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CENTRO DE INVESTIGACIONES Y DESARROLLO CIENTÍFICO

Imitando epítopes en proteínas: uso de ligandoshidrazona para la restricción conformacional

Julio C. Calvo-Mozo1

[email protected] C. Satterthwait2

[email protected]

RESUMEN

Los péptidos sintéticos pueden ser usados en inmunología para detectaranticuerpos en sueros, pero a menudo se han caracterizado por su baja sensi-bilidad. Esta sensibilidad puede ser notablemente mejorada al usar péptidosrestringidos conformacionalmente a imitar la estructura tridimensional deepítopes en las proteínas nativas. El presente estudio resalta las bondades deun enfoque estructural basado en ligandos, que puede ser usado para estabili-zar péptidos en una variedad de conformaciones. Este enfoque está basado enel reemplazo de un enlace de hidrógeno por un ligando hidrazona, el cualpuede ser insertado dentro del péptido durante la síntesis en fase sólida. En estetrabajo un péptido fue restringido conformacionalmente a alfa hélice y otro a“loop”. Estos dos péptidos mostraron una mayor reactividad que sus análogoslineales.

Palabras clave:Epítope conformacional, péptido restringido, ligando hidrazona, anticuerpos,antigenicidad.

1 Químico, Dr. Sc. Profesor y Coordinador del Grupo PROTEOMA, Facultad de Ciencias y Educaciónde la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.

2 B.A., Ph.D. Associate Professor and Head of the Peptide Engineering Group at The Burnham Institute,La Jolla, CA, USA.

Fecha de recepción: mayo 30 de 2005 - Fecha de aceptación: agosto 26 de 2005

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ABSTRACT

Synthetic peptides can be used in immunology to detect antibodies in sera butare often characterized by low sensitivity. This sensitivity can be dramaticallyimproved by using peptides conformationally restricted to mimic the threedimensional structure of epitopes in native proteins. The present studyunderlines the advantage of a structure-based linker approach that can beused to stabilize peptides in a variety of conformations. This approach is basedon replacing a hydrogen bond by a hydrazone link which can be inserted intoa peptide during solid-phase synthesis. In this work one peptide wasconformationally restricted to an alpha helix and other to a loop. Thoserestricted peptides showed stronger positive reaction than their linearanalogues.

Keywords:Conformational epítope, restrained peptide, hydrazone link, antibodies,antigenicity.

INTRODUCCIÓN

Identificar determinantes antigénicos o epítopes en proteínas es el principalobjetivo en el desarrollo de vacunas y en el diagnóstico de enfermedades infec-ciosas. Infortunadamente, la mayoría de los fragmentos de proteínas o péptidosson conformacionalmente heterogéneos en agua (Dyson, 1992). Este hechodificulta el tamizaje de epítopes neutralizantes o protectores en proteínas, de-bido a problemas en el diseño y síntesis de péptidos para que imiten la estruc-tura tridimensional de fragmentos de una proteína nativa. Anfinsen (Anfinsen,1973) fue el primero en plantear el interrogante sobre el efecto de la conforma-ción del péptido en la energía de unión a un anticuerpo. Este y otros estudiosllevaron a concluir que cuando los péptidos son restringidos a simular lascavidades de unión en el receptor, esta energía se reduce y se alcanzan notablesaumentos en las afinidades (Anfinsen, 1973; Judice, 1997).

Aunque se ha cuestionado su eficiencia, se ha demostrado que anticuerposmonoclonales obtenidos contra péptidos sintéticos se unen a proteínas nati-vas (Dyson, 1988). También se ha encontrado que se pueden generaranticuerpos policlonales protectores, contra agentes patógenos in vivo, al in-

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munizar con uno o más péptidos derivados de antígenos del agente que causala enfermedad (Patarroyo, 1987); sin embargo, los resultados han sido meno-res a lo esperado. Esta respuesta podría ser mejorada si los péptidos se restrin-gen conformacionalmente para que imiten la forma espacial de los epítopes dela proteína. Los métodos actuales para dar estructura a los péptidos, alternosal aquí propuesto, incluyen la ciclización por reacciones de condensación amida(Alsina, 1994; Romanovskis, 1998), la formación de enlaces disulfuro (Albericio,1989; Calvo, 1999) y el uso de sistemas anulares sustituidos para dar rigidez aestructuras en “turn” (Freidinger, 1980).

