Guas microbiologa de alimentos - Document Transcript1. 2. Elaborado por: Mnica Mara Simanca Sotelo. Ingeniera de Alimentos. Alba Manuela Durango Villadiego. MSc. TABLA DE CONTENIDO Pgina 1. INTRODUCCIN 1 2. GUA N 1: Tcnica Ecomtrica. 2 3. GUA N 2: Estudio microbiolgico a manipuladores, utensilios y medio superficies, ambiente. 7 4. GUA N 3: Cuantificacin de microorganismos por el mtodo de recuento en placa. 14 5. GUA N 4: Tcnica del nmero ms probable (NMP). 22 6. GUA N 5: Recuento de mesfilos aerobios y facultativos viables. 31 7. GUA N 6: NMP de coliformes totales y fecales en alimentos de origen animal o vegetal. 33 8. GUA N 7: Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 36 9. GUA N 8: Recuento de Mohos y levaduras. 39 10. GUA N 9: Investigacin de Salmonella en alimentos. 41 11. GUA N 10: Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor. 44 12. GUA N 11: Recuento de Bacillus cereus. 47 13. GUA N 12: Investigacin de Listeria monocytogenes. 50 14. GUA N 13: Investigacin de Vibrio parahaemolytico. 53 15. GUA N 14: Control microbiolgico de conservas no alteradas. 56 16. GUA N 15: Recoleccin de muestras de agua para Anlisis acteriolgico. 59 17. GUA N 16: Cuantificacin de microorganismos por el mtodo de filtracin por membrana. 63 18. GUA N 17: Nmero ms probable de Pseudomona aeruginosa. 67 19. GUA N 18: Presenciaausencia de coliformes en muestras de agua (mtodo del sustrato definido). 69 20. GUA N 19: Prueba del tiempo de reduccin del azul de metileno (T.R.A.M.). 71 21. GUA N 20: Microbiologa de leche y derivados. 73 22. GUA N 21: Microbiologa de crnicos. 76 23. GUA N 22: Microbiologa de ovoproductos. 79 24. GUA N 23: Microbiologa de pescados y mariscos. 82 25. GUA N 24: Microbiologa de frutas y hortalizas. 85 26. GUA N 25: Microbiologa de cereales y panificacin. 88 27. GUA N 26: Microbiologa de bebidas. 91 28. GUA N 27: Microbiologa de aguas. 94 29. ANEXOS 96 I 3. LISTA DE TABLAS Pgina 1. TABLA No.1: Tabla de NMP y lmites de confianza cuando se usan 5 tubos con 10 ml de muestra. 26 2. TABLA No. 2 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras puras. 26 3. TABLA No. 3 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras diluidas. 27 ii LISTAS DE FIGURAS Pgina 1. Figura No. 1: Tcnica Ecomtrica. 5 2. Figura No. 2 Diluciones decimales. 19 3. Figura No. 3: Siembra en Profundidad. 20 4. Figura No. 4: Siembra en Superficie. 21 5. Figura No. 5: Tcnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras lquidas) 28. 6. Figura No. 6: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras lquidas). 29 7. Figura No. 7: Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas lquidas o slidas) 30 iii LISTA DE ANEXOS Pgina Anexo A: Divisin laboratorio de alimentos y bebidas alcohlicas- Laboratorio de Microbiologa de Alimentos INVIMA. 96 Anexo B: Normatividad relacionada con alimentos. 97 iv INTRODUCCION La calidad de los alimentos est constituida por tres reas de estudio, las cuales son: calidad microbiolgica, calidad fsico-qumica y calidad sensorial. Entre estas reas la que revista mayor importancia es la calidad microbiolgica, puesto que a travs de esta se puede determinar la inocuidad de los alimentos, es decir, su capacidad de no producir dao (enfermedad) a las personas que lo consumen. Para llevar a cabo el anlisis microbiolgico de los alimentos es necesario disponer de un laboratorio especializado donde solo se manipulen materias primas y aditivos alimentarios, productos procesados, materiales de insumo (envases, empaques) y muestras provenientes de la instalaciones de la empresas de alimentos (manipuladores, superficies y ambiente). En el laboratorio de Microbiologa de Alimentos se deben contar con una dotacin mnima de equipos, entre los cuales cabe mencionar incubadoras, baos termostatados, autoclave, microscopios, balanzas, centrifuga, pHmetro; con una dotacin de medios de cultivo y reactivos, los cuales se deben encontrar en ptimas condiciones de uso y con suficiente cantidad de material de vidriera. El laboratorio adems debe contar con un sistema de calidad en el cual se contemplen los procedimientos de preparacin de medios de cultivo y reactivos, los procedimientos de limpieza y desinfeccin de materiales, equipos y reas y se debe definir el personal de apoyo que labore en el mismo, el cual debe contar con una formacin en el rea donde se desempear. En el presente manual se muestran los procedimientos para llevar a cabo el anlisis microbiolgico de los alimentos.

