IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE Bacillus thuringiensis CON ...

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE Bacillus thuringiensis CON POTENCIAL CITOTÓXICO

Danithza Sirley Rojas Torres

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, Instituto de Biotecnología IBUN

Bogotá, Colombia

2019

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE Bacillus thuringiensis CON POTENCIAL CITOTÓXICO

Danithza Sirley Rojas Torres

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en ciencias- Microbiología.

Director (a):

Jairo Alonso Cerón Salamanca

Ph.D

Línea de Investigación:

Biología molecular de agentes infecciosos

Grupo de Investigación:

Biopesticidas

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, Instituto de biotecnología (IBUN)

Bogotá, Colombia

2019

A mis padres que me formaron y me llevaron

hasta donde estoy

Resumen y Abstract VII

Agradecimientos

A DIOS, por darme la oportunidad de culminar esta etapa de mi vida, a la UNIVERSIDAD

NACIONAL DE COLOMBIA, por brindar los instrumentos necesarios, espacios de

formación profesional con los más altos estándares de calidad y abrir grandes expectativas

en el campo de la ciencia.

Al grupo de investigación de Biopesticidas, Luisa Fernanda Velásquez y Luisa Fernanda

García y cada uno de los docentes, quienes desde su experiencia y saber aportaron lo

mejor de sí para ayudarme a el desarrollo de este proyecto de investigación.

A JAIRO ALONSO CERON mi asesor de tesis, de quien recibí una constante

retroalimentación; sus perspectivas, experiencia como investigador y calidez humana,

permitieron el logro de los objetivos propuestos.

A mis padres, JESUS ALIRIO ROJAS y FLOR EMILCE TORRES, quienes siempre me

han estado apoyando y motivando incondicionalmente para crecer todos los días como

persona, motivándome y haciendo de mí una mujer de lucha y poder así alcanzar el éxito

a nivel profesional. Sus miles de voces de aliento y sus sacrificios estarán en mi mente y

en mi corazón por siempre.

A mi abuelita Sofía Villalobos, quien siempre ha estado para animarme y darme aliento.

Es un motor para no desfallecer.

A Andrés Cardona y familia, por brindarme su apoyo, desde la parte social ya que han

compartido, experiencias y momentos significativos, en el transcurso de mi carrera.

A mis compañeros de Universidad, a todos y cada una de las personas quienes de manera

directa o indirecta contribuyeron a la consolidación de este logro, aportando ideas,

dedicando tiempo, apoyo moral e intelectual en este proceso.

VIII IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE Bacillus thuringiensis CON

POTENCIAL CITOTÓXICO

Resumen

Bacillus thuringiensis se caracteriza por producir proteínas Cry que tienen actividad contra

diferentes órdenes de insectos. Se encontró que este microorganismo produce proteínas

Cry sin actividad insecticida pero estas nuevas proteinas Cry denominadas parasporinas

o proteínas PS tienen actividad citotóxica frente a líneas celulares de cáncer y tienen baja

o nula actividad contra células sanas. En este estudio se evaluó 115 cepas nativas de

Colombia de Bacillus thuringiensis del cepario de Biopesticidas del Instituto de

Biotecnología de la Universidad Nacional que no tenían actividad insecticida para saber si

contenían estas proteínas PS. Se encontraron 8 cepas sin actividad hemolítica de las

cuales 3 tuvieron una actividad citotóxica frente a las líneas celulares PC-3 (Cáncer de

próstata) y MDA -MB231 (Cáncer de mama) considerándolas como posibles proteínas PS

con potencial citotóxico, a su vez se recomienda purificar previamente la proteína para

aumentar su actividad y secuenciar estas cepas para saber si se trata de una parasporina

reportada hasta la fecha.

Palabras clave: Bacillus thuringiensis, proteínas Cry, proteínas PS, PC-3 (Cáncer de

próstata) y MDA -MB231 (Cáncer de mama)

Contenido IX

Abstract

Bacillus thuringiensis is characterized by producing Cry proteins that have activity against

different orders of insects. It was found that this microorganism produces Cry proteins

without insecticidal activity, these new Cry proteins called parasporins or PS proteins, they

have cytotoxic activity against cancer cell lines and have low or no activity against healthy

cells. In this study, 115 wild Colombian strains of Bacillus thuringiensis were evaluated from

the Biopesticide of the Biotechnology Institute of the National University that did not have

insecticidal activity to know if they contained these PS proteins. 8 strains without hemolytic

activity were found, of which 3 had a cytotoxic activity against the cell lines PC-3 (prostate

cancer) and MDA -MB231 (breast cancer) considering them as possible PS proteins with

cytotoxic potential, in turn recommends to previously purify the protein to increase its

activity and sequence these strains to know if it is a parasporine reported to date.

