IBT502 - Microbiología · Ingeniería en Biotecnología 1 IBT502 - Microbiología GUÍA PARA...
Transcript of IBT502 - Microbiología · Ingeniería en Biotecnología 1 IBT502 - Microbiología GUÍA PARA...
Ingeniería en Biotecnología
1
IBT502 - Microbiología
GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA
INGENIERÍA EN
BIOTECNOLOGÍA
Ingeniería en Biotecnología
2
Presentación
La presente Guía para Prácticas de Laboratorio ha sido desarrollada para que
los estudiantes de la asignatura de Microbiología dispongan de la información
necesaria para la realización de las prácticas correspondientes de acuerdo a
los temas, objetivos y resultados de aprendizaje definidos. En este documento
se incluye el proceso en el laboratorio de experimentación e investigación, con
los respectivos recursos y resultados esperados, para que el estudiante pueda
desarrollar su práctica-taller y la elaboración de sus respectivos informes o
cualquier otra evidencia de aprendizaje, que serán evaluadas con las rúbricas
que constan en los anexos.
La Guía presenta una secuencia donde se especifica cada sesión de prácticas
en laboratorio con su respectivo proceso didáctico y formativo.
Ingeniería en Biotecnología
3
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 1
1. TEMA: Preparación de medios de cultivo,
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL:
Aprender a preparar medios de cultivo y observar la ubicuidad de los microorganismos
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Preparar medios sólidos y líquidos
• Observar la presencia de microorganismos en diferentes muestras.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
La preparación de medios de cultivo y la fase de esterilización es de suma importancia en
microbiología ya que siempre se requiere trabajar en condiciones asépticas. El reconocer la
omnipresencia de microorganismos nos ayuda a prevenir contaminaciones a futuro y prever
posibles consecuencias cuando de microorganismos se trata (Madigan, Martinko & Parker,
2009).
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1. MATERIALES
Probeta 250 ml
Matraz Erlenmeyer 500 ml
Varillas de vidrio
Papel aluminio
Ingeniería en Biotecnología
4
5.2. REACTIVOS
Agar Nutritivo
Caldo Nutritivo
5.3. EQUIPOS
Autoclave
Incubadora
pHmetro
Agitador magnético con calentamiento
6. METODOLOGÍA
Preparar los medios de cultivo siguiendo las instrucciones dadas por el fabricante.
Una vez listo el medio proceder a colocar diferentes muestras en el medio y observar los
resultados a las 24 y 72 horas.
7. RESULTADOS (Indicaciones)
Colocar las fotos de los microorganismos generados después de la inoculación de la
muestra.
8. DISCUSIÓN (Indicaciones)
Discutir en base a:
- Medios de cultivo
- Condiciones asépticas
- Esterilización, desinfección, Pasteurización etc.
- Posibles microorganismos en cada muestra.
9. BIBLIOGRAFÍA
Madigan, M., Martinko, J., &Parker, J. (2009). Biología de los Microorganismos. New Jersey. Estados Unidos. Pearson Prentice Hall.
Ingeniería en Biotecnología
5
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 2
1. TEMA: Siembra de Microorganismos y obtención de cultivos puros
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 GENERAL:
Aislar colonias a través de distintos métodos de siembra en estriado.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Aprender las técnicas de estriado por agotamiento y por ángulo recto.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los microorganismos cuando se encuentran en hábitat naturales crecen en poblaciones
complejas y mixtas, que a su vez están constituidas por varias especies. Sin embargo, al
momento de realizar estudios acerca de un único microorganismo que se encuentra en un
medio mixto representa una gran dificultad, razón por la cual se necesita un cultivo puro. En
este tipo de cultivo, la población de células proviene de una sola célula que permita definir
una especie particular. Además, existen diversas maneras de preparar cultivos puros
(Prescott, Harley, & Klein, 2004).
Una colonia independiente se forma cuando sobre una superficie de agar se extiende una
mezcla de células, de manera que cada célula aislada se multiplicará y se define como una
“agrupación o formación macroscópicamente visible de microorganismos sobre un medio
sólido”. Un cultivo puro es representado por cada colonia (Prescott, Harley, & Klein, 2004).
Para obtener colonias aisladas se puede emplear el método de siembra en estrías o siembra
por extensión, no obstante para conseguir un buen aislamiento se necesita la separación
respectiva de las células (Tortora, Funke, & Case, 2013). También, se pueden emplear las
colonias que crecen en la superficie del agar para preparar cultivos puros y para inocular un
medio fresco (Prescott, Harley, & Klein, 2004).
El método de siembra en estriado fue fundado por el bacteriólogo alemán Robert Koch
(Prescott, Harley, & Klein, 2004) y es más beneficioso cuando el microorganismo que se
desea aislar se encuentra en grandes cantidades en relación a la población total. No
Ingeniería en Biotecnología
6
obstante en casos contrarios, su cantidad debe incrementarse mediante enriquecimiento
selectivo antes de que sea posible su aislamiento (Tortora, Funke, & Case, 2013).
Además en el método de siembra en estriado, la muestra es colocada en un medio sólido de
crecimiento y es dibujada algunas veces sobre la superficie; existen algunas formas de
realizar el estriado. Cada estriado representa un proceso de dilución progresiva y se
obtienen células individuales a lo largo del estriado (Sharma, 2007).
El objetivo de la presente práctica es aislar colonias a través de distintos métodos de
siembra en estriado.
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
• Asas
• Fósforo
5.2 REACTIVOS
Etanol 70%
Etanol 99%
Cajas Petri con Agar Nutritivo
5.3EQUIPOS
Incubadora
6 METODOLOGÍA
Todos los estudiantes deben ingresar al laboratorio con su respectivo mandil y proceder a
desinfectar su área de trabajo y sus manos. Luego se encienden los mecheros y en el área
de trabajo se coloca una caja Petri con cultivos de bacterias provenientes de una muestra
previa, dos cajas Petri con medios de cultivo sólido y un asa de inoculación. Las cajas Petri
se deben etiquetar con el nombre del estudiante, la fecha y el tipo de estriado.
Para el aislamiento de colonias se emplearán dos métodos, uno de ellos es el estriado por
agotamiento, en el cual se dividió al agar en tres secciones. Inicialmente, el asa de
inoculación se esteriliza al pasarla por el fuego, se deja enfriar y se toma una cierta cantidad
de la caja Petri con bacterias para luego hacer una inoculación a manera de zigzag
(estriado) en la primera sección del agar. Después, se esteriliza el asa, se deja enfriar en
una sección del agar y se hace el estriado en la segunda sección del agar teniendo en
cuenta que las líneas deben tocarse en dos puntos con el estriado anterior. A continuación,
se pasa por el fuego el asa para esterilizar, se deja enfriar en una esquina del agar y se
realiza el estriado en la tercera sección tomando en cuenta que debe tocarse en un punto
con el estriado de la segunda sección.
El segundo método consiste en estriado por ángulo recto, para lo cual se esteriliza el asa de
inoculación, se dejó enfriar en el agar y se escogió una pequeña cantidad de bacterias con
Ingeniería en Biotecnología
7
el asa. Sobre el medio de cultivo de una nueva caja Petri se trazó una línea recta vertical,
después se esteriliza el asa, se deja enfriar y sobre toda la línea recta se realiza el estriado.