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UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 1: TECNICA ECOMETRICA 1. INTRODUCCIN En el laboratorio de Microbiologa de Alimentos se debe realizar una evaluacin sistemtica de los medios de cultivo no selectivos y selectivos preparados en el laboratorio y an los comerciales, ya que stos varan ampliamente segn su composicin, modo de preparacin, etc. Es muy importante el control que se tenga sobre los medios de cultivo, porque de ellos depende la exactitud de los resultados. Para establecer la calidad de los medios de cultivo se ha desarrollado una tcnica sencilla y confiable, cuyo fundamento es comprobar el crecimiento efectivo en los medios de cultivo, de los microorganismos buscados y la inhibicin de la flora acompaante. Esta tcnica se ha denominado ecomtrica porque evala la susceptibilidad de los medios de cultivo a la colonizacin por cepas interferentes. Esta tcnica implica una siembra por estra con ayuda de un asa bacteriolgica, obtenindose Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en nmero decreciente, como sucede en la siembra por agotamiento. En la figura N 1 se ilustra muy bien como se debe realizar la siembra. Todos los microorganismos que se suponen crecen en el medio de cultivo deben desarrollar colonias visibles, an en la estra central. En cambio los microorganismos que se suponen son inhibidos en el medio de cultivo ensayado no deben formar colonias mas all del primer cuadrante, a lo sumo en el segundo cuadrante (Ver figura 1). 2. OBJETIVO Evaluar la selectividad de los diferentes medios de cultivo selectivos mediante la tcnica ecomtrica. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos y cepas Materiales* 6 cajas de agar 3 suspensiones de cepas de asas selectivo ( EMB, microorganismos que deben crecer en bacteriolgicas hektoen, BPLS, el medio de cultivo salado manita, 3 suspensiones de cepas de incubadora Baird Parker) microorganismos que no deben crecer Mecheros en el medio de cultivo Cinta de enmascarar

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* Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 1. Tomar 6 cajas del medio a analizar. 2. Dividir con el asa bien caliente cada caja en cuatro cuadrantes, como se observa en la figura 1. 3. Marcar tres cajas con el nombre de los microorganismos que supuestamente crecen y forman colonias en ese medio de cultivo. 4. Marcar las tres cajas restantes con el nombre de los microorganismos que supuestamente no deben crecer en ese medio de cultivo. 5. Sembrar cada caja con el microorganismo correspondiente, haciendo 5 estras en cada cuadrante y una estra central (Ver figura 1), sin quemar el asa y tomando inculo slo una vez. 6. Incubar a 37C por 24-48 horas. 5. RESULTADOS 1. Se procede a observar el crecimiento o no de cada uno de los cuadrantes de cada caja. 2. El resultado se expresa como un nmero de 6 cifras. Se anota un nmero de 0 a 5 segn el crecimiento en cada cuadrante, incluyendo la estra central considerada como la quinta. 3. Se debe anotar cada uno de los resultados de cada cuadrante, igualmente el microorganismo utilizado. 4. Al final se informar un nmero de 6 cifras. 6. INTERPRETACIN Y REPORTE Las tres primeras cifras indican los sectores positivos de los microorganismos que deben crecer y las tres ltimas cifras los sectores positivos de crecimiento por parte de las cepas cuyo desarrollo no debe producirse. As un medio selectivo perfecto dara un resultado de 555000, pero en la prctica se acepta la frmula 55001 o an otra ms desfavorable. Se reporta segn las indicaciones de la hoja de informe. 7. BIBLIOGRAFA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnstico Microbiolgico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS). Manual de Bioseguridad. Editorial Ginebra. 2 edicin, 1994. 4. MOSSEL, A. y MORENO, B. Microbiologa de los alimentos. Fundamentos ecolgicos para garantizar y comprobar la inocuidad y la calidad de los alimentos. Editorial Acribia. 5. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994.

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3 8. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar Marcador.

