Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y

Maldi-TofUNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA

Alberto Jorge GarcíaLaboratorio de Proteómica

Centro de Biología Molecular Severo OchoaUniversidad Autónoma de Madrid-CSIC

Oferta del Servicio de Proteómica

• www2.cbm.uam.es/proteomica• Análisis mediante Espectrometría de

Masas• Identificación sistemática de proteínas

presentes en las bases de datos a partir de geles

• La Síntesis de Péptidos es un servicio independiente

Proteoma

Proteína

Péptidos

Fragmentos

BASE DEDATOS

BASE DEDATOS

Identificación Proteína

Identificación Péptido

Proteómica:

Servicio de “Proteómica”

• Digestión manual en gel

• Análisis mediante MALDI-TOF:• Obtención del mapa peptídico e identificación

mediante huella peptídica (PMF)

• Análisis mediante LC-ESI-IT• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión

dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest

• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Requisitos para la preparación de geles

• Reactivos• Manipulación

– Frescos, alto grado de pureza.– Muy cuidadosa, queratinas, recipientes de vidrio– Precauciones en la preparación de la muestra

• Confección del gel– Lo más cercano posible a la entrega de la muestra– STD no preteñidos, no coloreados, no

recombinantes. En cantidades conocidas y MW conocidos

– No admitimos bandas ó spot recortados. Gel completo

Requisitos para la preparación de geles

• Diseño del gel (monodimensional). Usuario– Minimizar el tamaño del carril para mejorar la

razón proteína:gel– Optimizar la resolución y enriquecer para muestras

muy complejas

• Geles 2 D (bidimensionales)– Incluido en la oferta de Servicio– Es crítica la preparación de la muestra por parte del

usuario (Precipitación con acetona)

Tinción de geles• Tinción Coomassie

– Coomassie 0.2%/metanol 50%/10%acético. Fresco– Coomassie Coloidal, mayor contraste– No fijar con etanol, se forma acetato de etilo– Sensibilidad: 0.1 mg, Cuantitativo– Prácticamente nunca interfiere con la digestión

• Tinción con plata (no recomendada)– Sensibilidad: 1-10 ng, No es cuantitativa– Alta variedad en los protocolos de tinción– Interfiere con la digestión – Aumenta la necesidad de concentración de proteína,

bajo rendimiento y alto nivel de contaminantes

Tinción de geles

• Tinción fluorescente (mono ó 2 D)– Sensibilidad: Igual ó mayor a la plata– Variedad de tinciones (SYPRO Ruby, SYPRO

Orange, SYPRO Red, Deep Purple…)– No interfiere con la digestión– La fluorescencia se puede medir en el Typhoon y

recortar las bandas en un transiluminador UV (300 nm)

– Disponible en el Servicio

Digestión “in situ” de geles

• Procedimiento adaptado de Mann y cols. Con variaciones entre coomassie y plata.

• Control interno de cada gel digiriendo std de pm (descarta problemas atribuibles a la preparación/tinción del gel)

• Control externo con bandas/spots de geles ya procesados (descarta problemas atribuibles al proceso de digestión y preparación de muestra para MS)

Servicio de “Proteómica”

• Digestión manual en gel

• Análisis mediante MALDI-TOF:• Obtención del mapa peptídico e identificación

mediante huella peptídica (PMF)

• Análisis mediante LC-ESI-IT• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión

dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest

• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Espectro de masas MALDI-TOF

Resultados búsqueda en Mascot

Asignación de péptidos en el mapa de MALDI

Aspecto de un mapa cuando no hay digestión

Las masas provienen de queratinas y autoproteolisisde tripsina

Mapa típico de digestión de queratinas

Contaminación por queratinasdentro del gel

Sypro Rubi vs Plata

STD PM

2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1

Gel plata Gel SyproGel Syprodespués de

cortar

Picomoles

Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa 2 picomoles (88 ng)

1 2 0 0 1 7 0 0 2 2 0 0 2 7 0 0 m /z

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

1 0 0 0 0

a .i.

1 2 0 0 1 7 0 0 2 2 0 0 2 7 0 0 m /z

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

a .i.

Sypro

Plata

Péptidos de Ovalbúmina

T

TT

17 péptidos

8 péptidos

Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa 500 fmoles (22ng)

1 2 0 0 1 7 0 0 2 2 0 0 2 7 0 0 m /z

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

4 0 0 0

4 5 0 0

a .i.

1 2 0 0 1 7 0 0 2 2 0 0 2 7 0 0 m /z

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

3 0 0 0

3 5 0 0

a .i.

Sypro

Plata

T

M

TT

T

T T?

Péptidos de Ovalbúmina

10 péptidos

2 péptidos

Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa 250 fmoles (11 ng)

1200 1700 2200 2700 m /z

0

500

1000

1500

2000

2500

a.i.

1200 1700 2200 2700 m /z

0

500

1000

1500

2000

2500

a.i.