Keywords: Bacillus thuringiensis, Cry proteins, PS proteins, PC-3 (prostate cancer) and

MDA -MB231 (Breast cancer)

Contenido XI

Contenido

1. Marco teórico y Antecedentes ................................................................................. 1 1.1 Bacillus thuringiensis .......................................................................................... 1 1.2 Proteínas Cry ..................................................................................................... 3 1.3 Parasporinas (PS) .............................................................................................. 5 1.4 Parasporina 1 (PS1). .......................................................................................... 7 1.5 Parasporina 2 (PS2). .......................................................................................... 9 1.6 Parasporina 3 (PS3). ........................................................................................ 11 1.7 Parasporina 4 (PS4). ........................................................................................ 12 1.8 Parasporina 5 (PS5). ........................................................................................ 13 1.9 Parasporina 6 (PS6). ........................................................................................ 14 1.10 Cáncer ............................................................................................................. 15

2. Justificación ........................................................................................................... 19

3. Pregunta de investigación e hipótesis.................................................................. 21

Identificar una proteína Cry parasporina que tenga actividad citotóxica contra la línea celular de MDA-MB231(Cáncer de mama) y/o PC-3 (Cáncer de próstata). ....... 21

4. Objetivos ................................................................................................................. 22 4.1 Objetivo General .............................................................................................. 22 4.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 22

5. Materiales y Métodos ............................................................................................. 23 5.1 Cepas bacterianas ........................................................................................... 23 5.2 Cultivo celular. .................................................................................................. 23 5.3 Solubilización de los cristales y activación de la proteína ................................. 24 5.4 Diseño de Primers ............................................................................................ 25

5.4.1 Alineamientos de las secuencias reportadas de PS ....................................... 25 5.4.2 Diseño y Análisis de Primers. ........................................................................ 25

5.5 Identificación de genes PS en Bt nativos por PCR .......................................... 26 5.6 Ensayo de citotoxicidad .................................................................................... 26 5.1 Actividad Hemolítica ......................................................................................... 26

6. Resultados y discusión ......................................................................................... 29 6.1 Cepas bacterianas ........................................................................................... 29

¡Error! Marcador no definido. 6.2 Diseño de Primers ............................................................................................ 30

6.2.1 Búsqueda y alineamientos de las secuencias reportadas de PS ................... 30

XII IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE Bacillus thuringiensis CON


6.2.3 Diseño y Análisis de Primers. ........................................................................ 33

6.3 Identificación de genes PS en Bt nativos por PCR ........................................... 38 6.4 Solubilización de los cristales y activación de la proteína .................................. 40 6.5 Actividad Hemolítica ......................................................................................... 42 6.6 Ensayo de citotoxicidad .................................................................................... 45

7. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 53 7.1 Conclusiones ....................................................... ¡Error! Marcador no definido. 7.2 Recomendaciones ............................................... ¡Error! Marcador no definido.

8. Referencias bibliográficas..................................................................................... 63

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura 1. Modelo de mecanismo de acción de las proteínas típicas insecticidas de los 3

dominios. (Toro., 2010). ................................................................................................... 4

Figura 2. Simulación de PCR in silico con los 6 pares de primers diseñados, amplifican

solo el ADN template que se quería y una sola región mostrándonos estabilidad y

especificidad .................................................................................................................. 36

Figura 3. Análisis electroforético teórico de Gel de Agarosa al 1% con los productos de

PCR realizados simulada in silico en el programa SnapGene donde en el primer pozo se

ubicó el marcador, pozo 2: PS1, pozo 3: PS2, pozo 4: PS3, pozo 5: PS4, pozo 6: PS5,

pozo 7: PS6, se puede observar su amplificación con sus respectivos pesos moleculares

....................................................................................................................................... 37

Figura 4. Análisis electroforético de Gel de Agarosa al 3% con los productos de PCR,

pozo número 1: Cepa 1 (HD1) control negativo, pozo número 2: Cepa 2 (4R2) control

positivo, pozo número 10: Marcador de peso molecular. Pozo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11,12,13:

diferentes muestras control. Se repite este procedimiento hasta analizar las 115 cepas de

estudio. Solo se observa amplificación de control positivo. ............................................ 39

Figura 5. Electroforesis SDS-PAGE de las cepas 2, 23, 68 y 79 con las cuales se

llegarán con ellas hasta el último procedimiento de este ensayo. ................................... 41

Contenido XIV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Clasificación y características de proteínas PS. (Velásquez et al., 2018) ............ 7

Tabla 2 Listado de cepas utilizadas en el estudio y controles: Control negativo de

parasporinas PS cepa N° 1 (HD1), control positivo de parasporina PS2 cepa N° 2(4R2).