Finalmente, las dos cajas Petri se llevan a la incubadora.
Estriado por agotamiento
Estriado en ángulo recto
7 RESULTADOS (Indicaciones)
Colocar las fotos del aislamiento obtenido
8 DISCUSIÓN
Discutir en función de cuál método es mejor para el aislamiento de cultivos puros y la importancia
de tener un cultivo axénico
9 BIBLIOGRAFÍA
Prescott, L. M., Harley, J. P., & Klein, D. A. (2004). Microbiología (Quinta ed.). Madrid: McGraw Hill Interamericana.
Sharma, P. D. (2007). Microbiology. Meerut, IND: Rastogi Publications. ISBN: 9789350437872
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2013). Microbiology: an introduction (Eleventh ed.). New York: Pearson Education.
Ingeniería en Biotecnología
8
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 3
1. TEMA: Elaboración de una curva de Crecimiento bacteriano
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
a. OBJETIVO GENERAL:
Distinguir mediante la realización de una curva de crecimiento bacteriano las etapas de
desarrollo de un microorganismo bacteriano
b. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Realizar una curva de crecimiento de la bacteria E. coli y asociar con los valores de
absorbancia a 600nm.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
La espectrofotometría consiste en una técnica de química analítica cuantitativa
basada en la capacidad de las partículas de absorber longitudes de onda
determinadas y mide la absorbancia o cantidad de luz que no atraviesa a la muestra,
la cual es proporcional a la concentración de la misma. (Meah, Allum, & Kebede-
Westhead, 2012). El valor que se indica en la pantalla del dispositivo indica la
absorbancia, un valor logarítmico útil para la construcción de la gráfica que relaciona
a la cantidad de analito en dependencia del tiempo (Aneja, 2003).
La curva de crecimiento representa gráficamente la tasa de reproducción de
bacterias o de otras células en un medio determinado, generalmente líquido, de
manera que se distinguen cuatro fases principales: de adaptación o latencia (lag),
exponencial o logarítmica, estacionaria máxima y de declinación o muerte
logarítmica (Becker, Caldwell, & Zachgo, 1996; Romero, 2007).
Cabe destacar que las bacterias recién inoculadas deben acondicionarse al nuevo
medio al que están siendo expuestas, la duración de esta fase depende de factores
múltiples como edad, estado de salud, nutrientes, pH, disponibilidad de oxígeno,
presencia de toxinas y temperatura, básicamente de la diferencias del medio de
cultivo previo y el posterior (Hogg, 2013); aunque no haya fisión binaria, la actividad
metabólica es elevada (Romero, 2007).
Ingeniería en Biotecnología
9
En la fase exponencial, identificada como trazo ascendente en la gráfica, es posible
calcular el tiempo de generación ya que las bacterias cuentan con las enzimas
necesarias para sobrevivir en el nuevo medio e inician su reproducción, sin
embargo, la fase puede verse afectada por factores externos que promueven la
transición a la fase estacionaria máxima, representada generalmente por una línea
horizontal recta en la curva de crecimiento, que se interpreta como velocidad
constante y por ende, equilibrio entre el índice de crecimiento y de mortalidad debido
a la disminución de la cantidad de nutrientes e incremento de desechos. En la etapa
final, en la cual la actividad celular decrece de forma progresiva hasta cesar
completamente. (Tortora, Funke, & Case, 2007).
El incremento de la turbidez o densidad óptica es un indicador eficiente al ser
proporcional a la cantidad de biomasa en el tiempo transcurrido tras la inoculación y
puede ser monitoreada por espectrofotometría (Tiwari, Hoondal, & Tewari, 2009)
empleando una longitud de onda de 600 nm.
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
Matraz erlenmeyer 500 ml
Tubos de ensayo 20ml con tapa rosca
Asa de Drigalsky
Asas graduadas
Micropipeta 10-100ul con portapipeta
Micropipeta 100-1000ul con portapipeta
Vaso de precipitación 100 mL
Puntas 10-100uL
Puntas 1mL
Cubetas para espectrofotómetro.
Fósforos
5.2 REACTIVOS
Agar nutritivo
Caldo Nutritivo
5.3 EQUIPOS
Balanza analítica
Agitador
Espectrofotómetro
Cámara de flujo laminar
Shaker
Ingeniería en Biotecnología
10
6. METODOLOGÍA
Los procedimientos serán llevados a cabo en condiciones asépticas, se inicia
con la inoculación del cultivo inicial que será empleado por todos los equipos de
trabajo siguiendo los procedimientos descritos a continuación en intervalos de
dos horas desde 8h00 hasta 17h00.
6.1 Espectrofotometría
El medio de cultivo sin inóculo (blanco) y el medio con bacterias serán previamente
colocados en matraces Erlenmeyer distintas. Para la manipulación de la muestra se
emplea la cámara de flujo laminar. Empleando una micropipeta, se toma 1 mL de cada
uno de los matraces y se colocó cuidadosamente en cubetas distintas para registrar los
datos de la absorbancia a longitud de onda de 600 nm.
6.2 Dilución seriada
Extraer 1 mL del medio de cultivo con microorganismos y diluir en 9 mL de medio de
cultivo vacío en un tubo de ensayo (1/10), del mismo modo, preparar diluciones 1/100,
1/1 000, y 1/10 000.
6.3 Plaqueo
Tomar 100 μl de cada una de las diluciones sembrar en un nuevo medio de cultivo sólido
con ayuda de un asa de Drigalsky, colocar en la Incubadora a 37 °C.
6.4 Conteo de Bacterias
Contabilizar las colonias presentes en cada una de las repeticiones de las diluciones,
seleccionar las que contienen de 25 a 250 colonias. Calcular el número de Unidades
Formadoras de colonias /mL.
7. RESULTADOS (Indicaciones)
Realizar un gráfico de absorbancia vs tiempo y otro de UFC/mL vs tiempo. Comparar
resultados obtenidos basándose en las etapas del crecimiento microbiano.
8. DISCUSIÓN (Indicaciones)
Discutir los resultados basándose en los resultados de absorbancia vs tiempo y
UFC/mL vs tiempo.
9. BIBLIOGRAFÍA
Ingeniería en Biotecnología
11
Aneja, K. (2003). Experiments in Microbiology, Plant Patology and Biotechnology. New Age International.
Becker, J., Caldwell, G., & Zachgo, E. (1996). Biotechnology: A Laboratory Course. Burlington, MA, USA: Academic Press.
Hogg, S. (2013). Essential Microbiology. Somersent, Nueva Jersey, Estados Unidos: John Wiley & Sons.
Meah, M., Allum, J., & Kebede-Westhead, E. (2012). Essential Laboratory Skills for Biosciences. Hoboken, Nueva Jersey, Estados Unidos: John Wikey & Sons.
Romero, R. (2007). Microbiología y parasitología humana. Editorial Médica Panamericana.
Tiwari, R., Hoondal, G., & Tewari, R. (2009). Laboratory Techniques in Microbiology and Biotechnology. Chandigarh, India: Abhisek Publications.
Tortora, G. J., Funke, 0. R., & Case, C. L. (2007). Introducción a la microbiología. Editorial Médica Panamericana.
