Hepatitis C

Diagnóstico en un solo paso

Dra. Aitziber Aguinaga Pérez

Servicio de Microbiología Clínica

Complejo Hospitalario Navarra

Hepatitis C. Diagnóstico en un solo paso

• Epidemiología VHC

• Marcadores de la infección

• Ag core VHC

• Experiencia con el Ag core VHC en CHN

• Diagnóstico:

-Algoritmo convencional

-Diagnóstico en un solo paso

• Conclusiones

En 2016, La OMS se propuso como estrategia mundial eliminar la hepatitis viral como

un problema de Salud Pública en 2030.

La eliminación se definió como un 90% de reducción en nuevas infecciones crónicas y

un 65% de reducción en la mortalidad comparado con los datos de 2015.

2030

Diagnosticar 90% de los infectados

Tratar 80% de los diagnosticados

2015, VHC

20% pacientes infc estaban diagnosticados

7% habían iniciado tratamiento

Tratamiento AAD

Seguros

Altamente efectivos

Pangenotípicos

Reducción de precios

Diagnóstico

Sencillo

Búsqueda activa

Prevención

Transmisión Sangre

Virus de la Hepatitis C (1989)

• Familia: Flaviviridae

• Género: Hepacivirus

• Características: ssRNA (+)

Restrepo JC. Medicina

&Laboratorio 2011;17:411-28.

RNA (9400

nucleótidos)

Core

Glicoproteínas

Envoltura

ɸ: 55-65 nm

• Gran variabilidad genética

• Cuasiespecies

•7 GT, >65 SubT,

Lancet Gastroenterol Hepatol. 2017 Mar;2(3):161-176.

Historia natural VHC

Guidelines for the screening, care and treatment of persons with chronic hepatitis C infection.

World Health Organization, April 2016.

Edad avanzada, obesidad, esteatosis, alcohol, ADVP, coinfección VIH, VHB

Trasplante hepático

70% 4% per year

Extrahepatic

manifestactions

Datos WHO (2018)

referidos 2015:

* 1.75 millones de

nuevas infecciones

* 71 millones de

personas viven con

VHC crónica

* 2.3 millones de

personas VIH-VHC

* 399000 Fallecidos

por VHC estadío final

* 843000 Curados

Prevalencia mundial:

1%

7

Plan Estratégico Nacional de la Hepatitis C,

2015

Bruguera 2006. En España entre 1994-2004 prevalencia: 1.6-2.6%.

García Comas 2015. Estudio en Madrid 2008-2009 prevalencia 1.8%.

Enero 2015 (Situación previa al plan estratégico):* 4269 persona con diagnóstico de Ac VHC positivo: 7/1000

habitantes de haber tenido infección VHC (virémicos: 2,4/1000 hab)* 10% de los pacientes VHC +, Co-VIH* 47% de los pacientes VIH+, Co-VHC (transmisión en UDP)

Navarra

“Evaluación de intervenciones preventivas y terapéuticas frente a la infección por el virus de la hepatitis C (EIPT-VHC)” financiado por el Plan estratégico Nacional de la hepatitis C a través del Instituto de Salud Carlos III (2015-2019). (CM17/00095 and INT17/00066). Liderado por Dr. Jesús Castilla (Salud Pública)

Conclusiones:

Prevalencia de ac-VHC y de

infecciones no diagnosticadas

inferior a la propuesta en España

(1.7, 60%, respectivamente).

PER:1/1/2014-30/09/2016

Protocolo preqgico MF;

CP, Otorrino, Oftalm, CC

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Diagnóstico- Marcadores de infección VHC

Ac VHC

1ª G Ab test (NS4) 3ª G Ab test (Core, NS3, NS4 y NS5)

2ª G Ab test (Core, NS3 y NS4)

P. Ventana

Días

Ac anti-VHC (Architect/Alinity, Abbott)

• Ensayo cualitativo (3G)

• Quimioluminiscencia de 2 pasos

• Dirigido a determinar ac vs proteínas estructurales y no estructurales.

