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1. M édico Oncólogo C línico.. . . G erente M édico L abora torios Roche .

2. M édico Internista N efrólogo. Profesor de medic ina U N M S M. . .y D irector médico de L aboratorios Roche .

Tema de revisión

Genómica y proteómica: Un paso más

F ranklin A ldecoa Bedoya1 y C arlos Battilana G uanilo2

Genomics and proteomics: one further step

RESUMEN

I N T R O D U C C I Ó N

E n e l a ño 2001 l a hum a n i d a d f u e t e st i go d e unacontecimiento que acaparó la atención no solamente det odos l os m e d i os d e c omun i c a c i ón , s i no d e l a sorgani z a c iones c i ent í f i c as , gremios prof es iona l es ,instituciones, etc. La noticia se esparció rápidamente hastae l último confín de l planeta: se había completado lasecuenciación del genoma humano1. Desde que se inicióel desarrollo de la genética con Mendel, la influencia deesta área fue grande, pero contribuyó en los cuidados dela salud de pocas personas, la mayoría no tuvo el beneficiodirecto de la genética2. La percepción que actualmente setiene de la genómica es mucho más ambicioso, ya queésta descansa en e l acceso experimenta l directo de lgenoma total y su aplicación a condiciones comunes queincluyen muchos millones de personas en el mundo:cáncer, SI D A , tuberculosis, enfermedad de Parkinson yde A lzheimer entre otras patologías.

En la presente publicación pretendemos dar una miradamuy rápida y superficial a los aspectos que se relacionandire c t ament e con e l desarrol lo de l a genómi c a yproteómica; no podemos abarcar cada uno de los tópicosen forma completa, porque la cantidad de informaciónen cada una de sus partes es compleja y desbordante.

Iniciamos con una visión histórica de los eventos quecondicionaron la evolución del conocimiento de los geneshac ia e l descubrimiento de la estructura de l A D N ,acontecimiento que sin duda es una de las piedras angularesen la rápida y sorprendente secuenciación de la informacióngenética de una serie de organismos, hasta llegar al serhumano. Inmediatamente, incidimos en los procesosbásicos para generar la información genética y que durantemuchos años fue e l “dogma centra l de la biologíamolecular”; la simplificación de estos procesos no essencilla y muchos de los aspectos finos no son tomadosen cuenta, por lo cual resultan decididamente incompletos.La derivación del conocimiento científico a la forma aplicadapodrá evidenciarse a través de una somera revisión dealgunas de las principales tecnologías sobre las cuales sebasan actualmente la genómica y proteómica, las cualesapuntan a ser de notable ut i l idad, cuando a l f ina l ,

ABSRACTEl desarrollo de la genómica y proteómica descansan sobre losdescubrimientos fundamentales que constituyen hitos históricossin los cuales no hubiera sido posible el hallazgo de nuevosparadigmas, teorías, tecnología, que han cambiado drásticamenteel enfoque de la ciencia médica. El descubrimiento de la estructuradel ADN y sus funciones básicas: replicación, transcripción ytraducción, asociadas a la manipulación del material genéticocelular a través de las enzimas de restricción, ligasas, polimerasas,secuenciación de las bases nucleotídicas, nos llevaron a laingeniería genética, el develamiento del genoma humano, lacreación de nuevas herramientas para el estudio y diagnostico delas enfermedades, como el PCR (reacción en cadena de lapolimerasa), microarray, y al mejor entendimiento acerca delcomportamiento de nuestro organismo frente a los medicamentos(farmacogenómica). Ahora nos toca un reto superior: entendermejor el comportamiento de las proteínas como elementos básicosde vida, el alfabeto a través del cual el DNA genera vida. Estosnuevos conceptos traen consigo nuevas responsabilidades,problemas éticos y morales y obviamente la necesidad de unanueva legislación para este desarrollo.Palabras clave: proteómica, genómica, geneterapia, biologíamolecular, clonación.

T h e d e v e l opm e n t o f g e nom i c s a nd pro t e om i c s d e p e nds onfundamenta l discoveries that resulted in new paradigms, theoriesand technologies, that have drastically changed the focus of medicalsc i enc es. T he discov ery of the struc ture of D N A and the bas i cfunc t ions of repl ica t ion, transcript ion and transla t ion, assoc ia tedto the manipulation of cel lular genetic material through restrictionenzymes, ligases, polymerases, nucleotide base sequences, etc., leadus to gene t ic engineering, the disc losure of the human genome ,the creat ion of new tools for the study of diseases and diagnosis,such as PC R (Polymerase Chain Reaction), microarray technology,and the better understanding of the behav ior of our organism inre l a t i on to me d i c a t i on (pha rma c oge nom i c s) . N o w w e ha v e agreater cha l lenge: to improve our understanding of the behav iorof prote ins as basic e lements, the machinery through which D N Agenerates life. These new concepts carry new responsibilities, bringup e th i c a l a nd mor a l prob l e ms a nd th e n e e d f or a ppropr i a t el egisl a t ion for the ir de v e lopment .K ey words: porteomic , genomic , genotherapy. molecular biology,C loning.