Ingeniería en Biotecnología
12
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 4
1. TEMA: Observación de microorganismos: Tinciones
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL:
Realizar tinción Gram y de esporas bacterianas
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Aprender a elaborar un frotis bacteriano
4 FUNDAMENTO TEÓRICO
Una de las etapas fundamentales para las tinciones simples o compuestas es el frotis, que
consiste en extender un cultivo bacteriano sobre un portaobjetos para visualizar estructuras
específicas de las bacterias. La tinción de Gram es una tinción compuesta que utiliza 4
reactivos distintos: el cristal violeta cuya función es proporcionar color a las células, el lugol
que forma el complejo cristal violeta-yodo, el alcohol-acetona que es un agente decolorante y
la safrinina que es un reactivo de contratinción (Rojas Triviño, 2011). Además, la tinción
Gram proporciona colores dependiendo del tipo de pared celular que tenga la bacteria
(Arauz Cavallini, 1998). Las bacterias de tipo Gram positivas reservan el color azul o violeta
debido a que su pared celular consta de un gruesa pared celular compuesta en su gran
mayoría por peptidoglicano (Salton & Kim, 1996), mientras que las Gram negativas
adquieren tonalidades rojas o rosadas debido a que su pared celular posee solo una capa
(Ellner, 2000).
Otra forma de evaluar la reacción Gram puede ser mediante la adición de KOH al 3% a una
solución que esté concentrada de bacterias, debido a que este reactivo libera ácido
desoxirribonucleico al destruir las paredes celulares (Meurant, 1987); de manera que si la
solución se torna viscosa, indicando que las bacterias presentes en la solución son Gram
negativas. En su gran mayoría las bacterias gramnegativas son especies fitopatógenas
(Arauz Cavallini, 1998).
Por otra parte, las endosporas son enormemente deshidratadas y resistentes, poseen
además un conjunto de cubiertas mínimamente permeables; provocando que sean difíciles
de teñir a menos que sean calentadas para permeabilizarlas. El tamaño y la localización
Ingeniería en Biotecnología
13
cambia de acuerdo a la especie bacteriana; las esporas son producidas por Clostridium,
Bacillus, entre otras (Rodríguez Cavallini, Gamboa Coronado, Hernández Chavarría, &
García Hidalgo, 2005).
De manera tal, que el objetivo de la presente práctica es determinar el tipo de bacterias
presentes en un cultivo mediante tinción Gram y prueba de KOH. Además, se pretende la
visualización de esporas mediante una tinción especial en la que se involucra gran cantidad
de calor.
5 MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
• Asas
• Fósforos
• Portaobjetos
• Pinzas
• Goteros
• Guantes
5.2 REACTIVOS
Etanol 70%
Etanol 99%
Agua destilada
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol cetona
Safranina
Verde de Malaquita
KOH
Aceite de Inmersión
5.3 EQUIPOS
Incubadora
Microscopio
6 METODOLOGÍA
Todos los estudiantes se colocan el mandil al momento de ingresar al laboratorio y
desinfectan su área de trabajo y sus manos, además se encendieron los mecheros.
Posteriormente se procede a realizar el frotis, para lo cual se coloca una gota de agua
destilada en un portaobjetos y con un asa de inoculación se recoge una pequeña cantidad
Ingeniería en Biotecnología
14
de bacterias, provenientes de una muestra y con ella se frota sobre la gota de agua para que
la muestra quede totalmente distribuida. Seguidamente, el portaobjetos se pasa por la llama
del mechero hasta que el agua se evapora y la muestra se fija. A continuación, se coloca
una cantidad suficiente de cristal violeta sobre el frotis hasta cubrirlo y se espera por 1
minuto; transcurrida esa cantidad de tiempo se lava la muestra y se añade Lugol para
cubrirlo y se espera por un minuto. Se lava con alcohol cetona tratando de eliminar el cristal
violeta empleado. Finalmente, se añade safranina y se espera por un minuto, se lava con
agua.
Se procede a observar la muestra. Primero se coloca el portaobjetos en el microscopio y se
enfocó con el lente de 4X, posteriormente se enfoca con los lentes de 10X y 40X.
Finalmente, se coloca aceite de inmersión para observar con el lente de 100X.
Mientras que para la prueba de KOH, se coloca una gota de KOH al 3% en el portaobjetos y
con el asa de inoculación se recoge una pequeña cantidad de bacterias provenientes de una
muestra, en una portaobjetos y con movimientos de abajo hacia arriba sobre el reactivo se
espera 1 minuto para ver si ocurría alguna reacción, se forma un hilo viscoso al momento de
mover el asa (Gram Negativo).
Para la tinción de esporas, se realiza un frotis y se coloca un papel filtro sobre la muestra.
Después sobre el papel filtro se añade verde de Malaquita hasta que el papel se empapa
totalmente. Luego, se pasa por el fuego hasta que el verde de Malaquita se evapora.
Posteriormente, se repite el proceso de añadir y luego evaporar el verde de Malaquita
durante 10 min. Se retira el papel filtro y se añade safranina por 1 minuto. Finalmente se
lava la muestra y se la observó en el microscopio.
7 RESULTADOS
Colocar las fotos de cada una de las tinciones.
8 DISCUSIÓN
Discutir en función de cuál tipo de bacterias poseen esporas y cuáles son Gram positivas y
negativas.
9 BIBLIOGRAFÍA
Arauz Cavallini, L. F. (1998). Fitopatología: Un enfoque agroecológico (Primera ed.). San José: Editorial de la Universidad de Cosa Rica.
Ellner, R. (2000). Microbiología de la leche y de los productos lácteos. Madrid: Díaz de Santos.
Meurant, G. (1987). Methods in Microbiology. Orlando: Academic Press.
Rodríguez Cavallini, E., Gamboa Coronado, M., Hernández Chavarría, F., & García Hidalgo, J. (2005). Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio. San José: Editorial Universidad de Costa Rica.
Rojas Triviño, A. (2011). Conceptos y prácticas de microbiología general. Recuperado el 13 de Octubre de 2015, de Universidad Nacional de Colombia: http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf
Salton, M. & Kim, K. (1996). Medical microbiology (Fourth ed.). Galveston: University of Texas Medical Branch. Capítulo 2. Recuperado el 14 de Octubre de 2015 de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8477/
Ingeniería en Biotecnología
15
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 5
1. TEMA: Pruebas Bioquímicas y medios selectivos
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL:
Identificar la importancia de los medios selectivos y pruebas boquímicas
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Conocer el fundamento bioquímico de cada uno de los tests.
4 FUNDAMENTO TEÓRICO
Para identificar bacterias a menudo se emplean pruebas bioquímicas debido a que las
distintas especies generan diferentes enzimas. Por lo tanto, la finalidad de tales pruebas es
determinar la presencia de enzima (Tortora, Funke, & Case, 2013). Un tipo de prueba
bioquímica tiene como base la detección de enzimas que se encargan de catabolizar
aminoácidos relacionados con los procesos de descarboxilación y deshidrogenación
(Tortora, Funke, & Case, 2013).
La prueba de la catalasa tiene como principio detectar la presencia de la enzima catalasa.
Además, en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que poseen
citocromos está presente la catalasa, mientras que los anaerobios obligados carecen de
catalasa. En algunas bacterias, la catalasa se sintetiza en respuesta a O2, H2O2 o alguna
otra sustancia formada cuando el H2O2 está presente, confiriéndole el término de enzima
inducible. La catalasa se encarga de descomponer el peróxido de hidrógeno u oxidar
sustratos secundarios (MacFaddin, 2003).