Los anticuerpos generados al inocular péptidos estructurados, han demos-trado reaccionar más eficientemente con las proteínas nativas, que los gene-rados al inocular péptidos no estructurados. Trabajos con fragmentosestructurados de proteínas, provenientes de diferentes agentes infecciosos,han ayudado en la identificación de nuevos epítopes conformacionales o amejorar la actividad de la secuencia de los epítopes ya identificados (Cabezas,2000; Calvo, 1994 y 2003a).

Como las estructuras secundarias de una proteína pueden ser caracterizadascon patrones diferentes de enlaces de hidrógeno, se han planteado diversosmétodos de síntesis para imitar covalentemente los enlaces de hidrógeno. Unode estos enfoques consiste en insertar un enlace hidrazona para reemplazar unenlace de hidrógeno (Chiang, 1993; Cabezas, 1999; Calvo, 2003b). Este enfo-que requiere la introducción durante la síntesis de los ligandos J (ácido 5,5-dimetoxi-1-pentanóico) y Fmoc-Z (ácido -propilideno-2-Fmoc-hidrazinoacético). Con el propósito de demostrar la relación estructura-acti-vidad y la versatilidad de este enfoque en el diseño y síntesis de péptidosestructurados se escogieron dos secuencias: una en alfa hélice y otra en “loop”.El péptido escogido de la proteína Pfs25 de P. falciparum con restricciónconformacional a “loop” (J-ILDTSNPVKT-GZG) y el péptido de la proteínaHPV16-E7 del virus de papiloma humano con restricción conformacional aalfa hélice (JLAZ-TLHEYMLDLQ) se analizaron frente a sus homólogos li-neales (sin restricción conformacional). Como se esperaba, los péptidos conrestricción conformacional mostraron significativas diferencias con sus aná-logos lineales en la reacción antígeno-anticuerpo en ensayos de ELISA.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Predicción de la estructura. La proteína Pfs25 pertenece a la clase de proteínastipo EGF, la cual se caracteriza por contener una serie de cisteínas con unpatrón definido de espaciamiento entre ellas y la consiguiente formación de unmanojo de “loops” o bucles. Con el fin de determinar la estructura del frag-mento escogido, se llevaron a cabo predicciones de estructura con los progra-mas de Chou-Fasman (Chou, 1974), GORBTURN versión 3.0 (Hutchinson,1994), PHD (Rost, 1994) y PSIpred (Jones, 1999). Con el mismo fin, se lleva-ron a cabo predicciones de estructura con los programas de Garnier (Garnier,1978), PHD y PSIpred, del fragmento escogido de la proteína HPV16-E7.

Diseño de los péptidos. El fragmento proveniente de la proteína HPV seestabiliza como alfa hélice introduciendo los ligandos J y Z al final de la síntesisde la secuencia escogida y dejando entre ellos los aminoácidos leucina (Leu, L)y alanina (Ala, A). La secuencia así obtenida, JLAZ, recibe el nombre de “sitiode nucleación”. El fragmento proveniente de la proteína Pfs25 se estabilizacomo “loop” o bucle introduciendo los ligandos en los extremos de la secuenciaescogida: el ligando Z en el extremo carboxilo y J en el extremo amino. Comoel ligando J contiene un grupo acetal y el ligando Z un grupo hidrazino, laciclación se lleva a cabo en fase sólida por la reacción entre los dos grupos paraformar el enlace hidrazona (Figura 2).

Fmoc-N CO2H

NC

O

C

CH3O OH

CH3O

Fmoc- Z (Act) J

Fmoc-N CO2H

N

Fmoc-N CO2HCO

2H

NC

O

C

CH3O OH

CH3O

C

O

C

CH3O OH

CH3O

Fmoc- Z (Act) J

Figura 1. Estructura de los ligandos Z y J.