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la experiencia y simplificación lleven estas tecnologías alconsultorio médico.

El otro aspecto que enfocamos, es el contexto terapéutico:¿Cómo influirán los nuevos conoc imientos sobre lasposibilidades de búsqueda de nuevos lineamientos y blancosterapéuticos?; existen ya algunos nuevos medicamentos quehan roto los moldes tradicionales de enfocar el tratamiento ya futuro esperamos mayor progreso; pero además, debemosentender mejor, qué sucede con la variación farmacocinéticay farmacodinámica de muchos de los medicamentos queactualmente disponemos, en el contexto de la variabilidadgenética de cada persona.

Posteriormente , abrimos una pequeña v entana paraexplorar algunos nuevos conceptos de la proteómica, áreamás reciente y con mayores dificultades por diferentesr a z on e s , mu y r á p i d a m e n t e e sbo z a d a s a qu í , qu econstituyen un verdadero reto para los investigadoresactua les y para aque l las nuevas generac iones que seintroduzcan en esta importante arista de la biología. Lafuncionalidad de las proteínas es ampliamente conocidapor los médicos, sin embargo, muchas func iones nopuede ser pre v is ibl es por los a c tua l es s istemas deinforma c ión, debido a l as di f erentes v ari abl es quecondicionan este comportamiento. Finalmente, se registraun a l i s t a d e l a s pos i b i l i d a d e s d e l a l c a n c e d e l ainvestigación genómica a futuro: ¿Qué debemos esperaren los sigui entes años en re l ac ión a l conoc imi entogenómico?, ¿Cuál es la orientación de la investigaciónc i ent í f i c a?, ¿ C ómo inf luenc i ará sobre los aspe c tosbiológicos, en la salud y en la sociedad?; preguntas queobviamente solo el tiempo podrá determinar.

B ASES M O L E C U L A R ES D E L A G E N É T I C A

1. Los hitos históricos más importantes del A D N

Juan Gregorio Mendel, un monje agustino alemán (1822-1884) es el padre de la genética. Utilizando el Pisum sativumo guisante de color hizo probablemente la contribuciónmás grande de la iglesia a la ciencia. La planta elegida porMendel se autofecunda obligatoriamente, y su polen, encondiciones normales, no puede alcanzar el estigma deotra flor. Sin embargo, abriendo la flor inmadura y retirandol a ant era que proporc ionarí a e l pol en y cubri endoposteriormente el estigma con polen de otra planta condist intas característ icas, se produce una fecundac iónabsolutamente experimental, cruzada, y controlada. Lasconclusiones finales de sus estudios se conocen comolas leyes de la genética de Mendel, son el modelo teóricosobre las cuales se basa aún mucho de lo que sabemosactua lmente en la transmisión de los caracteres porherenc i a 3,4. E n 1902 Wa l ter Sut ton, corre l ac ionó l aasociación de los cromosomas maternos y paternos enpares y su posterior separación durante la división celular,con las leyes mendelianas de la herencia5.

Posteriormente Thomas Morgan encontró en 1910 que el

F ranklin A ldecoa Bedoya, C arlos B attilana G uanilo

rasgo del color blanco de los ojos podía transmitirse juntoa un factor que determinaba el sexo, en el cromosoma X dela mosca de la fruta (Drosophila)6, demostrando más tarde,que durante la meiosis existe un intercambio de materialentre cromosomas homólogos (crossing-over) y que laprobabilidad de un entrecruzamiento entre dos genesasociados, es proporcional a la distancia entre ellos en elcromosoma ; por t anto , cont ando l a fre cuenc i a deentrecruzamientos entre a le los de un par de genes esposible mapear aquellos genes en el cromosoma7 (Morganrecibió el premio Nobel en 1933 por este trabajo).

Basados en un experimento de Griffith en 1928, en el cualinfectando con Streptococcus pneumoniae a un grupod e r a ton e s e n l os c u a l e s l a b a c t e r i a c on c á psu l a(neumococo S) causaba la muerte en menos de 24 horas yque al usar la misma cepa de Streptococcus sin cápsula(neumococo R) no letal, asociada al neumococo virulentopreviamente muerto por calor, mataba nuevamente losratones, Avery, Mac Leod y McCarty condujeron en 1944su clásico experimento del “principio transformante” en elcual encontraron que el A D N purificado de las bacteriasletales S transformaban a las bacterias no virulentas R a laforma letal8. Hasta ese entonces la opinión mayoritaria eraque el A D N , aun siendo un importante constituyente delos cromosomas, era una molécula monótona y más bien“ estruc tura l ” , y que de ninguna manera podí a serportadora de la información hereditaria. Sin embargo, apesar de esta nueva evidencia, algunos suponían que dichainformación posiblemente venía de las proteínas asociadasa los cromosomas y se tuvo que esperar casi diez años,hasta que Hershey y Chase confirmaron el rol de A D N ensu clásico experimento con bacteriófagos de virus9.

