I TRANSFORMACIN GENETICA DE PLANTAS MEDIANTE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Universidad Nacional de Quilmes

Biotecnologa Vegetal

Gua de trabajos prcticosTRANSFORMACIN GENETICA DE PLANTAS MEDIANTE AGROBACTERIUM TUMEFACIENSINTRODUCCIN

El uso de Agrobacterium tumefaciens como sistema natural para producir plantas transgnicas, est basado en el hecho de que durante la interaccin de la bacteria con el tejido vegetal herido, un segmento de plsmido Ti llamado T-DNA, se transfiere a la clula vegetal integrndose a su genoma. El DNA transferido normalmente contiene un nmero de genes que codifican para enzimas involucradas en la sntesis de hormonas y metabolitos especficos denominados opinas. Como consecuencia de la expresin de estos genes, las clulas vegetales transformadas forman tumores o races (en el caso de la infeccin con Agrobacterium tumefaciens o rhizogenes respectivamente) con capacidad de crecimiento autnomo y de producir opinas, utilizadas por la bacteria como fuente de nitrgeno y de carbono.

Con el objeto de usar este sistema para obtener plantas transgnicas capaces de expresar un gen deseado se hacen las siguientes modificaciones al plsmido Ti:

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hPara que el fenotipo de las plantas transgnicas sea el normal, se eliminan los genes responsables de la induccin de tumor de la regin del T-DNA.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hA su vez, es necesario incorporar un gen dominante fcilmente seleccionable (como por ejemplo el gen que confiere resistencia a antibiticos aminoglucosdicos, como kanamicina).

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hPor otro lado, pueden incorporarse genes marcadores como el que codifica para la -glucuronidasa, que permiten conocer la localizacin de la expresin del marcador en un tejido dado.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hPor ltimo, se incluye el gen de inters, que puede conferir resistencia a insectos, virus, herbicidas, etc.

Para la introduccin de genes en plantas mediada por este sistema es necesario fundamentalmente disponer de un sistema de cultivo de tejidos en el que la regeneracin de plantas completas sea reproducible, y que la especie sea susceptible a la infeccin por Agrobacterium. Frecuentemente se emplean explantos de hojas como material inicial para la transformacin. La mayora de los brotes regenerados de estos explantos parecen ser de origen unicelular.

Transformacin gentica de plantas de tabaco mediante Agrobacterium tumefaciensSe trabajar con la cepa LBA 4404 de A. tumefaciens que lleva el plsmido p-AL4404 cuyo T-DNA ha sido deletado y que conserva la regin vir capaz de aportar en trans las funciones de virulencia necesarias para la transferencia al genoma de la planta de un T-DNA presente en el vector de clonado. Figura 1

El plsmido pBI-121 (1) es capaz de replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Posee entre los bordes derecho e izquierdo del plsmido Ti al gen npt-II como marcador de seleccin que confiere resistencia a kanamicina y el gen uidA que codifica para la -glucuronidasa que permite detectar su presencia mediante un ensayo bioqumico. Ambos genes se encuentran bajo el control de promotores y seales de terminacin adecuados para su expresin en plantas (Fig. 1). Este plsmido puede ser manipulado en E. coli y luego introducido en Agrobacterium por conjugacin o transformacin. Este ltimo mtodo es el que se utilizaremos en la prctica.

Durante el cocultivo el contacto de A. tumefaciens con compuestos fenlicos liberados por los tejidos de la planta (especialmente acetosiringonas) activa la transcripcin de los operones de la regin vir. Esto provoca la escisin del T-DNA y por un mecanismo todava no completamente elucidado, su transferencia e integracin en un lugar al azar en el genoma de la planta. Las clulas de los discos de hoja que hayan incorporado este DNA darn lugar a brotes y eventualmente a plntulas al ser repicadas en medio de regeneracin adecuado en presencia del agente selectivo. Mediante la deteccin de los productos codificados por los genes marcadores (npt-II y uidA) se puede confirmar la presencia del DNA exgeno. Figura 1

NOTA

El tiempo necesario para obtener plantas transgnicas en condiciones de ser analizadas para verificar la presencia y expresin del transgn vara segn las especies entre 3 y 4 meses. Por este motivo, la verificacin de la transgnesis se realizar utilizando plantas previamente transformadas en nuestro laboratorio.

