Caracterización e identificación de microorganismos mediante

técnicas moleculares 1. Antecedentes La caracterización de los microorganismos supone un notable avance en seguridad microbiológica del proceso industrial tanto en la Industria Alimentaria como en Biofarmacología y Salud Pública, ya que permite establecer la fuente de contaminación de una forma mucho más precisa y por tanto identificar las cepas implicadas y establecer su trazabilidad. Los métodos moleculares de caracterización basados en la amplificación de fragmentos repetidos no codificantes (REP-PCR) mediante una técnica automatizada, constituyen un método rápido, fiable y sencillo de genotipado molecular de cepas bacteriana y fúngicas. La capacidad de identificar los microorganismos a nivel de cepa y al mismo tiempo establecer un análisis comparativo de las diferentes cepas analizadas constituye un notable ahorro de tiempo para identificar el potencial contaminante alimentario y por tanto erradicar el foco contaminante. 2. Metodología

Aislamiento e identificación del microorganismo a nivel de familia y/o género Extracción del ADN bacteriano mediante lisis térmica de los microorganismos, detergentes y lisis mecánica en una solución de microesferas. Unión del ADN a filtros de sílica, lavado y elución en tampón Tris. Lectura espectrofotométrica del ADN a una longitud de onda de 260 y 280 nm para su cuantificación. Ajuste del ADN a una concentración de 25 ng/µl. REP-PCR Amplificación de fragmentos repetidos de regiones no codificantes del genoma del microorganismo. Detección de los amplicones mediante un bioanalizador (2100 Bioanalyzer. Agilent) y el uso de un chip con una matriz de microfluidos. Interpretación de los resultados mediante un potente software de análisis vía web (Diversilab System v.3)

Tipificación: permite el análisis comparativo entre cepas para ver similitudes y diferencias. Aplicaciones: Estudios epidemiológicos Trazabilidad de patógenos y alterantes en la cadena alimentaria. Autentificación de microorganismos de interés (cultivos iniciadores, fermentos, probióticos…)

Clasificación: identificación de las cepas mediante la comparación de los perfiles genéticos con una base de datos. Aplicaciones: Confirmación de resultados analíticos. Identificación de serotipos (Salmonella, Listeria monocytogenes…) Identificación de especies microbianas.

3. Plazo de entrega El plazo de entrega de resultados es de forma habitual de 10 días. No obstante, existe la posibilidad de realizar la analítica mediante un servicio de urgencia de forma que los resultados estarían en un plazo de 24 h. 4. Otras técnicas Ainia dispone de diversas metodologías para el análisis de las cepas de Salmonella. Entre ellas podemos citar:

1. Dispone de un servicio de identificación de microorganismos mediante PCR- secuenciación. No obstante, debido a que el poder de discriminación a nivel de serotipo es menor que la REP-PCR su aplicación fundamental es la identificación de microorganismos a nivel de especie.

2. Electroforesis en campo pulsado (PFGE). Dicha técnica se considera el método de referencia en

la tipificación de microorganismos. No obstante, debido a su mayor laboriosidad y complejidad hace que utilicemos dicha técnica como método de confirmación de perfiles genéticos dudosos.