GUÍA TÉCNICA para los países con escasos recursos económicos ...
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63 GUÍA TÉCNICA para los países con escasos recursos económicos Diagnóstico de la tuberculosis por examen microscópico directo de la expectoración Quinta edición 2000 Unión Internacional contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias 68 boulevard Saint Michel, 75006 París, Francia
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GUÍA TÉCNICA
para los países con escasosrecursos económicos
Diagnóstico de la tuberculosispor examen microscópico directo
de la expectoración
Quinta edición
2000
Unión Internacional contra la Tuberculosisy Enfermedades Respiratorias
68 boulevard Saint Michel, 75006 París, Francia
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COMITÉ DE REDACCIÓN
Mohammed Akhtar
Gisela Bretzel
Fadila Boulahbal
David Dawson
Lanfranco Fattorini
Knut Feldmann
Thomas Frieden
Marta Havelková
Isabel N de Kantor
Sang Jae Kim
Robert Küchler
Frantz Lamothe
Adalbert Laszlo
Nuria Martin Casabona
A Colin McDougall
Håkan Miörner
Graziella Orefici
C N Paramasivan
S R Pattyn
Ana Reniero
Hans L Rieder
John Ridderhof
Sabine Rüsch-Gerdes
Salman H Siddiqi
Sergio Spinaci
Richard Urbanczik
Véronique Vincent
Karin Weyer
Sobre la base de un documento preparado por Adalbert Laszlo, para la Unión Internacionalcontra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias
Diseño de las figuras: Edik Balaian
Traducción: Raúl Díaz
Edición: José Caminero
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La UICT publicó por primera vez en 1978 la Guía técnica para el diagnósticode la tuberculosis por microscopia directa, basada en el documento confeccio-nado en 1969 por el Dr. J. Holm, entonces Director Ejecutivo de la UniónInternacional contra la Tuberculosis. Esta guía fue incluida en la tercera y cuartaediciones de la Guía de la Tuberculosis para los países de escasos recursoseconómicos, de la UICTMR. Estaba diseñada para servir de referencia simplesobre las normas para la recolección, conservación y transporte de las muestrasde esputo y para el examen microscópico directo de los frotis de esputo (baci-loscopia). Estaba destinada especialmente a los trabajadores de la salud de lospaíses de escasos recursos económicos y de alta prevalencia, en los cuales seconcentra la mayor carga mundial de los casos de tuberculosis.
A pesar de los más de veinte años transcurridos desde la primera publicación,la guía no había sido modificada. Hoy en día, la tuberculosis es una de las prin-cipales causas de muerte, por un solo agente infeccioso, en los adultos de lospaíses de escasos recursos, donde sigue siendo un problema importante desalud pública. La herramienta básica para el diagnóstico de la tuberculosis, esdecir, el examen microscópico directo del esputo, no ha cambiado en sus detallestécnicos, a pesar de los avances mayores de las modernas tecnologías de dia-gnóstico. Sin embargo, el contexto en el cual se aplica, es decir, el ProgramaNacional de Tuberculosis, se ha mejorado considerablemente en la dos últimasdécadas.
La utilización de la guía en el terreno, a través de los años, ha revelado omi-siones e imprecisiones que requerían ser abordadas. Además, los aspectos deseguridad y de control de calidad de la baciloscopia no habían sido tratados demanera suficiente en la edición anterior. Así, se estimó que la Guía Técnica dela UICTER debía ser revisada para que refleje en mejor forma su carácter de ins-trumento de salud pública y para ponerla al día con las modernas estrategias delcontrol de la tuberculosis. Este documento ha sido revisado cuidadosamentepor los miembros de Sección Bacteriología e Inmunología de la UICTER, por losdirectores de la Red de Laboratorios de referencia Supranacionales de laTuberculosis de la OMS/UICTER y por otros distinguidos profesionales en eldominio del control de la tuberculosis.
DR ADALBERT LASZLO
Ottawa 2000
PREFACIO
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1. INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2. EL LABORATORIO DE BACILOSCOPIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.1 Las funciones del laboratorio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.2 Acondicionamiento físico del laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
2.3 Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.4 Preparación de los reactivos para el método de tinción de Ziehl-Neelsen . . . . . 71
3. RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.1 La toma de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 733.1.1 Muestras de esputo para el diagnóstico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 733.1.2 Muestras de esputo para el seguimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2 Recolección de las muestras de esputo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.3 El envase de recolección de esputo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.4 Transporte de las muestras de esputo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.5 Registro del paciente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4. PREPARACIÓN DE LOS FROTIS PARA EL EXAMEN MICROCÓPICO. . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.1 Identificación de las láminas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.2 Confección del Extendido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4.3 Fijación de los frotis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.4 Tinción de los frotis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 804.4.1 Método de tinción de Ziehl-Neelsen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
• Tinción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80• Decoloración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81• Contratinción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.4.2 Calidad del extendido y de la coloración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
5. EXAMEN MICROSCOPICO DE LOS FROTIS DE ESPUTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.1 El microscopio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.2 Uso del microscopio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.3 Examen de los frotis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.4 Graduación de los resultados de la baciloscopia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
5.5 Registro e informe de los resultados de la baciloscopia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
5.6 Conservación de los frotis en espera del control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
CONTENIDO
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6. CONTROL DE CALIDAD DE LA BACILOSCOPIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
6.1 Definiciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
6.2 Procedimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
7. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROSCOPIA DE LA TUBERCULOSIS 88
7.1 Aspectos generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
7.2 Aspectos específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
8. GESTIÓN DE LOS MATERIALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
SUGERENCIAS DE LECTURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
Anexo 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95• Prevención de resultados falsos positivos de la baciloscopia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95• Consecuencias de los resultados falsos positivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95• Prevención de resultados falsos negativos de la baciloscopia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95• Consecuencias de los resultados falsos negativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Anexo 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96• Mantenimiento del microscopio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Anexo 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97• Guía para la solución de los problemas de microscopia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
En los países de escasos recursos econó-micos y con alta prevalencia de tuberculosis,el examen microscópico directo de esputo obaciloscopia, es y seguirá siendo, en un
futuro previsible, la única herramienta conbuena relación costo-eficacia para el dia-gnóstico y el seguimiento del tratamiento delos pacientes con tuberculosis contagiosa. Labaciloscopia es una técnica simple, barata yapropiada, relativamente fácil de realizar yde leer. Produce resultados rápidos, con unagran sensibilidad para la detección de lossujetos que transmiten el bacilo tuberculosoy proporciona la mayoría de los indicadoresepidemiológicos de laboratorio, esencialespara la evaluación del Programa Nacional deTuberculosis (PNT).
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1. INTRODUCTION
2. EL LABORATORIO DE BACILOSCOPIA
Los objetivos de los servicios de diagnós-tico en los laboratorios de tuberculosisdentro de la estructura de un PNT son:– el diagnóstico de los casos contagiososresponsables de la transmisión de la enfer-medad.– el seguimiento durante el tratamientohasta la curación.
2.1 Las funciones del laboratorio
En los países en desarrollo la mayoría delos diagnósticos bacteriológicos de tubercu-losis se realiza en laboratorios locales o per-iféricos cuya responsabilidad principal es lade efectuar las baciloscopias para el PNT,examen microscópico de diagnóstico basadoen el examen directo de extendidos deesputo después de su tinción con la técnicade Ziehl-Neelsen (ZN). Estos laboratorios,ubicados en los centros de salud, postas desalud, hospitales, etc. en general, cuentancon personal técnico especializado capaz derealizar las baciloscopias, entre otras tareas.Estos laboratorios deben poder realizar lassiguientes funciones:– realizar todas las baciloscopias solicitadasen el área asignada, habitualmente un dis-trito (50 000 a 150 000 habitantes);– servir de centro de referencia para las uni-dades de recolección de muestras;– coordinar con los Laboratorios Regionales(intermedios), la referencia de las muestrasque requieren cultivo y pruebas de sensibili-dad;– recibir las muestras durante las horas deatención del Centro de Salud;– enviar la información al Laboratorio Regional;
– cumplir las directivas nacionales de controlde calidad;
– pedir, administrar y almacenar el materialde laboratorio.