10. 4 CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO TCNICA ECOMETRICA INFORME 1. Nombre del medio de cultivo:____________________________________ 2. Fundamento del medio de cultivo:________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________

_________________________________________________________ _________________________________________________________ No de caja Sectores positivos Microorganismo 1 _______________ ___________________ 2 _______________ ___________________ 3 _______________ ___________________ 4 _______________ ___________________ 5 _______________ ___________________ 6 _______________ ___________________ La frmula final obtenida ser: _____________________________________ Conclusin: ____________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 11. 5 Figura No. 1: Tcnica Ecomtrica Microorganismos que SI crecen Microorganismos que NO crecen 12. 6 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 2: ESTUDIO MICROBIOLOGICO A MANIPULADORES, SUPERFICIES, UTENSILIOS Y MEDIO AMBIENTE. 1. INTRODUCCIN Para asegurar la calidad de los alimentos debe prestarse atencin tanto a los microorganismos patgenos como a los alterantes, que pudieran llagar a las materias primas o al alimento terminado, a partir del hombre (manipulador), de los equipos, tuberas, superficies, aire, etc. Segn el Ministerio de la Proteccin Social se denomina manipulador a toda persona que trabaje a cualquier ttulo y aunque sea ocasionalmente, en un local o establecimiento o en el comercio ambulante donde se produzcan, procesen, almacenen, distribuyan, transportan o expendan alimentos o materias primas para alimentos. En una planta procesadora de alimentos, el manipulador juega un papel importante en la fabricacin de sus productos, ya que se puede convertir en una fuente de contaminacin. Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal, los sitios de importancia donde residen los microorganismos saprfitos y que se constituyen en una fuente de contaminacin para manipuladores de alimentos son la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe). El microorganismo mas importante a analizar a partir de la piel, es el Staphylococus aureus, este microorganismo reside tambin en las fosas, tracto nasofarngeo y la mayora de las veces se encuentra asociado a furnculos, heridas y lesiones de la piel. Debido a sus condiciones metablicas, esta bacteria puede crecer y/o reproducirse en condiciones adversas; esto hace factible que contamine los alimentos y por su facilidad de aislarse en el laboratorio, ha sido utilizado como indicador de contaminacin por manipuladores. La presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en los alimentos procesados indica contaminacin a partir de piel, boca o nariz de los manipuladores. La importancia de identificar este microorganismo, radica en la propiedad que tiene de liberar una toxina termoestable en los alimentos y causar intoxicaciones alimentarias; Staphylococcus aureus coagulasa positiva es el agente bacteriano que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicacin alimentaria, es por esto que el manipulador de alimentos se puede convertir en una fuente de contaminacin. Otros microorganismos no pertenecientes a la flora normal de la piel, pueden transferirse al alimento debido a una pobre higiene corporal, un ejemplo son los coliformes totales y fecales, provenientes del tracto gastrointestinal, especficamente de la regin anal, la presencia de estos tambin se investiga 13. en las manos dedos y uas de los manipuladores e indican contaminacin de origen fecal. 7 Un manipulador debe cumplir con los siguientes requisitos: 1. No presentar heridas, ni afecciones cutneas en brazos o manos. 2. No padecer enfermedades infectocontagiosas. 3. Practicar buena higiene personal. 4. Durante su trabajo debe usar uniforme y gorro, en las reas de envasado se hace indispensable el uso de mascarilla. 5. Recibir capacitacin sobre manejo higinico de alimentos. Los equipos, utensilios y superficies, utilizados en el procesamiento, fabricacin o preparacin de alimentos, deben estar diseados, construidos, instalados y mantenidos de tal forma que se evite la contaminacin del alimento y se facilite el proceso de limpieza y desinfeccin de los mismos. Igualmente es importante el estudio microbiolgico del aire (ambiente), ya que este se pone en contacto con los alimentos, por eso se debe estar seguro de trabajar en un ambiente adecuado, debidamente desinfectado o esterilizado. 2. OBJETIVOS 1. Detectar la presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en fosas nasales y zona farngea de los manipuladores, mediante la realizacin de frotis y cultivos. 2. Establecer la eficacia del lavado de manos, mediante la comparacin del nmero de UFC antes y despus del lavado. 3. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales a partir de las manos, dedos y uas de los manipuladores, mediante frotis y cultivos. 4. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales en utensilios, equipos y las superficies. 5.