Control positivo de hemolisis cepa N° 118 (Bt israeliensis). ............................................ 29

Tabla 3. Secuencias reportadas en GenBank y su respectivo número de acceso .......... 30

Tabla 4. Características de los primers diseños .............................................................. 34

Tabla 5. Promedio de absorbancias concentración 500 μg/mL de las 115 cepas y cepas

control ............................................................................................................................. 43

Tabla 6. Promedio de absorbancias concentración 250μg/mL de las 8 cepas sin

actividad hemolítica que se observan en la tabla 5. Se les realizo esta prueba a las 115

cepas, a continuación, se muestran solo los datos de las cepas con las que se continuara

la investigación para mayor facilidad más las cepas control, cepa número 2: control

positivo de la parasporina PS2, cepa número 1: control negativo de la parasporina PS,

cepa número 118: control positivo de cepa hemolítica. ................................................... 44

Tabla 7. Promedio de absorbancias a una concentración de 125μg/mL de las 8 cepas

sin actividad hemolítica que se observan en la tabla 5 y cepas control. Se les realizo esta

prueba a las 115 cepas esta prueba, a continuación, se muestran solo los datos de las

cepas con las que se continuara la investigación para mayor facilidad. .......................... 44

Tabla 8. Porcentaje de supervivencia ± ESM en las líneas celularesPC-3 y MDA -MB231

frente al control positivo Bacillus thuringiensis subespecie israeliensis ........................... 46

Tabla 9. Porcentaje de supervivencia para las líneas celulares PC-3 y MAD-MB231

frente a las 8 proteínas de las cepas no hemolíticas a 4 concentraciones diferentes. ..... 50

Tabla 10. Porcentaje de supervivencia ± ESM del Buffer de carbonatos con proteinasa K

....................................................................................................................................... 46

Tabla 11. Resultados de citotoxicidad expresados en valores de Concentración efectiva

media (CE50) para las líneas celulares MAD-MB231 y PC-3 frente a las proteínas de IC50

menor a 100μg/mL y su control positivo de parasporina PS2. ......................................... 51

Introducción

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram positiva, mide aproximadamente de 3 a 5

µm de largo por 1 a 1,2 µm de ancho, es aerobia estricta, quimioorganótrofa (Sauka &

Benintende, 2008) y es considerada como una bacteria ubicua ya que se ha aislado de

diferentes lugares como: suelo, agua, hojas de plantas, insectos muertos, telarañas, heces

de vaca, etc. (Soberón & Bravo, 2011).

Bacillus thuringiensis se caracteriza de las demás especies de Bacillus por contener un

cuerpo de inclusión conocido como cristal, (Schnepf et al., 1998), estos cristales son de

diferentes formas geométricas y pueden representar hasta un 30% del peso seco del

esporangio (Sauka & Benintende, 2008), se producen durante la fase de esporulación y

están constituidos por proteínas denominadas δ-endotoxinas, responsables de la actividad

toxica (Bravo & Cerón, 2004).

Existen dos familias principales de δ-endotoxinas: las proteínas Cyt vienen de la palabra

Cytolytic en inglés y las proteínas Cry vienen de la palabra Crystal (Ammons et al., 2016;

Bravo & Cerón, 2004). Estas proteínas se clasifican con base al porcentaje de identidad

determinado por la secuencia de aminoácidos (Periyasamy et al., 2016).

Las proteínas Cry y Cyt son ingeridas por las larvas y se vuelven solubles en el intestino

del insecto antes de insertarse en la membrana apical de las células del intestino medio

del insecto. Las toxinas Cry y Cyt pertenecen a una clase de toxinas bacterianas conocidas

como toxinas formadoras de poros (TFP) que, en general, se describen como proteínas

que experimentan cambios conformacionales para insertarse en la membrana de sus

2 Introducción

huéspedes, creando poros que interrumpen la homeostasis iónica y destruyen las células

diana. (Soberón et al., 2013). Existen dos grupos principales de TFP: i) TFP-α, ii) TFP-β.

Las toxinas Cry de tres dominios se encuentran en el primer grupo (TFP-α), estas tienen

una parte dentro de su estructura primaria formada de α -helices que son responsables de

la formación de poro. Por el contrario, las toxinas Cyt se encuentran en el segundo grupo

TFP-β ya que forman el poro con sus estructuras de hojas plegadas- β. Los cambios de

pH y las interacciones de receptores específicos de sus hospederos como la cadherina en

lepidópteros están asociados a la acción insecticida de estas toxinas.

Las toxinas Cyt son toxicas para la orden diptera, particularmente moscas y mosquitos.

Estos insectos causan millones de muertes en el mundo ya que son vectores importantes

de diferentes enfermedades humanas como la malaria, la fiebre amarilla, el dengue y la

filariasis linfática. Aunque las toxinas Cyt no son tóxicas para las principales plagas de

lepidópteros, algunas toxinas Cyt pueden matar larvas de coleópteros, como Cyt1Aa, que

es tóxica para Chrysomela scripta y Cyt2Ca, que es tóxico para Leptinotarsa decemlineata

y Diabrotica spp (Soberón et al., 2013). También cabe resaltar que esta toxina tiene

actividad hemolítica (Xu et al., 2014) y se clasifica actualmente en 3 grupos genéticamente

diferentes, Cyt 1, Cyt 2 y Cyt 3 (Crickmore et al., 2016).

Las proteínas Cry son específicamente tóxicas para la mayoría de las órdenes de insectos,

como dipteran, coleóptero y lepidóptero, han hecho que Bacillus thuringiensis sea un

agente biológico ambientalmente sano y se haya convertido en uno de los insecticidas

microbianos más eficaces e importantes para el control de plagas de insectos (Xu et al.,

2014).

