Genomanalyse

Was ist das?

Was ist ein Genom?

Genom was wofür

Zelle Chromosomen essentiell, nur ProkaryontenKern Chromosomen essentiell, Eukaryonten

autonome Elemente extrachromosomal spezielle Zweckevervielfältigte Elementez.B. RNA PalindromPlasmide Bakterien,

auch in EukariaMito- reduziertes bakterielleschondrion Chromosom fast alle EukaryontenPlastid reduziertes bakterielles

Chromosom photosynthetischeEukaryonten

Wie begreife ich einen Organismus?

TranscriptommRNA Häufigkeiten in Abhängigkeit von externen BedingungenESTs, Chip-Technologie

ProteomProteinmuster in Abhängigkeit von externen Bedingungen2D Gele, Massenspektroskopie, Interaktionen

Genomstatische zelluläre InformationsquelleSequenzierung, Arrays zur Variationsdetektion, Bioinformatik,vergleichende Genomik, Evolution

Voraussetzungen für die Genom- Analyse

SequenzDatenbanken

organismusspecifischrepetitive Elemente, ESTs

andere QuellenProteine, Domänen, Klassifizierungen

AnalysewerkzeugeGen-, Promotor-Vorhersage

Funktionale Analyseknockouts, reporter gene assays, etc.

Die Erstellung der Sequenz

1. Shear clones2. Clone fragments3. Sequencing4. Assemble sequences clone by clone

6. order overlapping clones7. Definition and analysis of gene models

Fertige annotierte Sequenz

Produktion

Assemblierung

Annotation

Kartierung

Rekonstruction

5. Proofreading

sequence ready map

Assemblierung

Organismus Spezifische DatenbankenFür die Genanalyse

EST BibliothekenQuelle

-vegetative Kulturen -specifische Umweltbedingungen

Bewertungen für-Genstrukturen-Häufigkeiten

Für die GenomstrukturanalyseRepetitive ElementeQuelle

-genome survey SequenzenBewertungen

-Genfamilie oder repetitives Element?

Genom-Analyse-Möglichkeiten

BasenzählenNukleotidzusammensetzung, Ungleichgewichte, Motive

GenvorhersageErkennen von Gensignaturen (geneid, genemark, genscan, xgrail, etc.)

Promotorvorhersagentransfac Datenbank, phylgenetisches shadowing + footprinting

KlassifizierungGO, COG, manuelle Zuordnung entsprechend der Funktion

Vergleichende Genomik Gen für Gen, Phylogenie, Syntenie, Genursprünge

Generkennung - Signale

Genmodell

optional: Suche nach Ähnlichkeiten in Gen-Datenbanken

DNA Sequenzpositionale Basenpreferenz Schwellenwert

Splicesignale A A A A A A A A A A A AD D D D DD D DD D AORFsstart und stop

Klassifizierung

Baumstruktur

Enzym

Kinase

Serin/Threonine K.

S/T k. für Protein X

Probleme bei der Klassifizierung

ungenügende Funktionsbeschreibungmehr Experimente!

multifunktionale Proteinekeine einfache Baumstruktur vorhanden

individuelle Domänenkombinationenjeder Organismus hat eigene Funktionszusammenhänge

die Beschreibung ist abhängig vom Kontextverschiedene Definitionen müssen für ein und dasselbe Protein erstellt werden

Karten von Stoffwechselwegenhttp://www.genome.jp/kegg/kaas

automatische Visualisierung von Soffwechselwegen

weiß=nicht vorhandengrün=vorhanden

KEGG=Kyoto Encyclopedia of Genes and GenomesKAAS=Kegg Automatic Annotation Server

Funktionale Analyse

was wie warum

Transcriptom GenregulationExpressionsanalyse/MicroarraysDefinition von Regulationseinheiten

Proteom2D Gele, Proteinarrays Proteinregulation

und Modifikation2 und 1hybrid Systeme Protein/Protein und

Protein DNA InteraktionenMassenspektrometrie

Reverse Genetikknockouts Phänotype-FunktionskorrelationReportergene GenregulationGFP-fusionen Proteinlokalisation

Stoffwechselwege

Tabellarischer Überblick

Welche Wege gibt es?Wieviele Proteine sind beteiligt?Einteilung in Großkategorien

Das Konzept Modellorganismus

Modell- Definition:Der Organismus ist beispielhaft für eine Eigenschaft, Funktion oder phylogenetische Position

deshalb können theoretisch alle Spezies Modelle für irgendetwas sein

sehr wichtig: wie weit können Ergebnisse, die an der einen Spezies

gewonnen wurden, auf andere übertragen werden?