• Proteína HCr43 compuesta por 2 regiones codificantes no contiguas; aa 1192-1457 del NS3

• Proteína c100-3NS3 y NS4

• S: 99.1% (IC 95%: 96.77-99.89%)

• E: 99.2% (IC 95%: 99.45-99.71%)

Testing for HCV Infection: An Update of Guidance for Clinicians and Laboratories. MMWR May 10, 2013 / 62(18);362-365.

Screening S/CO Valuen % n % n %

<2.5 8 21.62 3 8.11 26 70.002.5-4.9 7 41.18 4 23.53 6 35.29

TOTAL <5 15 27.78 7 12.96 32 59.265-9.99 9 75.00 2 16.67 1 8.00>10 35 97.22 1 2.78 0 0

TOTAL >5 44 91.67 3 6.25 1 2.08

Confirmatory assay INNOLIAPOSITIVE INDETERMINATE NEGATIVE

Conclusions:

1. The result of the S/CO value is useful to determine the true positives: 27.78% ≤ 5 are true

positives; however when S/CO is >5, 91.67% are true positives. With S/CO values >10,

97.22% are true positives.

2. Performing on the same serum sample the confirmatory test has the advantage of avoiding

possible false positive reports and reporting the true positives without delay. 9.80% of the

samples have indeterminate results in the confirmatory test and require monitoring over

time.

Correlation between a confirmatory test and S/CO values in the initial HCV antibody assay. Navascués A., Aguinaga A, Polo I. et al.

PEP: 1/01/2015-30/09/2015

• Inmunoensayo de 3 G

• Incorpora Ag derivados región del core, región hipervariable E2, NS3 helicasa, región NS4A, región NS4B y región NS5A (adheridos a la tiranylon).

Confirmatorio Ac anti-VHC (INNO-LIA HCV Score, FUJIREBIO)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

RNA VHC

Ac VHC

HCV RNA

P. Ventana

Diagnóstico- Marcadores de infección VHC

Días

3ª G Ab test 2ª G Ab test 1ª G Ab test

Sample preparation

Sampletransfer

Result calculation

Result delivery to LIS

Amplification & detection

Cobas ® 6800 System, Roche

preparationResult

calculationResult

delivery to LISAmplification & detection

Desnaturalización

Hibridación de los primers-extensión

Pol

Extracción/purificación

Rango detección:

VHC: 15-1x108 UI/mL

Diagnóstico infección aguda,

crónica activa,

monitorización AAD,

Inmunosuprimidos

Genotipado VHC- Line probe assay (LiPA) VERSANT HCV Genotype 2.0 (Siemens)

BCIP/NBT

Secuenciación

RNA VHC

Ag VHC

Ac VHC

P. Ventana

- 1ª gen (1996): ELISA Detectan la fracción libre� periodo ventana. Cualitativo. (Ortho)

- 2ª gen (1999): ELISA Detecta fracción libre y ligada a Ig, pretratamiento manual. Cuantitativo. (Ortho)

- 3ª gen (2006): MEIA Detecta fracción libre y ligada a Ig, pretratamiento automatizado (Abbott)

Diagnóstico- Marcadores de infección VHC

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

3ª G Ab testHCV Antígeno coreHCV RNA

Días

Antígeno core VHC

(Architect/Alinity, Abbott)

Ensayo Quimioluminiscencia (2 pasos)

Ac monoclonales vs Ag core

Paso previo: Pretratamiento- Ruptura de inmunocomplejos

Rango: 3 fmol/L-20000 fm/L

Solución

Pretratamiento +

Suero (Agc VHC)

Ac VHC Ag core

paramagnetic

microparticle.

WASH

Anti-TC:acridinium

conjugate (mouse, moncl.)

is added.

Conjugate binds to TC

bound to solid phase.

