Guía Nº 4SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

Objetivos:

- Comprender los conceptos de siembra y cultivo de microorganismos

- Aprender las técnicas asépticas de siembra de microorganismos- Realizar siembras en medios líquidos y sólidos aplicando las

técnicas aprendidas

1. Concepto de siembra:

En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual se deposita una pequeña cantidad de microorganismos (inóculo) en un medio de cultivo estéril. El inóculo puede proceder de una muestra o de un cultivo previo. (al crecimiento de microorganismos obtenido, se le denomina cultivo)La finalidad de la siembra es permitir la multiplicación de los microorganismos, al proporcionarles las condiciones óptimas para su desarrollo, dentro de las cuales, se debe considerar: temperatura, nutrientes, pH, disponibilidad de oxígeno, entre otros. La siembra de microorganismos debe llevarse a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados trabajando siempre bajo condiciones de asepsia, lograda por medio de un mechero Bunsen que, debido a las corrientes de convección verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.

2 Técnicas de siembra:

a) Siembra de medios líquidos: ésta se realiza en tubos de ensayo o en matraces. El crecimiento se observa por la turbidez del medio, por la formación de velo o película superficial, o por acumulación de microorganismos en el fondo del tubo (Figura 1). El inóculo se toma con el asa de loop, pipetas o micropipetas. Se utiliza para el enriquecimiento de microorganismos, algunas técnicas de recuento, pruebas bioquímicas, etc.

Figura 1: crecimiento de microorganismos en medios de cultivo líquido a: velo superficial; b: crecimiento en el fondo

del tubo; c: turbidez en todo el tubo; d: tubo control

b) Siembra en medios sólidos: se realiza en tubos de ensayo o en placas de Petri, tiene distintos usos, según el objetivo del cultivo a realizar.

Siembra por estría en tubos: se utilizan tubos con agar inclinado y con el asa de loop se siembra sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior del tubo. Se observa el crecimiento sobre la superficie del agar. (Figura 2)

Figura 2: siembra por estría en tubo

Siembra por picadura: se utilizan tubos con agar , y se agrega el inóculo con el asa en punta. El asa se introduce en el centro del agar con un solo movimiento. Se observa el crecimiento en la linea de inoculación. En agar semisólido, se utiliza para la prueba de movilidad. (Figura 3)

a b c d

Figura 3: siembra en picadura en medio semisólido

Siembra por extensión en placas: consiste en poner un inóculo en la superficie del agar y luego extenderlo sobre el medio. La extensión del inóculo se puede hacer con asa de loop, técnica denominada “siembra en estrías” o el asa de Drygalsky, técnica denominada “siembra homogénea”

Siembra en estrías: con un asa de loop previamente esterilizada a la llama del mechero, se deposita un pequeño inóculo y se extiende, en estrias, sobre un área pequeña de la placa. Se esteriliza el asa, se enfría en la tapa de la placa y a partir de la siembra realizada anteriormente, se estría la zona contigua. El proceso se repite sucesivamente, hasta sembrar en cuatro zonas (Figura 4). Los microorganismos se adhieren a la superficie del medio y se multiplican formando colonias. Este tipo de siembra se utiliza para aislar bacterias y obtener cultivos puros

Figura 4: siembra de estrías en placa

Siembra homogénea: se toma un pequeño volumen a partir de un cultivo o muestra líquida. Generalmente y dependiendo del objetivo de la siembra, se toman inóculos desde 0,1 a 2ml. Luego se distribuye homogéneamente sobre el agar con el asa de Drygalsky. Se utiliza para recuento de microorganismos y como técnica de aislamiento, previa dilución de la muestra. (Figura 5)

Figura 5: Dilución y siembra homogénea

Siembra en profundidad: en una placa de Petri se vacía un pequeño volumen (1 ml) de muestra y a continuación se agrega el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y temperado a 45º C. Se mezclan por rotación suave de la placa. (Figura 6) Los microorganismos se distribuirán en forma homgénea en el medio de cultivo, permitiendo, así el desarrollo de colonias separadas en el agar. Se deja enfriar la placa hasta que solidifique el medio. Esta técnica se utiliza para determinar el número de bacterias viables, anerobias facultativas y microaerófilas, presentes en la muestra

