Guio Practiques Microbiologia Sanitaria UB v2.5.1 (2007)

GUIÓ DE PRÀCTIQUES DEGUIÓ DE PRÀCTIQUES DE

MICROBIOLOGIA SANITÀRIAMICROBIOLOGIA SANITÀRIA

2003 - 20072003 - 2007

Dept. MicrobiologiaFacultat de Biologia Universitat de Barcelona

Av. Diagonal, 64508028 BarcelonaTelf. 93 402 14 88Fax. 93 403 46 29

Aquesta obra està sota una llicènciaReconeixement-CompartirIgual de Creative Commons.http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5/

- Coordinador de Teoria:Joan Tomàs

- Coordinador de Pràctiques:Óscar Gallardo

- Disseny del guió:Jose María NietoCristina GarciaÓscar Gallardo



Índex de continguts

BLOC 1: ANÀLISI MICROBIOLÒGICA D'UN ALIMENT (BLEDES)...................................5Introducció a la pràctica...................................................................................................5Pràctica (realització en grups de 2 alumnes)...................................................................5

1. Preparació de la mostra de bledes (ho farà el professor)................................52. Anàlisi de la mostra..........................................................................................5

A. Aerobis totals......................................................................................5B. Indicadors de contaminació fecal. Coliforms totals..........................5C. Indicadors de contaminació fecal. Coliforms fecals..........................6

C.1. Prova presumptiva...............................................................6C.2. Prova confirmativa..............................................................6

D. Indicadors de contaminació fecal. Estreptococs fecals.....................6D.1. Prova presumptiva...............................................................7D.2. Prova confirmativa (dos dies més tard)..............................7

E. Clostridis sulfit-reductors....................................................................7F. Detecció de microorganismes patògens. Salmonella........................7

F.1. Creixement sense pressió selectiva (estrès).........................7F.2. Enriquiment..........................................................................7F.3. Identificació presumptiva.....................................................8

G. Detecció de microorganismes patògens. Staphylococcus aureus.. . .8Identificació per aglutinació de Staphylococcus aureus............8

BLOC 2: ANÀLISI D'ORINA....................................................................................................10Introducció a la pràctica.................................................................................................10Protocol de la pràctica (en grups de dos alumnes)........................................................10

1. Obtenció de les mostres d'orina de 2 voluntaris...........................................102. Anàlisi de la mostra........................................................................................10

A. Anàlisi del sediment: Tinció Gram...................................................10B. Urocultius: Recompte d'aeròbics totals............................................11C. Urocultius: Inòcul en medis selectius...............................................11D. Cultiu pur en TSA de les colònies aïllades en McConkey i KF......11E. Tinció Gram.......................................................................................11F. Sembra en ENTEROSYSTEM 18 R i API 20S................................11G. Antibiograma....................................................................................12H. Proves de l'Oxidasa i la Catalasa......................................................12

BLOC 3: TÈCNIQUES MOLECULARS DE DETECCIÓ DE MICROORGANISMES........13Part I: DETECCIÓ DE COMPONENTS CEL·LULARS DE SALMONELLA PER

E.L.I.S.A. ...........................................................................................................13Protocol de la pràctica........................................................................................13

Part II: DETERMINACIÓ DE LA PRESÈNCIA D'ÀCIDS NUCLEICS PER HIBRIDACIÓ MOLECULAR..........................................................................15Dia 1: Cultius overnight (realitzats pels professors).........................................15Dia 2: Fixació i hibridació.................................................................................15Dia 3: Rentats i revelat.......................................................................................16

ANNEX 1....................................................................................................................................17Tinció de Gram...............................................................................................................17Taula del Nombre Més Probable (NMP).......................................................................17

ANNEX 2....................................................................................................................................18Composició dels Medis de Cultiu..................................................................................18

Brou Lactosat Porpra (BLP)..............................................................................18Brou Azida de Rothe (BAR)..............................................................................18Agar Hektoen.....................................................................................................18Agar SPS. Agar selectiu per Clostridium perfringens......................................18Brou Base al Tetrationat (BBT).........................................................................18Brou Bilis al Verd Brillant (BBVB)...................................................................18Agar de Baird-Parker (BP).................................................................................18Agar de Sabouraud glucosat amb cloramfenicol..............................................18Brou Azida Violeta de Litsky (LIT)...................................................................18Agar KF..............................................................................................................19

Composició dels Reactius del E.L.I.S.A........................................................................19Composició dels Reactius de la Hibridació...................................................................19

ANNEX 3....................................................................................................................................21Llicència Creative Commons.........................................................................................21

Pràctiques Microbiologia Sanitària

BLOC 1: ANÀLISI MICROBIOLÒGICA D'UN ALIMENT (BLEDES).

Introducció a la pràctica:

En aquesta pràctica es determinarà la presència en un aliment vegetal sense cuinar (bledes) dels següents grups de microorganismes:

A.-Microorganismes coneguts com a "indicadors de contaminació fecal": Les característiques que han de tenir els indicadors de contaminació fecal són:

– Ser fàcils d'aïllar i cultivar en el laboratori.– Ser relativament inofensius.– La seva concentració ha de ser elevada.– No s'han de poder reproduir al medi aquàtic.– Han de tenir una resistència als tractaments (depuració, etc) semblant a la dels patògens.

Farem un recompte de coliforms i estreptocos fecals mitjançant el creixement sota condicions estandaritzades i aplicant la tècnica del nombre més probable (NMP). També farem un recompte d'un altre grup d'indicadors de contaminació fecal: els clostridis sulfit-reductors.

B.-Microorganismes patògens:Els microorganismes patògens provinents de la contaminació d'origen fecal es troben en quantitats molt menors que els indicadors de contaminació fecal. Adicionalment el seu recompte pot ser més difícil.