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Síntesis de péptidos. Los péptidos fueron sintetizados en fase sólida por laestrategia Fmoc (Merrifield, 1963; Calvo, 1999) sobre una resina Rink (0.4 –0.6 mmol/g, NovaBiochem) y purificados por HPLC. Para la síntesis depéptidos en fase sólida se utilizaron aminoácidos de NovaBiochem, protegi-dos en el a-amino por el grupo Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo). El paso máscrítico fue el acople del aminoácido posterior al ligando Z, el cual fue acopladocomo cloruro de aminoácido. Para cada etapa de acople se disolvió elaminoácido (3 equivalentes respecto a la resina) en NMP (N-metilpirrolidona,Merck) y se adicionó HOBt (hidroxibenzotriazol, NovaBiochem, 3 Equiv) yDIC (diisopropilcarbodiimida, NovaBiochem, 3 Equiv.). La mezcla se dejó enreacción con la resina por 45 min a temperatura ambiente. Para el acople delcloruro de aminoácido, éste (3 Equiv.) se disolvió en diclorometano (DCM,Merck) seco, se adicionó a la resina, se agitó 1 min, se adicionódiisopropiletilamina (DIEA, 6 Equiv., Merck) y se dejó en reacción con agita-ción por 14 min. La reacción de todos los acoples se monitoreó con el ensayode ninhidrina (Sarin, 1981).

Preparación del cloruro de aminoácido. Se sintetizaron dos cloruros deaminoácido: uno para la hélice (Fmoc-Ala-Cl) y otro para la “loop” (Fmoc-Gly-Cl). Para preparar el cloruro se tomaron 6.7 mmol (4.9 ml) de SOCl

2

(Aldrich) y se añadieron a una mezcla de 6.7 mmol de Fmoc-AA-OH

JLAZ SECUENCIA Resina

J SECUENCIA ResinaZ

1. HCl / TFE-DCM, 10 min2. TFA / H2O, 1 hr

J SECUENCIA Z

JLAZ SECUENCIA (a)

(b)

JLAZ SECUENCIA ResinaJLAZ SECUENCIA ResinaResina

J SECUENCIA ResinaZJ SECUENCIA ResinaResinaZ

1. HCl / TFE-DCM, 10 min2. TFA / H2O, 1 hr

J SECUENCIA Z

JLAZ SECUENCIA (a)

(b)J SECUENCIA ZJ SECUENCIA Z

JLAZ SECUENCIAJLAZ SECUENCIAJLAZ SECUENCIA (a)

(b)

Figura 2. Inserción de los ligandos J y Z en la secuencia de un péptido en diferenteposición para dar un alfa hélice (a) o una “loop” (b).

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(NovaBiochem) en 36 ml de DCM. La mezcla se dejó en reflujo por 15 min. enatmósfera de nitrógeno y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. El sol-vente y el exceso de SOCl

2 fueron removidos (usando un rotavapor) y el residuo

se disolvió en 10 ml de DCM seco. El producto (1.52 g, 4.8 mmol de Fmoc-Gly-Cl; 1.62 , 4.9 mmol de Fmoc-Ala-Cl) se recristalizó por adición de hexano. Loscristales se lavaron con hexano y se secaron al vacío 1 hr (Calvo, 2003b).

Formación del enlace hidrazona. Se adicionó ácido clorhídrico 6 N en dioxano(2 Equiv. respecto a la resina) a una solución 20% de 2,2,2-trifluoroetanol enDCM. Esta mezcla fue adicionada al “péptido-resina” y se dejó en agitación por15 min. Luego se lavó el “péptido-resina” con DCM (5 veces por 1 min), y sesecó para el desanclaje del péptido.

Desanclaje del péptido. Este proceso fue llevado a cabo a temperatura am-biente, siguiendo dos procedimientos. Los péptidos lineales fueron liberadostratando por 1 hr el “péptido-resina” con una solución compleja de TFA (TFA/ etanoditiol / agua / triisopropilsilano, 94:2.5:2.5:1), y los péptidos que con-tenían enlace hidrazona con una solución acuosa de TFA (TFA / agua, 95:5). Elproducto crudo fue precipitado de la solución ácida con éter dietílico seco, elprecipitado fue secado al ambiente, y el residuo seco disuelto en una soluciónacuosa de acetonitrilo al 10%, luego fue congelado y liofilizado.

Purificación y caracterización. Los péptidos crudos fueron purificados porcromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa, RP-HPLC, usando unacolumna semipreparativa RP C-18 (Cosmosil, 5C18-AR), con un flujo de 8ml/min y un gradiente de 0-40% de solvente B (0.1% de TFA en acetonitrilo);la corrida total dura 40 min; el solvente A era 0.1% TFA en agua. La pureza dela fracción recogida fue verificada por RP-HPLC analítica y confirmada en unespectrómetro de masas MALDI-TOF (Bruker).