Dentro del grupo de mecanismos para identificar bacterias encontramos al sistema Microgen
GN-ID, el cual emplea 12 (GN A) o 24 (GN A+B) sustratos bioquímicos, los cuales se
encuentran normalizados y deshidratados. Las tiras de prueba GN A y GN B de micropocillos
se utilizan conjuntamente para producir un sistema de sustrato de 24 que permite la
identificación de bacilos Gram negativa (oxidasa negativo y positivo), además de todas las
especies actualmente reconocidas de la familia Enterobacteriaceae. La tira de prueba GN A
de micropocillos está destinada a la identificación de oxidasa negativa, nitrato positivo,
fermentadores de glucosa que comprenden los géneros más comúnmente ocurrentes de la
familia Enterobacteriaceae (Microgen Bioproducts, 2007).
Ingeniería en Biotecnología
16
La prueba de citrato se basa en determinar si un microorganismo tiene la capacidad de
emplear como única fuente de carbono al citrato para metabolizar y crecer con alcalinidad.
Además, el citrato se utiliza para la identificar a la familia Enterobacteriaceae,
microorganismos gramnegativos y bacterias no fermentadoras (MacFaddin, 2003).
El agar de TSI (Hierro- triple azúcar) es un medio diferencial que se emplea para determinar
la fermentación de carbohidratos, la producción de H2S y el gas proveniente del metabolismo
de los carbohidratos. Además, el TSI identifica a las bacterias en función de la fermentación
de lactosa, glucosa y sacarosa, y en la producción de sulfuro de hidrógeno; dado que el TSI
contiene glucosa (0,1%), sacarosa (1%) y lactosa(1%). A menudo se utiliza TSI para la
identificación de la familia Enterobacteriaceae y de bacterias Gramnegativas (Lehman,
2013).
El medio SIM se emplea para detectar la producción de sulfuro, la formación de indol y la
motilidad. Sulfato de amonio ferrosos y tiosulfato de sodio son los componentes de este
medio y al actuar en conjunto sirven como indicadores de la producción de H2S al formar un
precipitado de color negro (Hardy Diagnostics, 2009).
La prueba de la ureasa tiene como principio determinar si un microorganismo es capaz de
hidrolizar la urea mediante la acción de la enzima ureasa en dos moléculas de amoníaco.
Además, la ureasa en una enzima microbiana muy importante que se relaciona con la
descomposición de compuestos orgánicos (MacFaddin, 2003).
La prueba del almidón tiene como principio determinar si un microorganismo tiene la
capacidad de hidrolizar por medios enzimáticos al almidón y permite además probar si el
almidón desaparece a través de un reactivo que contenga yodo (MacFaddin, 2003).
El agar Sangre facilita el crecimiento de microorganismos, los cuales requieren una nutrición
exigente. Además en este agar se puede visualizar de forma clara las reacciones de
hemólisis, dichas reacciones de hemólisis se pueden dividir en alfa, beta y gamma (Britania
Lab, 2010).
El agar MacConkey es selectivo y diferencial que está compuesto por el colorante violeta
cristal, el cual inhibe el crecimiento de las bacterias grampositivas y de los hongos, de forma
que solo facilita el crecimiento de bacilos gramnegativos. La fermentación de lactosa
produce ácido, ocasionando que el pH del medio disminuya y otorgándole un color rosa a las
colonas bacterianas. Las bacterias que no son fermentadoras de la lactosa se presenta de
forma incolora y traslúcidas (Forbes, et al., 2009)
La prueba de la oxidasa permite identificar a los microorganismos que carecen de la enzima
citocromo oxidasa o a los que son anaerobios obligados. El sistema citocromo puede
encontrarse en microorganismos aerobios o microaerofílos y anaerobios facultativos. Como
un control positivo se puede tomar Pseudomonas aeruginosa y como control negativo a
Escherichia coli (Koneman, et al., 2008).
5 MATERIALES Y REACTIVOS
Ingeniería en Biotecnología
17
5.1 MATERIALES
• Asas
• Fósforos
• Goteros
5.2 REACTIVOS
Etanol 70%
Etanol 99%
Agua destilada
Aceite mineral
Tiras de Microgen
Medio TSI
Medio SIM
Agar MacConkey.
Agar Urea
Medio SIM
Agar Sangre
5.3 EQUIPOS
Incubadora
6 METODOLOGÍA
Para realizar la prueba de catalasa, se procede a colocar una gota de peróxido de
hidrógeno sobre un portaobjetos y con una punta de micropipeta se toma una pequeña
cantidad de muestra e inmediatamente se la coloca sobre la gota del peróxido de
hidrógeno haciendo movimientos envolventes.
En cuanto a la pruebas de GN A, se realiza una solución bacteriana y en cada uno de
los 12 pocillos se colocan 100 uL de dicha solución con una micropipeta; se agrega
además a los pocillos 1,2,3 y 9, 3 gotas de aceite mineral. Se deja en la incubadora y al
día siguiente se añaden reactivos para revelar determinadas pruebas según el manual
Microgen GN-ID.
Para las pruebas de TSI, SIM, citrato y ureasa, se esteriliza una aguja de inoculación.
Después, con esa aguja se toma una pequeña porción bacteriana y se inocula cada uno
de los tubos que contiene el agar específico para cada prueba. Se perfora el agar con la
aguja y sobre la parte del agar inclinado se realiza un pequeño estriado. Se incuba.
Se procede a esterilizar un asa de inoculación y se toma una pequeña porción
bacteriana. A continuación, se procede a hacer un estriado en el agar MacConkey.
Además, se repitió el mismo proceso para hacer un estriado en el agar Sangre.
Ingeniería en Biotecnología
18
Para la prueba de almidón, se procede a añadir Lugol sobre una caja Petri que contiene
la bacteria en cuestión. Se espere 1 minuto y se desecha el reactivo en exceso para
poder revelar el resultado.
7 RESULTADOS
Colocar las fotos de cada una de las pruebas.
8 DISCUSIÓN
Discutir en función de los resultados el tipo de microorganismo con el que estamos trabajando.
9 BIBLIOGRAFÍA
Britania Lab. (2010). Sangre Agar Base. Recuperado el 27 de Noviembre de 2015, de Britania
Lab: http://www.britanialab.com/productos/360_hoja_tecnica_es.pdf
Forbes, B., Sahm, D., & Weissfeld, A. (2009). Bailey & Scott: diagnóstico microbiológico
(Doceava ed.). Buenos Aires: Médica Panamerica .
Hardy Diagnostics. (2009). SIM (Sulfide, Indole, Motility) Medium. Recuperado el 27 de
Noviembre de 2015, de Catalog Hardy Diagostic:
https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/SIMMedium.htm
Koneman, E., et al. (2008). Koneman diagnóstico microbiológico (Sexta ed.). Buenos Aires:
Médica Panamericana.
Lehman, D. (2013). Triple Sugar Iron Agar Protocols. Recuperado el 27 de Noviembre de 2015,
de American Society for Microbiology:
http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/2842-triple-sugar-iron-agar-
protocols
MacFaddin. (2003). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia
Clínica (Tercera ed.). Buenos Aires: Médica Panamericana.