TRANSFORMACIN DE A. tumefaciens, CON EL PLASMIDO pBI-121 (2)Preparacin de las bacteriasA partir de un cultivo de A. tumefaciens en 200 ml de medio LB, suplementado con rifampicina y estreptomicina (100 g/ml), crecido hasta OD600= 0.5 a 26C con agitacin:

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hCosechar por centrifugacin a 1100 xg durante 15 min a 4 C.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hLavar con 200 ml de agua estril a 4C y volver a centrifugar como en el paso anterior.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hResuspender en 1 ml de glicerol 10 % en agua estril.

TransformacinSMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hMezclar 50 l de las bacterias con 1 g de plsmido (250 ng/(l) y 50 l de LB.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hCongelar en N2 lquido durante 5 min y descongelar en bao a 37 C durante 20 min.

(Efectuar paralelamente un control de viabilidad y un control de seleccin).

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hRepetir el paso anterior de congelacin-descongelacin dos veces ms.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAgregar 5 ml de LB e incubar durante 6 h a 26 C con agitacin.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hCosechar las bacterias por centrifugacin, resuspender en 100 l de LB y plaquear en el medio selectivo correspondiente ([antibitico] = 100 g/ml).

TransformacinControl de viabilidadControl de seleccin

pBI-121 (DNA)

4 l--

A. tumefaciens.

50 l50 l50 l

Medio LB

50 l50 l50 l

Suplementar las

placas LB agar con:Rif+++

Str+++

Kan+-+

NOTA: La caracterizacin de los transformantes se realiza por mapeo de restriccin de los plmidos purificados a partir de colonias resistentes a los 3 antibiticos.

Minipreparacin de ADN plsmidico y mapeo de restriccin

Se utilizar una modificacin del mtodo de Birnboim and Doly (1979) (3).

Para preparaciones en pequea escala, se parte de 3 ml de cultivo bacteriano crecido en LB/antibitico durante toda la noche a 26C con agitacin.

Cosechar por centrifugacin en microcentrfuga a 4000 rpm, durante 1 min.

Resuspender en 300 (l de solucin hipotnica (Tris-HCl 50 mM pH 8, EDTA 10 mM y RNAsa A 50 (g/ml). Agregar 300 (l de solucin de lisis (SDS 1%, NaOH 0,2 N).

Mezclar inmediatamente por inversin varias veces hasta observar lisis completa del cultivo

Agregar 300 (l de solucin de neutralizacin (acetato de potasio 3 M, pH 4,8) mezclar por inversin y dejar en hielo.

Luego de 10 min de incubacin, centrifugar en microcentrfuga durante 10 min a 12000 rpm.

Transferir el sobrenadante obtenido (aproximadamente 750 (l) a otro tubo, agregar 550 (l de isopropanol y mezclar por inversin.

Luego de incubar 5 min en hielo, centrfugar a 12000 rpm durante 10 min y descartar el sobrenadante. Una vez secado el pellet de DNA, resuspender en 30-40 (l de H2O

Para cortar con las enzimas de restriccin adecuadas, se utilizan alrededor de 5 (l de DNA.

TRANSFORMACION DE DISCOS DE HOJAS DE TABACO MEDIANTE AGROBACTERIUM (4)Se Trabajar con hojas provenientes de plantas jvenes de N. tabacum cv. Xanthi crecidas in vitro.