En 1950 el bioquímico Erwin Chargaff demostró queaunque la composic ión de l A D N varia de espec ie enespecie (sobre todo en lo relacionado a la cantidad decada nucleótido), el número de bases adenina ( A ) era

F igu r a 1. G regor io M endel (1822-1884).Estableció su teor ía basándose en 3

principios: dominancia, segregación yorden independiente

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igual al de timinas (T) y el de citosinas (C) al de guaninas(G)10. Poco tiempo después Rosalind Franklin trabajandoen el grupo de Wilkins en Londres obtuvo una excelentefotografía por medio de la difracción de rayos X de lasfibras de L A D N . Sobre estos hallazgos Watson y Crickdedujeron que el A D N estaba formado por una doblehélice regular constituida por azucares (desoxirribosa)y fosfatos con las bases nuc leot ídicas en forma dep e l d a ños f orm a ndo e n l a c e s A - T y C - G 11.L amentablemente , Rosa l ind Franklin murió de unaenfermedad leucémica y no pudo compartir el premioNobel con Watson y Crick en 1962.

2. Dogma central de la biología molecular

L a t e or í a d e Wa t son y C r i c k f u e c ono c i d aposteriormente como el Dogma Central de la B iologíaMolecular, basado en que el A D N codifica los genes deun modo lineal estricto a través de un mediador: el A RN ,el cual es una plantilla para la síntesis de proteínas.

- 2.1. Replicación del A D N

En las células procariotas la replicación comienza en unpunto definido y avanza a la misma velocidad en ambasdirecciones hasta finalizar con la duplicación del materialgenético. En los eucariotas en fase S del ciclo celular seinic ia la duplicac ión en distintos puntos (replicones),en ambas direcciones. Sin embargo, en cada replicónla inserc ión de nuc leótidos es continua en la direcc ión5’-3’ , pero en la cadena antipara le la (3’-5’) se formapor segmentos pequeños (fragmentos de O kasaki) de1 000 a 2 000 bases; este proceso complicado implicamuchos compl e jos enz imá t i cos, que permi ten e ldesenrollar el A D N , regular procesos, como las ciclinasentre otros . L a repl i c a c ión semi conserv a t i v a fuedemostrada por M ese lsonn y Sta lh en 195812. Esteme c an i smo ha s i do e x p l o t ado en e l proc eso desecuenc i ac ión de l A D N ac tua l , usando compl e josenzimáticos bacterianos.

Genómica y proteómica: un paso más

- 2.2. T ranscripción

Para que l a c é lul a pueda usar l as instruc c iones del a informa c ión gené t i c a , ést a debe tras l adarse de lnúc l e o a l c i top l a sma , donde l a s pro t e í na s s e rá nconstruidas . E l A R N de t ipo mensa j ero ( A R N m) ese l intermediario, que rea l iza esta labor. E l A R Nm estaconformado por una c adena úni c a que no formadobl e hé l i c e , con mucha menos est abi l idad que e lA D N ( v i d a m e d i a e n m i n u t os ) . E l p r o c e s o d etranscripc ión es s imi l ar a l a repl i c a c ión de l A D N ,pero en la incorporac ión de nuc leót idos se reemplazal a t imina por e l ura c i lo . E l proc eso es comandadopor la enz ima A R N pol imerasa y solamente se copianse c tores que codi f i c an genes , dependi endo de l t ipoc e lul ar en l a cua l se l l e v e a c abo est e proc eso en e lt i empo . E st a f ase es muy compl e j a y a l igua l que l atranscripc ión t i ene v ari as enz imas que regul an sufunc ionami ento . L a e x ist enc i a en los euc ariot as del o s e x o n e s e i n t r o n e s c o m p l i c a a u n m á s e s t eproc eso; ahora sabemos que pueden e x ist ir v ari asformas de re cort e a est e ni v e l , de t a l forma que ung e n c on f orm a do por d i v e rsos e x on e s e i n tron e st i ene formas a l t erna t i v as de cort ado a ni v e l R N A m ,de t a l forma que un gen puede generar más de unt ipo de prot e ína 13.

- 2.3 T raducción

Para que un gen se a e xpresado e l A R N m debe sertraduc ido a prot e ína . E l probl ema era codi f i c ar 20di f erentes aminoá c idos, contando para e l lo con solo4 nuc l eót idos; no podí a haber una correspondenc i auno a uno , ni s iqui era uno a dos , e l número mínimodebi era ser a l menos 3 nuc l eót idos por aminoá c ido(codón), pero l as posibi l idades de combinac ión eran(4 x 4 x 4) 64 , d e l o qu e s e d e du j o qu e h a b í ase cuenc i as de codones redundant es o que e x ist í ancodones s in sent ido. E n 1961 N iremberg y M a t tha e idemostraron que un po l í mero s i n t é t i co de basesura c i lo , añadido a una me z c l a de ribosomas , A R N t( A R N de transf erenc i a) , aminoá c idos , AT P (comofuent e de energí a) y otras enz imas , daban origen auna prote ína monótona de f eni l a l anina , conf irmandoque e l tripl e t e U U U generaba di cho aminoá c ido14, apart ir de entonc es comenz aron a describirse nue vostr i p l e t e s l i ga dos a sus a m i noá c i dos re spe c t i v os ,const i tuy endose f ina lment e en 1964 l a t abl a de l ac l a v e g e n é t i c a . E l p r o c e s o d e t r a d u c c i ó n e sc a t a l i z ado por un e l emento mol e cul ar compl e jo: e lribosoma , e l cua l t i ene un A R N ribosoma l (R N A r) ypro t e í nas .