Ensayo de ELISA. La titulación de los sueros humanos contra el péptido enalfa hélice y su análogo lineal y del anticuerpo monoclonal 4B7 contra el péptidoen “loop” y su análogo lineal, fue llevada a cabo por duplicado usando péptidosunidos a maleimida-BSA, siguiendo protocolos estándar con anticuerpos con-jugados a fosfatasa alcalina y determinando la densidad óptica a 405 nm.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Preparación del cloruro de aminoácido. La reacción fue monitoreada por RP-HPLC (Figura 3). Los cloruros se disolvieron en metanol seco y se inyectaronen la columna. Se tomó como referencia el Fmoc-Gly-OH y se observó la dife-rencia en el tiempo de retención entre éste y el Fmoc-Gly-Cl. Este procedi-miento fue una manera fácil para evaluar la calidad del cloruro obtenido alcalcular la razón cloruro/ácido. La reacción generalmente llegó a finalización.

Síntesis de los péptidos. Los péptidos se sintetizaron y desanclaron de la resinasiguiendo el protocolo descrito en materiales y métodos, se purificaron porRP-HPLC y se caracterizaron por espectrometría de masas, dando los valoresesperados.

Caso 1: mimo estructural en alfa hélice. Como antecedentes a este trabajo sellevaron a cabo ensayos con péptidos lineales en el Instituto Nacional de Cance-rología en Bogotá, Colombia, con sueros de pacientes con carcinoma cervicalinvasivo y neoplasia cervical intraepitelial (Orozco, 1995). Se probaron 14péptidos de 20 residuos de aminoácidos; tenían 15 residuos sobrelapados entreun péptido y el siguiente, cubriendo toda la secuencia de la proteína HPV16-E7del virus de papiloma humano. El péptido 1 (MHGDTPTLHEYMLDLQPETT,residuos 1-20) fue reconocido por el 11.3% (9/80) de los sueros de los pacientes,mientras que el péptido 2 (PTLHEYMLDLQPETTDLYCY, residues 6-25) fuereconocido solo por el 2.5% (2/80).

22.88 min 26.72 min

Fomc-Gly-OH Fomc-Gly-Cl

22.88 min 26.72 min

Fomc-Gly-OH Fomc-Gly-Cl

Figura 3. Monitoreo de la reacción de formación de Fmoc-Gly-Cl a partir deFmoc-Gly-OH por RP-HPLC, en una columna RP-18 Lichrosorb (Merck), usandoun gradiente de 0-100% de acetonitrilo (con 1% de TFA) en 30 min.

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Los anticuerpos contra los epítopes de las proteínas son usualmente muy espe-cíficos y los cambios estructurales inducidos por la denaturación de la proteí-na pueden llevar a una pérdida total de la unión de los anticuerpos quereconocen la conformación de la proteína nativa. Como los péptidos linealesno conservan la estructura nativa, es posible observar una diferencia bienmarcada en la reacción antígeno-anticuerpo entre los péptidos lineales y lospéptidos conformacionalmente restringidos a imitar subestructuras de losepítopes de las proteínas.

Si la especificidad del anticuerpo está determinada tanto por la secuencia deaminoácidos como por la conformación en la región de unión, el diseño ysíntesis de un péptido con restricción conformacional a alfa hélice (JLAZ-TLHEYMLDLQ-GGG) debía ser llevada a cabo para comparar su reactividadcon el péptido lineal 1. Una vez desarrollado el diseño, se encontró que elpéptido con restricción conformacional a alfa hélice presentaba una fuertereacción con quince sueros de alta respuesta de pacientes con carcinoma cervi-cal invasivo (Figura 4). La mayor reactividad del péptido con restricciónconformacional a alfa hélice por sueros de pacientes sugiere que este péptidoadopta conformaciones que imitan la conformación de unión de la proteínaHPV16-E7 a los anticuerpos.

Suero humano

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5000 10000 15000

[Dilución Suero]-1

D.O

. a 4

05 n

m

Péptido Lineal 1Péptido en Hélice

Suero humano

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5000 10000 15000

[Dilución Suero]-1

D.O

. a 4

05 n

m

Péptido Lineal 1Péptido en HélicePéptido Lineal 1Péptido en Hélice

Figura 4. Títulos en ELISA de sueros de pacientes con carcinoma cervical contra elpéptido lineal 1 (MHGDTPTLHEYMLDLQPETT) y su análogo estructural en hélice (JLAZ-TLHEYMLDLQ-GGG).