Sypro

Plata

T

T

M T

Péptidos de Ovalbúmina

T

M

T T

11 péptidos

3 péptidos

Identificación mediante PMF

• Tres niveles de preparación de muestras:– Sensibilidad normal: método estándar en

placa de acero inoxidable (automatizable)– Alta sensibilidad: método “anchorchip” con

matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker (automatizable)

– Muy alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz DHB y cristalización heterogénea (no automatizable) Siempre trabajamos con este método

Identificación mediante PMF• Métodos de calibración:

– Externa próxima, para búsquedas en DB con 100-150 ppm. Los espectros se adquieren con esta calibración

– Mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas con 50-100 ppm. Se aplica a la lista de masas obtenida por calibración externa

– Interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con 30-50 ppm

• Motores de búsqueda:– Internet (Mascot, Profound)

* Campillo, Martín and Vázquez

Identificación mediante PMF

Causas por las que no se identifica una proteína

• Mapa con un nº insuficiente de péptidos• Mezcla de proteínas• Proteína no presente en DB• Alto nivel de contaminación• Modo en el que se genera la lista de masas

Servicio de “Proteómica”

• Digestión manual en gel

• Análisis mediante MALDI-TOF:• Obtención del mapa peptídico e identificación

mediante huella peptídica (PMF)

• Análisis mediante LC-ESI-IT• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión

dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest

• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Identificación de péptidos presentes en DB mediante LC-

MS/MS ESI-IT

• Alta sensibilidad en modo “full scan”: Exclusión dinámica (DE), 100 fmoles para un digerido en solución de estándar de BSA

• Muy alta sensibilidad en modo SIM: “Monitorización de iones sencillos”, 1-10 fmoles para estándar de BSA

Exclusión Dinámica (Triple-play)RT: 0.00 - 70.06

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100R

ela

tive

A

bu

nd

an

ce

11.70

42.33

44.62

12.29

12.38

14.30

14.48

44.81

37.4135.74

44.92

38.0214.66

35.0641.15

14.85

54.5845.2339.5854.45 54.67

55.39

45.34 53.24 55.5210.9956.0352.74

15.0645.70 52.24 56.888.700.90 51.9924.81 33.0431.4624.33 25.2015.29 46.28 58.408.554.96

1.01 68.4517.50 27.7723.66 67.8760.26

NL:7.13E7

Base Peak F: MS 040604JAAsturiasEDp10

040604JAAsturiasEDp10 #1051 RT: 40.93 AV: 1 NL: 3.14E6T: + c Full ms [ 400.00-1600.00]

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

824.60

947.46

948.37

1198.26

905.05

1197.40

799.00474.52

1199.241140.74971.94

632.47454.22

825.30701.64 1022.26 1112.32

1209.36864.441422.011210.231052.50

1298.311217.06721.411320.08767.14

700.281329.11

550.76 1431.67631.30 649.04 1512.501403.031581.58475.40 1478.93

1532.65

040604JAAsturiasEDp10 #1052 RT: 40.97 AV: 1 NL: 1.07E5T: + p d Z ms [ 943.00-953.00]

944 945 946 947 948 949 950 951 952 953

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

947.44

947.89

947.91

948.40

947.37

948.46

948.86

948.91949.43

946.96

950.36949.82

951.37943.64

952.63944.66943.18

946.72 950.25945.72 952.20951.09944.10 950.71946.43 951.61

945.31

946.21

952.81

040604JAAsturiasEDp10 #1053 RT: 40.99 AV: 1 NL: 1.07E6T: + c d Full ms2 947.46@35.00 [ 250.00-1905.00]

300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

754.41

1507.39811.09

1508.491121.28

617.821122.40

745.431234.33868.20 1489.65

1379.13359.09 674.21561.15387.04 1104.19273.91 483.98 898.29 1228.22 1361.29

975.131292.661027.34 1180.22281.92 1745.601537.62404.43 1621.17

600 700 800 900 1000 1100 1200m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Inte

nsi

dad

Rel

ativ

a

736.3

655.3

817.3 1082.7

A

735 736 737 738 739m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100736.3

736.7

737.2

654 655 656 657 658m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100655.2

655.6

656.2

z = +2M = 1470.6

z = +2M = 1308.4

B C

400 600 800 1000 1200 1400m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Inte

nsi

dad

Rel

ativ

a

704.5

1078.3

851.3394.31177.3

295.21021.3463.5 764.3589.5

964.3 1325.0

V

D FW S L G G V

DMFVGGLSWDTSKK

M

MF

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

m/z

0

20

40

60

80

100

Inte

nsi

dad

Rel

ativ

a

656.1

543.2

767.1

429.1 932.2881.2

378.0204.0 1106.11031.1333.1

541.0

DYVN I L YPQ

769.2

279.0

V ILY PQN

EYDVYLINPQGK

YD

Secuenciación de especies individuales en mezclas de péptidos

Análisis mediante Espectrometría de Masas

• Análisis empleando MALDI-TOF– Muestras preparadas por usuario (incluye

portas y matriz)– Muestras preparadas por el Servicio

• Análisis empleando LC-ESI-IT de fracciones de péptidos provenientes de HPLC preparadas por usuario

Equipos disponibles• Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo

Autoflex de Bruker, equipado con reflector

• Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una HPLC Agilent 1100 con restrictor de flujo inteligente (cedido en mayo 04 por un año)

• Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LC-ESI-IT y columna RP de 180 mm, flujos de 1,5 a 2 ml/m

Procedimiento de trabajo

• Recepción y control de muestras– Aviso previo a la entrega de geles– Escaneo del gel, – Confección de ficha de usuario,– Instrucciones del trabajo a realizar

• Análisis– Digestión manual en gel– Obtención del mapa peptídico mediante MALDI-

TOF– Análisis mediante LC-ESI-IT

Personal del Servicio de Proteómica

• Rosana Rogado:– Laboral contratado temporal (CSIC), Ayudante de

Investigación y Laboratorio• Alberto Jorge:

– Laboral fijo (CSIC), Técnico de Investigación y Laboratorio

• Yolanda Núñez:– Funcionaria. Técnico Especialista de Grado Medio

• Anabel Marina: – Laboral interino (CSIC), Titulado Técnico nivel 2