) marcados

cada uno con un fluorocromo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado y purificado (pueden ser uno o varios los moldes a analizar en una sola reacción de SNaPshot)

DNA MOLDE PURIFICADO

Figura 2. Reacción de Primer Extensión (Kit SNaPshot).

Primer Extension Analysis: SNaPshot kit 3. La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de

polimorfismo y el genotipo.Color=Genotipo

Azul: G

Rojo: T

Verde: A

Negro: C