Determinarem la presencia de Salmonella sp, (aquest és un patogen d'origen fecal) y Staphylococcus aureus (aquest no és un patogen d'origen fecal).

Pràctica (realització en grups de 2 alumnes):

1. Preparació de la mostra de bledes (ho farà el professor).

– Pesem 100 g de les bledes sense rentar a dins d'una bossa de “masticator”. Afegim 300 ml de solució salina Ringer 1/4 (proporció 1:3). Homogeneïtzem la mostra mitjançant l'aparell "masticator". El temps d'homogeneïtzació serà 1 minut.

– Per cada grup de pràctiques preparem 1.2 litres de ressuspensió final, aproximadament, i el repartim en ampolletes estèrils a raó de 100 ml aproximadament.

2. Anàlisi de la mostra.

A. Aerobis totals.

Definim aquest grup com tots aquells heteròtrofs aerobis i anaerobis facultatius, mesòfils, capaços de créixer en agar nutritiu a una temperatura i en un temps determinat.– Fem un banc de dilucions en Ringer 1/4 fins la dilució –4 fent servir pipetes de vidre i tubs de tap verd.– Sembrem dues rèpliques de 0.1 ml de les dilucions -3 i -4 en plaques de TSA.– Incubem a 37 ºC durant 24-48 hores.– Fem el recompte de les colònies en aquelles plaques que continguin entre 30 i 300 colònies. Donar el

resultat promig en u.f.c./g de bleda.

B. Indicadors de contaminació fecal. Coliforms totals.

Són tots aquells bacils Gram negatius, anaerobis facultatius, oxidasa negatius, que no formen espores i fermenten la lactosa amb producció d'àcid i gas a 37 ºC en 48 hores. Taxonòmicament corresponen als gèneres Escherichia, Klebsiella, Enterobacter i Citrobacter.

Material: 9 tubs de Brou Lactosat Porpra (3 x 9 ml; 3 x 10 ml i 3 doble concentració), pipetes de vidre de 10 i 1 ml.

5


– Sembrem 3 tubs de 10 ml de Brou Lactosat Porpra (BLP) 2X amb 10 ml de mostra.

– Sembrem 3 tubs de 9 ml de BLP 1X amb 1 ml de mostra.– Sembrem 3 tubs de 10 ml de BLP 1X amb 0.1 ml de mostra.– Incubem a 37 ºC durant 48 hores mantenint els tubs estàtics.

El tubs de BLP porten campana de Durham per tal de recollir els possibles gasos produïts en la fermentació de la lactosa, únic sucre fermentable del medi.

Es consideraran positius aquells tubs on hi hagi viratge del color del medi a groc i s'observi acumulació de gas en la campana de Durham.

La prova de recompte de coliforms totals equival a la primera part del recompte de coliforms fecals.

C. Indicadors de contaminació fecal. Coliforms fecals.

Són aquells bacteris del grup coliform que presenten les mateixes característiques que els coliforms totals però que fermenten la lactosa amb producció de gas en un màxim de 48 hores a 44 ºC en presència de sals biliars, i a més són indol +.

C.1. Prova presumptiva:

La prova presumptiva correspon a la ja explicada dels coliforms totals, és a dir, que els coliforms totals presumptivament poden ser fecals, i per tant cal dur a terme una prova confirmativa.

C.2. Prova confirmativa:

– De cada tub positiu de BLP inoculem amb nansa de sembres un tub de 10 ml de Brou Bilis Verd Brillant (BBVB); incubem durant 24 hores a 44 ºC.

– De cada tub positiu de BLP inoculem també amb nansa de sembres un tub d'indol (I); incubem durant 24 hores a 37 ºC.

– Mirem el creixement i la producció de gas en els tubs BBVB, i l'aparició o no d'un anell rosat en els tubs d'indol en afegir el reactiu de kovacs.

Només es consideren positius per coliforms fecals aquells tubs, provinents dels tubs positius per BLP, que donin positius en BBVB i indol.

Fent servir la taula del Nombre Més Probable de l'Annex 1, donar el NMP de coliforms fecals per gram de bleda (NMP/g).

D. Indicadors de contaminació fecal. Estreptococs fecals (enterococs).

Són cocs Gram positius, aerobis o anaerobis facultatius, catalasa negatius, que fermenten la glucosa amb producció d'àcid a 37 oC en un màxim de 48 hores.L'antic gènere Streptococcus va ser dividit en el gèneres Lactococcus, Streptococcus i Enterococcus. Hi trobem espècies com Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus.

Atenció!: els medis Brou Azida de Rothe (BAR) i Brou Azida Violeta de Litsky (LIT) contenen Azida Sòdica, un potent inhibidor de la cadena respiratòria. Evitar el contacte, la inhalació i la ingestió.

2x

9 ml 1x

10 ml 1x

10 ml

1 ml

0.1 ml

Muestra

2x

9 ml 1x

10 ml 1x

10 ml

1 ml

0.1 ml

Muestra

6


D.1. Prova presumptiva:

– Sembrem 3 tubs de 10 ml de Brou Azida de Rothe (BAR) 2X amb 10 ml de mostra.– Sembrem 3 tubs de 9 ml de BAR 1X amb 1 ml de mostra.– Sembrem 3 tubs de 10 ml de BAR 1X amb 0.1 ml de mostra.– Incubem a 37 ºC durant 48 hores mantenint els tubs estàtics.

Es consideraran positius aquells tubs on hi hagi creixement bacterià (terbolesa).

D.2. Prova confirmativa (dos dies més tard):

– De cada tub positiu de BAR inoculem amb nansa de sembres un tub de 10 ml de Brou Azida Violeta de Litsky (LIT).

– Incubem durant 24 hores a 37 ºC.

Es consideraran positius aquells tubs on hi hagi creixement bacterià (terbolesa).