Obtencin de los discosSMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hPreparar 3 placas de Petri con 20 ml de medio MS lquido (5)

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hCortar las hojas ms jvenes y bien desarrolladas y con un bistur cortar trozos de aproximadamente 1 cm2 (discos), colocando los mismos en las cajas a medida que se van cortando

Cocultivo

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAgregar 20 l de un cultivo O.N. de LBA4404 (pBI121) a una de las placas, agitar hasta homogeneizar y dejar reposar durante 2 min.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hTransferir los discos a un papel de filtro estril y una vez secos sembrarlos en los frascos correspondientes.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAgregar 20 l de un cultivo O.N. de LBA4404 a otra de las placas y proceder de la misma manera que con la anterior.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hTransferir los discos de la tercera placa sin Agrobacterium, ya que son los destinados a los controles de regeneracin y eficacia del agente selectivo.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hIncubar todas las Magentas a 22 C, con un fotoperodo de 16 h de luz, 8 h de oscuridad, durante 48 h.

Transferencia a medio selectivoSMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hRepicar los discos provenientes del cocultivo a nuevas Magentas que contienen MS slido suplementado con hormonas, el agente de seleccin (50 mg/l kanamicina) y el bacteriosttico (200 mg/l cefotaxime).

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hIncubar las magentas en las mismas condiciones del cocultivo.

NOTA: Este repique se repite cada 3 semanas. Cuando comienzan a aparecer los brotes, al cabo de 6 semanas (aproximadamente), y alcanzan un tamao de alrededor de 10 a 20 mm se repican a medio MS slido sin hormonas suplementado con el agente de seleccin (50 mg/l Kan) y el bacteriosttico (200 mg/l cefotaxime). En este medio los brotes enraizarn (si no lo hicieron en la etapa anterior). Despus de 2 o 3 repiques sucesivos las plntulas que hayan enraizado en medio selectivo estarn en condiciones de ser pasadas a tierra (rusticacin).

SolucionesMS30:

Macronutrientes MS 20 X50 ml

Micronutrientes MS 200 X5 ml

Fe-EDTA 200 X5 ml

Sacarosa 30 g

Agar 8 g

H20 c.s.p. 1 litro.

Llevar a pH 5,8 con KOH.

VITAMINAS MS:

Myo-inositol100.0 mg/l

Acido nicotnico0.5 mg/l

Piridoxina-HCl 0.5 mg/l

Tiamina-ClH0.1 mg/l

Glicina2.0 mg/l

HORMONAS:

Benciladenina (BA) cc. final. 1mg/L

Acido naftalenactico (ANA) cc. final. 0,1 mg/L

ANTIBITICOS:

Cefotaxime (cef) 200 mg/l

Kanamicina (kan) 50 mg/l

Rifampicina (rif) 100 mg/l

Estreptomicina (str) 100 mg/l

MACRONUTRIENTES:

NH4NO3 33.0 g/l

KNO3 38.0 g/l

CaCl2.2H2O 8.8 g/l

MgSO4.7H2O 7.4 g/l

KH2PO4 3.4 g/l

MICRONUTRIENTES:

KI 166 mg/l

H3BO3 1240 mg/l

MnSO4 .4H2O 4460 mg/l

ZnSO4 .7H2O 1720 mg/l

Na2MoO4 .2H2O 50 mg/l

CuSO4 .5H2O 5 mg/l

CoCl2.6H2O 5 mg/l

SOLUCION QUELANTE DE HIERRO:

FeSO4.7H2O 5.56 g/l

Na2EDTA.2H2 O 7.46 g/l

DETECCIN DE ACTIVIDAD DE -GLUCURONIDASA (6).

La -glucuronidasa es una hidrolasa que cataliza el clivaje de una gran variedad de -glucurnidos, existen sustratos artificiales, como el cido 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glucurnido (X-Glu), que al ser hidrolizados por la enzima dan lugar a un producto coloreado.

ProcedimientoSMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hTomar una hojita (o trozo de tejido), de la planta a analizar y colocarla en un pocillo de una placa de ELISA al que se agrega 200 l del buffer para X-glu.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hIncubar luego a 37 C y observar la presencia o ausencia de precipitado color azul sobre el tejido. El tiempo de incubacin depende de la permeabilidad del tejido al sustrato.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hLavar con alcohol 70 % para aumentar el contraste y preservar el material.

Buffer Para X-glu:

NaH2PO4 (pH 7,0)50 mM

EDTA 10 mM

-Mercaptoetanol10 mM

Triton X-100 0.1 %

Sarkosyl 0.1 %

X-glu0.5 mg/ml.

(Agregar X-glu en el momento de usar).

ANALISIS DE PLANTAS TRANSGENICAS MEDIANTE LA TECNICA DE PCR (7)Introduccin

La reaccin en cadena de polimerasa (polimerase chain reaction o PCR) se usa par amplificar un fragmento de DNA que yace entre dos regiones de secuencia conocida. Se utilizan dos oligonucletidos cebadores o primers, los cuales son complementarios a sendas secuencias que yacen en las cadenas opuestas del DNA, flanqueando a la zona a amplificar. La mezcla de reaccin conteniendo un exceso de estos primers, el DNA molde, los 4 deoxinuclesidos trifosfato y una DNA polimerasa termoestable se calienta hasta desnaturalizar el DNA molde y se enfra para permitir la hibridacin de los primers a sus secuencias blanco y la polimerizacin a partir de los mismos. El ciclo de desnaturalizacin, hibridacin y polimerizacin se repite varias veces. Dado que el producto de cada polimerizacin sirve de molde para la siguiente, cada ciclo duplica la cantidad de producto del ciclo anterior. El producto mayoritario de la reaccin es un fragmento de DNA de doble hebra cuyos extremos corresponden a los extremos 5' de los primers y su tamao a la distancia entre los mismos.

Los primeros protocolos de PCR utilizaban el fragmento Klenow de la DNA pol I, que se inactiva a la temperatura de desnaturalizacin del DNA. Esto obligaba a agregar una alcuota de enzima en cada ciclo de reaccin, adems de que la temperatura de reaccin permita frecuentemente el apareamiento inespecfico de los primers. Para evitar estos problemas se introdujo el uso de la DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq DNA pol) que no se inactiva a 95 C y funciona a elevada temperatura.

Esta tcnica est siendo ampliamente utilizada tanto en ciencia bsica como aplicada. A continuacin se mencionan algunos ejemplos de los usos que se le est dando a esta tcnica:

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hdeteccin de DNA de patgenos en muestras de tejido de pacientes

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hdiagnstico de enfermedades congnitas

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hanlisis de mutantes

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hamplificacin de fragmentos de DNA para secuenciar, etc.

Sin embargo la Taq polimerasa tiene la limitacin de producir una alta proporcin de errores de incorporacin de nucletidos. La frecuencia es de 2 x 10-4 nucletidos incorrectos por ciclo, lo cual es 4 veces mayor que el fragmento Klenow. Esto da como resultado un promedio de 0,25 % de errores en una reaccin de PCR. La frecuencia de error se ve aumentada por mayores concentraciones de nucletidos o de Mg2+.

En esta prctica utilizaremos la tcnica de PCR para determinar la presencia de un transgn en plantas sometidas a un ensayo de transformacin con A.tumefaciens.

Minipreparacin de DNA de plantas para PCR (8)

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hColocar 100-200 mg de tejido en un tubo Eppendorf y agregar nitrgeno lquido.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAl evaporar el nitrgeno, moler el tejido congelado con un vstago de punta cnica.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAgregar inmediatamente 700 l de buffer EB, aplicar vortex hasta resuspender el tejido e incubar por 10 min a 65 C.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAgregar 200 l de AcOK 5 M, aplicar vortex brevemente y colocar en hielo durante 20 min.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hCentrifugar 10 min a 4 C y transferir a otro tubo Eppendorf.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hPrecipitar el DNA con 1 volumen de isopropanol.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hCentrifugar inmediatamente por 1 min en microcentrfuga.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hLavar con etanol 80 % y volver a centrifugar 5 min.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hSecar el pellet y resuspender en 50 l de TE.