2.2 Acondicionamiento físicodel laboratorio
Los detalles del acondicionamiento dellaboratorio de baciloscopia variarán consi-derablemente según las condiciones locales.Es difícil dar normas generales acerca deldiseño del laboratorio, puesto que, con eltiempo, en muchos países, éstos han sidointegrados en los servicios de diagnóstico delos laboratorios generales. Idealmente, ellaboratorio de baciloscopia para el diagnós-tico de la tuberculosis debe incluir lassiguientes secciones independientes (Figura1, adaptada de Collins y col.1):
– un espacio para una mesa (A) para depo-sitar las muestras que llegan (Figuras 1 y 2);
– una mesa bien iluminada (B), para la pre-paración de los frotis (Figuras 1 y 3);
– una pila o cubeta para la tinción (C), conagua corriente (Figuras 1 y 4);
– una pila o cubeta (D) con agua corrientepara el lavado de las manos;
– una mesa (E) para el examen microscópico,delante de una ventana (Figuras 1 y 5);
– una mesa o mesa (F) para los libros deregistro y el almacenamiento de los frotis(Figuras 1 y 6);
– un guardarropa o armario cerrado (G), parala ropa del personal (Figura 1).
Si el mesón de trabajo está hecho conmaterial poroso, debe cubrirse con una placade material no poroso como fórmica, metalgalvanizado o aluminio; esta placa debe teneralrededor de 80 cm de ancho y bordes de 5cm de alto. El borde anterior debe doblarsehacia abajo en un ángulo de 90° para ajus-tarse al borde de la mesa, lo que facilitará lasmanipulaciones (Figura 3). Todas estas mani-pulaciones deben realizarse sobre esta super-ficie, la que debe ser descontaminada todoslos días después de su empleo con un ger-micida antituberculoso (p. ej. fenol al 5% ouna solución de hipoclorito de sodio al 0,1%*[NaClO], conocida también como blanquea-dor casero, cloro, agua de javel, etc.).
2.3 Material necesario
Los detalles del material son menciona-dos en la Figura 3
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Figura 1
Figura 2
* El cloro casero contiene 5% de NaClO (50 g/litro).Para preparar una solución al 0,1%, que contiene 1gde NaClO/litro se diluyen 20 ml de cloro en un litro deagua. Esta solución se utiliza como desinfectante deuso múltiple para las situaciones de «limpieza rela-tiva».
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Figura 3
1. Porta-láminas para la preparación de los frotis2. Secador para los frotis3. Envase de esputo colocado lo más cerca posible a la
derecha del porta-láminas4. Palillos de madera
5. Lámpara de alcohol/Mechero de Bunsen6. Pinza7. Receptáculo metálico para desperdicios, con tapa, para
depositar el material contaminado8. Caja de láminas grabadas para los frotis
NOTA: Si el técnico es zurdo, puede sermás práctico disponer sobre la mesa todos ola mayor parte de los elementos de la Figura3 en posición inversa (imagen en espejo).
2.4 Preparación de los reactivospara el método de tinciónde Ziehl-Neelsen
El método más apropiado de coloraciónpara el examen microscópico directo deesputo es el de Ziehl-Neelsen (ZN), puestoque es el único que da regularmente buenosresultados, sin necesidad de un equipa-miento especial. Para la preparación de los
reactivos necesarios se requiere una balanza,que no se encuentra siempre disponible enlos laboratorios periféricos. La solución másfrecuente es la preparación de los reactivosen el Laboratorio Nacional de Referencia oen el laboratorio intermedio más cercano. Laventaja de esta solución es la mejor estan-darización y garantía de calidad, que son másimportantes que la desventaja de un alma-cenamiento más prolongado. No se reco-miendan las técnicas de tinción al frío, talescomo la de Kinyoun y de Tan Thiam Hok, yaque se ha probado que permiten difícilmentela detección de los bacilos ácido alcohol resis-tentes (BAAR) en las muestras paucibacilaresde esputo y que la tinción se hace pálida rápi-damente. La microscopia por fluorescencia,
recomendada cundo el volumen de trabajoexcede las 50 muestras por día, no tienecabida en la mayoría de los laboratorios delos países de escasos recursos económicos.
a) Carbol fucsina de Ziehl
Solución stock de fucsina alcohólica al 3%(solución A)
Fucsina básica*...................................3g†
Alcohol‡de 95%...............hasta completar 100 ml
Colocar la cantidad requerida de fucsinaen un frasco o cilindro graduados y agregarla cantidad de etanol o de alcohol metíliconecesaria para obtener un volumen total de100 ml y luego agitar enérgicamente hasta ladisolución completa. Las pequeñas canti-dades de esta solución deben ser filtradasantes de proceder a la tinción.
b) Solución acuosa de fenol(solución B)Cristales de fenol§ ...............................5 g
Agua destilada,si posible.............hasta completar 90 ml
Antes de agregar el agua, licuar los cris-tales de fenol calentándolos suavemente.
Para preparar la solución de trabajode fucsina fenicada de Zihel al 0,3% mezclar10 ml de la solución A con 90 ml de la solu-ción B.
c) Soluciones decolorantes
– Solución ácido-alcohol
Alcohol de 95%.............................970 ml
Acido clorhídricoconcentrado (35%)**......................30 ml
O, cuando el alcohol no está disponible:
– Solución acuosa de ácido sulfúrico al 25%
Agua destilada, si posible............300 ml
Acido sulfúrico concentrado†† .....100 ml
Colocar 300 ml de agua en un frasco de1 litro de tipo Erlenmeyer. Agregar lenta-mente 100 ml de ácido sulfúrico, permitiendoque el ácido fluya a lo largo de las paredesdel frasco. Se notará que la mezcla se va acalentar. Nunca vaciar el agua dentro del
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Figura 4
ácido sulfúrico: esto puede provocar salpica-duras explosivas.
d) Solución de contratinción de azulde metileno al 0,3%
Cloruro de azul de metileno‡‡ .........0,3 g
Agua destilada, si posible............100 ml
* Cloruro de pararosanilina, contenido mínimo encolorante 88% (C19H18NCl) Sigma P1528 o equiva-lente.† Los polvos de colorantes en general no son puros,de manera que el peso debe ser corregido para ase-gurar una coloración adecuada. El porcentaje decolorante disponible en el contenido, frecuentementeesta indicado en la etiqueta del envase original. Elpeso corregido se obtiene dividiendo la cantidad decolorante deseada por la fracción decimal del colo-rante disponible. Así, si la cantidad de colorantedeseado es de 3 g y el porcentaje de colorante dis-ponible es de 75%, la cantidad efectiva de coloranteque debe ser pesada es de 3/0,75 = 4g de coloranteimpuro. Si el contenido en colorante es de 88% omás, no es necesario proceder a la corrección.‡ Etanol 95% (C2H5OH) - Farmacopea de los E.E.U.U.XVIII, 20 1067 (1970). Se autoriza la calidad indus-trial.§ Fenol aproximativamente a 99% (C6H60) - Sigma P3653 o su equivalente.** Acido clorhídrico concentrado (HCL) - Se puedeusar la calidad industrial.†† Acido sulfúrico concentrado (H2SO4) - Se puedeusar la calidad industrial.‡‡ Cloruro de metiltionina, contenido mínimo encolorante 82% (C16H18CIN3S) - Sigma M 9140 o suequivalente.
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Figura 6Figura 5
3. RECOLECCIÓN Y TRANSPORTEDE LAS MUESTRAS DE ESPUTO
men de la primera muestra, un 15% adicionalcon el de la segunda y el 5% restante con elde la tercera.
3.1.2 Muestras de esputo parael seguimiento
El tratamiento de la tuberculosis com-prende dos fases: la fase intensiva, que durahabitualmente 2 ó 3 meses y la fase de conti-nuación que dura de 4 a 10 meses, depen-diendo del tipo de tratamiento. Indepen-dientemente del esquema de tratamiento, sedebe recolectar una muestra «MATINAL»para seguimiento, al final de la fase intensivapara determinar si el paciente puede pasar ala fase de continuación, si la baciloscopia esnegativa o, si ésta es positiva, continuar lafase intensiva. Se debe tomar otra muestrade esputo al 5o mes de la fase de continua-ción, para controlar la evolución del pacientey para detectar un posible fracaso del trata-miento y otra muestra al final del tratamientopara confirmar la curación. A menudo, lasmuestras al final del tratamiento no se obtie-nen fácilmente, debido a que el paciente yano expectora. El esquema exacto de bacilo-scopias de seguimiento varía según losesquemas de tratamiento y debe ser preci-sado en el Manual del PNT.