Fent servir la taula del Nombre Més Probable de l'Annex 1, donar el NMP d'estreptococs fecals per gram de bleda (NMP/g).

E. Clostridis sulfit-reductors.

Són bacils Gram positius anaerobis estrictes, formadors d'espores i amb activitat sulfit-reductora (son capaços de reduir el sulfit a sulfur).

– Afegirem 1 ml de mostra a un tub de tap verd vuit, i el sotmetrem a un tractament de xoc tèrmic a 80oC durant 10 minuts.

– Afegim a aquesta mostra tractada per calor 9 ml d'agar SPS i agitem per inversió a fi d'homogeneïtzar bé la mostra i el medi.

– Incubem durant 48 hores a 37 ºC.– Fem el recompte de les colònies negres que apareguin (degudes a la formació de sulfur de ferro, en reduir

els clostridis els sulfits a sulfurs). Donar el resultat en u.f.c./g de bleda.

F. Detecció de microorganismes patògens. Salmonella .

Les salmonel·losis o gastroenteritis causades per Salmonella es deuen al consum d'aliments o aigües que han rebut contaminació fecal amb el bacteri. Cal doncs diagnosticar la seva presència per a evitar els brots de salmonel·losi.

F.1. Creixement sense pressió selectiva (estrès):

– Inoculem 4 ml de mostra en un tub amb 4 ml d'aigua peptonada.– Incubem durant 24 hores a 37 ºC mantenint els tubs estàtics.

F.2. Enriquiment:

– Inoculem 1 ml del creixement en aigua peptonada en 3 tubs de 9 ml de Brou Base al Tetrationat (BBT) preparat el mateix dia. El BBT conté sals biliars i tetrationat per dificultar el creixement de microorganismes diferents a Salmonella.

– Incubem durant 24 hores a 37 ºC mantenint els tubs estàtics.

7


F.3. Identificació presumptiva:

– A partir de cada tub crescut de BBT fem una estria en escocès en una placa d'Agar Hektoen (medi selectiu-diferencial que conté sals biliars i altres substancies adients per a la identificació de Salmonella).

– Incubem durant 24 hores a 37 ºC.– Contem com a presumptes Salmonel·les les colònies verd-blaves amb o sense un punt fosc al centre.

Comparar amb les colònies de Salmonella de la placa control sembrada pel professor el dia abans.

G. Detecció de microorganismes patògens. Staphylococcus aureus.

Els estafilococs formen part dels bacteris més freqüentment aïllats en patologia humana i animal. Clínicament, les espècies més importants són Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis i Staphylococcus saprophyticus. Aquests bacteris són responsables de freqüents infeccions, sobre tot cutànies, que poden revestir gravetat. Són també importants patògens nosocomials, podent causar afeccions greus com septicèmies, endocarditis, meningitis, pneumònies, etc. Quan causen contaminacions en aliments no provenen de contaminació d'origen fecal, sinó d'una manipulació i/o elaboració incorrecta.

Procediment de la pràctica:

– Fem una dilució -1 de la mostra.– Inoculem 0.1 ml de la dilució -1 i 0.1 ml de la mostra directa en dues plaques d'Agar de Baird-Parker

(medi selectiu i diferencial per Staphylococcus, amb TTC i lecitina d'ou).– Incubem durant 48 hores a 30 ºC.

Considerem possibles (presumptes) colònies positives aquelles que presentin un halus de degradació de la lecitina al seu voltant i a més siguin de color negre degut a la utilització del TTC (tots 2 fets relacionats amb la presència de coagulases).

Amb aquestes possibles positives realitzarem una prova d'aglutinació (Slidex Staph-kit).

Identificació per aglutinació de Staphylococcus aureus:

S'utilitzarà el kit Slidex Staph Kit de Biomerieux, un test d'aglutinació per a la identificació ràpida de Staphylococcus aureus. Els principis de la prova són la detecció d'un receptor proteic per fibrinogen (present en un 96 % de les soques de Staphylococcus aureus), la detecció de la proteïna A (present en un 90 % de les soques i que mostra afinitat d´unió al fragment Fc de les IgG) i la detecció d'antigens superficials propis de Staphylococcus aureus. Si les soques d'aquest microorganisme tenen receptor per fibrinogen, al ser barrejades amb les partícules de làtex sensibilitzades amb fibrinogen, contingudes en el reactiu del kit, té lloc una aglutinació que es detecta visualment. Si les soques que s'avaluen tenen proteïna A, al ser barrejades amb les partícules de làtex, sensibilitzades amb un anticòs monoclonal que conté el reactiu, té lloc una aglutinació de làtex que també es pot detectar visualment. Finalment si les soques que es testen tenen l'antigen de superfície contra el qual està dirigit l'anticòs monoclonal adherit a les partícules de làtex, també es produirà una aglutinació visual del làtex.

Protocol a seguir (Atenció!: el Kit d´aglutinació Slidex conté components d'origen humà, manipular amb precaució i fent servir guants de làtex):

– Emulsionar bé els reactius test i control.– Aplicar una gota del reactiu 1 (partícules de làtex sensibilitzades amb fibrinogen humà i anticossos

monoclonals dirigits contra antigens de la superfície de S. aureus) sobre la targeta subministrada amb el kit.

– Prendre amb una vareta de plàstic una colònia aïllada de la placa de Baird-Parker (fer servir cultius joves de màxim 48 hores, i millor si fossin de 24 hores) i barrejar-la amb la gota del reactiu test, començant per un extrem.

– Fer moviments circulars sobre la targeta blanca a fi de que tingui lloc la reacció d'aglutinació.

8


– Deixar reposar.– Si la reacció és positiva cal repetir la prova amb el reactiu control (partícules de làtex no sensibilitzades),

per confirmar que en aquest cas la nostra soca dona negatiu (C-).– Paral·lelament es farà la prova amb una soca coneguda de Staphylococcus aureus per utilitzar-la com a

control positiu (C+).