Protocolo de PCR:

Solucin de DNA:

Colocar en un tubo Eppendorf de 0,5 ml:

DNA de planta 250 ng

H2O c.s.p. 25 l

Calentar 5 min a 100 C y colocar inmediatamente en hielo.

Mezcla de reaccin:

Colocar en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, por cada reaccin de PCR:

Buffer PCR 10x 5 l

dATP 10 mM 1 l

dGTP 10 mM 1 l

dCTP 10 mM 1 l

dTTP 10 mM 1 l

Primer 1 (150 ng/l) 0,5 l

Primer 2 (150 ng/l) 0,5 l

MgCl2 25 mM 3 l

H2O c.s.p. 25 l

Taq DNA pol 5 u/l 0,25 l

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hTomar 50 l de la mezcla de reaccin y mezclarlos con la solucin de DNA en el tubo de 0,5 ml.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAgregar 2 gotas de aceite mineral

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hColocar el tubo en la mquina de PCR utilizando el siguiente programa:

95 C 4 min

95 C 1 min (50 C 1 min ( 35 ciclos

72 C 1 min (72 C 5 min

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hDejar correr el programa durante la noche

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hAgregar 1 l de RNAsa A 10 mg/ml e incubar 15 min a 37 C.

SMBOLO 183 \f "Symbol" \s 10 \hTomar 10 l de la mezcla de reaccin y observar en gel de agarosa.

SolucionesEB: Buffer de extraccinTris pH 8 50 mM

EDTA pH 8 10 mM

NaCl 100 mM

SDS 1 %

-mercaptoetanol 10 mM

TETris pH 8 10 mM

EDTA 1 mM

DETECCION DE PROTEINAS UTILIZANDO LA TCNICA DE WESTERN-BLOT

Separacin de las protenas utilizando geles de Poliacrilamida-SDS:

Gel separador 12% (10 ml)

Acrilamida-bisAcrilamida 30% (30:1)4.0 ml

Tris-HCl 1.5M pH 8.82.5 ml

Agua destilada3.3 ml

SDS 10%0,1 ml

Persulfato de Amonio 10%0.1 ml

TEMED5.0 l

Gel concentrador (5 ml)

Acrilamida/bisAcrilamida 30% (30:1)0,83 ml

Tris-HCl 1M pH 6,80,63 ml

SDS 10%50.0 l

Agua destilada3.4 ml

Persulfato de Amonio 10%25 l

TEMED5 l

SDS= Dodecil sulfato de sodio

TEMED= N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina

-Hervir las muestras durante 5 min.

-Sembrar 10-20 l por calle en geles de 12 % SDS-poliacrilamida y se corre a 25 mA. (minigeles 8x8).

-Una vez finalizada la corrida, un gel se teir con 0,5% de Azul de Coomasie y al otro se le realizar un Western-blot.

TRANSFERENCIA DE PROTEINAS A NITROCELULOSA: WESTERN BLOT Electrotransferencia

-Luego de la corrida sumergir el gel en buffer de electrotransferencia (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 196 mM Glicina;20% metanol).

-Cortar un trozo de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, BA 85 0,45 um) del tamao del gel y dejar hidratando unos minutos en el buffer.

Cuidando no queden burbujas colocar el gel sobre la nitrocelulosa y con esto hacer un sandwich entre 3 hojas de papel filtro Whatman 3MM y las esponjas tipo Scotch Brite.

-Se emsambla en el cartucho de transferencia y este se coloca dentro de la cuba de electrotransferencia (Bio-Rad), que luego se llena de buffer. La transferencia se hace durante toda la noche a 30 V. voltaje constante a 100 V. voltaje constante durante 1 hora.