Tecnología en biología molecular y genómica

A part ir de l as observ a c iones de Wa tson y C ri c k ,l os c u a l e s d e du j e ron br i l l a n t e m e n t e qu e a mb a sc adenas de la doble hé l ice eran complementarias, unacadena sirve de plant i l la para la síntesis de una nuevacopia, reteniendo por tanto la información original. Estoexplica como la informac ión genética

F igura 2. En 1950 Rosal ind Franklin produjo esta fotografía delD N A por difracción de los rayos X , que fue uno de los puntos claves

en el descubrimiento de la doble hél ice.

A D N A R N P R O T E Í N ATraducción Transcripción

Replicac ión

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es guardada en los cromosomas y como pasa a unac é l u l a que est á en d i v i s i ón . Por t an to , s i ambasc a d e n a s c o m p l e m e n t a r i a s s o n s e p a r a d a s e n e ll abora torio por c a l ent ami ento (desna tura l i z a c ión) ,e l l a s p u e d e n v o l v e r a u n i r s e p o r l acomplementariedad de sus nuc leót idos. E ste procesode s e pa ra c i ón y nue v a un i ón e s c onoc i do c omo“ hibridi z a c ión ” y es l a pi edra angul ar de un granse c tor de l a t e cnologí a de l a biologí a mol e cul ar.

L a t e c no l og í a g e nóm i c a e s l a a p l i c a c i ón d e l aautoma t i z a c ión de l a t e cnologí a mol e cul ar bás i c a aun s ist ema para l e lo mas i vo . M e t a fóri c ament e , s i l abiologí a mol e cul ar prov e e l as opera c iones de cort e ,copi ado y pegado para un de t erminado t e x to (gen) ,l a te cnologí a genómi c a opera sobre múl t ipl es genesa l mismo t iempo13. Por tanto, para entender bien estanue v a t e cnologí a de a l to rendimi ento , es ne c esarioconoc er sobre l as t é cni c as de l a biologí a mol e cul arbás i c a .

3. T écnicas de la biología molecular

3.1. E nzimas de restricción (cortar)

Son enzimas que cortan el A D N . Son obtenidas de algunasbacterias que las usan como protección a invasión deA D N foráneo. E l primero en obtener y purificar estasenzimas fue Hamilton Smith a principios de los ‘7015. Estasenz imas reconocen secuenc ias espec í f icas de 4 a 8nucleótidos lugar donde producen el corte. Se conocenactualmente más de 400 diferentes tipos.

3.2. C lonaje del A D N (copiar y pegar)

Es un proceso mediante el cual se usan bacterias comohospederos, para insertar en su material genético o enlos llamados plásmidos un segmento de A D N de interésy hacer que dicha bacteria se replique ilimitadamente.Fue Stanley Cohen quien logró insertar plásmidos quetransportaban genes de resistencia a antibióticos de unabacteria a otra y posteriormente incluir material genéticode otras especies en bacterias16.

E l proceso comienza con el aislamiento de un fragmentode A D N de interés mediante las enzimas de restricción; almismo tiempo se aísla y abre el A D N circular de unplásmido con la misma enzima de restricción usada;inmediatamente se junta ambos materiales permitiendoque los fragmentos se peguen usando una A D N ligasa yse tenga un nuevo círculo de material plasmídico (plásmidoquimérico). Las bacterias se dividirán rápidamente con elconsiguiente aumento del gen insertado y la producciónde la proteína de interés dentro de la bacteria, la cual serápurificada para su uso posterior. Toda este proceso tieneel nombre de “ Tecnología del A D N recombinante” o“Ingeniería Genética”.

3.3. P C R: C lonación sin bacterias

Mediante esta técnica, múltiples copias de un segmento deA D N específico pueden producirse por amplificación,usando un sistema de síntesis consecutiva que no requierecélulas vivas. Esta incluye una serie de reacciones a partirde la enzima A D N polimerasa, por lo cual toma el nombre de“Reacción de la polimerasa en cadena” o PCR (iniciales eninglés). Mediante un segmento iniciador o “primer” denucleótidos complementarios a un extremo de la secuenciadese ada en una de l as c adenas , y otro ini c i adorcomplementario en el otro extremo de la otra cadena,lograremos insertar los nucleótidos complementariosmediante la polimerasa y obtener millones de copias delsegmento deseado en aproximadamente 20 ciclos. Mullislogró el premio Nobel por esta técnica en 199317.

La tecnología moderna de secuenciación del A D N estábasada en el método de interrupción controlada de lareplicación del A D N desarrollada por Fred Sanger en 1977,por el cual obtuvo el Nobel en 1980. Sanger combinó lamaquinaria de replicación natural de las bacterias cona lgo de tecnología A D N recombinante y bioquímicainteligente para crear un sistema de clonación in vitro.