9


BLOC 2: ANÀLISI D'ORINA

Introducció a la pràctica.

El tracte urinari és estèril. Tan sols la uretra distal (anterior) posseeix una flora indígena la composició de la qual depen de l'edat, el sexe, l'estat de salut de la persona, entre d'altres factors. La presència de bacteris a l'interior del tracte urinari implica una situació patològica de variable significat clínic. El terme “bacteriuria” és emprat per designar la presència de bacteris a l´orina, independentment del significat clínic patogènic d'aquesta presència. El terme “bacteriuria significativa” es refereix a la presència en orina de més de 105 bacteris per mililitre. Les bacteriuries significatives poden ser asimptomàtiques (si el pacient no mostra indicis clínics d'infecció), o bé poden ser simptomàtiques, circumstància llavors coneguda com a “infecció urinària”.

Els microorganismes patògens que poden causar infecció urinària poden ser bacteris, fongs i virus. La infecció per paràsits sol ser un tema considerat apart. La immensa majoria d'infeccions del tracte urinari estan causades per microorganismes que formen part de la flora normal del intestí. Es tracta de bacteris Gram negatius, de la Família Enterobacteriaceae. En primer lloc en l'ordre de freqüència trobem Escherichia coli, a continuació trobem Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter i Serratia. El gènere Pseudomonas no pertany a aquesta família però també es pot trobar com a agent causal d'infeccions urinàries. Menys freqüents són les infeccions causades per microorganismes Gram positius. D'entre aquestes hem de destacar Enterococcus faecalis i Staphylococcus.

Els fongs més freqüentment associats a infeccions urinàries pertanyen al gènere Candida. Pel que fa als virus, els adenovirus són causa freqüent de cistitis hemorràgiques en els infants.

Sempre que sigui possible en hospitals s'ha de evitar la cateterització doncs comporta risc de causar infeccions.

En aquesta pràctica s'intentarà diferenciar una orina normal d'una orina contaminada mitjançant el paràmetre del recompte de microorganismes aeròbics totals i l'observació microscòpica. D'altra banda s'intentarà aïllar i identificar alguns microorganismes concrets presents en l'orina contaminada mitjançant la sembra en medis selectius i la identificació per mètodes numèrics.

Protocol de la pràctica (en grups de dos alumnes).

1. Obtenció de les mostres d'orina de 2 voluntaris.

A l'hora de realitzar una anàlisi d'orina és molt important que la mostra sigui agafada correctament i que es processi immediatament després de la recollida. Si l'anàlisi s'ha d'endarrerir, la mostra s'ha de conservar a 4ºC.

La mostra s'ha de recollir de forma correcta: la primera part de la micció s'ha de deixar perdre, s'ha de fer servir un recipient de boca ampla i s'ha de recollir la mostra sense interrupció.

2. Anàlisi de la mostra.

Uns grups faran les anàlisis amb orina normal i altres grups les faran amb orina contaminada experimentalment amb Klebsiella, Enterococcus i Candida (200-300 l de cada microorganisme per cada 50 ml d'orina). Hi hauran així 2 tipus de mostres: A i B.

Material: Orina normal i contaminada, ampolles de R1/4 estèril, tubs Eppendorf, puntes blaves i grogues i pipetes automàtiques. Plaques de TSA, McConkey, Sabouraud, KF.

A. Anàlisi del sediment: Tinció Gram.

– Centrifuguem 5 ml de cada mostra d'orina, per separat, a 5000 r.p.m. durant 10 min.

10


– Decantem el sobrenadant i ressuspenem el precipitat en 200 l de R1/4 o en el que quedi de líquid.– Col·locar uns 15 ó 20 l de la mostra concentrada sobre un portaobjectes.– Seguir el protocol per a la tinció Gram de l'Annex 1.– Observar la presencia de bacteris (Gram, morfologia, agrupació), cèl·lules epitelials, eritròcits, limfòcits,

cristalls, ...

B. Urocultius: Recompte d'aeròbics totals.

– Fem un banc de dilucions en Ringer 1/4 fins la dil·lució -4, utilitzant tubs eppendorf amb 900 l de Ringer 1/4 i inoculant-los amb 100 l.

– Sembrem dos rèpliques de 100 l de les dilucions -2, -3 i -4 en plaques de TSA.– Incubem a 37 ºC durant 24 hores.– Fem el recompte de les colònies en aquelles plaques que continguin entre 30 i 300 colònies. Donar el

resultat promig en u.f.c./ml d'orina.

C. Urocultius: Inòcul en medis selectius.

– Sembrem 50 l de la mostra sense concentrar en una placa de McConkey (medi selectiu-diferencial; hi poden créixer els enterobacteris degut a que porta sals biliars, i dintre d'aquest grup els fermentadors de lactosa donaran colònies de color rosat).

– Sembrem 50 l en una placa de KF (medi selectiu i diferencial, utilitzat per a la detecció d'estreptococs degut a que només aquests poden créixer en presencia d'azida sòdica; dintre d'aquests els enterococs donen colònies vermelles o roses). Atenció!: el medi KF conté Azida Sòdica. Evitar el contacte i la ingestió.

– Sembrem 50 l en una placa de Sabouraud (medi selectiu; en aquest medi hi creixeran majoritàriament fongs i llevats degut a l'alta concentració de glucosa i el cloramfenicol).

– Incubem a 37 ºC durant 24 hores.

D. Cultiu pur en TSA de les colònies aïllades en McConkey i KF.

– Fem una estria en TSA de les colònies rosades aïllades en McConkey, i altra estria també en TSA de les colònies vermelles o roses aïllades al KF.

– Incubem a 37 ºC durant 24 hores.