Eukaryotische Phylogenie[adaptiered von Baldauf et al. (2000) Science 290, 972-977]

Modellorganismen

Saccharomyces cerevisiae einzelliger Eukaryont

Dictyostelium discoideum Signaltransduktion,Zytoskelett signalling, Mehrzelligkeit

Caenorhabditis elegans einfachster Mehrzeller (Tiere)

Chlamydomonas reinhardtii ‘grüne Hefe'

Arabidopsis thaliana die Modell-PflanzeDanio rerio Vertebrat

Fugu rubripes "

Rattus rattus Säugetier

Mus musculus "

Homo sapiens Primat

Projekte

de novo GenomanalyseSequenzierung, Assemblierung,Bioinformatik

funktionale Analysenknockouts, Phänotypbeschreibungen

vergleichende GenomanalyseSequenzierung, Assemblierung,Bioinformatik

Organismen

niedere Eukaryonten

DictyosteliumGenomanalyse‚functional genomics‘vergleichende Genomik

AlgenEST Analysen

Mesostigma virideFlagilaropsis cylindrica, etc.

Genomcharakterisierung verschiedene Arten

Bakterienvergleichende GenomikBorrellia und LegionellaCyanobakterien

Dictyostelium discoideum

Frei lebende amöboide Lebensform

Multizelluläres Lebensstadium

Gut definierte und erforschte Physiologie und Genetik

Molekular manipulierbar, Methodenspektrum vergleichbar mit Hefe

Dictyostelium discoideumVegetativer Lebenszyklus

Voraussetzungen, den Zyklus zu

beginnen

Dunkelheit

Trocken

Das Genom von D. discoideum

34 Mb genomische DNA

sechs Chromosomens ( ~4 bis ~8 Mb)

90 kb rDNA Palindrom (~100 Kopien/Zelle)

55 kb mtDNA (~200 Kopien/Zelle)

Die Chromosomenstruktur

coding density = diameter of the chromosomeblue bands = complex repetitive elements, red bands = tRNAsblack bands = gapscurve above the chromosome = GC contentgreen marks = HAPPY marker expression during development = red (up regulated) und blue (down regulated)duplikation = hourglas

Interpro Domänen

DomainIPR001687IPR000694IPR000561IPR000719IPR002290IPR001245IPR001680IPR003593IPR000051IPR001849IPR002048IPR001841IPR002085IPR000794

DescriptionATP/GTP-binding site motif A (P-loop)Proline-rich region EGF-like domainEukaryotic protein kinaseSerine/Threonine protein kinaseTyrosine protein kinaseG-protein beta WD-40 repeatsAAA ATPase superfamilySAM nucleotidebinding motifPleckstrin homology (PH) domainEF-handRING fingerZinc-containing alc. dehyd. superfamilyBeta-ketoacyl synthase