DETECCION INMUNOLOGICA DE LAS PROTEINAS

ELECTROTRANSFERIDAS

Bloqueo e incubacin con el anticuerpo

-Incubar los filtros durante 30 min. con solucin de bloqueo.

-Incubar con el anticuerpo en una dilucin 1/2000 preparada en solucin de bloqueo, durante 1 hora con agitacin a temperatura ambiente,.

-Recuperar el anticuerpo y lavar el filtro 3 veces durante 15 min. cada lavado con TBS-T.

-Incubar con el anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a fosfatasa alcalina diludo 1/1000 en solucin de bloqueo, durante 60 min. a temperatura ambiente.

-Lavar con TBS-T durante 10 min.repetir este lavado dos veces ms

-Lavar una vez con buffer fosfatasa durate 10 min a temperatura ambiente.

-Preparar el revelador .utiliizando los siguientes sustratos: Bromocloroindoil-fosfato (BCIP) 60 mg/ml en dimetilformamida 100 %.

-Nitro blue tetrazolium (NBT) 50 mg/ml en dimetilformamida 70 %.

Agregar 66 (l de NBT y 33 (l de BCIP en 10 ml del bufffer fosfatasa, mezclar, verter sobre la membrana e incubar 3-10 min a resguardo de la luz.

-Detener la reaccin lavando con agua y secando sobre papel filtro.

SOLUCIONES TBS:

Tris-HCl 0.05 M pH 7.4, ClNa 0.15 M

TBS-T:

TBS, 0.05% Tween 20

Solucin de Bloqueo:

3% de leche en polvo descremada (Molico), 2% glicina en TBS.

Buffer de siembra:

3% SDS, 3% glicerina, 7% (-mercaptoetanol, 0.25% de Azul de bromo fenol, en TBS

Buffer fosfatasa:

Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM; NaCl, 100 mM; MgCl2, 5 mM

Buffer Tris-Glicina 10x (Para 1 litro):

Tris base 30.3 g

Glicina 144.0 g

Agua destilada csp. 1000.0 mlREFERENCIAS1-Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol.Biol.Rep. 5: 387-405

2-Hofgen R. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 9877.

3-Birmboim, H.C. y Doly J. (1979) Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.

4- Horsch RB, Rogers SG and Fraley RT (1985 ) Transgnic plants. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 50: 433-437

5-Murashige T. y Skoog G. (1962) Physiol. Plant 15: 473-477

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8- Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. (1983) A plant DNA minipreparation: Version 2. Plant Molecular Biology reporter. 1: 19-22.

Uso de vectores virales para la expresin transitoria de proteinas heterologas en plantas.

Adems de la expresin integrativa en el genoma vegetal (plantas transgnicas), se han desarrollado sistemas basados en vectores virales para la expresin no integrativa de distintos productos (Santa Cruz et al., 1996). Dado que los virus usados como vectores no se transmiten por semilla ni son capaces de integrarse al genoma vegetal, estos no se transmiten a la progenie y deben introducirse por inoculacin en cada generacin subsiguiente.

Potencialmente, los sistemas de expresin no integrativa permitiran obtener niveles de protenas recombinantes tan altos como los alcanzados por las protenas virales estruc-turales. Debido a que la infeccin viral sobrepasa los mecanismos regulatorios de la clula husped, la utilizacin de estos sistemas permitira explotar los mecanismos de amplificacin viral, eludiendo las restricciones fisiolgicas impuestas sobre la expresin integrativa.

Aunque se han desarrollado sistemas de expresin basados en virus a DNA y a RNA, este tipo de vectores se halla an en la etapa de desarrollo. Los sistemas reportados son variantes de virus pertenecientes a grupos muy diversos, tales como, cauliflower mosaic virus (CaMV), tomato golden mosaic virus (TGMV); african cassava mosaic virus (ACMV); tobacco mosaic virus (TMV), brome mosaic virus (BMV) y potato virus X (PVX). Se han utilizado sistemas derivados de estos virus para la expresin de interfern, inhibidor de la enzima conversora del angiotensina I, tricosantina y encefalina (Takamatsu et al., 1990).