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La baja sensibilidad del péptido lineal 1 de la proteína HPV16-E7 (como tam-bién la de los péptidos en general) se ha atribuido a sus estados no plegados.Esto conducirá a la búsqueda de estrategias para plegar los péptidos en con-formaciones que imiten la estructura que tienen las secuencias de dichospéptidos en la proteína, lo cual mejorará la sensibilidad de los ensayosserológicos en ensayos de ELISA.

Caso 2: mimo estructural en “loop”. La proteína Pfs25 es una proteína tipoEGF del ciclo sexual del P. falciparum de malaria. Esta proteína estimula unarespuesta de anticuerpos que bloquea la transmisión de la malaria. El anti-cuerpo monoclonal 4B7 (AcM 4B7) es un anticuerpo que se une a la ProteínaPfs25 y fue identificado con el péptido lineal ILDTSNPVK (Van Amerongen,1989), cuya secuencia está localizada en el tercer dominio tipo EGF de la pro-teína y se le predice una estructura en “loop” tipo “beta-hairpin”. Cuando estepéptido fue restringido con el enlace hidrazona, el péptido cíclico (“loop”) J-ILDTSNPVKT-GZG se unió con una mayor afinidad 26 veces mayor al AcM4B7 que su análogo péptido lineal G-ILDTSNPVKT-GGG (Figura 5). Elmarcado incremento en la afinidad del péptido con restricción a “loop” por elAcM 4B7, sugiere que esta “loop” adopta conformaciones que imitan mejor laestructura complementaria al sitio de unión del AcM (Calvo, 2003b).

AcM 4B7

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 100000 200000 300000

[Dilución AcM 4B7]-1

D.O

. t 4

05 n

m

Péptido LinealPéptido en “Loop”

AcM 4B7

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 100000 200000 300000

[Dilución AcM 4B7]-1

D.O

. t 4

05 n

m

Péptido LinealPéptido en “Loop”

Figura 5. Títulos en ELISA del anticuerpo monoclonal 4B7 contra el péptido lineal(G-ILDTSNPVKT-GGG) y su análogo estructural en “loop” (J-ILDTSNPVKT-GZG).

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Los resultados mostraron que los anticuerpos contra epítopes conformacio-nales de las proteínas, no eran bien reconocidos por los péptidos lineales. Apesar de que los péptidos estructurados no sean los mimos perfectos de lasestructuras correspondientes de los epítopes de la proteína, estos reaccionanmucho mejor con los anticuerpos que sus respectivos análogos lineales y estamayor reactividad estará relacionada con la proximidad a la estructura realque se quiere imitar. Esta estrategia podría ser útil para la identificación deanticuerpos contra epítopes conformacionales y proporcionaría las herra-mientas para el desarrollo de estrategias que mejoren la afinidad de secuenciaspor anticuerpos generados por proteínas nativas y su posible aplicación enmétodos de diagnóstico por ensayos de ELISA.

CONCLUSIONES

Se puede lograr aumento significativo en la antigenicidad plegando los péptidoscorrespondientes a epítopes en proteínas nativas. El presente estudio ha resal-tado la ventaja de usar procedimientos sintéticos para restringir péptidos conel fin de imitar ciertas subestructuras en proteínas. La base conceptual de esteenfoque está en reemplazar un enlace de hidrógeno estructural definido, porun mimo covalente de hidrazona. El enlace de hidrazona es un ligando conenfoque estructural que puede ser insertado en un péptido durante la síntesisen fase sólida. Este trabajo describe el uso de los ligandos J y Z para formar elenlace hidrazona. Al finalizar la síntesis siempre con el ligando J y variando laposición del ligando Z, el enlace hidrazona puede ser introducido en posicio-nes predeterminadas para restringir los péptidos y estabilizarlos como alfahélices o “loops”.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Dr. David Kaslow por proporcionar el AcM 4B7 y alDr. Oscar Orozco (q.e.p.d.), del Instituto Nacional de Cancerología, por pro-porcionar los sueros humanos.

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