Evaluar la contaminacin del ambiente. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* A. Baird Parker / A.S.M. Colorantes Gram Escobillones estril A. Ogy Aceite de inmersin Baja lengua estril A. Plate count Plasma fresco Gasa estril A. EMB Reactivo de Kovacs Portaobjetos estriles A. Prpura Bromocresol Microscopio Caldo BHI Incubadora Caldo Brilla Bao serolgico Caldo Indol Tubo taparosca estril Caldo lactosado Asa bacteriolgica * Algodn y alcohol al 70% 14. 8 4. PROCEDIMIENTO 4.1. MANIPULADOR 4.1.1. Fosas nasales y Faringe 1. Marcar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) como muestra farngea y nasal respectivamente. 2. Inmovilizar la lengua con un bajalengua. 3. Frotar con un escobilln los pilares amigdalianos, realizar un frotis y sembrar en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 4. Introducir un escobilln en las fosas nasales y frotarlo suavemente en las paredes, realizar un frotis y sembrar inmediatamente en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 5. Incubar por 24-48 horas a 37C. 6. Observar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) y buscar colonias negras brillantes con un halo blanco rodeadas de halos claros que contrastan con el medio (Colonias puntiformes amarillas con halos amarillos). 7. Realizar un frotis de cada caja a partir de las colonias de inters y colorearlos con Gram, se deben observar cocos grampositivos agrupados en racimos. 8. Tomar 3 colonias de cada caja y transferirlas a tubos con caldo infusin cerebro corazn (BHI), marcados respectivamente como fosas nasales y faringe. 9. Incubar por 24 horas a 37C. 10. Realizar la prueba de la coagulasa: transferir 0.3 ml de cultivo BHI + 0.3ml de plasma fresco, incubar a 37C en bao serolgico por 4 horas observando cada hora la formacin de coagulo. 4.1.2. Manos 4.1.2.1. Evaluacin del mtodo de desinfeccin 1. Colocar la mano del manipulador en una caja con Agar Prpura de Bromocresol. 2. solicitar al manipulador que lave las manos como siempre lo hace. 3. Colocar la otra mano del manipulador en otra caja con Agar Prpura de Bromocresol. 4. Incubar ambas cajas a 37C por 24-48 horas. 5. Observar y contar el nmero de UFC en las cajas de Agar Prpura de Bromocresol, antes y despus del lavado. 4.1.2.2. Evaluacin de contaminacin fecal 15. 1. Frotar un escobilln humedecido con caldo brilla las manos, dedos y uas del manipulador. 2. Introducir el escobilln dentro de un tubo que contiene caldo brilla con tubo durham. 9 3. Tapar bien el tubo. 4. Incubar a 37C por 24-48 horas. 5. Realizar la lectura (turbidez y produccin de gas indican presencia de coliformes totales). 6. Confirmar la presencia de coliformes Totales, sembrando en placas de Agar EMB. 7. Incubar a 37C durante 24 horas. 8. Realizar la lectura observando la presencia de colonias sospechosas de coliformes Totales (Colonias grandes verdosas con brillo metlico). 9. Transferir dos asadas del tubo positivo a un tubo con caldo brilla (con tubo durham) y a uno con caldo indol. 10. Incubar en bao serolgico a 45C por 24-48 horas, asegurndose de que el nivel del agua cubra el medio de cultivo. 11. Adicionar 5 gotas del reactivo de Kovacs al tubo con caldo indol, para la determinacin de indol. 12. Realizar la lectura (la turbidez y el gas en el tubo de brilla y la produccin de indol en el caldo indol, indican la presncia de coliformes fecales). Recuerde que solo la positividad de ambos tubos, indican la presencia de Coliformes fecales. 4.2. ESTUDIO MICROBIOLGICO A UTENSILIOS, EQUIPOS Y SUPERFICIES. Procedimiento de la esponja o gasa estril. 1. Con la ayuda de una bolsa de plstico, a manera de guante, tomar la esponja estril, evitando posibles contaminaciones. 2. Verter unos mililitros de caldo lactosado a la esponja y muestrear el utensilio, equipo o superficie seleccionada, frotando la esponja por toda el rea. 3. Dejar la esponja en el interior de la bolsa, una vez finalice la operacin y agregar el resto del caldo lactosado. 4. Cerrar y marcar la bolsa. 5. Exprimir la esponja varias veces, suavemente. 6. Incubar la bolsa con la espoja a 37C durante 24 horas. 7. Pipetear 1ml de caldo lactosado y transferirlo a un tubo con caldo brilla. 8. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas. 9. Realizar la lectura observando la presencia de gas y turbidez. 10. Continuar como en el inciso 6 del numeral 4.1.2.2. 4.3. ESTUDIO MICROBIOLOGICO AL AMBIENTE. 4.3.1. Evaluacin de la Contaminacin Bacteriana. 1. Abrir una caja de Agar Plate Count por 10 minutos. 16. 2. Cerrar la caja e incubar a 37C por 24-48 horas. 3. Contar y reportar el nmero de colonias. 10 4.3.2. Evaluacin de la Contaminacin Fngica. 4. Abrir una caja de Agar Ogy por 10 minutos. 5. Cerrar la caja e incubar por 3 a 5 das a 22C. 6. Contar y reportar el nmero de microorganismos. 5. INTERPRETACIN Y REPORTE 5.1. Fosas nasales y zona faringea La determinacin del Staphylococcus aureus en estos casos es considerada una prueba de presencia o ausencia, se reporta como prueba positiva o negativa para Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 5.2. Manos Evaluacin del mtodo de desinfeccin. Esta prueba sirve para establecer la eficacia del lavado de las manos en manipuladores y se