Clones infectivos y vectores virales

La posibilidad de obtener clones infectivos (como cDNA o como transcriptos de RNA sintetizados in vitro) a partir de los genomas de virus vegetales permite disponer de una poderosa herramienta para estudiar sus mecanismos de replicacin y expresin. La obtencin de clones infectivos ha permitido adems su utilizacin como vectores de expresin transitoria (no integrativa) en plantas. Una vez que el virus infecta una clula, es capaz de replicar su genoma y movilizarlo hacia otras clulas de la planta dentro de un perodo de das/semanas

En una vector viral tpico, se reemplaza un gen prescindible para la replicacin por un gen forneo, de forma tal que el promotor subgenmico (Psg) del gen reemplazado dirige la expresin del transgn (vector de reemplazo) (Fig. 1). A veces, se conserva parte del gen viral, producindose una protena de fusin entre un gen viral y el gen exgeno, pero conservando la actividad de la protena fornea. En un segundo tipo de construccin, el gen forneo es insertado dentro del genoma viral intacto (vector de insercin). El gen de inters es expresado a partir de un Psg adicional, ya sea del mismo virus o de un virus relacionado (Fig. 1).

Las ventajas de los sistemas de expresin basados en vectores virales son:

1) permiten niveles de expresin elevados, en comparacin con los obtenidos mediante expresin integrativa a nivel nuclear;

2) requieren perodos de tiempo mnimos para desarrollar y ensayar nuevas construcciones genticas. A los 15-20 das post inoculacin (dpi) el virus ha invadido ya los tejidos de la planta, pudindose establecer en ese momento el nivel de expresin del gen de inters;

3) requieren manipulaciones relativamente simples que incluyen el clonado del gen de inters en el vector, su amplificacin en bacterias, la transcripcin in vitro y la inoculacin mecnica de las plantas;

4) requieren la utilizacin de un menor nmero de plantas por ensayo (por cada construccin a evaluar se inoculan entre 5 y 10 plantas).

En principio, este tipo de vectores debe usarse en sistemas biolgicamente restringidos para evitar su dispersin al medio ambiente. Su utilizacin a campo abierto presupone la utilizacin de sistemas de contenimiento biolgico para bloquear sus mecanismos naturales de transmisin. En el caso particular de TMV y PVX (los cuales no son transmitidos por vectores biolgicos) la va de transmisin principal es la mecnica y se produce a travs de las maquinarias utilizadas en la labranza. Aunque ello establece mayores posibilidades de control de la diseminacin viral, an as es necesario introducir mutaciones y/o deleciones en el vector que eviten el pasaje del virus recombinante de una planta a otra.

Una caracterstica importante de los vectores basados en virus a RNA es la relativa inestabilidad en la expresin del gen exgeno. Ello es debido a la tasa de mutacin relativamente alta asociada a las RNA replicasas RNA dependientes. Es de esperar que un gen forneo (neutro desde el punto de vista de la gentica del virus) mutar a una tasa an mayor, por lo cual se convertira en no funcional o sera deletado en un perodo de tiempo ms o menos corto. Huisman et al. (1992) sugieren que, adems de la inac-tivacin de la informacin por la acumulacin de mutaciones, la desaparicin fsica de la informacin por recombinacin del RNA es un proceso muy rpido. La rapidez con la que este proceso ocurra es, pues, una cuestin a considerar en el diseo de esta clase de vectores. Idealmente, el virus quimrico debera recombinarse lo suficientemente rpido para producir efectos mnimos en el ambiente, pero no tanto como para impedir que la produccin de la protena recombinante sea eficiente. Debe destacarse que estos lapsos se miden en el nmero de generaciones virales que ocurren a partir de la inoculacin y que, en un sistema productivo, el ciclo finalizara con la recoleccin del material vegetal infectado, debindose proceder a una nueva inoculacin en la siguiente generacin de plantas.

