•Glicosilación, fosforilación y otras modificaciones covalentes de proteínas

La secuencia de aminoácidos de la proteína no siempre refleja la secuencia contínua de nucleótidos en el genoma

•splicing de pre-mRNA (eliminación de intrones)

•splicing alternativo (varios polipéptidos a partir de la misma secuencia de DNA)

•corrimiento del marco de lectura (translational frameshifting)

•edición del mRNA

•procesamiento proteolítico de polipéptidos (en algunos casos se obtienen productos alternativos en diferentes tipos celulares)

•splicing de proteínas (eliminación de inteínas)

los RNAs pueden procesarse de diferente manera eliminando parte del producto de transcripción

original

splicing alternativo del gen de calcitonina

RNA editing

Edición de mRNA

UGA C

UGA

RF2

Pausa

Frameshift(UGAC se lee como GAC y sigue +1)

GAC

RF2

Unión de RF2 terminación de la traducción

Corrimiento del marco de lecturaTranslational frameshifting

The group antigens form the viral core structure, RNA genome binding proteins, and are the major proteins comprising the nucleoprotein core particle. Reverse transcriptase is the essential enzyme that carries out the reverse transcription process that take the RNA genome to a double-stranded DNA preintegrate form

HIV

p55 proteasa

Proteasa p10Proteasa p10

Transcriptasa reversa p50Transcriptasa reversa p50RNAsa p10RNAsa p10

integrasaintegrasa

Modificación de proteínas

1. las proteínas sufren modificaciones post-traducionales (y co-traduccionales)

2. la actividad biológica puede depender de las modificaciones

3. la espectrometría de masas es uno de los mejores métodos para identificar las modificaciones

• Protein Post-translational Modifications

1. Folding and Processing of Proteins

-During translation proteins fold as they exit ribosome-Some proteins can assume native 3D structure spontaneously-Other proteins may require chaperones

• Protein Post-translational Modifications2. Amino-terminal and carboxyterminal modifications

-Cleavage of f-Met from bacterial proteins or Met fromeukaryotic proteins. Other amino acids may be trimmed as well.-Acetylation of Met or other N-terminal amino acids-Removal of signal peptide for secreted or membrane proteins-Removal of C-terminal amino acids.

• Protein Post-translational Modifications3. Modification of Individual Amino Acids

a. Phosphorylation-Enzymatic reaction by specific kinases- Usually on Ser, Thr, Tyr

• Protein Post-translational Modifications

3. Modification of Individual Amino Acids

b. CarboxylationAddition of extra carboxyl groups to Asp and Glu

c. MethylationAddition of methyl groups to Lys and Glu

• Protein Post-translational Modifications

3. Modification of Individual Amino Acids

d. Isoprenylation-Addition of an isoprenyl group to a protein at either theC-terminus or the N-terminus-Derived from pyrophosphate intermediate in cholesterolbiosynthesis

• Protein Post-translational Modifications

3. Modification of Individual Amino Acids

e. Addition of prosthetic groupsCovalently bound prosthetic group – required for activityExample: Cytochrome C -- Heme group

• Protein Post-translational Modifications

3. Modification of Individual Amino Acids

f. Proteolytic ProcessingSome types of proteins are synthesized as a larger, inactiveprecursor protein and must be cleaved for activity

g. Formation of disulfide bonds-Spontaneous cross-linking at Cys residues-Brought into proximity by folding-Helps to stabilize 3D structure

• Protein Post-translational Modifications

3. Modification of Individual Amino Acids

h. Glycosylation-Addition of oligosaccharides to proteins-Usually at Asn-Sugars are transferred from dolichol-P-Present in ER