DD6.07%3.72%2.18%1.93%1.89%1.71%1.11%1.11%0.89%0.89%0.86%0.82%0.82%0.79%

SC0.57%NA0.02%1.91%1.83%0.05%1.63%0.95%0.33%0.47%0.26%0.65%0.34%0.03%

AT0.61%NA0.16%4.07%3.34%1.84%1.02%0.90%0.40%0.12%0.85%1.82%0.15%0.02%

CE0.32%NA0.68%2.34%1.33%0.84%0.80%0.40%0.25%0.41%0.65%0.81%0.06%0.02%

DM0.46%NA0.62%1.79%1.22%0.65%1.31%0.56%0.28%0.54%0.93%0.85%0.07%0.03%

HS0.33%NA1.28%2.64%1.83%1.22%1.34%0.46%0.20%1.24%1.15%1.20%0.08%0.01%

‘Krankheitsgene’ in Dicty

Human Disease Gene Dd Gene P value Description Dm P Ce P Sc PHNPCC*-MSH2 JC1a91d04_r1_g3 0.0 homolog of S. cerevisiae Msh2p 0.0 1.0E-113 0.0Renal Tubul. Acidosis-ATP6B1 JC2c54h07_s1_g0 0.0 H+-ATPase beta 1 subunit [Homo sapiens] 1.0E-138 0.0 0.0Immunodeficiency-DNA Ligase 1 JC2d28h12_r1_g6 1.0e-174 DNA ligase I [Homo sapiens] 0.0 1.0E-167 1.0E-146Hyperinsulinism-ABCC8 JC2a33e08.s2_g0 1.0e-165 Sulfonyl urea acceptor 1 1.0E-160 1.0E-160 1.0E-176Fam. Cardiac Myopathy-MYH7 JAX4a36e06_s1_g1 1.0e-161 Myosin heasvy chain cardiac muscle beta form 0.0 0.0 0.0G6PD Deficiency.-G6PD JC2f25a03_r1_g2 1.0e-147 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.0 1.0E-176 1.0E-125Deafness, Hereditary-MYO15 JC2b107f11_s1_g1 1.0e-142 unconventional myosin-15 [Homo sapiens] 0.0 1.0E-161 1.0E-133Chediak-Higashi-CHS1 JC2b375c04_r1_g3 1.0e-123 beige protein homolog; Lysosomal trafficking reg. 1.0E-141 1.0E-107 3.0E-75Darier-White-SERCA JC2b198d10_s1_g1 4,00E-98 Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2 0.0 0.0 1.0E-117HDL Deficiency 1-ABCA1 JAX4a196c02_s1_g0 6,00E-90 ATP-binding cassette, sub-family A member 1 1.0E-127 1.0E-103 7.0E-13BLM JC2b73g03_s1_g1 5,00E-88 DNA ligase I [Homo sapiens] 1.0E-148 1.0E-120 1.0E-109Marfans-FBN1 JC2a205h12_r1_g1 4,00E-87 Fibrillin 1 precursor 1.0E-171 1.0E-104 5.7E02Niemann-Pick-NPC1 JC3a31c02.p2_g18 3,00E-80 Niemann-Pick C disease protein 0.0 1.0E-147 1.0E-159Tay-Sachs-HEXA JC2b193a06_s1_g1 1,00E-77 Beta hexosaminidase alpha chain precursor 1.0E-57 6.0E-99 8.3E00AKT2 JC2b105b05.p1_g16 6,00E-75 Protein serine/threonine kinase 1.0E-179 1.0E-162 3.0E-85

10 von 31 nicht in Hefe : 32%

1 von 31 nicht in C. elegans: 3.2%

Ähnlichkeitsverteilungen

Selektive Genverluste tragen zur Speziation bei

Metazoa Gene auch in D. discoideum vorhanden

ZytoskelettPhago- und Pinocytose, Beweglichkeit

extrazelluläre MatrixZell-Zell Kontakte

SignaltransduktionskomponentenZell- Zell Kommunication

viele Gene ohne definierte Funktion!

Reverse Genetik in D. discoideum

Welche Gene?

ähnlich zu Metazoa-Genen, aber keine Gegenstücke in Pflanzen oder Hefen

Welche Methoden?

GFP Vektor für die Lokalisierungknockouts für Phänotyp-Screens

Zusätzliche Daten

Microarray Experimente

Vergleichende Genomik in sozialen Amöben

Vergleichende Genomik - Basen

rot = mitochondrialblau = genomischschwarz = Palindrom

IV IGruppe

selbst in nahe verwandten Arten gibt es dramatische Unterschiede in der Basenzusammensetzung

Vergleichende Genomik - Trends

Gruppe

IV

III

II

I

Abnahme G/C Gehalt

Zunahme an Transposons

Zentromer und Telomerveränderungen

Amplifizierung von mitochondrialer und Palindrom DNA

Bakterielle GenomikDatenbanken für den Genomvergleich

Bakterielle GenomikGenomvergleichsmethoden

Bakterielle GenomikBorrelia burgdorferi sensu lato

vergleichende Genomik zur Auffindung krankheitsrelevanter Faktoren

B. garinii isoliert aus HirnflüssigkeitPBI niedrige PassagePBI 300 hohe Passage

B. afzelii HautisolatPKO niedrige PassagePKO72 hohe Passage

Passagen sind Kulturbedingungen, unter denen kein Selektionsdruck auf den Organismen liegt.

Die Folge ist der Verlust der Pathogenität

Bakterielle GenomikPlasmide

Spezies zirkulärePlasmide

lineare Plasmide Fragmente

B. garinii cp28; cp29; cp31

lp21-1; lp21-2; lp22; lp24; lp28; lp50; lp54; lp59

6 kb

B. afzelii cp27; 8x cp30

lp25; lp28; lp32; lp34; lp60-1; lp60-2

6 kb; 8 kb; 15 kb

Komplett kolineare Plasmide in allen Spezies fett gedruckt

Bakterielle GenomikUnterschiede zwischen hoher und niedriger Passage

4215 17

4443

niedrig hochI II III I II III

III III

Es fehlt in beiden untersuchten Spezies ein Oberflächenantigen

B. garinii

Toxische Algen

EST Projekte

Viele Algenspezies sind wichtig für die UmweltO2 ProduktionEnt- und VergiftungErnährungsgrundlage

toxische AlgenAlgen im evolutionären Kontext

Mesostigma viride, Paulinella

Algen

Physarum polycephalumvergleichende Genomik in AmoebozoaGenstrukturanalysen (das Genom wird gerade sequenziert)

END