reporta la diferencia entre las UFC antes y despus del lavado. Evaluacin de la contaminacin fecal. La determinacin de coliformes totales y fecales, en este caso es una prueba de presencia o ausencia, se reporta como presencia de coliformes totales o fecales; indican que el proceso de sanitizacin no es el ideal o contaminacin de origen fecal. 5.3. Estudio microbiolgico a utensilios, equipos o superficies. La presencia de coliformes totales o fecales, indican que el proceso de limpieza y desinfeccin no es el adecuado o contaminacin de origen fecal. 5.4. Evaluacin microbiolgica al ambiente. Se reporta el nmero de colonias, que no debe ser mayor de 10 en 10 minutos, si es mayor indica que el ambiente est contaminado y se debe repetir el proceso de desinfeccin o esterilizacin del ambiente. 6. BIBLIOGRAFA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnstico Microbiolgico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 17. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 11 4. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar 18. 12 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 3: CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE RECUENTO EN PLACA. 1. INTRODUCCIN El recuento en placa es el mtodo ms utilizado y ms recomendado por la Comisin Internacional sobre especificaciones Microbiolgicas en los alimentos (ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificacin de la poblacin microbiana presente en los alimentos slidos o lquidos, sembrando en profundidad o en superficie. La mayora de los alimentos no son estriles, sino que contienen una poblacin microbiana, que vara ampliamente en nmero, dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan diluciones para su cuantificacin, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir, presentaran un recuento tan alto que sera imposible realizar su conteo. Para eso se utilizan las diluciones logartmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilucin, que es el inverso de la dilucin. La dilucin inicial siempre ser 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parmetros que existan, pero lo importante que se guarde la relacin: 1+9 o sea 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente. 2. OBJETIVOS 1. Preparar correctamente homogenizados a partir de muestras de alimentos slidos o lquidos. 2. Realizar diluciones logartmicas en base 10 a partir de los homogenizados. 3. Sembrar en profundidad 1ml de las diferentes diluciones con agar plate count. 4. Sembrar en superficie 0.1ml de las diferentes diluciones en el agar correspondiente. 5. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, despus de evaluar la calidad de los controles y de las diluciones. 6. Informar el nmero de UFC/g ml de alimento. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Materiales* Agua peptona 0.1% Homogenizador Agar Plate count Balanza Agar leche Cuchillos-cucharas Agar EMB Incubadora Agar Tributirina Contador de colonias 19. Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Cajas petri estriles * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.4. PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES 1. Si la muestra no se va a procesar inmediatamente, debe guardarse en refrigeracin a 4C por un tiempo mximos de 24 horas. 2. Desinfectar con alcohol al 70% el frasco o envase que contiene el alimento. 3. En un frasco o fiola adicionar 90ml de agua peptonada al 0.1% y marcarla como dilucin 10-1. 4. Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilucin 10-2 y dilucin 10-3, adicionar a cada uno de ellos 9 ml de agua peptonada al 0.1%. 5. Agitar unas 25 veces las muestras lquidas, formando un arco con el antebrazo de 30 cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces, si el recipiente no tiene espacio libre con el fin de homogenizar la muestra y tomar una parte representativa del producto. Para muestras slidas pesar 10g de la muestra, tratando de tomar porciones de varias partes. 6. Tomar 10 ml o 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco que contiene los 90 ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta ms de 10 veces, hasta homogenizar la mezcla; as se obtiene la dilucin 10-1. 7. Tomar 1 ml de la dilucin 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml de agua peptonada al 0.1% marcado con la dilucin 10-2. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilucin 10-2. 8. Tomar 1 ml de la dilucin 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilucin 10-3. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. As se obtiene la dilucin 10-3. 9. De esta forma se tienen