3.1 La toma de muestras
3.1.1 Muestras de esputo parael diagnóstico
En las condiciones de trabajo del PNT, laUICTER recomienda la recolección de tresmuestras de esputo, «EN EL MOMENTO DELA CONSULTA», «MATINAL» al despertarseen el domicilio y nuevamente «EN ELMOMENTO DE LA CONSULTA», cuando elpaciente vuelve con la muestra recolectadaen el domicilio.
La muestras deben recolectarse de pre-ferencia en un período de dos días, paratodas las personas que se presentan a loscentros de salud, a los dispensarios del hos-pital, etc., con síntomas respiratorios durantemás de tres semanas. Estas muestras debenser examinadas al microscopio en el labora-torio más próximo. Bajo estas condiciones, sedefine un caso de tuberculosis con bacilo-scopia positiva, como la persona que se pre-senta con síntomas respiratorios y que tienepor lo menos dos baciloscopias positivas.
Este método, llamado también detecciónpasiva, detecta alrededor del 80% de loscasos sospechosos que finalmente son consi-derados con baciloscopia positiva, con el exa-
3.2 Recolección de las muestrasde esputo
Cuando el enfermo sospechoso de tuber-culosis tose, existe un riesgo elevado deinfección para el personal de salud. Por esto,las muestras deben ser obtenidas al aire librey lo más alejado posible del resto de la gente.Si esto no es posible, debe utilizarse un localaislado y bien ventilado.
El personal de salud debe despertarconfianza en el paciente sospechoso detuberculosis, explicándole las razones delexamen y la manera de toser, de forma queel esputo provenga de lo más profundo desu pecho. Si el paciente puede leer, se le pue-den dar además instrucciones por escrito.
El personal de salud debe asegurarse quela muestra tiene un volumen suficiente (3 a 5
ml) y que contenga material sólido o puru-lento y no solamente saliva, para aumentar lasensibilidad de la detección. Sin embargo, sisólo se obtiene saliva o, como sucede amenudo en la toma de muestra en «en elmomento de la consulta», si el volumen esinferior a 3 ml, de todas maneras la muestradebe ser examinada, pues a veces da resul-tados positivos. La muestra puede ser clasi-ficada por examen macroscópico como «sali-val» cuando contiene principalmente saliva,«mucosa» cuando contiene principalmentemoco, «purulenta», cuando es amarilla comoel pus, «mucopurulenta» cuando hay partí-culas amarillentas visibles en el moco y«sanguinolenta» cuando contiene sangre.Siempre debe anotarse la presencia desangre, porque puede indicar una enferme-dad grave y puede interferir en la lectura dela baciloscopia.
El personal de salud debe entregar losenvases marcados con el código del centrode salud y la identificación del paciente o sos-pechoso de tuberculosis debe ser escrita enlas paredes del envase y nunca en su tapa(Figura 7 C). Se debe pedir a la persona queva a someterse al examen que mantenga elenvase cerca de la boca y que expectore en él(Figura 7 B). La muestra obtenida se llamamuestra «en el momento de la consulta».
Si no hay producción de esputo, elenvase debe ser considerado como utilizado
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La UICTER recomienda:– El examen de tres muestras de esputo -
«EN EL MOMENTO DE LA CONSULTA»+ «MATINAL» + «EN EL MOMENTO DELA CONSULTA» - para el diagnóstico delos casos de tuberculosis.
– El examen de una sola muestra deesputo «MATINAL» en tres ocasionespara el seguimiento del tratamiento: unaal final de la fase intensiva, una durantela fase de continuación y una al final deltratamiento.
Figura 7
A
C
B
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Figura 8
A
C
B
y ser procesado como tal, según las normas.El envase debe ser cerrado en forma seguray, si debe ser enviado a un laboratorio cer-cano, debe ser colocado en una caja especialpara su transporte. Las muestras recolecta-das deben ser etiquetadas, guardadas en unlugar fresco y transportadas sin demora, esdecir, por lo menos dos veces por semana yexaminadas al microscopio dentro de las 24horas.
En situaciones muy particulares en quelas estructuras de salud que disponen demicroscopio están alejadas de los centros desalud, la expectoración también puede serprocesada en el centro de salud y enviarselos extendidos (frotis) ya preparados y fija-dos al laboratorio más cercano. Sin embargo,este procedimiento no es aconsejable, puestoque los frotis fijados, preparados por un per-sonal no entrenado son generalmente demala calidad y tienen tendencia a descom-ponerse rápidamente en los climas cálidos yhúmedos.
El personal de salud debe entregar a lapersona sospechosa de tuberculosis unnuevo envase etiquetado, explicándole quees para ser usado la mañana siguiente, pararecolectar la muestra «MATINAL» y debemostrarle cómo cerrarlo antes de traerlo devuelta al centro de salud.
3.3 El envase de recolecciónde esputo
Se recomienda la utilización de dos tiposde envase para la recolección de las muestrasde esputo, respetando la seguridad delpaciente y del personal y asegurando labuena calidad de la muestra. Uno, disponibleen la UNICEF (Figura 7 A), que es rígido, deboca ancha, de plástico, transparente, contapa de rosca, fácilmente destructible porcombustión; se usa para la mayor parte delos diagnósticos de rutina. Su tapa de roscapuede cerrarse herméticamente para preve-nir la desecación y las filtraciones.
El otro, es un frasco de vidrio pesado, contapa de rosca de tipo «frasco universal»(Figura 8 A). Estos frascos pueden volver a uti-lizarse después de limpieza cuidadosa y desin-fección en autoclaves durante 30 minutos a121°C. Si no se dispone de autoclave, se reco-mienda una olla a presión de tipo doméstico.
Cualquiera sea el tipo de envase utilizado,si deben ser transportados, se recomiendahacerlo en cajas de metal, madera o poliesti-reno, fabricados especialmente. Una caja demadera es una buena solución de compro-miso en términos de solidez y peso (Figura 8B,C).
3.4 Transporte de las muestrasde esputo
En los países que carecen de recursos delaboratorio y que han establecido unidadesde recolección de muestras, el transporte de
las muestras es indispensable. También esnecesario este transporte cuando se hanemprendido proyectos de investigación ope-racional que interesan al PNT, tales comoestudios de resistencia a los medicamentos,etc. Si se requiere hacer cultivos de las mues-tras, éstas deben llegar al laboratorio dentrode los 3-4 días y deben ser refrigeradas mien-tras esperan el envío. Debe seleccionarse elmedio de transporte con la mejor relacióncosto-eficacia. La flora de contaminación noafecta la ácido-resistencia de las micobacte-rias, pero puede licuar el esputo haciendodifícil la preparación del extendido, lo quehace la lectura menos fiable.
El envío debe ser acompañado de unalista que identifica las muestras de esputocontenidas en la caja de transporte y de unformulario de Pedido de examen de expec-toración (Figura 9) para cada muestra. Antesdel envío, el personal del centro de saluddebe verificar para cada caja de transporteque:– el número total de envases de la caja detransporte corresponde al de la lista que laacompaña y a los formularios de Pedido deexamen de expectoración;– El número de identificación de cada envasecorresponde al de la lista y al del formulariode Pedido de examen de expectoración;– los formularios de Pedido de examen deexpectoración contienen la informaciónrequerida para cada persona sospechosa detuberculosis.
Una vez que esta verificación ha sido rea-lizada, el personal de salud debe:
– poner la fecha en la lista
– poner la lista y los formularios de Pedidode examen de expectoración en un sobreque será fijado al exterior de la caja de trans-porte.
3.5 Registro del paciente
Toda la información contenida en el for-mulario Pedido de examen de expectoracióndebe ser transcrita en forma completa en losespacios correspondientes del Registro delLaboratorio de la Tuberculosis (Figura 10).Debe anotarse toda la información solicitada,es decir que, un espacio en blanco no cor-responde a un olvido de registro, sino a laausencia de información.
El Registro del Laboratorio de la UICTERtiene dos características esenciales y útiles:distingue entre baciloscopia para el diagnós-tico y baciloscopia para el seguimiento deltratamiento y asigna una sola línea para cadapersona sospechosa de tuberculosis exami-nada y no para cada muestra de esputo exa-minada. Esto permite el cálculo de la tasa decasos con baciloscopia positiva entre los sos-pechosos, la cual a su vez permite planificarlos requerimientos de material de laborato-rio, basados en el número de casos positivosinformados.