En este trabajo prctico utilizaremos una copia completa de cDNA de PVX y un vector viral derivado de esta capaz de expresar el gen marcador Uid-A, a partir de ellos, mediante una reaccin de transcripcin in vitro obtendremos RNAs infectivos.

Estos RNAs sern utilizados para infectar plantas de tabaco, finalmente la infeccin se pondr de evidencia mediante el uso de anticuerpos anti-cpside (clon infectivo) y midiendo la actividad del gen indicador (vector viral).

Fig.1 Vectores virales desarrollados utilizando al virus PVX

psg

pT7

A) Copia completa del virus PVX (pPVX)

psg

pT7

B) Vector de reemplazo, el gen Uid-A reemplaza al gen de cpside del virus PVX (CP)

psg psg

pT7

C) Vector de insercin, en este caso el gen Uid-A se agrega a la copia completa bajo la regulacin de un segundo promotor subgnomico de cpside (psg)

transcripcion in vitroLinealizacin

Se digieren 20 (g del plsmido purificado utilizando 50-100 U de la enzima de restriccin adecuada, en 350 (l de reaccin. Se verifica el corte corriendo una alcuota en un gel de agarosa.

Tratamiento con proteinasa KA los 350 (l del plsmido linealizado se agregan 7 (l de proteinasa K (SIGMA) 5 mg/ml y se incuba 20 min a 37(C.

A partir de este punto todas las manipulaciones se deben realizar en condiciones libres de ARNasa.

Realizar 2 extracciones con fenol:cloroformo:isoamlico (25:24:1) y una extraccin con cloroformo:isoamlico (24:1).

Recuperar la fase acuosa final y precipitar los cidos nucleicos con 1/2 vol. de AcNH4 y 3 vol. de etanol absoluto fro.

Dejar 30 min en hielo y centrifugar igual que antes.

Lavar el pellet 2 veces con 500 (l de etanol 70% fro, centrifugar 5 min a mxima velocidad y eliminar el sobrenadante.

Secar el pellet en un bloque seco a 37(C, y resuspendee en T.E. 10:1 pH 7.5 para que quede aproximadamente 0.5(g/(l

Transcripcin in vitro utilizando T7 ARN polimerasaSe lleva a cabo la reaccin en las siguientes condiciones:

DNA molde lineal2 (g totales

100 mM DTT5 (l

1 mg/ml BSA5 (l

5x Tsc Buffer10 (l

rRNAsin 1.2 (l (50 U)

H2O DEPCc.s.p. 50 (l (totales)

Klenow 1 (l (10 U)

Incubar 15min a temperatura ambiente y agregar

5x rNTPs (5 mM A, C y UTP; 0.5 mM GTP; ) 10 (l

10 mM CAP [m7G(5')ppp(5')G 2.6 (l

T7 RNA polimerasa 40 U

Incubar 60 min a 37(C.

Luego agregar 20 U de T7 RNApol y 10 (l de rGTP 2.5 mM, incubar 60 min a 37(C.

Al cabo de la primer hora de reaccin tomar 1/10 de la reaccin para analizar los ARNs transcriptos en un gel de agarosa.

(

ANALISIS DE LAS MICROPLANTAS

Figura 1

MEDIO DE SELECCIN

MICROCALLOS

(

BROTES

(

ENRAIZAMIENTO

EXPLANTO

(

OBTENCION DE DISCOS

(

COCULTIVO

(

ESQUEMA DEL METODO DE TRANSFORMACION

T-DNA

ch

vir

LBA4404-pBI121

pAL4404

pBI121

pNOS NPT-II tNOS p35S Uid-A (GUS) tNOS

pBI-121

LB

RB

replicasa viral

24 K

poli A

CP

12K

8 K

replicasa viral

24 K

poli A

GUS

12K

8 K

replicasa viral

poli A

CP

GUS

24 K

12K

8 K

2