• Protein Post-translational Modifications

4. Methods to Discover Modifications

a. Enzymatic methodsPhosphatases – remove phosphate groupsGlycosylases – remove carbohydrates

b. Physical methods1. Hydrolysis in 6N HCl – amino acid composition2. Digestion with specific protease or chemical agent3. Sequence of peptide by Edman Chemistry4. Mass Spectrometry (MALDI-TOF)

procesamiento proteolítico

insulina: sobre-simplificación

Alternative processing pathways of the prohormone pro-opiocortin. The initial cleavages are made by membrane-bound proteases that cut next to pairs of positively charged amino acid residues (Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys, or Arg-Arg pairs), and trimming reactions then produce the final secreted products. Different cell types contain different processing enzymes, so that the same prohormone precursor can be used to produce different peptide hormones. In the anterior lobe of the pituitary gland, for example, only corticotropin (ACTH) and b-lipotropin are produced from pro-opiocortin, whereas in the intermediate lobe of the pituitary, mainly a-MSH, g-lipotropin, b-MSH, and b-endorphin are produced.

Rutas de procesamiento alternativas de la prohormone pro-opiocortina

Protein Splicing

http://soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbes/inteins.gifT. littoralis is the source of vent DNA polymerase, used extensively in PCR. When scientists at New England Biolabs cloned the gene for the enzyme, they were surprised to find that it contains an extra sequence of non-DNA-polymerase. They assumed it was an intron, but found that the mRNA isn't spliced and the extra sequence is translated into a novel domain in the enzyme. This polypeptide domain is a peptidyltransferase that specifically splices itself out of the DNA polymerase, rejoining the 2 parts of the DNA polymerase as it leaves. This protein-splicing reaction is remarkably analogous to RNA-splicing by introns, and so it's called an 'intein' (intervening protein). Once the intein has removed itself from the DNA polymerase, it has another activity - it is a transposase. This enzyme cleaves DNA specifically at the ends of the intein-encoding sequence and directs a DNA repair process that results in the insertion of the intein DNA into other protein-encoding genes - in other words, the intein DNA is also a transposon.

Protein splicing

proteínas de secreción:la vía secretoria

secretory pathway

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS EN EUCARIOTES:

SEÑALES DE LAS PROTEÍNAS QUEDETERMINAN SU DIRECCIONAMIENTO CELULAR.

                     

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1999

"for the discovery that proteins

have intrinsic signals that

govern their transport and

localization in the cell"

                               

Günter Blobel

USA

Rockefeller University New York, NY, USA; Howard Hughes Medical Institute

Signal hypothesis

1971: “Las proteínas secretadas al espacio extracelular contienen una señal intrínseca que las dirige hacia y a través de las membranas”

Signal hypothesisSignal hypothesis

• La traducción de poly(A) mRNA de células de mieloma (principalmente mRNA de IgG) en un sistema

libre de células carente de vesículas microsomales genera una proteína 2-3kDa mayor.

• El mapa peptídico indica que la extensión se encuentra en el amino terminal

Milstein, C. et al., Nature New Biology 239: 117-120, 1972

preparación de microsomas

Experimentos utilizando microsomas

Las proteínas del lumen de los microsomas no son atacadas

por proteasas

Descubriendo cómo trabaja la secuencia señal…

Dobberstein and Blobel, 1975

Descubriendo cómo trabaja la secuencia señal…

La secuencia señal es hidrolizada en el lumen del ER

La secuencia señal dirige la proteína al microsoma. Este proceso es una translocación co-traduccional

Signal hypothesisSignal hypothesis

• “La señal consiste en una secuencia de aminoácidos que forma parte integral de la proteína”

• “La proteína atraviesa la membrana mediante un canal”

1975:

Ruta secretoria

Las proteínas destinadas para la secreción o incorporación al ER, Golgi, lisozoma o membrana plasmática son sintetizadas en ribosomas asociados a membrana y transferidas al RER durante su síntesis

¿Qué elementos son requeridos para entrar a la ruta secretoria?

• Una señal en la proteína

• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta

• Una maquinaria de translocación, un canal

• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína

Estructura de la partícula de reconocimiento de señal “signal recognition particle” (SRP)

¿Qué elementos son requeridos para entrar a la ruta secretoria?