El Número de Serie del Laboratoriocomienza con el 1 el 1° de enero de cada añoy aumenta con cada paciente hasta el 31 dediciembre del mismo año.
76
4. PREPARACIÓN DE LOS FROTISPARA EL EXAMEN MICROCÓPICO
4.1 Identificación de las láminas
El personal del laboratorio inscribirá encada muestra de esputo el código del labo-ratorio, un número de serie y un identificadorde la secuencia de las muestras, es decir, 1para la primera, 2 para la segunda, 3 para latercera (Figura 11).
4.2 Confección del Extendido
Los envases con las muestras de esputodeben ser dispuestos según el orden desecuencia. El número de serie del laboratoriodebe coincidir con la información correspon-diente inscrita en el formulario de Pedido deexamen de expectoración que los acompaña.
77
Figura 9. Pedido de examen de expectoración
PEDIDO DE EXAMEN DE EXPECTORACIÓN
Nombre de la Unidad de Tratamiento Fecha
Nombre del Paciente
Edad Sexo (marque una casilla) : M [ ] F [ ]
Dirección (precisa)
Razón del examen (marque una casilla) : diagnóstico [ ] examen de seguimiento [ ]
Firma de la persona que pide el examen
El formulario completo (con los resultados) debe ser enviado rápidamente a la Unidad de Tratamiento.
Fecha Examinado por (Firma)
* Aspecto visual del esputo (sanguinolento, muco-purulento, saliva).
RESULTADOS (completar en el laboratorio)
No de serie del Laboratorio.
+ + ++ ++1-9Neg.Aspecto*Muestra
1
2
3
Fecha
Resultados
78
Figura 10. Registro del Laboratorio de Tuberculosis
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Se recomienda la utilización de láminas nue-vas para los frotis; sin embargo, como éstasa menudo son grasosas, tienen tendencia apegarse y deben se limpiadas con alcohol ycuidadosamente secadas al aire. Cuando nose dispone de alcohol, las láminas puedenser flameadas para extraer los aceites. En lascondiciones climáticas prevalentes en lamayor parte de los países de escasos recur-sos, se recomienda la utilización de láminasempaquetadas a la manera tropical (cadalámina separada de la siguiente por una tirade papel impermeable). El número del códigodel laboratorio, el número de serie y el iden-tificador de la secuencia de las muestras pue-den gravarse con un marcador de diamanteal lado del frotis, en un extremo de la lámina.Cuando no se dispone de marcadores de dia-mante, se puede usar una fresa dental conpunta redonda, dada de baja, inserta en elextremo cónico de un lápiz plástico3. Si sedispone de láminas con el extremo no pulido,se puede utilizar un lápiz de mina ordinario.
• Verificar la concordancia entre el númerode las láminas y el de los envases.
• Tomar el envase correspondiente alnúmero de la lámina.
• Abrir cuidadosamente el envase para evitarla producción de aerosoles infectantes
• Quebrar un palillo de madera o de bambú(Figura 12), elegir partículas amarillas (puru-lentas) del esputo con el extremo quebradodel palillo. Utilizar al mismo tiempo las dospuntas quebradas del palillo para desmenu-zar las partículas más grandes.
• Esparcir el esputo regularmente sobre elárea central de la lámina con un movimientocontinuo de rotación (Figura 13); la dimen-sión recomendada del extendido es de alre-dedor de 20 mm por 10 mm (Figura 11).
• Colocar las placas sobre el secador con lasuperficie donde se encuentra el extendidohacia arriba y dejar secar al aire durante 30minutos aproximadamente.• Volver a cerrar el envase el cual no debeser eliminado antes que los resultados seanleídos y registrados.• Los palillos pueden se utilizados una solavez. Para eliminarlos colocarlos en unreceptáculo de desperdicios que contengauna solución acuosa de fenol al 5% o unasolución de hipoclorito de sodio al 0,5%* yluego pasarlos al autoclave o al incinerador.ATENCION: los vapores son muy tóxicos.
79
Figura 11
Figura 12
Figura 13
* El hipoclorito de sodio es un agente oxidantepotente, corrosivo para el metal. Para preparar unasolución al 0,5% que contiene 5 g de NaClO/litro, sediluyen 100 ml de cloro de uso caser en 1 litro deagua. Esta solución se utiliza en «condiciones desuciedad».
4.3 Fijación de los frotis
Fijar los frotis tomándolos con una pinzay pasándolos por una llama 5 veces durante4 segundos aproximadamente, con el ladodel extendido de esputo hacia arriba (Figura14). No fijar los frotis húmedos y no calentarexcesivamente.
80
Figura 14
4.4 Tinción de los frotis
4.4.1 Método de tinciónde Ziehl-Neelsen
Tinción
• Colocar los frotis fijados sobre el caballetede tinción, en el orden de serie y con el ladodel extendido de esputo hacia arriba. Los fro-tis deben estar separados por un espacio de1 cm y jamás deben tocarse entre ellos.• Cubrir cada frotis con la solución de trabajode carbol fucsina de Zihel al 0,3%, filtrada(Figura 15). Colocando una banda de papelabsorbente, como papel filtro o aun papel dediario, se retendrá la solución colorante y seevitarán los depósitos de cristales de fucsinasobre el frotis.• Calentar las láminas por debajo, con lallama de un mechero Bunsen, una lámparade alcohol o una mecha de algodón empa-pada en alcohol, hasta que se produzcavapor. La solución colorante nunca debe her-vir. No permitir que el colorante se seque(Figura 16).
• Dejar actuar el colorante caliente y hu-meante durante 5 minutos, recalentando sies necesario.• Enjuagar los frotis con un chorro suave deagua para remover el exceso de colorante(Figura 17).
Figura 15
Figura 16
Figura 17
81
• Remover el exceso de agua de enjuaguede las láminas (Figura 18). El frotis de esputoaparece de color rojo.
Figura 19
Figura 18
Decoloración
• Cubrir las láminas con ácido sulfúrico al25% o con una solución alcohol-ácida y dejaractuar durante 3 minutos, después de loscuales el color rojo deberá desaparecer casicompletamente (Figura 19). Si es necesario,repetir estas operaciones hasta que el colorrojo desaparezca, pero evitar un exceso dedecoloración.
• Lavar suavemente con agua el ácido sulfú-rico o la solución alcohol-ácida y el excesode colorante (Figura 20). Remover el excesode agua de enjuague de las láminas (Figura21).
Figura 20
Figura 22
Figura 21
Contratinción
• Cubrir cada lámina con la solución decontratinción de azul de metileno al 0,3% ydejar actuar durante un minuto (Figura 22).
82
Figura 23
Figura 24
• Enjuagar cada lámina con agua (Figura23).
• Remover el agua de las láminas y dejarlassecar al aire (Figura 24).
La técnica de tinción de Ziehl-Neelsenrequiere:
– Tinción durante 5 minutos
– Decoloración durante 3 minutos
– Contratinción durante 1 minuto
4.4.2 Calidad del extendidoy de la coloración
– Un frotis correctamente teñido debe mos-trar un color azul claro, debido al azul demetileno. Si el color es demasiado oscuro,es decir, cuando es imposible leer un texto através del frotis, significa que el frotis esdemasiado espeso.
– Ejemplo de un buen frotis (Figura 25).
Figura 25
Figura 26
– Ejemplos de frotis de mala calidad (Figura26).
BUEN FROTIS
83
5. EXAMEN MICROSCOPICO DE LOSFROTIS DE ESPUTO
5.1 El microscopio
Para el examen de los frotis se requiereun microscopio binocular con dos objetivos,uno estándar con aumento de ~ 40 y un obje-tivo de inmersión con aumento de ~ 100 asícomo oculares de aumento moderado (~ 8 o~ 10) (Figura 27).
Se recomienda el uso de microscopiosprovistos de una opción de espejo comofuente luminosa, que son útiles en caso decortes de electricidad o en los laboratoriosque no poseen electricidad. El espejo tieneuna superficie plana para la luz artificial y otracóncava para la luz natural. La base delmicroscopio contiene una fuente luminosa;una bombilla halógena da una buena ilumi-nación. Las lámparas halógenas dan mejorluminosidad y tienen mayor duración que lasde tungsteno.