Las investigaciones en todo el mundo de cepas de Bt han revelado la prevalencia de

proteínas Cry que, a pesar de tener morfologías asociadas a una toxicidad específica

Introducción 3

contra insectos, no parecen poseer dicha actividad. Se han realizado estudios para la

identificación de estas nuevas proteínas, y se han caracterizado como proteínas no

hemolíticas y no insecticidas (Periyasamy et al., 2016), estas proteínas las denominaron

parasporinas o proteínas PS, ellas presentan actividad anticancerígena con acción

selectiva (Mizuki et al., 2000), es decir tienen actividad contra células cancerosas y baja o

casi nula actividad contra células sanas (Espino, 2014). Estas proteínas se han clasificado

basándose en la homología de aminoácidos. Hasta la fecha se han identificado un total de

19 PS y se han clasificado en seis niveles de primer rango (PS-1 a PS-6) por el “Committee

of Parasporin Classification and Nomenclature” (Okumura et al., 2013). Se cree que todos

los grupos de parasporinas no tienen el mismo mecanismo de acción, las PS1 según

investigaciones actúan por actividad vía apoptótica (Katayama et al., 2009) mientras que

el modo de acción de la PS2 es por medio de la formación de poros (Kitada et al., 2007;

Periyasamy et al., 2016). Algunos estudios demostraron que estas proteínas parasporales

tienen actividad citotóxica para una línea celular específica, es decir, no todas las

parasporinas tienen acción citotóxica para todos los tipos de cáncer ya que se sabe que

podría haber posible mecanismo de selectividad (Periyasamy et al., 2016).

Las diferentes parasporinas fueron aisladas principalmente de Japón (Uemori et al., 2008),

Vietnam (Yasutake et al., 2008), Malasia (Nadarajah et al., 2008) e India (Periyasamy et

al., 2016); y recientemente se han encontrado cepas productoras de parasporinas en el

continente americano, específicamente en islas del Caribe (Gonzales et al., 2011), y

México (Espino et al., 2012).

1. Marco teórico y Antecedentes

1.1 Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis es una bacteria aislada por primera vez en Japón, de larvas del

gusano de seda Bombyx mori, aerobia, Gram positiva, formadora de esporas (Lenina et

al., 2014). Durante su ciclo de vida presenta dos fases principales: crecimiento vegetativo,

donde las bacterias se duplican por bipartición, y esporulación, un programa de

diferenciación de bacteria a espora. Bacillus thuringiensis es considerada una bacteria

ubicua, se encuentra principalmente en el suelo (Soberón & Bravo, 2007). Es aerobia,

quimioorganótrofa y catalasa positiva, posee la capacidad de fermentar glucosa, fructosa,

trealosa, maltosa y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno, esculina y N-acetil-

glucosamina. (Sauka & Benintende, 2008). Pertenece a la familia Bacillaceae y se ubica

dentro del grupo 1 del género Bacillus que incluye otras 5 especies: B. cereus, B. anthracis,

B. mycoides, B. pseudomycoides, B. subtilis y B. weihenstepHanensi. (Xu et al., 2014).

Bacillus thuringiensis se encuentra estrechamente relacionado con los dos primeros, de

los que no logran distinguirse por completo debido a que no existen suficientes diferencias

en sus características morfológicas y bioquímicas. (Xu et al., 2014). La individualidad de

esta especie se basa por que Bacillus thuringiensis produce un cuerpo de inclusión,

llamado cristal, además de las esporas que producen las otras especies de Bacillus. Se

sabe que hay una relación entre la esporulación y la aparición de dicho cristal. Existen 7

2 Marco Teórico y Antecedentes

etapas que definen los cambios morfológicos que ocurren durante la esporulación de Bt: i)

Etapa I, la célula deja de crecer, se forma un filamento axial de la cromatina. ii) Etapa II,

se distingue por una mitosis asimétrica que permite la formación de dos tipos de células,

la pre-espora y el esporangio. El filamento de la cromatina se separa en dos cromosomas.

Formación del septo de la pre-espora. iii) Etapa III, se produce un hundimiento del septo,

a medida que el proceso de esporulación avanza, se forman las 2 membranas (interna y

externa) de la pre-espora con polaridades diferentes. El cristal de Bt en esta etapa empieza

a ser visible. IV) Etapa IV, surge la pared de la célula y se forma el córtex entre la

membrana interna y externa. El citoplasma comienza a deshidratarse. Mientras se sintetiza

el exosporio empieza a incorporarce las SAPs (“small acid-soluble proteins’) y el

dipicolinato de calcio. V) Etapa V, la espora está rodeada completamente por el exosporio.