Microgen Bioproducts. (Julio de 2007). Microgen GnA+B-ID System. Recuperado el 26 de
Noviembre de 2015, de Microgen Bioproducts: http://www.medica-tec.com/arg/files/MICROGEN-
GN-ID-MID65%20y%20MID641.pdf
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2013). Microbiology: an introduction (Eleventh ed.). New
York: Pearson Education.
Ingeniería en Biotecnología
19
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 6
1. TEMA: Morfología Fúngica, test de antagonismo
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL:
Identificar las estructuras fúngicas y pruebas de antagonismo hongo-bacteria
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Aprender la replicación de hongos
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los hongos filamentosos se definen como aerobios facultativos que tienen la capacidad de
reproducirse mediante esporas, o de forma asexual o sexual. Además, su pared celular es
rígida debido a que está conformada por quitina. A diferencia de otros microorganismos, los
hongos se nutren mediante materia orgánica previamente fabricada, dado que no poseen
clorofila y aquello les impide realizar fotosíntesis. Por otra parte, los hongos poseen una
estructura conformada por un complejo, el cual se denomina talo o micelio y este por su
parte está formado por un sin número de hifas o filamentos, pese a que la gran mayoría de
estos hongos son inmóviles algunos de ellos poseen células reproductoras móviles (Arias &
Piñeros, 2008).
El crecimiento exorbitante de microorganismos perjudiciales puede ser imposibilitado al
establecer microflora normal que brinde beneficios al huésped. Este evento es denominado
exclusión competitiva o antagonismo microbiano. Dentro del antagonismo microbiano se
puede incluir a la competición entre microbios. Como resultado de tal competencia, la
microflora normal le proporciona protección al huésped, dado que no permite la colonización
de posibles microbios patógenos. Todo ello se debe a que se genera una competencia por
los nutrientes, genera sustancias que son perjudiciales para los microbios invasores.
Además, afecta algunas condiciones como por ejemplo: la disponibilidad de oxígeno y el pH.
Al alterarse el equilibrio entre los microbios patógenos y la microflora normal surgen
enfermedades (Tortora, Funke, & Case, 2013).
Las poblaciones de organismos se pueden reducir por eventos naturales, los cuales son
causados por parásitos, depredadores, enfermedades y antagonistas, tal proceso se
denomina “control natural”. Mientras que se llama control biológico o biocontrol, cuando el
Ingeniería en Biotecnología
20
objetivo del proceso es controlar plagas. El antagonismo microbiano consiste en la inhibición,
disminución o muerte de una especie de microorganismos debido a la gestión de otra; puede
consistir además en una relación entre dos poblaciones, en la que una de las dos genere
efectos letales o negativos para la otra (Pérez, Gonzalez, & Muñoz, 2014).
A finales del siglo XIX, Pasteur y Joubert realizaron las primeras investigaciones acerca del
antagonismo entre bacterias, centrándose principalmente en el estudio de tres tipos de
antagonismo que incluyen: virus que tienen la capacidad de lisar bacterias, bacterias que
destruyen a otras bacterias y el bloqueo de receptores celulares del huésped a través de
filtrados bacterianos. Sin embargo, al final se encontró que los hongos son aún más
eficientes en cuanto a los combates homicidas y algunos de ellos pueden derrotar a varias
especies bacterianas (Ledermann, 2013). Por otra parte, hay algunas especies bacterianas
que generan antibióticos, los cuales se han empleado como agentes de control biológico
para combatir hongos patógenos. Existen además algunos microbios que secretan enzimas
de forma extracelular como quitinasa, glucanasa, proteasa y celulasa, las cuales digieren los
micelios de los hongos (Ahmed Sheikh, 2010).
Varios fungicidas químicos se han empleado para control Fusarium, el cual es un hongo
patógeno. Sin embargo, estos fungicidas son altamente contaminantes para el ambiente,
por lo que en la actualidad se emplean microorganismos o sus metabolitos como agentes de
biocontrol. Se han encontrada algunas especies de Bacillus que son altamente efectivos
contra patógenos de plantas, entre ellos se encuentran los B. subtilis y B. amyloliquefaciens
(Zhang, et al., 2012).
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
• Asas
• Fósforos
• Bisturí
• Mechero de alcohol
• Vaso de precipitación 100mL
• Pipeta Pasteur
• Pinzas
• Cámara de Neubahuer
5.2 REACTIVOS
Etanol 70%
Etanol 99%
Tubos con agua destilada
Azul de lactofenol
Medio PDA
Medio Sabouraud
Ingeniería en Biotecnología
21
5.3 EQUIPOS
Incubadora
Microscopio
Cámara de Flujo laminar.
6. METODOLOGÍA
Para obtener una visión microscópica del hongo se emplea la técnica de cinta pegante,
para lo cual se corta una cinta de un tamaño específico y se la enrolla de manera tal que
la parte adhesiva queda hacia afuera. Luego, se presiona firmemente sobre la superficie
del hongo a estudiar. La tira de cinta se coloca sobre un portaobjetos, en el cual
previamente se ha colocado una gota de azul de lactofenol.
Para la prueba de antagonismo hongo versus bacteria, se procede a sumergir un bisturí
en alcohol 90% y seguidamente se lo pasa por la llama del mechero para conseguir
esterilizarlo. Luego, se corta un fragmento rectangular del hongo se lo coloca en el
centro de un nuevo medio de cultivo (PDA).Seguidamente, se esteriliza una pipeta
Pasteur de vidrio y con ella se realizaron cuatro perforaciones sobre un medio de cultivo
que contenía una determinada bacteria a ser testada, posterior a ello se esteriliza un
bisturí y con sumo cuidado se retiran las cuatro perforaciones de forma circular y se las
colocaron de tal forma que rodean a el hongo.
7. RESULTADOS
Colocar las fotos de los tests de antagonismos y de las visualizaciones del hongo en el
microscopio. Señalando las estructuras.
8. DISCUSIÓN
Discutir en función de los resultados de antagonismo e identificación de los hongos.
9. BIBLIOGRAFÍA
Ahmed Sheikh, H. (2010). Antimicrobial activity of certain bacteria and fungi isolated from soil
mixed with human saliva against pathogenic microbes causing dermatological diseases. Saudi
Journal of Biological Sciences(17), 331-339.
Arias Cifuentes, E., & Piñeros Espinosa, P. (2008). Aislamiento e identificación de hongos
filamentosos de muestras de suelos de los parámos de Guasca y Cruz verde. Recuperado el 2
de Diciembre de 2015, de Pontificia Universidad Javeriana:
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis226.pdf
Ledermann, W. (2013). Antagonismo microbiano en la terapia de las enfermedades infecciosas.
Revista Chilena Infectol, 30(4), 446-450.
Pérez, R., Gonzalez, T., & Muñoz, J. (2014). Antagonismo microbiano asociado a cepas
bacterianas provenientes de jitomate (Lycopersicum esculentum Mill) y maíz (Zea Mays). Revista
Iberoamericana de Ciencias, I(3), 53-60.
Ingeniería en Biotecnología
22
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2013). Microbiology: an introduction (Eleventh ed.). New
York: Pearson Education.