Cuando no se usa el microscopio debeser guardado en su caja, para protegerlo delpolvo, del calor y de la humedad. El sistemaóptico del microscopio está constantementeamenazado por el crecimiento de hongos,que puede ser inhibido por la instalación deuna lámpara de 20-40 watts al interior de lacaja, la que se mantendrá encendida duranteel tiempo en que el microscopio está guar-dado. Todos los días deben limpiarse losobjetivos, los oculares, el condensador y lafuente luminosa, con un papel para lentes.
5.2 Uso del microscopio
– Poner una gota de aceite de inmersiónsobre el frotis teñido y secado, para aumentarel poder de resolución. No tocar la lámina conel aplicador de aceite para evitar la contami-nación con BAAR. No se debe usar aceite deinmersión de cedro, puesto que, después delsecado forma una pasta espesa que puededañar los lentes del microscopio. Algunossubstitutos como el aceite de lino, de palma ode oliva o la parafina líquida, dan resultadosmuy insuficientes. Algunos aceites de inmer-sión pueden disolver la fucsina4 , lo que hace
palidecer rápidamente la coloración de ZN.Se recomienda la utilización de hidrocarbu-ros sintéticos y de polímeros avanzados coníndice de refracción de 1,5, puesto que no sesecan, no endurecen y no son disolventes.*– Colocar la lámina teñida sobre la platina,con el condensador en su posición más ele-vada y ajustar la fuente luminosa para obte-ner el máximo de luz mirando por el ocular,utilizando el objetivo estándar de ~ 40.– Seleccionar una zona que contenga másleucocitos (células de pus) que células epite-liales (más frecuentes en la saliva) antes deponer la goa de aceite de inmersión.– Bajando lentamente el objetivo de inmer-sión con el tornillo macrométrico, se formaráun fina película de aceite entre el objetivo y lalámina. Completar el enfoque utilizando eltornillo micrométrico. Se debe evitar que elobjetivo toque la lamina.
Para mayor información sobre la utiliza-ción y manipulación del microscopio, verreferencia 5.
5.3 Examen de los frotis
– Los bacilos ácido-alcohol resistentes(BAAR) aparecen en color rojo o rosa sobreun fondo de contratinción azul. Su forma esmuy variable (filamentos cortos ligeramentecurvos o filamentos alargados); pueden estarteñidos de manera uniforme o desigual ypueden ser más o menos granulosos. Puedenestar aislados, en parejas o agrupados y sepresentan típicamente como bastoncitos lar-gos, delgados e incurvados.– La lectura debe hacerse de manera sis-temática y estandarizada. Puede comenzar enel extremo izquierdo del frotis. La lecturaempieza en la periferia del campo y se terminaen el centro. Después de haber examinado uncampo microscópico, mover el frotis horizon-
* Aceite de inmersión tipo A o B (R.P. Cargille Labs,Inc. Cedar Grove, NJ. Catálogo N° 16484 o aceite deinmersión de la marca VWR, Resolve, CatálogoN°48218 o su equivalente).
84
Figura 27
1) ocular ; 2) anillo dióptico ; 3) objetivo ; 4) platina ; 5) condensador ; 6) regulador del diafragma ; 7) tornillo macrométrico para el enfoque grosero ;
8) tornillo micrométrico para el enfoque fino de lectura ; 9) fuente luminosa.
talmente, de modo de poder examinar loscampos vecinos. Enseguida la lámina se des-plaza verticalmente para poder leer unasegunda fila, de derecha a izquierda. Hay alre-dedor de 100 campos microscópicos de inmer-sión en el eje longitudinal de un frotis de 2 cm.Tres líneas del frotis examinadas correspon-den a 300 campos microscópicos controlados.La lectura comienza en la periferia del campoy se termina en el centro (Figura 28).
El microscopista debe tomar por lomenos 5 minutos para leer 100 campos y,cuando trabaja a tiempo completo, no se debeesperar que procese y lea más de 25 frotis pordía. No debe procesar más de 10 a 12 frotis deuna sola vez. Sin embargo, esta situación sepresenta raramente, incluso en los laborato-rios periféricos de los países con alta inci-dencia. Cuando la baciloscopia para el dia-gnóstico de la tuberculosis está totalmenteintegrada en los servicios generales de aten-ción primaria de la salud, el verdadero desafíoes llegar a tener un volumen suficiente de tra-bajo para mantener la competencia necesariapara la ejecución de este examen.
5.4 Graduación de los resultadosde la baciloscopia
La información sobre el número de baci-los encontrados es muy importante, puestoque tiene relación con el grado de conta-giosidad del paciente y con la gravedad de
85
Figura 28
Núméro de BAAR Registro/informe
Ausencia de BAAR en un minimo de 100 campos 0 / negativa
1 a 9 BAAR en 100 campos* Número real de BAAR‡
10 a 99 BAAR en 100 campos† +
1 a 10 BAAR por campo en un minimo de 50 campos† ++
> 10 BAAR por campo en un minimo de 20 campos† +++
Cuadro 1 Graduación de los resultadosde la baciloscopia recomendada por la UICTER
* El hallazgo de 1 a 3 bacilos en 100 campos no se correlaciona bien con la positividad del cultivo. La interpretación delsignificado de este resultado debiera dejarse al PNT y no a un microscopista. Se recomienda preparar un nuevo frotis apartir de la misma muestra de expectoración y volver a examinarla.† En la práctica, la mayor parte de los microscopistas leen algunos campos y confirman su observación por un barridovisual rápido de los campos restantes.‡ Se recomienda mencionar el recuento real de BAAR para permitir a la autoridad competente determinar si ese númerocoincide con la definición de caso del PNT.
la enfermedad. Por esta razón, los resulta-dos deben informarse de manera no sola-mente cualitativa, sino también semicuan-titativa. La UICTER recomienda la siguientegraduación de los resultados de la bacilo-scopia (Cuadro 1).
Un formulario que indica que un frotis espositivo constituye un documento en el cualse basa el diagnóstico de la tuberculosis pul-monar. En lo posible, la lectura de los frotispositivos debe ser confirmada por unsegundo lector.
5.5 Registro e informe de losresultados de la baciloscopia
Una vez que la lectura de los frotis estáterminada y que se han realizado los even-tuales controles necesarios (frotis positivosy frotis dudosos), los resultados del examenserán anotados en el Registro de Laboratorio(los resultados positivos deben anotarse enrojo) y en la mitad inferior del formulario dePedido de examen de expectoración.
Luego, debe poner la fecha y presentar elformulario para la firma del responsable dellaboratorio.
Los formularios de Pedido de examen deexpectoración rellenados deben ser devuel-tos al centro de tratamiento o al médico tra-tante dentro de los dos días hábiles quesiguen. En caso en que el esputo haya sidoenviado a partir de otra unidad de salud, elpaciente debe recibir una copia del formula-rio rellenado y el original debe ser enviado alcentro de tratamiento. Nunca deben darselos resultados solamente al paciente. Si ésteno entrega los resultados al centro de trata-miento, no recibirá tratamiento.
Después de haber terminado el examende cada lote de muestras recibidas, se deberegistrar la fecha en la lista de despacho, lacual debe ser devuelta, junto con las cajas detransporte, al centro de salud de origen, lomás pronto posible. Las cajas de transportese limpian con un paño empapado en un ger-micida antituberculoso (fenol al 5% o hipo-clorito de sodio al 0,1%). Atención: estas dossoluciones son extremadamente corrosivas,por lo que deben manipularse con guantes.
5.6 Conservación de los frotis enespera del control de calidad
Los frotis examinados deben ser guarda-dos en el laboratorio, durante el tiempo indi-cado por el PNT, para los propósitos de lasupervisión y las pruebas de competencia(ver capítulo 6).
Antes de guardar los frotis, se debe sacarel aceite de inmersión depositado sobre ellos.No se aconseja limpiar el aceite con un papelpara lentes, pues el frotis puede ser despe-gado de la lámina y además, el aceite no seránunca limpiado completamente. Se reco-mienda sumergir los frotis en xileno (xilol)*y secarlos antes de guardarlos en las cajashasta la siguiente supervisión. Los frotis posi-tivos y negativos deben guardarse separa-damente en cajas especiales para láminas.Estas cajas deben guardarse cerradas y, en lamedida de lo posible, preservadas del calor yla humedad hasta el momento de hacer elmuestreo para la relectura. Los frotis nodeben ser secados ni almacenados expuestosdirectamente a luz UV. El muestreo y relec-tura de los frotis debe hacerse lo más prontoposible, puesto que el almacenamiento encondiciones climáticas tropicales puede hacerpalidecer la tinción ZN y producir falsos resul-tados de control.