1.4. M étodo de Sanger: Secuenciación del genoma

Usó nucleótidos especiales (dideoxinucleótidos) para

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F igura 3. Proceso de transcripc ión y traducc ión de l A D N .

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cortar la replicación una vez que aleatoriamente una deestas bases se asociaba al proceso. Para visualizar losdiferentes segmentos obtenidos eran radiomarcados yluego separados por e lectroforesis obteniéndose unaplaca radiográfica con la posición de acuerdo al tamañomolecular de los distintos segmentos de A D N generadosse podía colegir los nucleótidos en forma secuencial18.

4. Tecnología genómica

4.1. Secuenciación automatizada del A D N .

La primera gran innovación del método de Sanger la hizoLeroy Hood, al desarrollar nucleótidos fluorescentes quereemplazaron a los radioactivos en 1985. Estos podíanser medidos directamente en el gel de acrilamida por undetector laser; adic iona lmente , cada nuc leót ido fuemarc ado con un color dist into, lo cua l f a c i l i tó suidentificación. Luego Hood conectó el proceso a unacomputadora y fundó A pplied B iosystems, Inc. ( A B I)19.E n esenc i a todo e l Proy ec to G enoma H umano fuerealizado en máquinas de A B I. Sin embargo, uno de lasprincipales limitaciones del metodo de Sanger/ A B I, fueque solo podía secuenciar fragmentos de 500 a 800 bases.

4.2. Subclonación “shotgun ” .

E l proceso de secuenc iac ión de fragmentos grandesde A D N requería cortar con enzimas de restricc ión,ingresar la informac ión a plásmidos (subc lonac ión) yluego secuenc iar.

Para aumentar la f ide l idad, e l proceso era duplicado.Sin embargo, aparte de l t iempo consumido en ta lestareas, habían muchos errores en los extremos de losfragmentos que deberían empatar con su complemento.Teóricamente , si un fragmento de A D N es copiadomuchas veces, luego fragmentando en forma a leatoria( s u b c l o n a c i ó n “ s h o t g u n ” ) y p o s t e r i o r m e n t esecuenc iados, si se t iene una sufic iente cant idad demuestras , es pos i b l e re est ab l e c er nue v amen t e e lf r a g m e n t o o r i g i n a l a t r a v é s d e l o s e x t r e m o scoinc identes de cada minifragmento.

A mediados de los 90’ el Institute for Genomic Research( T I G R ) l o g r ó a u t o m a t i z a r t o d o e l p r o c e s o d esubc lonac ión “shotgun” y secuenc ió en un t i emporea lmente corto para la tarea , la secuenc ia completade l genoma de l H a emophi lus inf luenza e 20. C e l eraG enomics Corporation más tarde, desarrolló un sistemade secuenc iac ión basado en este princ ipio, con lo cua limpulsó la secuenc iac ión de l genoma humano y lograrobjet ivos más tempranos de los esperados21.

G E N E T E R A P I A

La aplicación más evidente de este tipo de terapia es lacorrecc ión de a lgún de f ec to úni co de un gen, quecorresponda a una enfermedad heredada. Lo racional esel reemplazo del gen dañado o alterado, por un gen normaltrasladado a través de una serie de vectores hacia elcontexto celular donde debiera funcionar. La introduccióndel material genético de reemplazo debe cumplir variospasos: atravesar la membrana celular, cruzar el citoplasmay llegar al núcleo donde debe generar transcripción. Dehecho cada paso implica muchos obstáculos que incluyenlos mecanismos naturales de protección del la célula contralos elementos extraños, sobre todo a nivel nuclear. Losvectores pueden ser clasificados como de tipo viral o noviral.

Se han he cho a lgunos tra t ami entos e xperiment a l esen enf ermedades como: l a de f i c i enc i a de deaminasade adenosina ( A D A ), en e l cua l ex iste una disfunc iónde los l infoc i tos T y B por acumulac ión de produc tostóx i cos deri v ados de l a ausenc i a de l a enz ima A D A ;f ibros is quíst i c a ( F Q ) , una enf ermedad heredi t ari are c es i v a en l a cua l e x i st e una mu t a c i ón de l genregul ador de conduc tanc i a transmembrana de l a F Q ,e l cua l e xpresa un c ana l de c loro a l t erado y cuy aprinc ipa l mani f est a c ión es l a cont inua inf e c c ión ani ve l bronquia l ; hipercolesterolemia fami l iar, la cua le s u n a e n f e r m e d a d h e r e d i t a r i a d o m i n a n t ec ara c t eri z ada por un de f e c to en e l gen que codi f i c ae l re c eptor para l ipoprot e ínas de ba j a dens idad ani v e l hepá t i co .

F igura 4. M étodo de secuenc iac ión de A D N . Sanger usó dideoxinuc leótidos en vez de los desoxinuc leótidos c lásicos, ya que a l usardideoxinucleótidos no se puede establecer el enlace con la siguiente molécula de desoxirribosa a nivel del C3 por el cambio de un Opor O H y se trunc a l a s ínt es is nuc l eot ídi c a , Por t anto de cons iguen dist intos fragmentos que v i a j arán dist into en un c ampoelectroforético y en base al lugar que ocupa cada fragmento dentro de la electroforesis podemos establecer la secuencia específica deun fragamento de D N A . Si llevamos esté método a una forma automática con participación cibernética, obtendremos los secuenciadoresactua les, que tanto ayudaron a que e l Proyecto G enoma Humano fuera esbozado antes de su objetivo fina l .