Zhang, S.-M., Wang, Y.-X., Meng, L.-Q., Li, J., Zhao, X.-Y., Cao, X., y otros. (2012). Isolation and
characterization of antifungal lipopeptides produced by endophytic Bacillus amyloliquefaciens
TF28. African Journal of Microbiology Research, 6(8), 1747-1755.
Ingeniería en Biotecnología
23
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
1. TEMA: Antibiograma
2. IDENTIFICACIÓN:
3. OBJETIVOS
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 7
3.1 OBJETIVO GENERAL:
Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibióticos
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Determinar el mejor tratamiento antibiótico mediante la observación de halos inhibitorios
de crecimiento en la muestra bacteriana.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Las pruebas de sensibilidad antibiótica de las bacterias o antibiograma, son procedimientos
muy útiles, los cuales se ejecutan con mucha frecuencia en laboratorios clínicos para el
diagnóstico de enfermedades de carácter bacteriano y sobre todo la selección del antibiótico
más adecuado para el tratamiento de dicha enfermedad (Prescott, Harley, & Klein, 2004).
La siembra y el método de difusión en el medio de cultivo es muy sencillo, tan solo se basa
en la colocación de discos absorbentes impregnados con el antibiótico a ensayar. La
determinación de los resultados es netamente visual, ya que se observará un halo, en el cual
no hay proliferación de bacterias, mientras que si la bacteria resulta resistente al antibiótico
esta crecerá uniformemente y no se presentará ningún halo de inhibición en torno al disco de
papel.
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES Isopo
Fósforos
Mechero de alcohol
Vaso de precipitación 100mL
Pipeta Pasteur
Pinzas
Cámara de Neubahuer
Ingeniería en Biotecnología
24
5.2 REACTIVOS
Etanol 70%
Etanol 99%
Tubos con agua destilada
Mueller Hinton
Brain Heart Infusion BHI
Cloranfenicol
Erytromycin
Penicilina
Ampicilina
Oxacilina
Gentamicina
5.3 EQUIPOS
Incubadora
Cámara de flujo laminar
6 METODOLOGÍA
Con ayuda de un hisopo inocular la bacteria en el medio de cultivo formando un tapiz.
Seguidamente colocar los discos a evaluar sobre el agar.
7 RESULTADOS
Colocar las fotos de los tests y dimensiones de los halos de inhibición.
8 DISCUSIÓN
Discutir en función de los resultados: tipo de antibiótico y bacteria. Incluyendo terminología de
concentración mínima inhibitoria.
9 BIBLIOGRAFÍA
Prescott, L. M., Harley, J. P., & Klein, D. A. (2004). Microbiología (Quinta ed.). Madrid: McGraw Hill Interamericana.
Ingeniería en Biotecnología
25
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 8
1. TEMA: Análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de manipulación de
alimentos
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL:
Comprobar la ubicuidad de los microorganismos en diferentes ambientes de común
acceso en aire, superficie y alimentos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Obtener muestras de superficie a partir de mesas y mesones en la cafetería
universitaria.
Atrapar esporas de hongos contenidas en el ambiente en placas de agar Sabouraud
Determinar la presencia de microorganismos como Lactobacillus en alimentos de
consumo masivo.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
En la actualidad el aumento de la población y de la recurrencia a lugares ha provocado un
incremento de la flora microbiológica dispersa en los ambientes de recurrencia. Las
personas, y animales son los principales portadores de microorganismos, de los cuales
aquellos determinados como patógenos representan la mayor amenaza en cuanto a la
transmisión de enfermedades.
Los lugares destinados a las prácticas de sanidad y alimentación requieren de un control
exhaustivo y frecuente de la contaminación microbiológica ya que de lo contrario se puede
poner en riesgo la seguridad y calidad de los productos y consumidores. Para ello, se han
creado normas de control las cuales establecen protocolos a seguir para determinar la
inocuidad del lugar y parámetros a cumplirse con el fin de garantizar la seguridad y buen
servicio por parte del proveedor al consumidor.
El control se lo puede realizar bajo diferentes parámetros, para ello es importante realizar un
muestreo específico para delimitar la zona de análisis. El estudio microbiológico se lo puede
realizar tanto de aire como de superficie (Madigan, Martinko & Parker, 2009).
.
Ingeniería en Biotecnología
26
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
• Asas
• Fósforos
• Asa de Drigalsky
5.2 REACTIVOS
Etanol 70%
Etanol 99%
Tubos con agua destilada
PCA (plate count agar)
VRBG (Violet Red Bile Agar) (rojo violeta bilis)
Tripticasa soya Agar
Medio MRS
Medio LB
5.3 EQUIPOS Incubadora
6
METODOLOGÍA
Cámara de flujo laminar
Destapar las tapas de PCA en las cafeterías de la Universidad de las Américas sede
Queri y examinar la contaminación a los 30 minutos, 60 minutos y 90 minutos.
Finalmente, se taparon las placas y se dejó incubar la muestra durante 48 horas a 37ºC.
Elegir una superficie , emplear placas de PCA con la finalidad de recuperar los
aerobios totales. Presionar la placa sobre la superficie elegida, tapar la caja Petri e
incubar la muestra durante 48 horas. Aislar microorganismos (Lactobacillus) de
alimentos como frutas y lácteos.
7 RESULTADOS
Colocar las fotos de los crecimientos.
8 DISCUSIÓN
Discutir en función de los resultados: morfología bacteriana y fúngica
9 BIBLIOGRAFÍA
Madigan, M., Martinko, J., &Parker, J. (2009). Biología de los Microorganismos. New Jersey. Estados
Unidos. Pearson Prentice Hall.
Ingeniería en Biotecnología
27
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 9
1. TEMA: Análisis microbiológico de agua: Recuento de coliformes totales y E. coli por filtración
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2017-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL:
Analizar la presencia de coliformes y E. coli en muestras de alimentos susceptibles a la contaminación
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
A colocar por el estudiante
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
La presencia y el nivel de contaminación fecal constituye un factor importante en la
evaluación de la calidad de una masa de agua y del riesgo de infección que representa
para la salud humana. El análisis de muestras de agua para detectar la presencia de
Escherichia coli, que normalmente habita en el tracto intestinal de hombres y otros
animales de sangre caliente, proporciona una indicación de este tipo de contaminación. Los
resultados del análisis de bacterias coliformes pueden resultar más difíciles de interpretar
dado que algunas bacterias coliformes viven en el suelo y en las aguas dulces superficiales
y, por tanto, no tienen siempre un origen intestinal. La presencia de bacterias coliformes,
aunque no pruebe de forma concluyente una contaminación de origen fecal, si puede
indicar fallos en el tratamiento o en la distribución del agua. La identificación de las cepas
aisladas puede permitir en ocasiones obtener información acerca de su origen (Norma
INEN- NTE INEN-ISO 9308-1 Primera edición 2014-01).