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* Xileno, Reactivo ACS Sigma mezclado X2377 oequivalente. Se encuentra disponible un substitutodel xileno, más seguro, menos tóxico y menos infla-mable6.
6.1 Definiciones
El control de calidad de la baciloscopiaes un elemento indispensable de unPrograma de Control de la Tuberculosis efi-caz, que concierne a todo el proceso: la reco-lección del esputo, la preparación de los fro-tis, la tinción, el examen microscópico y elregistro e información de los resultados.
El propósito de los programas de controlde calidad es el de mejorar la eficiencia y lafiabilidad de los servicios de baciloscopia.Un programa de garantía de calidad com-prende tres componentes principales:
• Control de calidad interno: El control decalidad es un proceso interno, efectivo y sis-temático, cuyo objetivo es de detectar la fre-cuencia de errores, comparándola conlímites establecidos de rendimiento acep-table del examen. Aunque generalmente noes factible determinar con precisión la fre-cuencia de errores, por lo menos es unmecanismo por el cual los laboratorios detuberculosis pueden validar la competenciade sus servicios de diagnóstico.
• Prueba de competencia: También cono-cida como Evaluación Externa de Calidad, setrata de un programa diseñado para permi-tir a los laboratorios participantes la evalua-ción de sus capacidades, comparando susresultados con aquéllos obtenidos, en lasmismas muestras, en otros laboratoriosde la red, p. ej. el Laboratorio Regional deReferencia.
• Mejoramiento de la calidad: Es un procesopor el cual los componentes de los serviciosde diagnóstico baciloscópico son analizados,con el propósito de buscar permanente-mente los medios para eliminar los obstá-culos que se oponen al éxito. La recolecciónde datos, el análisis de datos, la identifica-ción de problemas y la solución creativa delos problemas, son los componentes clavede este proceso. Implica un control e identi-ficación de deficiencias en forma continua,seguidos de acciones dirigidas a evitar quelos problemas se reproduzcan.
6.2 Procedimientos
El control de calidad interno de la tinciónes imperativo. Los nuevos lotes de solucionescolorantes deben ser probados antes de su uti-lización. Esto se hace habitualmente tiñendofrotis no teñidos, pero conocidos como positi-vos o negativos. También es altamente reco-mendable la inclusión de algunas láminas noteñidas, con resultado conocido, en cada seriede tinción. La relectura de los frotis positivospor otro técnico de laboratorio es altamentedeseable, pero son escasos los laboratoriosperiféricos que disponen de dos microscopis-tas para la tuberculosis. Un aspecto esencialde la garantía de calidad es la observacióndirecta de los técnicos de laboratorio, en todaslas etapas de su trabajo de rutina, por un super-visor experimentado.
Hay cuatro métodos principales para rea-lizar las pruebas de competencia para la baci-loscopia:• El envío de los frotis desde el Laboratorio deReferencia al laboratorio periférico que permitecontrolar la tinción, la lectura y los registros.• La observación de la calidad de la realizaciónde la baciloscopia en todas sus etapas durantelas visitas de supervisión en el terreno.• El envío de los frotis desde el laboratorio per-iférico al Laboratorio de Referencia para relec-tura.• La realización de una muestra de frotis depacientes registrados en el Registro de laTuberculosis del Distrito.
Los cuatro métodos tienen sus ventajas ydesventajas; por eso se aconseja implemen-tarlos de acuerdo con las necesidades y cir-cunstancias de cada PNT.
En este contexto, el mejoramiento de lacalidad consiste en corregir las deficienciasen la realización y lectura de las bacilosco-pias, tomando medidas apropiadas. El per-feccionamiento de los técnicos de laboratorioque muestran una capacidad inferior a laóptima, es una responsabilidad de los labo-ratorios de un nivel superior, dentro de la red,es decir, los laboratorios de Referencia
87
6. CONTROL DE CALIDADDE LA BACILOSCOPIA
Regionales o Centrales. Para una discusiónmás detallada sobre los programas control
de calidad en microbiología de la tuberculo-sis, ver referencias 7 y 8.
88
7. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIODE MICROSCOPIA DE LA TUBERCULOSIS
7.1 Aspectos generales
Los técnicos de laboratorio son respon-sables de su propia seguridad y de la de suscolaboradores. La transmisión deMycobacterium tuberculosis se produceesencialmente a través de microaerosoles,es decir, los bacilos tuberculosos contenidosen los núcleos de gotitas, de un diámetro de1 a 5 micrones, que son lo suficientementepequeños para llegar a los alvéolos pulmo-nares y lo suficientemente grandes paraadherir a las paredes de estos alvéolos.
El control de la infección en el laborato-rio tiene como objetivo reducir la producciónde aerosoles. Es necesaria una buena venti-lación para proteger al personal del labora-torio contra la infección con los núcleos degotitas transportados por el aire. Una manerafácil para obtener la ventilación y una cor-riente de aire adecuada es la disposición jui-ciosa de las puertas y ventanas, de tal maneraque las partículas transportadas por el airese mantengan alejadas de los técnicos delaboratorio (ver figura 4). Cuando se disponede corriente eléctrica se pueden utilizar extra-ctores de aire para aspirar el aire del labora-torio.
Los técnicos deben lavarse las manoscada vez que entran o salen del laboratorio.Durante su trabajo, el personal debe usarropa protectora como blusas o delantales delaboratorio, que deben ser guardados enarmarios antes de salir del laboratorio. Elacceso al laboratorio debe estar restringidosólo al personal del laboratorio.
Es deseable el uso de guantes dese-chables para la confección de los frotis y parasu tinción. Sin embargo, esto representa ungasto importante para los laboratorios peri-féricos, puesto que se supone que deben serdescartados después de cada manipulación.
Los guantes desechables son concebidospara una sola utilización, pero en muchoslaboratorios existe la tendencia a usarloshasta que se rompen. Esta utilización incor-recta da la sensación de falsa seguridad ylleva a negligencias que tienen un impactonegativo sobre las condiciones de bioseguri-dad del laboratorio; así, los guantes conta-minados son usados para manipular o hacerfuncionar equipos de laboratorio que, enotras condiciones no habrían sido jamáscontaminados. Dado que el uso de guanteses impracticable en la mayoría de los sitiosdonde esta guía será utilizada, se recomiendaenfáticamente sumergir las manos en alcoholal 70% y enseguida lavarlas con una solucióndetergente, enjuagarlas con agua y secarlascon papel.
El uso de mascarillas quirúrgicas conven-cionales no reduce significativamente elriesgo de infección por inhalación de aero-soles. Se insiste en que se debe poner el énfa-sis en la reducción de la producción de aero-soles durante las manipulaciones delaboratorio adoptando y aplicando estricta-mente las Prácticas Correctas de Laboratorio8.
No se debe permitir comer, beber ofumar en el laboratorio.
7.2 Aspectos específicos
La posibilidad de crear aerosoles varíaconsiderablemente según los procedimien-tos de laboratorio considerados:
g Recolección de las muestras deesputo
Con frecuencia las muestras de esputo serecolectan dentro del mismo laboratorio. Estapráctica expone a los técnicos del laboratorio
a un alto riesgo de contagio por aerosoles,por lo que, en ninguna circunstancia debe seradmitida. Como se ha mencionado en elCapítulo 1, se deben tomar precauciones paradisminuir este riesgo pidiendo a las personassospechosas de tuberculosis cubrir la bocacuando tosen y haciéndoles obtener las mues-tras de esputo al exterior, donde los aerosolesserán diluidos e incluso esterilizados por losrayos UV de la luz solar directa.
g Preparación de los frotis
Aunque la apertura de los envases y elextendido del esputo sobre las láminas pue-den producir aerosoles, estas manipula-ciones conllevan un riesgo de transmisiónmenor que la tos no protegida de un pacientecon baciloscopia positiva. Hay escasas prue-bas que demuestren que la preparación delos frotis de expectoración pueda producirun aumento del riesgo de infección tubercu-
losa. Sin embargo, la ausencia de pruebasno es una prueba de ausencia de riesgo y elpersonal de laboratorio debe ser prudente ypermanecer vigilante a todo momento.