Todas las características de resistencia físicas y químicas de la espora son debido a estas

dos capas protectoras (pared y exosporio). VI) Etapa VI, la espora termina de madurar y

cristal de Bt ha llegado a su máximo tamaño. VII) Etapa VII, permite la liberación de la

espora y el cristal gracias a la lisis del esporangio. (Bravo & Cerón, 2004). Estos cristales

pueden presentar distintas morfologías, pueden ser bipiramidales, romboédricos, cúbicos,

cuadrados, esféricos, y otras formas atípicas menos frecuentes. Se compone, de una o

varias toxinas de naturaleza proteica llamadas δ-endotoxinas. Existen dos familias de δ-

endotoxinas: Las proteínas Cyt (por su palabra Cytolitic en inglés), proteínas hemolíticas y

las proteínas Cry (por su palabra Crystal) (Bravo & Cerón, 2004), que son altamente

específicas y toxicas para diferentes órdenes de insectos como: lepidópteros (mariposas

y polillas), dípteros (moscas y mosquitos), coleópteros (escarabajos y gorgojos), y algunas

otras ordenes como: Hymenoptera, Orthoptera, Hemiptera, Isoptera, MallopHaga,

Thisanoptera, y algunas plagas, como nemátodos y ácaros (Xu et al., 2014). Esto hizo que

Bacillus thuringiensis se convirtiera en un agente microbiano prometedor en el control de

Introducción teórico y antecedentes 3

plagas de insectos en agricultura, silvicultura, veterinaria (Lenina et al., 2014) y en la base

del insecticida biológico más difundido a nivel mundial. (Sauka & Benintende, 2008)

1.2 Proteínas Cry

Las proteínas Cry tienen una estructura tridimensional de tres dominios y está relacionada

con su actividad insecticida. El dominio I consiste en una estructura constituida por siete

α-hélices (hidrofóbicas y anfipáticas), donde una hélice central está rodeada por las otras

6. Se considera que este dominio es responsable de la formación de poros en el epitelio

intestinal del organismo susceptible (Bravo & Cerón, 2004). El dominio II tiene tres láminas

de estructura β antiparalelas. Este dominio es el encargado de presentar afinidad hacia los

receptores del epitelio del intestino del insecto (Bravo & Cerón, 2004). El dominio lll

consiste de dos láminas β antiparalelas dobladas formando un β sándwich, está

relacionado en la integridad estructural de la toxina ante la proteólisis en el intestino del

organismo susceptible, participa en la unión al receptor, inserción en la membrana celular

y en la formación de canales iónicos que generan desbalance osmótico, lo cual causa

muerte celular. (López, 2011).

El intestino medio de la mayor parte de las larvas de insectos susceptibles a las toxinas

Cry (lepidópteros, dípteros y algunos grupos de coleópteros) se caracteriza por su pH alto

(alcalino). Al momento en que la larva digiere los cristales producidos por Bacillus

thuringiensis gracias al ambiente del intestino se rompen los puentes disulfuro que son

abundantes en la mitad C-terminal de las proteínas Cry de 130 kDa y por acción del pH

alcalino que se encuentra dentro de este se solubilizan los cristales liberando la protoxina,

para que esta sea activada debe ser procesadas por las proteasas del intestino medio de

los insectos liberando el fragmento tóxico. Puede generalizarse que el procesamiento


típico de las toxinas Cry1 se da por el corte de los primeros veintiocho residuos del extremo

N-terminal en un sitio conservado y de los últimos 500 residuos del extremo C-terminal,

quedando de esta forma un fragmento resistente a proteasas de entre 55 y 65 kDa que se

le denomina toxina. (Bravo et al., 2007). Esta toxina tiene alta afinidad hacia receptores

específicos como cadherinas, alcalino fosfatasas (ALP) y Aminopeptidasas N (APN)

presentes en las microvellosidades celulares del intestino del insecto. Esta especificidad

hacia los receptores es la que le confiere esa acción selectiva a la toxina Cry por cierta

orden de insectos (Figura 1). La inserción conlleva a la formación de poros que permiten

el paso de iones y agua, proceso que provoca un desequilibrio osmótico y por lo tanto lisis

celular lo cual causara muerte del insecto (Toro, 2010)

Figura 1. Modelo de mecanismo de acción de las proteínas típicas insecticidas de los 3 dominios. (Toro, 2010).

Es notable que los aislamientos de proteínas Cry no insecticidas con frecuencia

representan más del 90% de las poblaciones naturales de los suelos (Lenina et al., 2014;

Ohba et al., 1996), esto hace que se plantee si tales inclusiones sin esta actividad tienen

alguna actividad biológica aún no descubierta (Ohba et al., 1988). En años más recientes,

el estudio de las proteínas Cry no insecticidas, ha ido aumentando ya que Mizuki y


colaboradores en 1999 encontraron proteínas Cry con actividad citotóxica frente a líneas

celulares de cáncer discriminando células no tumorales (células sanas), las cuales podrían

llegar a ser de alto impacto para la salud (Mizuki et al., 2000 & Periyasamy et al., 2016 )

Esto hace que se establezca una nueva categoría de proteínas Cry, denominadas

parasporinas (PS), las cuales fueron definidas como un grupo de proteínas Cry sintetizadas

por Bacillus thuringiensis que no presentan actividad hemolítica ni insecticida, pero

presentan actividad específica contra células cancerígenas. (Mizuki et al., 2000).