E. Tinció Gram.

Es comprova que hem obtingut cultius purs realitzant una tinció Gram de cadascun dels cultius (veure l'Annex 1).

F. Sembra en ENTEROSYSTEM 18 R i API 20S (5 galeries de cada tipus per grup de pràctiques).

En aquesta apartat realitzarem la identificació, mitjançant mètodes numèrics, d'un bacteri pertanyent a la Família de les Enterobacteriàcies i d'un pertanyent al grup dels estreptococs mitjançant la inoculació de les galeries miniaturitzades de probes bioquímiques ENTEROSYSTEM 18 R i API 20S, respectivament.

– A partir d'un cultiu pur, realitzarem una suspensió en aigua destil·lada:– Per a l'ENTEROSYSTEM 18 R: resuspendre algunes colònies provinents del cultiu pur a partir de

McConkey en el medi de resuspensió proporcionat amb el kit.– Per a l'API 20S: 2 ml d'aigua estèril + bastantes colònies provinents del cultiu pur a partir de KF.

Agafar 0.8 ml d'aquesta resuspensió i afegir-los a 1 ampolleta de medi GP.– Inocularem les galeries d'acord a les instruccions de la galeria, ENTEROSYSTEM 18 R o API 20S.– Incubarem 24 hores a 37 ºC.– Lectura i interpretació dels resultats segons les instruccions proporcionades per la casa comercial.

11


G. Antibiograma.

S'entén per antibiograma l'estudi de la sensibilitat in vitro dels microorganismes als antibiòtics. En aquesta pràctica, determinarem la sensibilitat a diferents antibiòtics de les dues soques bacterianes aïllades de l'orina.

– Ressupendre 2-3 colònies dels cultius purs de les soques en 0.5–1 ml de solució salina Ringer 1/4, fins que cadascuna de les preparacions es vegi tèrbola.

– Impregnar un hisop estèril amb la solució de R1/4 en què han estat ressuspesos els microorganismes. Caldrà repetir aquesta operació per cadascun dels microorganismes.

– Estendre l'inòcul fregant l'hisop sobre una placa d'agar Mueller-Hinton (s'utilitza aquest medi, ja que els antibiòtics hi difonen millor degut al midó que conté), de manera que quedi tota la placa mullada, en totes direccions. Es farà una placa per cada soca.

– Deixar assecar la placa durant uns 15 minuts.– Col·locar amb unes pinces estèrils (flamejant-les) els diferents discs d'antibiòtics (AMP: ampicil·lina 10

g, C: cloramfenicol 30 g, GN: gentamicina 10 g, S: estreptomicina 10 g, W: trimetoprim 1.25 g), de manera que quedin repartits sobre la placa, però sense estar massa a prop de les vores de la placa.

– Incubar a 37 ºC tota la nit, en aquest cas les plaques s'incuben del dret.– La lectura dels resultats es fa mesurant el diàmetre de les zones d'inhibició del creixement. La sensibilitat

a cada producte es considera segons els valors indicats a la taula següent:

ANTIBIOGRAMA Resistent Intermedi Sensible

AMP; Ampicilina 10 g ≤ 20 mm 21 – 28 mm ≥ 29 mm

C; Cloramfenicol 30 g ≤ 12 mm 13 – 17 mm ≥ 18 mm

GN; Gentamicina 10 g ≤ 12 mm ≥ 13 mm

S; Estreptomicina 10 g ≤ 11 mm 12 – 14 mm ≥ 15 mm

W; Trimetroprim 1.25 g ≤ 16 mm 17 – 19 mm ≥ 20 mm

H. Proves de l'Oxidasa i la Catalasa.

Per la prova de l'Oxidasa, s'agafa una mica de creixement, s'estén sobre un paper de filtre, i es tiren a sobre unes gotes del reactiu de l'oxidasa (1% de di-tetra-metil-p-fenilendiamina en aigua destil·lada). Es considera que la prova és positiva quan la massa cel·lular es torna fosca immediatament. Cal fer la lectura abans d'un minut ja que passat aquest temps, l'aparició de color fosc és deguda a l'oxidació espontània del reactiu.

Com a Control + de la prova de l'oxidasa es fa servir una soca de Pseudomonas.

Per la prova de la Catalasa, es tiren unes gotes de H2O2 directament a sobre del creixement en placa. La prova és positiva si apareixen bombolles d'oxigen.

12


BLOC 3: TÈCNIQUES MOLECULARS DE DETECCIÓ DE MICROORGANISMES.

Part I: DETECCIÓ DE COMPONENTS CEL·LULARS DE SALMONELLA PER E.L.I.S.A.

La tècnica de E.L.I.S.A. (“enzyme-linked immunosorbent assay”) es fonamenta en:

a) L'especificitat de la reacció antigen - anticòs. b) La capacitat dels antigens i anticossos (proteïnes) d´unir-se a plàstic (l'adsorció d'aquestes

molècules a la superfície del plàstic és deguda a forces de Van der Waals (polaritats elèctriques)).c) L'existència d'anticossos conjugats amb enzims que permeten la valoració colorimètrica.

Mitjançant aquesta tècnica immunoenzimàtica detectarem la presència de cèl·lules senceres de Salmonella typhimurium fent servir anticossos comercials específics contra una de les proteïnes del flagel d'aquest bacteri (proteïna FliC).

L'experiment que farem a pràctiques es doncs un E.L.I.S.A. directe, ja que detectem directament el microorganismes o una part d'aquest. En l'E.L.I.S.A. indirecte, com per exemple l'utilitzat per detectar si un individu es seropositiu per VIH, no es detecta el microorganisme sinó els anticossos que produeix el cos contra aquest microorganisme.Cal tenir pressent que aquestes definicions d'E.L.I.S.A. directe i indirecte són les que donen autors del mon de la clínica; però altres autors, que aborden la tècnica d'una manera més genèrica, defineixen l'E.L.I.S.A. directe com aquell en que un únic anticòs és el que realitza el reconeixement de l'antigen i dona la senyal que detectem, i l'E.L.I.S.A. indirecte com aquell en que un primer anticòs reconeix l'antigen y és un segon anticòs anti-inmunoglobulina el que dona la senyal.