Los equipamientos costosos y sofistica-dos no substituyen las prácticas correctas dellaboratorio de microbiología. Además, lascabinas de bioseguridad de tipo comercialexigen un mantenimiento eficaz anual reali-zado por expertos, que producen gastos que,en general no son considerados en elmomento de la compra. Estas cabinas de tipocomercial, si no son mantenidas correcta-mente, dan una falsa impresión de seguri-dad; lo mismo sucede con aquéllas construi-das de manera artesanal. El modelopropuesto en la primera edición de esta guíase ha mostrado impracticable, después de 20años de experiencia en el terreno. Así, lascabinas de bioseguridad no son obligatoriasen los laboratorios periféricos que realizansolamente las baciloscopias.
89
Figura 29
90
g Desinfección, esterilizacióny eliminación del materialcontaminado
Después del examen de los frotis, sedeben destapar todos los envases utilizados.Los envases, las tapas y los palillos se colo-can en un receptáculo para desperdicios quecontenga una solución de fenol al 5% o dehipoclorito de sodio al 0,5%, en la cual sonsumergidos completamente. Enseguida, elmaterial puede ser puesto en el autoclave. Sino se dispone de autoclave, todo el materialdebe ser quemado en un incinerador, unafosa al aire libre o en un tambor de gasolinavacío (Figura 29). Nota: el humo producidopor una gran cantidad de envases plásticoses tóxico.
En caso de que se utilicen materialescombustibles y envases de vidrio al mismotiempo, estos últimos deben ser separadosy colocados en un recipiente diferente parahervirlos, lavarlos y poder usarlos nueva-mente. Los demás elementos, tales como el
soporte de los frotis, el secador y la superfi-cie de trabajo, deben ser limpiados con unasolución de fenol al 5% o de hipoclorito desodio al 0,5%.
Después de haber sido sometidas alcontrol de calidad, las láminas positivasdeben ser quebradas y tratadas como losotros objetos cortantes. Las láminas negati-vas pueden ser eliminadas o bien, si es nece-sario, pueden ser lavadas para una nueva uti-lización en un trabajo diferente de latuberculosis (p. ej. malaria, hematología).
Las láminas de los frotis negativos sedeben hervir durante una hora y media enuna solución de jabón o detergente, lavar conagua corriente, secar con algodón o un paño,secar al aire, examinar para confirmar laausencia de rayas, limpiar con un algodónempapado en alcohol, y almacenar para unanueva utilización.
Las láminas de tuberculosis, ya seanpositivas o negativas, nunca se deben volvera utilizar para un trabajo en tuberculosis.
8. GESTIÓN DE LOS MATERIALES
Los programas deben presupuestar demanera racional sus necesidades de materialde laboratorio a fin de asegurar un abasteci-miento continuo. La única base cuantificablepara esta planificación es el número depacientes registrados, para los cuales se hanrealizado baciloscopias. El número y el por-centaje de pacientes con baciloscopia posi-tiva puede ser determinado en base alRegistro del Laboratorio.
Suponiendo que la proporción de frotispositivos es de 10%, que cada sospechosode tuberculosis requiere tres baciloscopias yque cada caso de tuberculosis con bacilo-scopia positiva requiere tres exámenes deseguimiento, el número de láminas de micros-copio y de envases de esputo que se requie-ren por cada caso con frotis positivo detec-tado será:
1 enfermo positivo 3 láminas
9 enfermos sospechososno positivos 27 láminas
para el enfermo positivo,3 exámenes de seguimiento 3 láminas
Total para un casopositivo 33 láminas y 33 [(1+9) x 3 + 3 = 33] envases
El cálculo para los pedidos se realiza uti-lizando el formulario Pedido de materiales deLaboratorio (Figuras 30 y 30 bis):– en la columna titulada «N° de casos» seanota el número de pacientes con bacilosco-pia positiva (casos nuevos y casos de retra-tamiento) registrado en los dos últimosInformes Trimestrales de Detección de Casos;– los requerimientos para el próximosemestre (A), se calculan multiplicando elnúmero de casos por un factor predetermi-nado, basado en el supuesto que se necesitaexaminar a 10 sospechosos de tuberculosispor cada caso con baciloscopia positiva;– los requerimientos para la reserva (B) soniguales al doble de la cantidad requerida para6 meses (A x 2);
– se debe anotar la cantidad de materialinventariado, actualmente en stock (C) en elalmacén del distrito;– el pedido total (D) es la suma de las canti-dades requeridas para el semestre siguiente(A) más la cantidad requerida para la reserva(B) menos la cantidad inventariada (C) en elmomento en que se rellena el formulario depedido.
Los requerimientos de material de labo-ratorio son relativamente pequeños, razónpor la cual los pedidos se hacen cada 6 meses
en lugar de cada 3 meses y los requerimien-tos para constituir la reserva se estiman en unaño de abastecimiento.
Las cantidades de fucsina básica, azul demetileno, etanol y fenol se calculan según elmétodo recomendado por la UICTER para latinción ZN, suponiendo que se necesitan 5ml de cada una de las soluciones para cadafrotis. Se supone además que se necesitan 2gotas o 0,1 ml de aceite de inmersión paracada frotis.
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Referencias
1. Collins C H, Grange J M, Yates MD. Organization and practice in tuberculo-sis bacteriology. London: Butterworths,1985.
2. Laboratory Biosafety Manual. 2nd ed.Geneva: WHO, 1993: pp 60-61.
3. McDougall A C. An inexpensive slide mar-ker made from a dental bur and a plasticpen. Lep Rev 1992; 63: 79-80.
4. Smithwick R C. Laboratory manual foracid-fast microscopy. 2nd ed. USDepartment of Health, Education, andWelfare, Public Health Service. Atlanta,GA: Centers for Disease Control, Bacte-riology Division, 1976.
5. The Microscope. A Practical Guide. WHOProject: ICP TUB 001. New Delhi, India:WHO Regional Office for South-East Asia,1999.
6. McDougall A C. The use of xylene (xylol)in medical laboratories. Lep Rev 1989; 60:67.
7. Woods G L, Ridderhof J C. Quality assu-rance in the mycobacteriology laboratory.In: Clinics in Laboratory Medicine.Philadelphia, PA: W B Saunders, 1996: Vol16, Number 3.
8. Kumari S, Bathia R, Heuck C C. Qualityassurance in bacteriology and immuno-logy. WHO Regional Publication, South-East Asia Series No 28. New Delhi, India:WHO Regional Office for South-East Asia,1998.
Sugerencias de lectura
1. Bacteriology of tuberculosis. The speci-men. Microscopy examination. Technicalnote no. 26. Washington, DC: PanAmerican Health Organization, 1984.
2. Minamikawa M. Laboratory Manual forthe National Tuberculosis Programme ofNepal. National Tuberculosis Centre.JICA/HMG National TB Control Project(II). March 1998.
3. De Kantor I N, Kim S J, Frieden T, LaszloA, Luelmo F, Norval P Y, Rieder H L,Valenzuela P, Weyer K. Laboratory ser-vices in tuberculosis control. WHO GlobalTuberculosis Programme. WHO/TB/98.258. Geneva: WHO, 1998.
4. Manual of norms and technical proce-dures for tuberculosis bacteriology. Part1 Smear microscopy. Technical note 26.Washington, DC: Pan American HealthOrganization, 1984.
5. Manual for Laboratory Technicians.Revised National Tuberculosis ControlProgramme (RNTCP). Nirman Bhavan,New Delhi, India: Central TB Division,Directorate General of Health Services,Ministry of Health and Family Welfare,1997.
6. Module for Laboratory Technicians.Nirman Bhavan, New Delhi, India: CentralTB Division, Directorate General ofHealth Services, Ministry of Health andFamily Welfare, 1997.
7. Rieder H L, Chonde T M, Myking H,Urbanczik R, Laszlo A, Kim S J, Van DeunA, Trébucq A. The Public Health ServiceNational Tuberculosis ReferenceLaboratory and the National LaboratoryNetwork. Minimum requirements, roleand operation in a low income country.Paris: IUATLD, 1998.