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
Mechero Bunsen
Incubadora
Equipo de
Ingeniería en Biotecnología
28
filtración
Kitasato
1000 ml
Esteril
5.2 REACTIVOS
Placas de Agar tergitol TTC *6
Placas de Agar nutritivo AN *6
Reactivo de oxidasa
Reactivo de Kovacs
6. METODOLOGÍA
Advertencia: si se presume que el agua contiene un alto contenido de microorganismos
realizar diluciones seriadas
Armar el equipo de filtración que debe estar estéril, de tal modo que establezca las
siguientes partes: recipiente de vidrio 250 mL con base para embudo esmerilado, frasco
erlenmeyer de 1000 ml pinza, porta-filtro, bomba y membrana de 0.2 um de poro. Filtrar 100
ml de muestra, medida en una probeta estéril
Retirar la membrana con ayuda de una pinza estéril y colocarlo sobre la superficie del agar
TTC
Incubar a 37°C, 24horas. Posteriormente contar las colonias de color amarillo o naranja y
transferirlas a placas con AN
Incubar las placas con AN por 24 horas y realizar la prueba de oxidasa.
Inocular una colonia en el tubo triptona sal a 44°C durante 24 horas y revelar la presencia
de indol mediante la adición de reactivo de KOVACS.
Mediante el contaje en TTG, oxidasa negativa y expresarla como UFC/100ml considerarlas
COLIFORMES TOTALES. Considerar E. coli, aquellas colonias típicas en TTG, oxidasas
negativos e indol positiva
7. RESULTADOS
Colocar las fotos de l a s p l a c a s y las identificaciones en cada una,
8. DISCUSIÓN
Discutir en función de los resultados obtenidos en cada grupo.
9. BIBLIOGRAFÍA
Madigan, M., Martinko, J., &Parker, J. (2009). Biología de los Microorganismos. New Jersey. Estados
Ingeniería en Biotecnología
29
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 10
1. TEMA: Análisis microbiológico de alimentos: Recuento de coliformes por la técnica del Número más probable
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL:
A Investigar la presencia mediante el recuento de coliformes totales por razón de la técnica del número más probable
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Aprender el desempeño e importancia de esta técnica.
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Método de detección de coliformes: Los tubos que presentan opacidad o producción de gas en el medio liquido de enriquecimiento selectivo y cuyos subcultivos han producido gas en Caldo EC e indol en agua de peptona a 44 °C se considera que contienen Escherichia coli presuntiva. Método de enumeración El número más probable de Escherichia coli presuntiva es determinado por medio de la tabla MPN, acorde con el número de tubos con medios de concentración simple o doble cuyos subcultivos han producido gas in el caldo EC e indol en agua peptonada a 44°C. Pruebas INVIC para determinación de Escherichia coli La determinación de Escherichia coli se realizan mediante la aplicación de las pruebas bioquímicas INVIC. Prueba de indol. Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el triptófano en indol y alanina. El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovacs). El triptófano forma parte de las peptonas del medio. Escherichia coli es positive a la prueba de indol.
Ingeniería en Biotecnología
30
Prueba de rojo de metilo. Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo. Escherichia coli es positiva a la prueba de rojo de metilo.
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
Espátulas metálicas estériles
Tubos con 10 ml CP estéril
Tubos con 9 mL de caldo verde brillante-bilis-lactosa. BGBL Adicionado la campana de Durhan
5.2 REACTIVOS
Caldo Peptona 90 mL en frasco boeco con tapa, estéril
5.3 EQUIPOS
Mechero Bunsen
Balanza +/- 0.1 g
Pipetas automáticas
Puntas estériles
6. METODOLOGÍA
Pesar en condiciones asépticas aproximadamente 10 g del alimento problema previamente homogenizado (stomacher) dentro del frasco con 90 mL de CP, esta será conocida como dilución madre, ó 10-1.
Agitar por 5 minutos y proceder a realizar diluciones seriadas, colocando 1 mL en el tubo que contiene 9,0 mL de CP (1:10), tomar 1 mL y suspenderlo en 9,0 ml de CP (1:100) y tomar 1 mL, colocar en 9 mL (1:1000)
Colocar 1 ml de cada dilución (1:10),(1:100),(1:1000), en una serie de 3 tubos de caldo BGBL+campana, incubar los tubos por 24-48 horas a 37°C.
Calcular los el NMP de coliformes totales según la combinación de los tubos obtenida, según la tabla 25-1 pag. 157 (Gamazo,2005)
7. RESULTADOS
Colocar las fotos de la cepa aislada con sus características principales.
8. DISCUSIÓN
Discutir en función de los microorganismos fijadores de nitrógeno
9. BIBLIOGRAFÍA
Wang, E. T., Martínez Romero, J., López Lara, I., Martínez Romero, E., & Martínez Romero, J. C.
Ingeniería en Biotecnología
31
(2001). Rhizobium y su destacada simbiosis con plantas. Microbios.(Eds. E. Martínez Romero y JC
Martínez Romero). Centro de Investigaciones sobre Fijación de Nitrógeno. Universidad Nacional
Autónoma de México, México.
Ingeniería en Biotecnología
32
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 11
1. TEMA: Urocultivo y coprocultivo
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.2 OBJETIVO GENERAL:
Identificar los microorganismos presentes en orina y heces
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Identificar los microorganismos patógenos en orina y heces
Diferenciar otras características presentes en orina y heces con síntomas de
infección urinaria o gastrointestinal
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
El urocultivo es un examen de laboratorio para analizar si hay bacterias u otros microbios en
una muestra de orina. Puede ser utilizado para buscar una infección urinaria en adultos y
niños. Un examen "positivo" o anormal es cuando se encuentran bacterias o cándidas en el
cultivo. La presencia de E. coli por ejemplo es anormal.Esto probablemente significa que se
tiene una infección urinaria o vesical. Es un examen de laboratorio para encontrar
organismos en las heces (materia fecal) que puedan causar enfermedad y síntomas
gastrointestinales. La presencia de Salmonella o Shigella sería un resultado anormal
(Madigan, Martinko & Parker, 2009).
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
• Tubos con agua destilada
• Cubreobjetos
• Portaobjetos
• Tubos para centrífuga
• Puntas 100-1000uL
5.2 REACTIVOS
Ingeniería en Biotecnología
33
Etanol 70%
Etanol 99%
McConkey
Base Sangre Agar
Urea Base Agar
Agua destilada
Medio CLED
Medio Hektoen
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol cetona
Safranina
5.3 Equipos
Microscopio
Incubadora
Centrifuga
6. METODOLOGÍA
Sembrar directamente la orina en los medios de cultivo. De las heces hacer una dilución.
En un segundo paso centrifugar la orina para observar los cristales en el microscopio
7. RESULTADOS
Colocar las fotos de la cepa aislada con sus características principales.
8. DISCUSIÓN
Discutir en función de los microorganismos encontrados en las muestras.
9. BIBLIOGRAFÍA
Madigan, M., Martinko, J., &Parker, J. (2009). Biología de los Microorganismos. New Jersey. Estados
Unidos. Pearson Prentice Hall.
Ingeniería en Biotecnología
34
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 12
1. TEMA: Aislamiento de patógenos de plantas
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL:
Aislar microorganismos patógenos de distintas partes de la planta.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Realizar los postulados de Koch
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
En 1882, se determinaron los postulados de Koch para verificar si un organismo es o no
el que actúa como patógeno de una determinada enfermedad (Cifuentes, 1990). Los
postulados son: 1) En todos los casos de la enfermedad debe estar presente el
mismo patógeno. 2) El patógeno será aislado del huésped y cultivado axénicamente. 3) El
patógeno del cultivo axénico debe ser inoculado en un organismo sano de la misma
especie de donde fue aislado. 4) El patógeno se aisla a partir del organismo inoculado y
se deberá comprobar que es el organismo patógeno original.