Genómica y proteómica: un paso más

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L os resul tados son aun irre levantes y la tox ic idadproducida en un par de casos, en uno de los cualeshubo muerte de l pac iente , han generado opinionesadversas22-24. Sin embargo hay algunas publicacionesmás recientes que muestran interesantes resultados enestudios experimentales en perros con hemofilia B 25,amaurosis congénita de Leber y en cáncer26.

T E C N O L O G Í A M I C R O A R R A Y

La base de la tecnología gene “array” radica en que ungran número de A D N de genes conocidos son pegadose n l a sup e r f i c i e d e un a m a t r i z d e p e qu e ñosmicroespacios (generalmente una laminilla de vidrio),sobre la cual se pone secuencias de A R N marcado,extraídas de algunas células de interés. D icho R N A seligará por hibridación RN A-D N A en la matriz. La cantidadde R N A marcado que se liga al D N A fijado a la matrizpuede luego medirse13. Los experimentos “array” sonsiempre conducidos comparando dos o más muestras ymiden la expresión genética, es decir la cantidad relativade R N A m a l momento de l estudio y puede o nocorre lac ionar con los nive les de transcripc ión y losniveles de proteína en la célula (pero, generalmentecorrelaciona bien).

El ensamblado robótico para utilización masiva del “array”toma el nombre de tecnología microarray; en un soloproceso se pueden evaluar miles de genes y es unaherramienta flexible para medir la expresión genética encualquier tejido del cual pueda aislarle el A R N . L asaplicaciones inmediatas de esta tecnología han sidobásicamente en investigación y desarrollo, enfermedad yrespuesta a drogas. Uno de los campos donde esta técnicapuede colaborar es la patología; existen muchas neoplasiasque difícilmente pueden tener un diagnóstico patológicoseguro, mediante el uso del microarray podría hacerse undiagnóstico más fino, incluyendo la posibilidad de agruparsubt ipos de cáncer dentro de una misma neoplasia(predicción de clase). Así por ejemplo Golub y colaboradoresusaron esta técnica para distinguir entre leucemias agudasde tipo linfático y mieloide27, A lizadeh estableció grupospronósticos en linfomas de células grande B, basados enel perfil de expresión genética28.

Asimismo, el pronóstico de otras enfermedades en el campooncológico podrían variar, como en el cáncer de próstata,en el cual muchas veces existen incrementos del antígenoprostático específico asociado a un proceso inflamatorioal que pueden diagnosticar como neoplasia sin serlo, einc luso, la eva luac ión de la agresividad en caso deneoplasia y la correlación con el tratamiento respectivo.Sin embargo, antes de que esta tecnología llegue a serampliamente usada en el campo clínico, aun se requierenalgunas consideraciones:

1. D ebemos est ar seguros que l o que est amosmidiendo es el material genético de las células quenos interesan y no de las células vecinas de soporteu otra estirpe.

2. En los casos de tumor, lo más probable es queestemos midiendo solamente una de las tantasvariaciones celulares del mismo tumor.

3. La medida del contenido de R N A m es indirecta ypueden haber varios factores de error en la prueba.

4. E xisten genes muy similares en su conformaciónqu e c omp a r t e n p a r t e d e su c ompos i c i ónnu c l e o t í d i c a (homo l og í a ) y podr í a n h a b e rrespuestas cruzadas.

5. L os genes indi v idua les pueden tener caminosa lternativos de corte, en e l momento en que e lR N A m conserva aun exones e intrones.

Figura 5. Hibridización de 6 genes humanos a través del “array deoligonucleótidos” GeneChip™. La tecnología es un proceso complejo yse hace con robots. En una lámina de vidrio se separan cientos demiles de celdas dentro de los cuales fijamos el DNA de los genes quenos interesa evaluar. Luego permitimos la hibridización de estos genescon el RNA o DNAc del material biológico obtenido y tendremos unafoto dimensionada de la funcionalidad de esa célula con respecto aotras.

FARMACOGENÓMICALa fármacogenética es el estudio de cómo los diversosgenes afectan la respuesta de las personas a las drogas;la farmacogenómica es def inida como e l uso de lainformación secuenciada del A D N para medir, predecirla respuesta de un individuo a las drogas13.