las diferentes diluciones, el nmero de ellas va ha depender del alimento y de los parmetros que existan, pero deben sembrarse por lo menos tres (3) diluciones. (Ver figura 2 ) 4.5. PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD. 1. Tomar 5 cajas de petri estriles y marcarlas en la tapa como dilucin 10 -1, 10-2, 10-3, control del diluyente y control del medio; adems escribir en cada una de ellas el N del grupo, el semestre, la fecha, el tipo de examen y el nmero de la muestra. 2. Mezclar unas diez veces con la pipeta la dilucin 10 -1 y tomar 1ml de la dilucin y adicionarlo en la caja marcada con 10-1 (ver figura 3), las diluciones deben sembrarse por duplicado. 3. Mezclar de igual forma con pipeta diferente la dilucin 10-2, tomar 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilucin 10-2. 20. 14 4. Mezclar de igual forma con pipeta nueva la dilucin 10-3, pipetear 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilucin 10-3. El tiempo transcurrido entre la realizacin de las diluciones y la siembra en la ltima caja, no debe ser mayor de 20 minutos. 5. Adicionar 1ml de agua peptonada al 0.1% a la caja marcada como control del diluyente. 6. Adicionar 15ml del agar fundido a 45C, a cada una de las cajas, incluyendo las cajas marcadas como control del diluyente y del medio. Segn la temperatura de incubacin, se obtienen los mesfilos aerobios a 37C, los termfilos cuando se incuban las cajas a 55C, los psicrfilos a 7C por 10 das. La temperatura elegida depender del objetivo que se pretenda con la realizacin del recuento. Tambin dependiendo del medio de cultivo se pueden determinar: mesfilos aerobios y facultativos viables, utilizando agar plate count; protelticos, utilizando agar leche; lipolticos, utilizando al agar tributirina; coliformes, utilizando agar EMB o VRBD. Cambiando las condiciones de aerobiosis por anaerobiosis y el medio de cultivo, se pueden detectar loa mesfilos anaerobios y facultativos viables, utilizando agar cisteinado e incubando por 72 horas en condiciones de anaerobiosis. a. Mesfilos aerobios y facultativos viables: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C por 24 a 48 horas. b. Termfilos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 55C por 24 a 48 horas. c. Psicrtrofos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 7C por 10 das. d. Proteolticos: Adicionar 15 ml de Agar leche fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 22C por 72 horas. 21. e. Coliformes: Adicionar 15 ml de Agar EMB fundido a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C por 24 a 48 horas. 15 7. Mezclar cinco veces en forma de ochos, en direccin de las manecillas del reloj y viceversa, de arriba hacia abajo y viceversa con el fin de obtener una distribucin homognea de la muestra en el medio de cultivo. 8. Dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C de 24 a 48 horas. 4.6. PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE. 1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar con el nombre del alimento, fecha, dilucin y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del diluyente y otra como control del medio. 4. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio de cultivo. 5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C (ver figura 4). 7. Seleccionar las cajas que tengan entre 20 a 200 colonias. 8. Realizar el conteo final multiplicando por la dilucin y por 10. 5. INTERPRETACIN Y REPORTE 1. Sacar las cajas de la incubadora. 2. Evaluar las cajas marcadas como control del diluyente y control del medio. 3. Organizar las cajas de la dilucin menor a la mayor. 4. Evaluar el crecimiento secuencial y la calidad de las diluciones, el recuento debe ser 10 veces menos a medida que aumenta la dilucin. 5. Proceder al recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC). 6. INFORMES DE RESULTADOS 1. Se reportan solamente dos dgitos, el primero y el segundo de izquierda a derecha, los otros dgitos deben reemplazarse por ceros. 2. No se reportan cifras decimales, sino que se redondea al mas prximo nmero si el tercer dgito es 5 o mayor y se quita si es menor de cinco. 3. Los recuentos estimados no se reportan para la aceptacin o rechazo de un alimento, porque es til solo como una aproximacin primaria en la calidad bacteriolgica de un alimento.

22. 7. REGLAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS 16 1. Cajas entre 30 -300 UFC Es la caja ideal (para siembras en profundidad), se cuentan las UFC y se multiplican por el inverso del factor de dilucin. Ej: Dil: 10-1 >300 UFC -2 Dil: 10 > 300 UFC Dil: 10-3 80 UFC Dil: 10-4 10 UFC Resultado: 80x103 UFC /g o mL. Si las cajas se sembraron por duplicado, se promedia el valor y se multiplican por el factor de dilucin. Se reporta Recuento Estndar en placa 80x103 UFC /g o mL Para siembras en superficie se recomienda escoger cajas que contengan entre 20 y 200 UFC, y para el recuento de mohos y levaduras cajas que contengan entre 20 y 100 UFC (Escobar, 1994, p 183 y 199). 2. Diluciones consecutivas entre 30-300 UFC. Se hace el recuento para cada dilucin y se promedian los resultados. Ej: a) Si el conteo de una de las cajas es menos del doble del conteo de la otra caja, se informa el promedio de recuento. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC -2 Dil: 10 300 UFC Dil: 10-3 38 UFC Dil: 10-4 10 UFC Resultado: 38000/30000= 1,27, lo que indica que el conteo de la dilucin mayor es manos del doble de la dilucin menor, entonces se reporta el promedio del recuento: (38000 + 30000)/2 = 34000 UFC 34x103. Se reporta Recuento Estndar en placa 34x103 UFC /g o mL b) Si el conteo de una de las cajas es el doble o ms del conteo de la otra caja, se informa el recuento menor. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC -2 Dil: 10 200 UFC Dil: 10-3 60 UFC Dil: 10-4 15 UFC Resultado: 60000/20000= 3, lo que indica que el conteo de la dilucin mayor es mas del doble de la dilucin menor, entonces se reporta la dilucin menor o sea 20000UFC 20x103 UFC. Se reporta Recuento Estndar en placa 20x103 UFC/ g mL. 23. 17 3. Ninguna caja entre 30 y 300 UFC En estos casos se elige la caja con el recuento ms cercano a 300, se multiplica por el factor de dilucin y se reporta como Recuento Estimado en Placa. 4. Todas las cajas tienen menos de 30 UFC. Se cuentan las colonias de la caja con menor dilucin y se reporta como Recuento Estimado en placa. 5. Ninguna de las cajas presenta crecimiento. Despus de estudiar los controles, evaluar que no haya presencia de sustancias inhibidoras en el medio de cultivo, se informa como menos de la dilucin mas baja utilizada, menos de 101 UFC /g mL. o menos de 10 UFC /g mL ( para siembra en profundidad) y menos de 10 2 UFC /g mL o menos de 100 UFC /g mL ( para siembra superficial). Se reporta como Recuento Estimado en placa: 16x105 UFC/g mL. 7. Presencia de Spreader Es el crecimiento de un microorganismo en forma de pelcula, la cual puede ocupar toda la caja o parte de ella. Si cubre solo la mitad contar las colonias presentes en la otra mitad y reportar como Recuento Estimado en placa. Si cubre toda la caja se tiene que repetir el recuento y reportar presencia de spreader o accidente de laboratorio. 8. INVESTIGAR 1. Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los alimentos o productos donde la contaminacin es esencialmente superficial? 2. Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los productos grasos y que se hace cuando el contenido graso es mayor del 20%? 24. 3. Qu precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir de alimentos congelados, deshidratados o pasteurizados? 4. Cul es la importancia y utilidad del recuento en placa? 18 9. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 10. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeo Grupo 4: 100 g de pulpa de fruta o una fruta fresca Grupo 5: 100 g de chorizo. Figura No. 2 Diluciones decimales 90 ml Agua Dilucin 10-1 10 g pepto na 1ml 10 ml 9 ml Agua Dilucin 10-2 Pept. 1ml 9 ml Agua Pept. 25. Dilucin 10-3 19 Figura No. 3: Siembra en Profundidad 10-1 10-2 10-3 C.D 1 ml 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 C.D. C.M . ml 15 Agar 15ml 45C Mezclar Solidifi car Y Incubar

26. 20 Figura No. 4: Siembra en Superficie 10-1 10-2 10-3 C.D 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 10-1 10-2 10-3 C.D. C.M . Agar Incubar 27. 21 UNIVERSIDAD DE CRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS GUA N 4: TECNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP) 1. INTRODUCCIN Esta tcnica sirve para estimar la poblacin de microorganismos viables en una muestra de alimento. En contraste con el recuento estndar en placa, el NMP es un mtodo indirecto y solo da recuentos estimados de la poblacin microbiana; es menos preciso que el recuento en placa cuando se trata de alimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero mas eficaz en poblaciones bajas porque permite el anlisis de muestras de tamao mas significativo. Se usa principalmente para la determinacin de coliformes, pero variando el medio de cultivo tambin se puede utilizar para la cuantificacin de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, etc. La metodologa de la tcnica se basa en la siembra de volmenes secuenciales de base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 mL) de la muestra pura o 1 mL de la diluciones decimales. El nmero de diluciones depender del grado de contaminacin del alimento y/o de los estndares microbiolgicos establecidos para ese producto: La relacin muestra pura o diluida debe ser de 1mL para 10 mL de medio de cultivo. Existen diferentes del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivo utilizado: el norteamericano emplea el caldo laurel sulfato triptosa, seguida de la confirmacin de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante o siembra por estra en EMB; el britnico solo utiliza caldo Mac-konkey; un tercer mtodo emplea el caldo lactosa bilis verde brillante y confirman con agar cristal violeta rojo neutro bilis lactosa. La utilizacin del mtodo depender del tratamiento a que ha sido sometido el alimento. 2. OBJETIVOS 1. Conocer el fundamento de la tcnica del nmero ms probable. 2. Sembrar muestras puras y diluidas por la tcnica del NMP utilizando diversas modalidades y medio de cultivo. 3. Leer la positividad de los tubos en las tablas correspondientes. 4. Informar los resultados de la tcnica del NMP. 3. MATERIALES 28. Medios de cultivo Reactivos Materiales* Bilis verde brillante Coloracin de gram Homogenizador lactosa con durham A. EMB Balanza Agua peptona 0.1% Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo * Algodn y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.1. TECNICA CON 5 TUBOS PARA MUESTRAS LQUIDAS PURAS 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo. 2. Marcar 5 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa a doble concentracin. 3. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 4. Mezclar muy bien el alimento y adicionar 10mL en cada uno de los tubos (ver figura 5). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37C. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parmetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos y buscar en la tabla No. 1, que es una tabla que se usa cuando se utilizan 5 tubos con 10mL de muestra. El resultado del NMP se obtiene en 100mL, si el resultado se tiene que expresar por mL se divide entre 100. 4.2. TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS LQUIDAS PURAS. 1. Desinfectar Con alcohol al 70% toda el rea de trabajo. 2. Tomar 9 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa, tres de los cuales estn a doble concentracin y los 6 restantes a concentracin simple. 3. Marcar los tubos anteriores de la siguiente manera: con el nmero 10 los tres tubos que tienen doble concentracin, con el nmero 1 tres tubos con concentracin simple y con el nmero 0.1 los tres tubos restantes que tambin tienen una concentracin normal o simple. 4. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 5. Mezclar muy bien el alimento y sembrar por triplicado 10mL, 1mL y 0.1 mL en cada uno de los tubos marcados respectivamente (ver figura 6). 6. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 3537C. 29. 7. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presenten estos parmetros o presente solamente uno de los dos. 23 8. Anotar los tubos positivos y confirmar la presencia del microorganismo a determinar usando pruebas complementarias. 9. Anotar los tubos que resultaron positivos en la prueba confirmatoria. 10. Buscar en la tabla No. 2, que es una tabla que se usa cuando se siembran 10mL de muestra en tres tubos, 1mL en otros tres tubos y 0.1mL de muestra en los ltimos tres tubos. El resultado del NMP se da en 100mL, si el resultado se debe expresar por mL se divide entre 100. 4.3. TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS LQUIDAS O SLIDAS. 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo. 2. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 3. Mezclar muy bien el alimento y realizar tres diluciones de igual forma que para el

recuento en placa. 4. Sembrar por triplicado 1mL de cada uno de las diluciones en tubos que contengan 10mL de Bilis verde brillante lactosa preparados a concentracin simple (ver figura 7). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37C. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parmetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos que dieron positivo la prueba confirmatoria (Ver figura 7). 8. Buscar en la tabla No. 3, que se usa cuando se siembra por triplicado 1mL de muestra en cada una de las diluciones. El NMP se expresa por mL. 4.4. PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS COMPLEMENTARIAS Estas pruebas se utilizan para comprobar si realmente se ha detectado el microorganismo buscado 4.4.1. Examen microscpico directo: 1. realizar frotis a partir de los tubos positivos. 2. Colorearlos con Gram. 3. Observar los microorganismos al microscopio con objetivo de 100X. Este mtodo no es til ya que no permite distinguir los microorganismos muertos de los vivos. 4.4.2. Subcultivos: 1. Realizar siembras de los tubos positivos en agar selectivo (EMB, mac- Konkey Endo). 2. Incubar por 2448 horas a 37C. 30. 3. Observar el crecimiento del microorganismo buscado e informar. 24 5. RESULTADOS E INTERPRETACIN. Los resultados se expresan como NMP = No. de bacteria/ g mL de alimento; hay veces dependiendo del alimentos se expresa como NMP = No. de bacterias / 100mL. Los resultados de un anlisis de NMP, estn directamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una serie de resultados positivos, que son los mas probables que ocurran cuando un nmero dado de organismos estn presentes en una muestra de alimentos. En caso de realizar ms diluciones que las que posea la tabla empleada, se puede usar la siguiente frmula para hallar el NMP por g mL: (NMP de la tabla x Factor de dilucin intermedio de la lectura)/ 100 = Bact/g mL 6. BIBLIOGRAFA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 3. ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln, 1994. 4. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol. 1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fsforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche cruda Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeo Grupo 4: 100 mL de jugo preparado en casa Grupo 5: 100 g de chorizo. 31. 25 TABLA No. 1 TABLA DE NMP Y LMITES DE CONFIANZA CUANDO SE USAN 5 TUBOS CON 10 ML DE MUESTRA NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95% Mnimo Mximo 0 2.2 0 6.0 1 2.2 0.1 12.6 2 5.1 0.5 19.2 3 9.2 1.6 29.4 4 10.0 3.0 52.9 5 16.0 8.0 Infinita TABLA No. 2 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS PURAS NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95% 10mL 1mL 0.1mL Mnimo Mximo 000 2400 26 TABLA NO. 3 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/g mL LIMITES DE CONFIANZA 10-1 10-2 10-3 99% 95% 000