1.3 Parasporinas (PS)

Las parasporinas (PS) son un nuevo grupo de proteínas Cry sintetizadas por Bacillus

thuringiensis, que presentan actividad biológica específica contra células de cáncer y

tienen baja o nula actividad hacia células no tumorales (Mizuki et al., 2000).

Las parasporinas (PS) son sintetizadas como protoxinas, semejante a lo que se explicaba

en el anterior numeral con las proteínas Cry insecticidas, para adquirir su forma tóxica o

toxina, primero necesitan ser solubilizadas a pH alcalino (Mizuki et al 2000) o ácido y

posteriormente in vitro ser digeridas por proteasas, como la proteínasa K (Ohba et al.,

2009; Okumura et al., 2006; Espino, 2014). Para las parasporinas Ps1 y Ps6 la digestión

ocurre en el N- terminal, para la parasporinas Ps4 y Ps5 la digestión ocurre en C-terminal,

y para las parasporinas Ps2 y Ps3 ocurre en ambos extremos (Ohba et al., 2009)

Hasta la fecha se han identificado un total de 19 PS y se han clasificado en seis grupos

(PS1 a PS6) por el “Committee of Parasporin Classification and Nomenclature” como se

puede observar en la tabla 1 (Velásquez et al., 2018).

La parasporina PS1 es rica en serina y leucina, las parasporinas PS2 y PS5 son ricas en

treonina y serina, la parasporina PS3 es rica en asparagina y leucina, la parasporina PS4


es rica en treonina y glicina y la parasporina PS6 es rica en asparangina e isoleucina (Aktar

et al 2019).

Las parasporinas (PS) de mayor peso molecular son PS1 (Cry31), PS3 (Cry41) y PS6

(Cry63), tienen relación estructural con las proteínas Cry insecticidas, ya que su estructura

está conformada por los tres dominios. Al ser activada la proteína con proteinasa K, su

toxina puede estar constituida por dos fragmentos de distinto peso molecular (Espino,

2014). La parasporina PS3 tiene una fracción adicional conformada por un dominio similar

al que posee la fitotoxina ricina (Palma et al., 2014). Las parasporina PS2 (Cry46), PS4 (

Cry 45) Y PS5 (Cry64) tienen menor peso molecular y no tienen tanta relación con las

proteínas Cry clásicas en su estructura de 3 dominios, pero estan relacionadas con la

estructura de otras especies, ejemplo, la parasporina PS2 tiene similitud con la toxina

aerolisina, la PS4 y PS5 son toxinas Mtx similares a la toxina épsilon producida por

Clostridium perfringens cuyo mecanismo de muerte celular involucra la oligomerizacion de

la toxina en la membrana lipídica de las células formando poros (Espino, 2014 & Palma et

al., 2014).

El mecanismo de acción de las diferentes clases de parasporinas todavía se encuentra en

estudio y las hipótesis sobre estas todavía varían como sucedió con la pasasporina PS2

la cual se creía que su mecanismo de acción no estaba asociado la vía apoptótica, pero

en estudios realizados en el año 2015 indican que el mecanismo de esta parasporina si

está asociado a este.


Tabla 1. Clasificación y características de proteínas PS. (Velásquez et al., 2018)

1.4 Parasporina 1 (PS1).

La parasporina PS1Aa1 (Cry31Aa1) fue la primera toxina PS identificada. Como protoxina

es un polipéptido de 81 kDa, cuya secuencia aminoacídica contiene los cinco bloques

conservados, comúnmente descritos para las proteínas Cry insecticidas y se infiere que la

estructura de estas toxinas es característica de los tres dominios de proteínas Cry. Sin

embargo, la identidad en la secuencia de aminoácidos de PS1Aa1 con respecto a las

proteínas Cry y Cyt bioinsecticidas es menor del 25 % (Velásquez et al., 2018).

En 1999 Mizuki y colaboradores encontraron que esta proteína presentaba actividad

citotóxica contra líneas celulares de Leucemia (MOLT-4), Cáncer de pulmón humano

(A549) y cáncer de cuello uterino humano (Hela), y era capaz de discriminar entre las


células no tumorales ya que no presentaban actividad ante ellas (Mizuki et al., 1999). En

el 2000 este grupo de investigadores clonaron y secuenciaron por primera vez el gen

Cry31Aa1 de la cepa 84-HS-1-11, demostrando que al tratar esta proteína de 81 kDa con

las proteasas tripsina y proteínasa K, se obtienen 4 proteínas con pesos moleculares de

66, 58, 56 y 44 kDa, que son las responsables de la actividad citotóxica preferencial contra

células con leucemia (García R, 2007).

Debido a que la citotoxicidad se lee por medio de absorbancia se puede observar como

cada tipo de parasporina por más de que sea citotóxica tiene mayor afinidad o mayor grado

de citotoxicidad hacia algunos tipos de cáncer específicos. Se sugiere que esta actividad

selectiva es por el reconocimiento de un receptor específico entre la toxina y las células

blanco (Velásquez et al., 2018).