Unbound conjugate

is removed. Rate of chemiluminescence is

directly proportional to Agc VHC

in sample.

basic pH + peroxide

light

acridinium

WASH

Suero (VHC Ag core)

Características marcadores de replicación

ARN VHC (Carga viral) Antígeno core VHC

– marcador de viremia

– infección aguda

– diagnóstico de infección vertical

– confirma hepatitis crónica C

– confirma VHC en pacientes con una alteración de la inmunidad humoral

– monitorización de la respuesta al tratamiento antiviral.

3fm/L

GT RNA (UI/mL)

1a 507

1b 405

2 600

3 771

4 RNA (+)/Ag (-): RNA: 73- 814 IU/ml

6 RNA(+)/AgVHC(-): 5 RNA: 75-249 UI/ml , 1 RNA 6572 UI/ml

No Falsos Positivos de Ag

Conclusions

HCVcAg assays with signal amplification havehigh sensitivity, high specificity, and goodcorrelation with HCV RNA greater than 3000 IU/mL. HCVcAg assays have the potential toreplace NAT in high HCV prevalence settings.

Freiman JM et al. Annals of Internal Medicine, 2016

IV Congreso Nacional de Hepatitis

(Gehep/SEIMC) Cordoba 2018

17189 CV - 595 (3.46%) CV < 5000 UI/mL

64 (0.37%) pacientes naïve

2735 Ag - 83 (3%) <3fmol/l

34 (0.18%) pacientes naïve

Eficacia del Ag core monitorización/RVS con AAD

(99.83%)

Discusión-conclusiones: Ag core fue capaz de determinar 98.7% de pacientes virémicos al inicio de tratamiento.

Fue capaz de diferenciar entre SVR y NO-SVR 12w en un 100%. (95.9%).

Objetivo: evaluar la utilidad del Ag

core para la monitorización y

fracaso del tratamiento AAD.

MyM: Estudio prospectivo

monitorización: 262 pacientes en

2015 (Baseline, +1w, +4w, End T,

+12w)

Estudio retrospectivo de

muestras 132 pacientes con fracaso

AAD

VRS 12 S: 3 FP Ag c (Ag c P, RNA N) Seguimiento 24 S: 3 Ag c N y RNA N

VRS 12 S: 1 FN Ag c (Ag c N, RNA 1288 UI/mL), No hubo muestra seguimiento 24 S

Coste/efectivo

↑Screening

Dudoso RVS

Octubre 2016-Enero 2017 Noviembre 2016-febrero 2017 Febrero-Agosto 2017 Junio-Diciembre 2017

Control al inicio de tratamiento Control S4 tratamiento Control FIN tratamiento

(S12/24)Control +12S

post-tratamiento(S 8/12/16/24)

Determinación Ag core VHC CHN

HCV core antigen: useful in the diagnosis and management of patients treatment with AAD. J hepatol 2018 (In press)

Cribado (40 muestras/40 pacientes (44%), 91 nuevos diagnósticos)

Fracaso tratamiento (14 muestras/14 pacientes (36%) 39 fracasos AAD)

Inicio de tratamiento (249 muestras/70 pacientes (13.8%), 507 pacientes):

P. estudio: octubre 2016- diciembre 2017

VariableTotal

(N=124)Treatment

(N=70)Screening

(N=40)Failure Ttm

(N=14)n(% ) n(% ) n(% ) n(% )

Age Medium (sd) 52,4(10,5) 51,2(8,4) 51,9(14,5) 51,1(5,9)

Gender Men 87(70,2) 50(71,4) 24(60) 13(92,8) Female 37(29,8) 20(28,6) 16(40) 1(7,2)Group patients Treatment 70(56,5) 70(100) - - Screening 40(32,3) - 40(100) - Failure 14(11,3) - - 14(100)