Protocol de la pràctica.

Material: Placa de microtiter de poliestirè “MaxiSorp” (5 plaques màxim per grup de pràctiques). Cultius de Salmonella typhimurium soca A i Enterococcus faecalis que serviran com a mostra 1 i 2, i per preparar els estàndards. Anticòs de conill anti-flagel·lina de Salmonella. Anticòs de ratolí anti-IgG de conill conjugat amb fosfatasa alcalina. Substrat cromogènic de la fosfatasa alcalina (p-nff).

Partim de cultius saturats (overnight) de les tres soques esmentades.

– Preparar el tub d'estàndards per fer la recta patró de l'E.L.I.S.A: fer una dilució 1/2 a partir del cultiu de Salmonella typhimurium soca A. Mesurar la D.O. 600nm de la dilució per fer-la servir com a estimació de la concentració bacteriana (el tub d'estàndards ha de ser una mostra coneguda).

– Marcar els cultius sense diluir de Salmonella typhimurium soca A i Enterococcus faecalis com a mostra 1 i mostra 2 (a l'atzar).

– Centrifugar 5 ml de cadascun dels 3 cultius (mostra 1, mostra 2 i estàndards) durant 10 minuts. Ressuspendre els precipitats (cèl·lules) en 5 ml de PBS, separadament.

– Seguidament es fa un banc de dilucions en PBS a partir del tub d'estàndards, fent servir tubs Eppendorf. Les dilucions a fer a partir del tub d'estàndards són: 1/2, 1/5, 1/10, 1/30 i 1/50.

– Fer també un petit banc de dilucions en PBS a partir dels tubs de les mostres, fent servir tubs Eppendorf. Les dilucions a fer a partir dels tubs de mostres són: -1 i -2.

– Després, en nous tubs Eppendorf, barregem 0.5 ml de coating buffer amb 0.5 ml de les diferents suspensions antigèniques; això es fa per cadascuna de les dilucions que s'han fet (-1 i -2 per les mostres, i 1/2, 1/5, 1/10, 1/30 i 1/50 pels estàndards).

– Preparar també un tub Eppendorf amb 0.5 ml de coating buffer i 0.5 ml de PBS. Aquest tub l'utilitzarem per fer els blancs (B), els quals ens serviran com a blancs d'absorbància, com a controls – i com a punt 0 dels estàndards.

13


– Adsorció: Dispensem 100 l/pouet de cada barreja, fent 3 rèpliques verticalment, tal com es mostra al següent esquema:

Incubarem la placa d'E.L.I.S.A. overnight a 4 ºC.Aquest pas permet l'adsorció dels antigens bacterians a la superfície del plàstic.

– Al dia següent, decantar i colpejar la placa invertida sobre paper per tal d'eliminar el líquid dels pouets.– Bloqueig: Afegim 100 l/pouet de PBS + llet descremada 5%. Ho mantenim 15 minuts a 37ºC. – Decantar i colpejar la placa invertida sobre paper.– Primer anticòs, de conill anti-flagel·lina de Salmonella typhimurium: Afegim 100 l/pou de l'anticòs

diluït 1/2000 en PBS (2,5 l d'anticòs en 5 ml de PBS). Incubem 1 hora a 37 ºC.– Decantar i colpejar la placa invertida sobre paper. – Rentar 3 vegades amb PBS-Tween 0,05%.– Segon anticòs, de ratolí anti-immunoglobulina de conill, conjugat: Afegim 100 l/pouet de l'anticòs

conjugat amb fosfatasa alcalina diluït 1/2000 en PBS. Incubem 1 hora a 37ºC.– Decantar i colpejar la placa invertida sobre paper.– Rentar 3 vegades amb PBS-Tween 0,05%.– Detecció: Afegim 100 l/pouet del substrat per a la fosfatasa alcalina (preparada afegint 2 tauletes de p-

nitrofenilfosfat disòdic en 30ml de tampó dietanolamina pH 9.5 MgCl2 0.5 mM, per tal d'obtenir una concentració final de 1 mg pNPP/ml). Incubem 20-40 min. a 37 ºC, fins a l'aparició de color groc (aturar la reacció abans si convé).

– Aturar la reacció de la fosfatasa alcalina amb 25 l/pouet de NaOH 3 M.– Lectura: llegim l'absorbància a 405nm fent servir un lector automàtic de plaques.– Fer la gràfica de la recta patró absorbància 450nm – D.O. 600nm (concentració d'antigen), i utilitzar-la per

determinar la concentració d'antigen de les mostres 1 i 2:

14

Abs. 405nm

[Antigen]

1 2 3 4 5 6 7 8 9

A

B

C

F

G

H

BlancEstàndards de

Salmonella typhimurium A

10

Mostra 2Mostra 1

-1 -1 -2

-1

-1

-1 -2

-1 -2

1/2 1/5 1/10 1/30 1/50

E

D

11 12

-2

-2

-2

1/2 1/5 1/10 1/30 1/50

1/2 1/5 1/10 1/30 1/50

B

B

B


Part II: DETERMINACIÓ DE LA PRESÈNCIA D'ÀCIDS NUCLEICS PER HIBRIDACIÓ MOLECULAR

La pràctica es realitzarà per parelles fins al moment en que es posarà la solució de prehibridació, llavors s'agruparan totes les membranes en uns 6 tubs de tap verd que es fiquen dintre de 2 tubs d'hibridació de vidre.