Se ha identificado que las parasporinas PS1 ejercen efectos citotóxicos altos contra ciertas

líneas celulares especificas tales como las tipo HeLa (Ito et al., 2004), MOLT-4 (leucemia

de células T) (Katayama et al., 2007) y HL60 (Kitada et al., 2006), así mismo tienen un

efecto citotóxico moderado hacia células Sawano (células de cáncer endometrial), HepG2

(células de cáncer de hígado) y nula actividad tóxica contra células T obtenidas de tejidos

normales y líneas celulares MRC-5. (Velásquez et al., 2018). Katayama y colaboradores

en el año 2006 evidencian que el mecanismo citotóxico de la parasporina PS1 por más de

que tiene relación con la estructura típica de los tres dominios de las proteínas Cry

insecticidas de Bacillus thuringiensis parece diferir en su mecanismo de acción de toxinas

formadoras de poros de membrana (TFP). Ya que ellos observan un efecto inicial inusual

de aumento de 𝐶𝑎2+ extracelular y cuando ellos disminuyen las concentraciones

extracelulares de esta baja la citotoxicidad de la parasporina sugiriendo que el exceso

extracelular de 𝐶𝑎2+ resulta en la muerte por apoptosis de la célula diana (Katayama et al.,

2007). Este mismo grupo de investigadores en el año 2011 identifican y patentan la


molécula beclina -1 como receptor de PS1Aa1; indicando que este receptor es una

proteína que en células normales actúa intracelularmente en procesos como la autofagia

y apoptosis, pero en las células HeLa está localizada de forma extracelular (Velásquez et

al., 2018). Actualmente se han reportado 11 clases de parasporina 1 (Ps1) por el

“Committee of Parasporin Classification and Nomenclature”


En el año 2004 Ito y colaboradores realizaron un tratamiento de la inclusión parasporal de

la cepa A1547 de Bacillus thuringiensis con proteínasa K y midieron sus efectos citotóxicos

sobre células MOLT-4 utilizando el ensayo MTT (Ito et al., 2004).Esta proteína tiene una

masa molecular de 37kDa, 1017 nucleotidos, 338 aminoacidos en su forma nativa, al ser

tratada con la proteinasa K, obtuvieron una proteína con un peso de 30 kDa a la cual se le

asoció su actividad toxica. Se evidencia que sin realizar esta activación con proteínasa K

estas proteínas no muestran ningún tipo de actividad citotóxica. Esta proteína codifica un

polipéptido de 338 residuos de aminoácidos y no posee bloques conservados Cry, ni la

estructura típica de tres dominios clásicos (Okumura et al., 2005), identificando así una

nueva proteína Cry del grupo de las parasporinas llamada actualmente Ps2Aa1. Así mismo

en este estudio se dieron indicios por primera vez del mecanismo de acción de esta

parasporina podría ser por medio de formación de poro y se observó que parecía no estar

asociada a apoptosis como la parasporina PS1(Ito et al., 2004)

Es importante señalar que la proteína Cry15Aa tiene alta identidad con toxinas

mosquitocidas (Mtx2 y Mtx3) de Bacillus sphaericus (de Maagd et al., 2003); a las cuales

se les ha reconocido su similitud con la toxina aerolisina de Aeromonas hydrophila, toxina


bacteriana reconocida como β-formadora de poros (TFP) (Akiba et al., 2009). Esto sugiere

que un posible mecanismo de acción para la parasporina PS2 podría ser por TFP (toxinas

bacterianas formadoras de poro), como las toxinas Cry insecticidas B. thuringiensis. (Akiba

et al., 2009)

Se creía que una proteína anclada a Glycosylphosphatidylinositol (GPI) parecía estar

implicada en la acción citotóxica de la parasporina PS2Aa1 y que la formación de poros

daba como resultado alteraciones de las estructuras del citoesqueleto, fragmentación de

los orgánelos, alteraciones de la morfología celular tales como hinchamiento celular y

finalmente lisis celular. Todo señalaba que el modo de muerte celular parecía no ser

apoptótico, pero esta hipótesis no fue confirmada. Por lo tanto, la caracterización adicional

de los eventos intracelulares implicados durante la muerte celular ocasionada por

parasporina PS2Aa1 fue obligatoria para confirmar si la apoptosis estaba o no implicada.