No 99(79,8) 49(70) 39(97,5) 14(100) Sí 22(18,2) 21(30) 1(2,5) 0Genotype 1a 45(37,2) 26(37,1) 12(32,5) 7(50) 1b 27(22,3) 14(20) 11(29,7) 2(14,3)_2 7(5,8) 6(8,6) 1(2,7) 0_3 30(24,8) 13(18,6) 13(35,1) 4(28,6)_4 12(9,9) 11(15.7) 0 1(7,1)

HIV Co-infection

Determinación Ag core VHC CHN

Determinación Ag core VHC CHN

Negative Positive Negative Positive Negative Positive

HCV-cAg Negative 166 4 2 1 0 0

Indeterminate 5 2 0 1 0 0

Positive 3 123 0 36 0 14

VL VL VL

Total (n=303) Screening (n=40) Failure (n=14)

HCV-cAg Negative

Indeterminate

Positive

Negative Positive Negative Positive Negative Positive Negative Positive

0 0 0 39 3 62 0 63 0

0 0 0 2 1 2 0 1 0

14 0 69 1 2 2 0 0 2

VL VL VL

Treatment (n=70)

VLBaseline 4 weeks End treatment 12 weeks Post-ttm

Se (%) Sp(%) Se(%) Sp(%) Se(%) Sp(%)

3 97(92,99) 95(91,98) 97(92,99) 94(88,97) 98(91,100) 95(77,100)10 95(89,98) 98(95,100) 94(88,98) 97(93,99) 95(77,100) 100(91,100)

2 98(93,100) 95(91,98) 98(93,100) 94(88,97) 95(77,100) 98(91,100)5 96(91,99) 98(94,99) 96(90,99) 96(91,99) 95(77,100) 100(91,100)6 95(90,98) 98(94,99) 95(89,98) 96(91,99) 95(77,100) 100(91,100)12 95(89,98) 99(96,100) 94(88,98) 98(94,100) 95(77,100) 100(91,100)

Puntos de corte clásicos

Otros puntos de corte alternativos

Total CO-VIH no CO-VIH sí

Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%)

3 97(92,99) 95(91,98) 98(89,100) 93(83,98) 100(82,100) 91(82,100)

10 95(89,98) 98(95,100) 96(86,100) 98(91,100) 100(82,100) 94(80,99)

Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%) Se (%) Sp(%)

3 100(47,100) 100(66,100) 100(83,100) 97(86,100) 86(57,98) 100(83,100)10 86(42,100) 100(66,100) 97(82,100) 100(86,100) 86(57,98)100(83,100)

Puntos de corte clásicos

Puntos de corte clásicos

Genotipo 2 Genotipo 3 Genotipo 4

Total Genotipo 1a Genotipo 1b

Subgrupos de pacientes Nδ ROC(95% IC)

NºMuestra total 303(91%) 0.987(0.972, 1.000) 174Según situación

Recta de regresión CV vs Ag IC95% (b) R2

Total Log10 CV = 1.77* Log10 Ag + 0.22 (1.71,1.82) 0.932

Co-VIH

SI Log10 CV = 1.84* Log10 Ag + 0.16 (1.75,1.92) 0.958

NO Log10 CV = 1.75* Log10 Ag + 0.23 (1.68,1.81) 0.926

Genotipo

1a Log10 CV = 1.72* Log10 Ag + 0.17 (1.65,1.80) 0.957

1b Log10 CV = 1.69* Log10 Ag + 0.04 (1.55,1.82) 0.913

2 Log10 CV = 2.00* Log10 Ag + 0.29 (1.64,2.36) 0.877

3 Log10 CV = 2.00* Log10 Ag + 0.24 (1.88,2.12) 0.948

4 Log10 CV = 1.75* Log10 Ag + 0.25 (1.64,1.87) 0.958

Determinación Ag core VHC CHN

Conclusión

Antígeno-core VHC es técnica con una alta correlación con respecto a la técnica gold

standard, útil para el seguimiento de pacientes en tto con AAD frente VHC, detección

de nuevos casos y fracasos de tratamiento.