Es determinarà quina de dues soques de Escherichia coli es portadora del plàsmid pBR322, el cual conté un gen de resistència a tetraciclina (tetR) i un gen de resistència a ampicilina (ampR).

Material: Cultius bacterians, membrana de nylon, oligonucleòtid marcat amb digoxigenina OLI-PBR (DIG-5'-TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAA-3'), llum ultraviolada, anticòs antidigoxigenina (anti-DIG) conjugat amb fosfatasa alcalina, substrat cromogènic de la fosfatasa alcalina (NBT-BCIP), solucions, banys termostàtics.

Dia 1: Cultius overnight (realitzats pels professors):

– 5 ml de la soca d'E. coli DH5α / pBR322 en medi LB més ampicil·lina (50 g/ml).– 5 ml de la soca d'E. coli DH5α en medi LB (sense antibiòtics).

Dia 2: Fixació i hibridació.

– Centrifuguem els cultius a 3000 r.p.m. durant 10 minuts, i ressuspenem les cèl·lules en 100 l de PBS. Per una altra banda retallem la membrana de niló (1 x 2 cm aproximadament).

– Apliquem les cèl·lules (5 l de cada soca) sobre la membraneta de niló, dipositada sobre un paper de filtre, i deixem assecar completament.

– Col·loquem seqüencialment la membraneta a sobre de paper de filtre dintre de plaques petri i mullat amb:1) Solució desnaturalitzant (0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl, 0.1% SDS). Deixem incubar 15 min.2) Solució de neutralització (1 M Tris, pH 7.5, 1.5 M NaCl). Deixem incubar 15 min.3) Solució 2X SSC (20X SSC = 3 M NaCl + 0.3 M citrat trisòdic). Deixem incubar 15 min.

– Assecar 30 minuts a temperatura ambient.

– Fixació: fixem el DNA amb llum ultraviolada de =260nm durant uns 3 ó 5 minuts. Es posen les membranes entre 2 làmines de plàstic transparent, i es fixen totes a la vegada sobre un transil·luminador (3 minuts de manera que el costat de les membranes que conté el DNA quedi cap a la llum ultraviolada, i 2 minuts amb la cara que conté el DNA cap a dalt).

– Eliminació de restes cel·lulars: incubem totes les membranes juntes amb 3X SSC + 0.1% SDS, a 68 ºC amb agitació suau (manual) durant 1 hora.

– Prehibridació: posar les membranes de 2 en 2 en tubs de tap verd, afegir-hi 5 ml de la solució de prehibridació (5X SSC, 1% agent bloquejant, 0.1% N-lauroilsarcosina, 0.02% SDS) preparada pel professor, i incubar durant 10 min. a 60 ºC al forn d'hibridació.

– Hibridació: es canvia la solució de prehibridació per 5 ml de la solució d'hibridació, que és igual que la de prehibridació però contenint la sonda (25 ng/ml). Fixar be el tap verd del tubs amb parafilm i cinta adhesiva, i incubar durant tota la nit a 60 ºC al forn d'hibridació.

15


Dia 3: Rentats i revelat.

Es faran amb totes les membranes juntes en un recipient comú i al mateix temps.

– Rentem 5 minuts amb 2X SSC + 0.1% SDS.– Rentem 10 minuts amb 0.5X SSC + 0.1% SDS.– Rentem 1 min en Sol I (àcid maleic 100 mM; NaCl 150 mM, pH 7.5) contenint 0.3% Tween 20, a

temperatura ambient, en agitació.– Incubem 30 min en 30 ml de Sol II (Sol I + 1% agent bloquejant), a temperatura ambient, en agitació. – El professor diluirà l'anticòs anti-DIG (1:5000; 2 l/10 ml) en Sol II, i incubarem els filtres 30 min. en 30

ml de solució d'anticòs a temperatura ambient.– Rentem 15 min., dues vegades, amb Sol I + 0.3% Tween 20, a temperatura ambient, en agitació.– Equilibrem les membranes amb Sol III (Tris-HCl 100 mM; NaCl 100 mM; MgCl2 50 mM; pH 9.5)

durant 2 min. a temperatura ambient.

– Revelat: Pel revelat de la fosfatasa alcalina, incubem amb 10 ml de sol. cromàtica (200 µl NBT/X-fosfat en 10 ml de Sol III) a l'obscuritat, sense agitar ni barrejar. Anar comprovant l'aparició de color fosc.

– Aturem la reacció rentant amb aigua destil·lada a temperatura ambient. Alternativament es pot aturar amb 50 ml de Tris-HCl 10 mM pH8 + EDTA1 mM.

– Deixem assecar la membrana a l'aire.

16

+-


ANNEX 1:

Tinció de Gram.

– Rentar i desengreixar un portaobjectes.– Agafar una gota de cultiu i estendre-la damunt del porta.– Deixar assecar a l´aire.– Fixar a la flama sense "cremar" la preparació.– Cristall violeta. 1' 30''.– Decantar i rentar amb aigua.– Lugol 30''.– Decantar i rentar amb etanol. Rentar amb aigua.– Safranina durant 1' 30''.– Decantar i rentar amb aigua.– Assecar amb paper de filtre, suaument i sense fregar.– Oli d'immersió i observació microscòpica.

Taula del Nombre Més Probable (NMP).

TAULA nombre més probableTAULA nombre més probable

17


ANNEX 2:

Composició dels Medis de Cultiu:

Brou Lactosat Porpra (BLP).

Peptona 5 g/l; Extracte de carn 3 g/l; Lactosa 5 g/l; Porpra de bromocresol 0.02 g/l

Brou Azida de Rothe (BAR).