Figura 6: Siembra en profundidad

Las siembras realizadas en placas de Petri, permitirán observar el crecimiento de los microorganismos a través de la formación de colonias. Cada colonia se desarrolla a partir de la multiplicación de una célula, y cada colonia se denomina “Unidad Formadora de colonia” (UFC). Las colonias pueden diferenciarse de acuerdo a:

Tamaño: Grande (mayor a 1 mm de diámetro); media ( 1mm de diámetro); pequeña ( menor a 1 mm de diámetro)

Elevación: plana, convexa, centro elevado, umbilicada, cóncava Forma: circular, filamentosa, irregular, puntiforme, rizoide,

ovalada, fusiforme Margen o borde: entero, ondulado, lobulado, dentado,

filamentoso, rizado Color: blanco, negra, crema, naranja, etc Apariencia de la superficie: brillante, opaca, suave, rugosa,

granular Consistencia: observada al tomar la colonia con el asa, puede

ser: cremosa, viscosa, granular(Figura 7)

Figura 7: Características de las colonias

3 Normas generales para realizar siembra de microorganismos

Para trabajar bajo condiciones de asepsia en el laboratorio y mantener la esterilidad

de los medios de cultivo que serán sembrados, se deben seguir las siguientes

indicaciones:

1. El trabajo es individual, por lo tanto cada alumno debe disponer de un mechero

2. Lavarse las manos con agua y jabón desinfectante3. Desinfectar el área de trabajo con etanol4. Encender el mechero5. Dejar al alcance de sus manos el material a utilizar (medios de

cultivo, asas, pipetas, cementerio, etc)6. Debe flamearse a la llama del mechero la boca de los tubos de

ensayo antes y después de tomar un inóculo7. Las asas rectas y de loop deben esterilizarse al rojo cada vez que

se utilizan y dejan de utilizar. Antes de tomar el inóculo deben enfriarse, dejándolas cerca del mechero

8. Las asas de Drygalsky deben esterilizarse por flameado en alcohol y enfriadas en la tapa de la palca, antes de ser utilizadas. Una vez utilizadas deben dejarse en alcohol. Para ello, se mantendrán en un vaso con etanol.

9. La boca y tapa de los pipeteros deben flamearse a la llama del mechero, cada vez que se saque una pipeta. Las pipetas utilizadas deben dejarse en un recipiente con solución desinfectante (cementerio)

10. Para la siembra en placas, éstas deben abrirse frente al mechero, sin dejar la tapa boca abajo sobre el mesón.

Umbilicada

11. Una vez que la siembra se ha realizado, los tubos y placas serán incubados bajo condiciones controladas de temperatura. En el caso de las placas, debe incubarse invertidas.

Trabajo Práctico“Siembra de microorganismos”

Materiales y equipos:

- Asa de loop- Asa recta- Asa de Drygalsky- Pipetas de 1 ml- Vasos pp con alcohol- Etanol- Mechero- Gradillas- Medios de cultivo esterilizados: agar nutritivo inclinado y recto, Agar

nutritivo en placas, caldo nutritivo- Cepas bacterianas en cultivos líquidos y sólidos

Actividades: Trabajo individual

Cada alumno realizará las siguientes siembras:

- Siembra en medio líquido- Siembra en picadura- Siembra por estrías en tubo- Siembra por estrías en placa- Siembra homogénea

Resultados:

Los resultados serán observados a la semana siguiente. El alumno deberá revisar cada siembra realizada y anotar los resultados obtenidos:

Tipo de siembra Crecimiento Asa utilizada Utilidad de la técnica

PicaduraEstría en tubo

Medio líquidoCaracterísticas de las colonias(forma, color, elevación)

Estrias en placas

Homogénea

Autoevaluación:

1 ¿Por qué debe utilizar el mechero Bunsen durante la siembra?2. ¿Cómo esteriliza el asa de loop y el asa de Drygalsky?3 ¿Qué tipo de siembras puede realizar con el asa de loop?4. Si tuviera que determinar la movilidad de una cepa bacteriana.

a) ¿qué tipo de siembra realizaría?b) ¿Qué tipo de medio de cultivo utilizaría?c) Describa paso a paso el procedimiento que realizaría