ARN VHC (Carga viral) Antígeno core VHC

Marcador de viremia

Infección aguda

Diagnóstico de infección vertical

Confirma hepatitis crónica C

Confirma VHC en pacientes con una alteración de la inmunidad humoral

Monitorización de la respuesta al tratamiento antiviral

– sensibilidad analítica 12/20 UI/ml – sensibilidad analítica 3 fmol/l≈500-3000 UI/ml

– EASL guidelines (AI) 2016, equivalencia ARN (diagnóstico, monitorización)

Características marcadores de replicación

EALS 2016 EALS 2018

ARN VHC (Carga viral) Antígeno core VHC

Marcador de viremia

Infección aguda

Diagnóstico de infección vertical

Confirma hepatitis crónica C

Confirma VHC en pacientes con una alteración de la inmunidad humoral

Monitorización de la respuesta al tratamiento antiviral

– sensibilidad analítica 12/20 UI/ml – sensibilidad analítica 3 fmol/l≈500-3000 UI/ml

– EASL guidelines (AI) 2016, equivalencia ARN (diagnóstico, monitorización)

Características marcadores de replicación

– rapidez/flexibilidad

– coste reducido

– estabilidad de diana (proteína)

– misma plataforma que Ac: utilidad como reactivo combo, útil en donantes, diálisis, peq. laboratorios, bajos recursos….

– Simplifica los algoritmos diagnósticos

Testing for HCV Infection: An Update of Guidance for Clinicians and Laboratorians. MMWR May 10, 2013 / 62(18);362-365

Algoritmo diagnóstico en un solo paso

Todo en una misma muestra

Negativo

Cribado

Ac-VHCPositivo

Stop

Replicación

Negativo

Alerta/comunicación APInfección

activa

Stop

Retraso entre diagnóstico e inicio de tratamiento.

Harris M. J Viral Hepat 2016;23:479-86.

Levi M. Eur J Public Health 2016;26:561-9.

Casas P, Enferm Infecc Microbiol Clin 2019;37 (5):347-48.

Positivo

Implementación del diagnóstico en un solo paso

Algoritmo diagnóstico en un solo paso

Cribado

Ac-VHCPositivo

Negativo

Stop

Replicación Positivo

Negativo

Alerta/comunicación

AP

Infección

activa

Stop

Algoritmo diagnóstico VHC CHN

Ac VHC

N

P (>1 S/CO)

B. Test 3 G

P

N

GT

• Encuesta a nivel nacional (hospitales públicos/privados, acreditados, >200 camas): 90 Hospitales.

• Alta variabilidad en el diagnóstico de la hepatitis C (Servicio, test confirmatorio, D1P, información) .

• Menos de la mitad (43%) de los encuestados cree que el diagnóstico definitivo se debe hacer con una única muestra.

• 81% de los hospitales encuestados dispone de medios para realizar el diagnóstico de la infección por el VHC en un solo paso, pero sólo lo realiza el 31%.

• El 88% de los encuestados cree que debe existir algún tipo de alerta ante el diagnóstico de una infección activa, pero casi un tercio de los hospitales no tiene estrategia de comunicación cuando se detecta una infección activa.

García F, et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2019. https://doi.org/10.1016/j.eimc.2019.03.001

F1. Circuito asistencial del

D1P.

F2. Circuito asistencial del

DTRA.

Ideas para llevar…

• El diagnóstico en un solo paso es un procedimiento sencillo, asequible para los Servicios de Microbiología Clínica y necesario para mejorar el acceso de los pacientes VHC virémicos a Atención Especializada en el menor tiempo posible.

Esta estrategia evita “pérdidas” de los pacientes, y contribuye a la eliminación de la Hepatitis C.

• El Ag del core es un marcador de replicación útil (eficaz y eficiente) tanto en el diagnóstico, monitorización y RVS. Puede servir como alternativa al RNA, simplificando los algoritmos diagnósticos y economizando los procedimientos diagnósticos.

MUCHAS GRACIAS