Peptona de carn 10 g/l; Peptona de caseïna 10g/l; Dextrosa 5 g/l; Clorur de sodi 5 g/l; Fosfat dipotàssic 2.7 g/l; Fosfat monopotàssic 2.7 g/l; Azida sòdica 0.2 g/l.

Agar Hektoen.

Proteosa-peptona 12 g/l. Extracte de llevat 3 g/l; Sals biliars 9 g/l; Lactosa 12 g/l; Sacarosa 12 g/l; Salicina 2 g/l; Clorur de sodi 5 g/l; Tiosulfat de sodi 5 g/l; Citrat fèrric-amònic 1.5 g/l; Fucsina àcida 0.10 g/l; Blau de bromotimol 0.06 g/l; Agar-Agar 15 g/l.

Ressuspendre en aigua destil·lada (77 g/l). Escalfar fins a ebullició per dissoldre. Deixar refredar fins a 55 - 60 ºC i fer les plaques. Aquest medi no s'autoclava.

Agar SPS. Agar selectiu per Clostridium perfringens.

Sulfat sòdic 0.5 g/l; Polimixina sulfat 0.01 g/l; Sulfadiacina sòdica 0.12 g/l; Peptona de caseïna 15 g/l; Extracte de llevat 10 g/l; Citrat fèrric 0.5 g/l; Tioglicolat sòdic 0.1 g/l; Polisorbat 80 0.05 g/l. Agar-Agar.

Es guarda solidificat. Cal fondre abans de fer-lo servir.

Brou Base al Tetrationat (BBT).

Peptona de carn 2.5 g/l; Peptona de caseïna 2.5 g/l; Sals biliars 1.0 g/l; Carbonat càlcic 10 g/l; Tiosulfat sòdic 30 g/l.

Es prepara el mateix dia i es conserva a 4ºC.

Brou Bilis al Verd Brillant (BBVB).

Bilis 20 g/l; Lactosa 10 g/l; Peptona 10 g/l; Verd Brillant 0.013 g/l.

Agar de Baird-Parker (BP).

Triptona 10 g/l; Piruvat sòdic 10 g/l; Glicocola 12 g/l; Extracte de carn 5 g/l; Clorur de liti 5 g/l; Extracte de llevat 1.0 g/l; Agar-Agar 17 g/l.

Agar de Sabouraud glucosat amb cloramfenicol.

D(+)Glucosa 40 g/l; Peptona de caseïna 5 g/l; Peptona de carne 5 g/l; Agar-Agar 15 g/l.

Brou Azida Violeta de Litsky (LIT).

Peptona de carn 10 g/l; Peptona de caseïna 10 g/l; Dextrosa 5 g/l; Clorur sòdic 5 g/l; fosfat monopotàssic 2.7 g/l; fosfat dipotàssic 2.7 g/l; Azida sòdica 0.2 g/l; violeta d'etil 0.0005 g/l.

18


Agar KF.

Peptona 10 g/l; Extracte de llevat 10 g/l, clorur de sodi 5 g/l; glicerofosfat sòdic 10 g/l; Maltosa 20 g/l; Lactosa 1 g/l; Azida sòdica 0.4 g/l; Agar-Agar 20 g/l.

Composició dels Reactius del E.L.I.S.A.:

Coating Buffer /500 ml Na2CO3 0.795 gpH 9.6 NaHCO3 1.465 g

MgCl2 10 mM

PBS /1 l NaCl 8 gpH 7.4 KCl 0.2 g

Na2HPO4 1.45 gKH2PO4 0.24 g

PBS-Llet descremada PBSLlet descremada 5%

PBS-Tween PBSTween 0.05%

Tampó Dietanolamina/1 l Dietanolamina 97 mlDissoldre en 1/2 vol. MgCl2 6(H2O) 100 mgAjustar a pH 9.8 amb HClEnrasar

NaOH 3M

Composició dels Reactius de la Hibridació:

Sol. Desnaturalitzant NaOH 0.5 MNaCl 1.5 MSDS 0.1 %

Sol. Neutralitzant Tris 1 MAjustar a pH 7.5 NaCl 1.5 M

SDS (stock al 10%) SDS 10%Agua destilada 250 ml

Laurilsarcosina Laurilsarcosina 10%(stock al 10%)

20XSSC NaCl 3 MpH 7.0 Citrat de Sodi 0.3 M

Solució 1 Àcid maleic 0.1 MAjustar a pH 7.5 NaCl 0.15 M

Solució de Rentat Solució 1 1 lAjustar a pH 7.5 Tween 0.3 %

Solució 3 Tris 0.1 MAjustar a pH 9.5 NaCl 0.1 M

19


Agent bloquejant Agent bloquejant 10%Conservar a - 10 ºC en Solució 1

20


ANNEX 3:

Llicència Creative Commons:

Reconeixement-CompartirIgual 2.5

Sou lliure de:• Copiar, distribuir i comunicar públicament l'obra.• Fer-ne obres derivades.

Sota les condicions següents:

Reconeixement. Heu de reconèixer els crèdits de l'obra de la manera especificada per l'autor o el llicenciador.

Compartir amb la mateixa llicència. Si altereu o transformeu aquesta obra, o en genereu obres derivades, només podeu distribuir l'obra generada amb una llicència idèntica a aquesta.

• Quan reutilitzeu o distribuïu l'obra, heu de deixar ben clar els termes de la llicència de l'obra. • Alguna d'aquestes condicions pot no aplicar-se si obteniu el permís del titular dels drets d'autor.

Els drets derivats d'usos legítims o altres limitacions no queden afectats per l'anterior.

Això és un resum llegible per humans del text legal (la llicència completa), que es pot consultar a:

http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5/legalcode



21

http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5/legalcode

Guio Practiques Microbiologia Sanitaria UB v2.5.1 (2007)

Documents

Transcript of Guio Practiques Microbiologia Sanitaria UB v2.5.1 (2007)