E xisten varios ejemplos en relación a interacciones delas drogas por problemas genéticos: durante la II guerramundial se descubrió que cerca del 10% de poblaciónafroamericana tenía alelos polimórficos de la glucosa 6fosf a to deshidrogenasa que condi c ionaba anemi ahemolítica cuando tomaban el antimalárico primaquina;aproximadamente 0,04% de la población general sonhomocigotes para alelos de la pseudocolinesterasa, loscua l es no pueden ina c t i v ar e l re l a j ant e muscul arsuccinilcolina, lo cual termina en parálisis respiratoria;cerca del 10% de personas caucásicas son homocigotespara los alelos del gen C Y P2D6 del citocromo P450 porlo cua l no me t abol i z an l a droga ant ihipert ens i v adebrisoquina; existen muchos alelos polimórficos delgen N-acetiltransferasa, que pueden reducir o aumentarla act ividad de la isoniazida; f ina lmente , pac ienteshomoc igotes para los a le los de l gen de la enz imaconvert idora de angiotensina con una de lec ión de lintrón 16 no muestran beneficio cuando usan enalapril.En los casos anteriores, conociendo el lugar de variacióndel nucleótido en el gen, podemos establecer pruebassimples de marcadores tipo SNP (single nuc leotidepolymorphism) para determinar que personas puedentener estos problemas; pero además, podemos incluso

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cubrir una buena parte del genoma buscando SNPs quepodrían asociarse con respuesta a drogas tanto en elaspecto de seguridad como de eficacia. En algunos casos,las diferencias entre las respuestas a una misma droga enun grupo de pac ientes ident i f icado por screeningfarmacogenómico podría indicar incluso, un mecanismodiferente de enfermedad13. Por tanto, la farmacogenómicapuede proveernos con información confiable que puedeayudar al médico en la decisión terapéutica apropiada, conuna dosificación justa de acuerdo ya no al peso, edad osexo, sino basados en las características genéticas de lapersona.

P R O T E Ó M I C AE s e l e s t u d i o s i s t e m á t i c o d e l a s d i v e r s a sp r o p i e d a d e s d e l a s p r o t e í n a s p a r a p r o v e e rde t a l l ada descripc ión de l a estruc tura , func ión ycontrol de los s ist emas biológi cos , esto inc luy e :se cuenc i a , c ant idad, modi f i c a c iones, intera c c ionescon otras prot e ínas , e t c . t anto en sa lud como en l ae n f e rm e d a d 29. D e n t ro d e l a v e rs a t i l i d a d d e l a sprot e ínas encontramos que :

..1. Numerosas proteínas cambian su forma deliberadamentemientras realizan su funcion.

2. Pueden asoc iarse se lect ivamente con colaboradores(cofactores) para llevar a cabo su tarea de forma máseficiente.

3. Numerosas transformaciones postraducción afectan laspropiedades de numerosas proteínas.

4. T ienen la capacidad de diversificarse en conglomeradosdesde simples dímeros a cientos de subunidades30.

C uantificación de las proteínas.

La medición de la cantidad de diferentes proteínas en unextracto celular es técnicamente más difícil que medir elA RNm con tecnología microarray, debido a la diversidadde las proteínas. El método más importante para cuantificarproteínas ha sido la electroforesis en gel de poliacrilamidaen 2 dimensiones (2-D PA GE), el cual ha sido el caballito debata l la de la química prote íca por varias décadas:inicialmente se separan las proteínas por pH en unadirección, usando su punto isoeléctrico, posteriormentese separan por tamaño en la otra dirección en el mismo gely por electroforesis, finalmente se visualizan en gel continciones especiales o por autoradiografía. Este métodosolo puede proveer un estimado aproximado. Sin embargo,la proteómica necesita un método de alto rendimiento quepermita identificar y cuantificar un alto número de proteínasa la vez; nuevas tecnologías como la espectrometría demasa asociada a procedimientos que ionizan las moléculasproteícas con laser en un campo eléctrico, para luego medirla cantidad de tiempo hasta que los iones alcancen eldetector son actualmente las más usadas; sin embargo,aún no es posible un mismo procedimiento para todo esteproceso.

Interacciones proteína-proteína.

A lgunas proteínas interactúan con otras para formarcomplejos moleculares multi-subunidades, para regular

la función de otras proteínas o para ser reguladas. Lae x tensión y na tura l e z a de estas interacc iones sonimportantes para entender l as v í as regul a tori as ymetabólicas y para la caracterización funcional de muchasotras que están siendo descubiertas. Varias tecnologíasestán disponibles para evaluar estas interacciones, sinembargo, ninguna t iene capac idad para ana l izar e lconjunto completo de una célula u organismo.

Proteómica estructural

Se espera conoc er más a c erc a de l as f unc i onesbiológi c as de l as prote ínas a part ir de su estruc turat r i d e m e ns i on a l (3 D ) , m á s qu e d e su s e c u e n c i aaminoac ídi ca o su peso mol ecul ar. A c tua lmente , noes pos ibl e prede c ir l a estruc tura tridimens iona l ,basándonos sol ament e en su se cuenc i a primari a opor los da tos de l a espe c trome trí a de masa . E st etraba jo pasa por l a puri f i c a c ión y crist a l i z a c ión del a prot e ína , l a cua l será post eriorment e some t ida acrist a logra f í a por ra yos X o resonanc i a magné t i c anuc l e ar. Sin embargo , es pos ibl e corre l a c ionar l ai n f orm a c i ón c ono c i d a y a c op i a d a e n b a s e s d eda tos espe c i a l es, para prede c ir l a conforma c ión 3 Dde prot e ínas con se cuenc i as s imi l ares (hast a en30%) , proc eso l l amado “ thre ading ” .