• Una señal en la proteína

• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta

• Una maquinaria de translocación (un canal)

• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína

La hidrólisis de GTP potencia el transporte al ER

Direccionamiento al lumen del ER

Anclaje a membrana

Topología de proteínas integrales de membrana sintetizadas

Una secuencia interna topogénica dirige la insersión de algunas proteínas de transmembrana

Se requieren múltiples secuencias topogénicas para las proteínas de transmembrana de pasaje múltiple

Overview de la ruta secretoria

RE rugoso

Cis Golgi

trans Golgi

Espacio extracelular

La N-glicosilación de las proteínas comienza en el ER

La N-glicosilación de las proteínas comienza en el ER

Direccionamiento de proteínas codificadas por el genoma nuclear

Las proteínas destinadas al citosol o a ser incorporadas en el núcleo, mitocondria, cloroplasto o peroxisoma son sintetizadas a partir de ribosomas libres

POST TRADUCCIONALES!!

Direccionamiento a los diferentes compartimientos sub-mitocondriales

¿Qué elementos son requeridos para el direccionamiento mitocondrial?

• Una o más señales en la proteína

• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta

• Una maquinaria de translocación, un canal

• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína

• Chaperonas para desplegar la proteína ya sintetizada

•ATP en el citosol, • fuerza protón motriz a través de la membrana interna

• ATP en la matriz

emplea

ENERGIA CHAPERONAS

•citosólicas y •Matriz mitocondrial

Se requieren múltiples rutas y señales para dirigir las proteínas a los distintos compartimientos Se requieren múltiples rutas y señales para dirigir las proteínas a los distintos compartimientos submitocondrialessubmitocondriales

Intermembrane-Space Proteins

Se requieren múltiples Se requieren múltiples

rutas y señales para rutas y señales para

dirigir las proteínas a dirigir las proteínas a

los distintos los distintos

compartimientos compartimientos

submitocondrialessubmitocondriales

Direccionamiento de proteínas codificadas por el genoma nuclear

Direccionamiento a Cloroplasto

Importación de proteínas a cloroplasto

¿Qué elementos son requeridos para entrar al cloroplasto?

• Una o más señales en la proteína

• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína a la membrana correcta

• Una maquinaria de translocación, un canal

• Energía para abrir la compuerta y translocar la proteína

• Chaperonas para desplegar la proteína ya sintetizada

Secuencias C- o N-terminal dirigen la entrada de proteínas proteínas plegadasplegadas a la matriz del peroxisoma

Peroxisoma

Direccionamiento al núcleo

Las proteinas con la señal de localización nuclear (NLS) son reconocidas por receptores y transportadas al núcleo

Antígeno T de SV40

El complejo de poro nuclear (NPC)

The nuclear pore complex

Modelo de importación de proteínas citosólicas con NLS

¿Qué elementos son requeridos para la entrada al núcleo?

• Una REGION SEÑAL en la proteína (no es clivada!!)

• Un receptor que reconozca la señal y direccione la proteína

• Una maquinaria de translocación, un canal

• Energía para translocar la proteína

Características de las secuencias señal

After insertion into the ER membrane, some proteins are transferred to a GPI

anchor

Anchoring of integral proteins to the plasma membrane by hydrocarbon chains

Post-translational modifications and quality control in the rough ER

• Newly synthesized polypeptides in the membrane and lumen of the ER undergo five principal modifications– Formation of disulfide bonds– Proper folding– Addition and processing of carbohydrates– Specific proteolytic cleavages– Assembly into multimeric proteins

Disulfide bonds are formed and rearranged in the ER lumen

ER-resident proteins often are retrieved from the cis-Golgi

Different structures characterize N- and O-linked oligosaccharides

The immediate precursors in the synthesis of oligosaccharides are nucleoside diphosphate

or monophosphate sugars

Specific sugars are linked by specific glycosyltransferases

Sugar nucleotides and free nucleotides are exchanged by antiporters in the ER

membrane

ABO blood type is determined by two glycosyltransferases

ABO blood groups

Mannose 6-phosphate residues target proteins to lysosomes

The mannose 6-phosphate (M6P) pathway