8. Fujiki A. TB microscopy. Tokyo, Japan:The Research Institute of Tuberculosis,Japan Anti-Tuberculosis Association,Japan International Cooperation Agency,Hachioji International Training Centre,1998.
9. Tuberculosis control: a manual ofmethods and procedures for integratedprograms. Scientific Publication No. 498.Washington, DC: Pan American HealthOrganization, 1986.
10. Enarson D A, Rieder H L, Arnadottir T,Trébucq A. Manejo de la TuberculosisGuía para los países con escasos recur-sos económicos. 5o ed. Paris: IUATLD,2000.
95
PREVENCIÓN DE RESULTADOS FALSOS POSITIVOSDE LA BACILOSCOPIA
• Usar láminas nuevas• Usar un nuevo palillo para cada muestra• Usar carbol fucsina filtrada• Mantener las láminas separadas unas de otras durante la tinción• No usar cubetas de tinción• No permitir que la carbol fucsina se seque sobre la lámina• No permitir que el aplicador de aceite de inmersión toque el frotis• No permitir que el objetivo de inmersión toque el frotis• Identificar en forma completa y precisa los envases de esputo, las láminas y los formu-
larios de laboratorio• Verificar, en forma cruzada, el número en el formulario de Pedido de examen de expec-
toración y en el envase de esputo antes de proceder al registro• Registrar e informar los resultados en forma precisa
CONSECUENCIAS DE LOS RESULTADOS FALSOS POSITIVOS
• Tratamiento innecesario - derroche de medicamentos• Falta de confianza en el PNT
PREVENCIÓN DE RESULTADOS FALSOS NEGATIVOSDE LA BACILOSCOPIA
• Asegurarse que la muestra contenga esputo y no sólo saliva• Asegurarse que la muestra contenga por lo menos 3 ml de esputo• Seleccionar partículas mucopurulentas gruesas para hacer el frotis• Los frotis no deben ser ni demasiado delgados ni demasiado gruesos• Teñir los frotis durante 5 minutos• Decolorar los frotis durante 3 minutos• Contrateñir los frotis durante 1 minuto• Leer la totalidad de los 100 campos antes de considerar que la lámina es negativa• En los frotis de control conocidos como positivos, los BAAR deben aparecer bien teñi-
dos• Identificar cuidadosamente los envases de esputo, las láminas y los formularios de labora-
torio• Verificar, en forma cruzada, el número en el formulario de Pedido de examen de expec-
toración y en el envase de esputo antes de proceder al registro• Registrar e informar los resultados en forma precisa
CONSECUENCIAS DE LOS RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS
• El paciente queda sin tratamiento, lo que significa sufrimiento, dispersión de la tuber-culosis y muerte
• La fase intensiva del tratamiento puede dejarse sin prolongación, lo que lleva a un tra-tamiento inadecuado
ANEXO 1
96
ANEXO 2
• Falta de confianza en el PNT.
MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO
El microscopio es el instrumento principal de los servicios de diagnóstico de la tubercu-losis del PNT. La manipulación correcta y el mantenimiento del microscopio por el personaldel laboratorio son esenciales para prolongar su vida útil. Se deben observar los puntossiguientes:
• Cuando no se usa, el microscopio debe ser guardado en un ambiente seco y libre de polvoy de vibraciones.
• Debe evitarse la exposición del microscopio a la luz solar directa, a los mohos y a la humedad.
• Colocar un gel de sílice en la caja donde se guarda el microscopio; cuando el gel se ponede color rosa debe ser restaurado por calentamiento.
• Limpiar el microscopio antes y después de su uso con un papel para lentes.
• Limpiar la superficie del lente de inmersión con una mota de algodón limpia, antes y des-pués de su uso. No utilizar alcohol para limpiar los lentes.
• El lente de inmersión en aceite nunca debe tocar el frotis.
97
ANEXO 3
GUÍA PARA LA SOLUCIÓN DE LOS PROBLEMAS DE MICROSCOPIA
PROBLEMA CAUSAS POSIBLES SOLUCIÓN
Campo sin luzCondensador demasiado bajo
Diafragma cerrado
Elevar el condensador
Abrir el diafragma
La imagen de bajoaumento no es clara
Aceite sobre el objetivo
Polvo sobre la superficiesuperior del objetivo
Objetivo dañado
Limpiar el objetivo
Limpiar el objetivo
Remplazar el objetivo
La imagen no es clara
El lado «frotis» de la láminaestá puesto hacia abajo
Burbuja de aire en el aceite
Aceite de mala calidad
Objetivo sucio
Dar vuelta la lámina
Desplazar el objetivode inmersión de un lado a otro
Cambiar el aceite
Limpiar el objetivo
Sombras oscuras en elcampo, que se desplazan
con el ocular cuandose lo hace girar
Ocular sucio
Ocular u objetivo contaminadocon hongos
Superficie del ocular rayada
Limpiar el ocular
El remplazo del ocular puedeser necesario
El remplazo del ocular puedeser necesario
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IMPRIMÉ EN FRANCE
99
FORMULARIOS
VII. ANEXO 2
FORMULARIO 1PROGRAMA DE CONTROL DE LA TUBERCULOSIS
PEDIDO DE EXAMEN DE EXPECTORACIÓN
Nombre de la Unidad de Tratamiento Fecha
Nombre del Paciente
Edad Sexo (marque una casilla) : M [ ] F [ ]
Dirección (precisa)
Razón del examen (marque una casilla) : diagnóstico [ ] examen de seguimiento [ ]
Firma de la persona que pide el examen
El formulario completo (con los resultados) debe ser enviado rápidamente a la Unidad de Tratamiento.
Fecha Examinado por (Firma)
* Aspecto visual del esputo (sanguinolento, muco-purulento, saliva).
RESULTADOS (completar en el laboratorio)
No de serie del Laboratorio.
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Resultados (marcar la casilla correspondiente)
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FORMULARIO 4
PROGRAMA DE CONTROL DE LA TUBERCULOSIS REGISTRO DE
Tipo de paciente***
Nuevo RecaídaTratamiento
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abandono
Trasladoentrante
Otro
Fecha deregistro
No en laUnidad
deatención
Nombre y apellido SexoM/F Edad Dirección completa
Unidadde
Tratamiento
Fechade inicio
delTratamiento
Esquema*Localizaciónenfermedad
P/EP**
* Casos Nuevos : HRZE = 8-meses o STH = 12-meses* Retratamiento : SHRZE** P = Pulmonar** EP = Extrapulmonar
*** Nuevo : nunca ha sido tratado previamente por másde 1 mes
*** Recaída : tratado previamente, declarado curado,baciloscopias vuelven ser positivas
Tratamiento después de fracaso : baciloscopia positiva 5 o más meses después del inicio del tratamiento, puesto enretratamientoTratamiento después de abandono : vuelve con baciloscopias positivas después de haber abandonado el tratamientodurante 2 meses o más, puesto en retratamientoTraslado entrante : registrado, en otra Unidad donde se inició el tratamiento
TUBERCULOSIS FORMULARIO 4
Resultados de las bociloscopias según el número de meses de tratamiento Resultado del tratamiento**** y fecha del resultado (marque una casilla)
ObservacionesResultado baciloscopias al término del tratamiento:
Negativa No realizada PositivaFallecido Abandono Trasladado
Antes del tratamiento
Resultato No Lab./fecha Resultato No Lab./
fecha Resultato No Lab./fecha Resultato No Lab./
fecha Resultato No Lab./fecha
2 meses 5 meses 7 meses 11 meses
Año
**** Baciloscopias negativas (curado): baciloscopias negativas en el último mes del tratamiento y por lo menos una vez antes.**** Baciloscopias no realizadas (tratamiento completado): tratamiento completado, pero examen de esputo insuficiente (no realizado) para
clasificar al paciente como con baciloscopia negativa.**** Baciloscopia positiva (fracaso): baciloscopia positiva a los 5 meses o más durante el tratamiento, confirmada por una segunda baciloscopia
positiva.
Fallecido: fallecido por cualquiera causa durante el tratamiento.Abandono: no ha acudido a retirar sus medicamentos por más de 2 meses después de laúltima fecha que fue visto.Trasladado: enviado a otra unidad de atención para continuar el tratamiento y el resultadodel tratamiento es desconocido.
FORMULARIO 5PROGRAMA DE CONTROL DE LA TUBERCULOSISIN
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