Blancos de drogas

Hasta hace poco tiempo, las compañías farmacéuticashabí an cre ado c erc a de 500 bl ancos terapéut i cosdirigidos a proteínas. Con la aplicación de la genómicaa l desarrol lo de nuevas drogas se espera que estenúmero crecerá a cerca de 4 000 en los próximos años.P a r t i c u l a rm e n t e , l a t e c no l og í a m i c ro a rr a y s e r áfundamental para este crecimiento.

Visión de la genómica

Sobre la base del Proyecto Genoma Humano y contandocon pilares como: recursos, desarrollo de tecnología,biología computacional, entrenamiento, educación yaspectos éticos y sociales, se configuran tres grandesáreas dentro de las cuales existen grandes retos a llevara cabo en los siguientes años31.

I . L a g e nóm i c a h a c í a l a b i o l og í a : e l u c i d a r l aestructura y función de los genomas.

( a ) I d e n t i f i c a r c o m p r e n s i v a m e n t e l os c o m p o n e n t e se s t r u c t u r a l e s y f u n c i o n a l e s c o d i f i c a d os e n e l g e n o m ah u m a n o .

(b) D i l u c i d a r l a o r ga n i z a c ión d e l a r e d ge n é t i c a y l as v í asd e l a s p r o t e í n a s y c o m o e l l a s c o n t r i b u y e n a l f e n o t i p oc e l u l a r y d e l o r g a n i s m o .

( c ) E n t e n d e r l a s v a r i a c i o n e s h e r e d i t a r i a s e n e l g e n o m ah u m a n o .

( d ) E n t e n d e r l a s v a r i a c i o n e s e v o l u c i o n a r i a s e n t r e l a se s p e c i e s y l os m e c a n i s m os s u b y a c e n t e s .

(e) D esa r r ol lo d e op c ion es q u e f a c i l i t e n l a d ise m i n a c iónd e l a i n f o r m a c i ó n ge n ó m i c a t a n t o e n e l co n t e x t o c l í n i coc o m o i n v e s t i g a c i o n a l .

Genómica y proteómica: un paso más

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I I . L a g e nóm i c a h a c i a l a s a l ud : Tr a s l a d a r e lconocimiento basado en el genoma hacia los beneficiosde la salud.

( a ) D e s a r r o l l a r f u e r t e s e s t r a t e g i a s p a r a i d e n t i f i c a rcon t r i b u c ion es ge n é t i c as a l a e n f e r m e d a d y l a r es p u est aa l as d r ogas .

(b) D esa r r ol l a r est r a t egi as p a r a i d e n t i f i c a r l as v a r i a c ion esg e n é t i c a s q u e c o n t r i b u y e n a l a b u e n a s a l u d o a l ar e s i s t e n c i a a l a e n f e r m e d a d .(c) D es a r r o l l a r h e r r a m i e n t a s b a s a d a s e n e l ge n o m a q u ep r e d i g a n l a s u s c e p t i b i l i d a d a l a e n f e r m e d a d y l ar esp u est a a l as d r ogas , d e t e c c ión t e m p r a n a y t a xonom í am o l e c u l a r d e l a e n f e m e d a d .

( d ) U s a r e l c o n o c i m i e n t o d e l os g e n e s y s u s v í a s p a r ad e s a r r o l l a r n u e v os y p o d e r osos e n f o q u e s t e r a p é u t i c osc o n t r a l a e n f e r m e d a d .

(e) I n v est iga r cómo es com u n i c a do e l r i esgo ge n é t i co e ne l c o n t e x t o c l í n i c o , c ó m o i n f l u e n c i a e s a i n f o r m a c i ó n e nl a s e s t r a t e g i a s d e l a s a l u d y e n e l c o m p o r t a m i e n t o ,a s i m i s m o , c ó m o i n f l u y e n e s t os e n l os r e s u l t a d os y l osc os t os .

(f) D esa r r ol l a r h e r r a m i e n t as b asa dos e n e l ge nom a , p a r am e j o r a r l a sa l u d d e todos .

III. La genómica hacia la sociedad: Promover el usode la genómica para maximizar beneficios y minimizardaños.

(a) D esa r r ol l a r op c ion es p a r a e l uso d e l a ge nóm i c a e n e lco n t e x t o m é d i co y n o m é d i co .

(b) E n t e n d e r l a r e l a c ión e n t r e ge nóm i c a , r a z a , e t n i c i d a dy l a s c o n s e c u e n c i a s d e n o e s t a b l e c e r e s t a s r e l a c i o n e s .

( c ) E n t e n d e r l a s c o n s e c u e n c i a s d e n o d e s a r r o l l a r l a sc o n t r i b u c i o n e s g e n é t i c a s a l os r a sgos h u m a n os y e lc o m p o r t a m i e n t o .

(d) Pol i t i c as e f e c t i v as p a r a d e f i n i r lo asoc i a do a l a é t i c ae n e l u so d e l g e n o m a

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Cor respondencia:

Dr Carlos Battilana Guanilocarlos.battilana @roche.com

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