Sintomatología se refiere al estudio de los síntomas y signos que puedan predecir
correctamente de qué enfermedad se trata, La enfermedad, en plantas, se relaciona con una
función o estructura anormal producto de estar expuesto a cierto patógeno. El síntoma es
más bien una variación anormal externa del material vegetal como color, olor, etc, Signo es
la visión de una parte del organismo patógeno como micelios y esporas (Cifuentes, 1990).
Existen hongos fitopatógenos como Penicillium, Rhizopus, Fusarium y Aspergillium entre los
más comunes, son frecuentes en frutas importadas y esto conlleva un peligro para el
bienestar de una población (Trigos et al., 2008). Por esta razón, la práctica presente es una
herramienta para aprender a identificar los patógenos que producen ciertas enfermedades
de interés.
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
Ingeniería en Biotecnología
35
• Bisturí
• Asa de Drigalsky
• Vaso de precipitación 100mL
• Aguja de disección
• Pinza
• Placas Petri de vidrio
• Mechero de alcohol
5.2 REACTIVOS
Etanol 70%
Etanol 99%
Cloro
Agua destilada
Agar Nutritivo
PDA
5.3 EQUIPOS
Cámara de flujo laminar
Estereomicroscopio
Incubadora
6 METODOLOGÍA
Para un aislamiento indirecto del patógeno se hace una desinfección superficial en el
material vegetal (tomando una parte con síntomas y otra sana) con cloro, etanol 70% y 3
lavados con agua estéril, se procede a sembrar en el medio de cultivo. Para el aislamiento
directo se observan esporas en el estereomicroscopio se toman con la aguja de disección y
se las coloca en el medio de cultivo.
7 RESULTADOS
Colocar las fotos de los patógenos aislados y su identificación.
8 DISCUSIÓN
Discutir en función de los microorganismos hallados y del cultivo que atacan.
9 BIBLIOGRAFÍA
Cifuentes, D. (1990). Prácticas de patología vegetal. Murcia: EDITUM.
Trigos, Á., Ramírez, K., & Salinas, A. (2008). Presencia de hongos fitopatógenos en frutas
y hortalizas y su relación en la seguridad alimentaria. Revista mexicana de micología,
28(SPE.), 125–129.
Ingeniería en Biotecnología
36
PRÁCTICA DE LABORATORIO # 13
1. TEMA: Producción cerveza, Vino y Yogurt
2. IDENTIFICACIÓN:
Asignatura: Microbiología
Sigla: IBT502
Período: 2018-1
Paralelos: 1 y 2
Sesiones: 2
Profesor: Blgo. Carlos Andrés Bastidas MSc.
3. OBJETIVOS
a. OBJETIVO GENERAL:
Observarla utilización de microorganismos en la industria alimenticia
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Producir cerveza, vino y yogurt
4. FUNDAMENTO TEÓRICO
Los seres humanos han elaborado alimentos, como el pan, el yogurt o el vino, mediante
procesos de fermentación desde hace miles de años. Evidentemente, en el pasado no se
conocía el papel que ejercen los microorganismos en los procesos de obtención de los
alimentos fermentados. Fue Louis Pasteur, en la segunda mitad del siglo XIX, quien
descubrió la implicación de los microorganismos en estas técnicas. El trabajo de Pasteur
revolucionó la tecnología de la elaboración de los alimentos fermentados, permitiendo la
exclusión de microorganismos que pudieran contaminar el proceso de fermentación y la
selección de las cepas más eficientes.
En el sentido biológico, la fermentación es un proceso de transformación, en condiciones
anaeróbicas (ausencia de oxígeno), de moléculas orgánicas en alcohol, ácido láctico y gases
mediante la acción de ciertas bacterias y levaduras (Madigan, Martinko & Parker, 2009). .
5. MATERIALES Y REACTIVOS
5.1 MATERIALES
• Vaso de precipitación 100mL
• Erlenmeyer 1000mL
• Papel aluminio
5.2REACTIVOS
Etanol 70%
Ingeniería en Biotecnología
37
Etanol 99%
Azúcar
Agua destilada
Yogurt natural
Leche
Frutas
Malta
Lúpulo
5.3 EQUIPOS
Incubadora
6 METODOLOGÍA
El yogurt se hace a través del proceso de fermentación (láctica) de la leche con bacterias
compatibles, en general Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Estas bacterias
se incorporan en la misma proporción y crecen a la vez alimentándose de lactosa, el azúcar de la
leche.
Durante el proceso de fermentación las bacterias metabolizan la lactosa produciendo ácido
láctico y el aroma y sabor característicos del yogurt.
Los ingredientes básicos para la elaboración de la cerveza son la malta, el lúpulo, el agua y la
levadura. A diferencia de la fabricación del vino, en la que mediante el prensado de la uva ya se
consigue un mosto con azúcares fermentables por la levadura, la elaboración de cerveza
requiere de unos procesos previos que permitan obtener este substrato.
Es necesario descomponer el almidón (un azúcar complejo) que contiene el cereal en azúcares
simples que puedan ser asimilados por la levadura. Para ello es necesario maltear y
posteriormente macerar el cereal malteado con agua a la temperatura adecuada. Esta
transformación la llevan a cabo unas enzimas contenidas en el grano de cereal llamadas
amilasas.
A continuación todo el mosto obtenido se calienta y se le añade la cantidad adecuada de lúpulo.
Durante esta cocción se esteriliza y se da amargor y aroma a la cerveza. Una vez enfriado el
mosto se introduce la levadura. La levadura más utilizada para la fabricación de cerveza es
Saccharomyces carlsbergensis, aunque también se puede utilizar Saccharomyces cerevisae
para obtener cerveza tipo ale. Este microorganismo llevará a cabo en ausencia de oxigeno el
proceso de fermentación alcohólica, y transformará así la maltosa del mosto en alcohol y dióxido
de carbono.
El mosto es el zumo de la uva resultante de su pisado, prensado, etc., o cualquier otra operación
que rompa los hollejos de las uvas y deje libre el líquido en ellas contenido.
Ingeniería en Biotecnología
38
La fermentación alcohólica es el proceso por el que los azucares contenidos en el jugo de la uva
o mosto se convierten en alcohol etílico. Para frenar la aparición de bacterias indeseables y otros
organismos limitantes de la fermentación.
Posteriormente se le añaden Saccharomyces cerevisae o Saccharomyces ellipsoideus. Estas
levaduras se alimentan de los azúcares contenidos en este jugo para crecer y fermentar. Tras
unos días de fermentación a la temperatura adecuada (los vinos blancos fermentan a
temperaturas relativamente bajas de 10º-15ºC y los vinos tintos a temperaturas mayores de 20º-
30ºC), se obtiene un producto final que pasará a un proceso de envejecimiento en el que se
produce una fermentación final que le proporciona el aroma y sabor característico.
7 RESULTADOS
Colocar las fotos de los resultados pH y especificaciones de cada uno.
8 DISCUSIÓN
Discutir en función de los resultados obtenidos y variables que influyen en la producción
9 BIBLIOGRAFÍA
Madigan, M., Martinko, J., &Parker, J. (2009). Biología de los Microorganismos. New Jersey. Estados
Unidos. Pearson Prentice Hall.