(Brasseur et al., 2015)

Brasseur y colaboradores en el año 2015 estudian una cepa adicional de B. thuringiensis

llamada Bt 4R2 que contiene el gen que codifica la proteína Cry46Aa1 (PS2Aa1) para

identificar los mecanismos implicados en la inducción de muerte celular. Encontraron que

la parasporina PS2Aa1 era citotóxica para muchas células cancerosas in vitro. Ellos

estudian esta cepa (4R2) para explorar más el mecanismo de acción, utilizando células

cancerosas seleccionadas de diferentes tejidos (HepG2-cáncer de hepatocito, PC-3-

cáncer de próstata y MCF-7-cáncer de mama) encontraron que al tratar esta parasporina

con proteinasa K, la muerte celular no solo se induce por formación de poros como en

estudios previos se había descrito, sino que también activa la vía de la apoptosis. Estos

investigadores observaron cambios morfológicos y por uso de Western blot en la ruptura

proteolítica de PAPP-1, caspasa-3 y caspasa-9 en líneas celulares de cáncer

exclusivamente, indicativo de muerte celular relacionada con apoptosis. Los análisis de


citometría de flujo, utilizando yoduro de propidio y anexina V, así como un ensayo de

caspasas 3/7 confirmaron la inducción de apoptosis. Se realizaron análisis adicionales

para estudiar las vías de supervivencia, incluidos AKT, XIAP, ERK1 / 2 y PAR-4. Estos

resultados indicaron que la parasporina-2Aa1 es una proteína citotóxica selectiva que

induce la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer humano de diversos tejidos y no

muestra toxicidad para las líneas celulares normales (IOSE-144, HIESC, HIEEC y MCF-

10A). (Brasseur et al., 2015)

Existen actualmente 3 tipos de parasporinas 2: Ps2Aa1 (cepa A1547 y 4R2), Ps2Aa2 que

se encuentran en revisión por el “Committee of Parasporin Classification and Nomenclature

“y Ps2Ab1 (cepa A1470) un polipéptido de 304 residuos de aminoácidos con un peso

molecular previsto de 33kDa, que muestra 84% de identidad con parasporina PS2Aa1. La

actividad citotóxica se asocia con una proteína con una masa molecular de 29 kDa. La

parasporina PS2Ab activada muestra citotoxicidad frente a las células MOLT-4 y Jurkat.

(Hayakawa et al., 2007)


Esta parasporina es sintetizada por la cepa A1462, fue aislada de los suelos de Tokio en

Japón por Yamashita et al., 2005, presenta una masa molecular de 88 kDa en su forma

nativa y hasta la fecha se conocen dos tipos de parasporina del grupo 3 o PS 3, conocidas

como Cry41Aa1 y Cry41Ab1. Estas proteínas al ser digeridas con proteínasa K, generan

tres fragmentos, en donde el más grande, corresponde a la toxina de 64 kDa. La secuencia

de aminoácidos de las PS3 de la cepa A1462 tienen una considerable similitud a las toxinas

Cry1 insecticidas de Bt, ya que estas poseen dominios conservados de la estructura típica

de los tres dominios. Las dos toxinas tienen una citotóxicidad preferencial contra las líneas


celulares de cáncer de leucemia mieloide (HL60) y células de cáncer de hígado (HepG2).

La PS 3 se encuentra en el segundo gen (ORF2) en un operón de tres genes, similar a lo

que ocurre con varias toxinas de Bt. (Garcia R, 2017, Krishnan, 2013)


La PS4Aa1 fue aislada de la cepa A1470 de Bacillus thuringiensis serovar shandongiensis,

es una proteína de 30 kDa en su forma nativa y de 27 kDa en su forma tóxica. La PS4 es

una proteína citotóxica que presenta homología con la secuencia de la toxina Épsilon (ETX)

(21%) y con la toxina Aerolisina (10%), similar a lo observado en el grupo de las

parasporinas PS2 y no posee los bloques conservados de Cry, ni la estructura típica de

tres dominios (Okumura et al., 2005; Espino, 2014; Velásquez et al., 2018). Es la única

parasporina que ha sido estandarizada a pH ácido, ya que tras ser solubilizada en HCl 10

mmol, se observó un incremento del 25% en su actividad citotóxica hacía varias líneas

celulares, en comparación a su actividad tras la solubilización en buffer de carbonatos. Se

ha observado que la protoxina de la parasporina 4 puede ser activada o tratada tanto con

proteínasa K como con Pepsina (Espino, 2014).

Fue reportado en el 2014 por Xu y colaboradores que la parasporina 4 muestra una alta

citotoxicidad frente a células de cáncer humanas in vitro, tales como MOLT-4, CACO-2

(cáncer de colon humano), Sawano, TCS (cáncer de cuello uterino humano), y HL60. La

parasporina 4 se une inespecíficamente a la membrana plasmática, formando un complejo

de poro oligomérico en células diana, durante este proceso, muestra independencia del

colesterol (Xu et al., 2014). Así mismo, se han realizado ensayos que permitieron medir la

liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) y la internalización de dextranos de diferentes

pesos moleculares, observándose la permeabilización de la membrana de células MOLT-


4 y baja activación de las caspasas afectoras 3/7, sugiriendo que el mecanismo de muerte

celular para esta parasporina puede ser por medio de necrosis (Okumura et al., 2011;

Velásquez et al., 2018)


La parasporina PS5Aa1 fue aislada y purificada de la cepa tohokuensis A1100 de Bacillus

thuringiensis por primera vez en Japon. Presenta una masa molecular de 33.8 kDa en su

forma inactiva (protoxina) que al ser tratada con proteinasa K genera una toxina de 29.8

kDa. La parasporina PS5 no muestra identidad con los otros grupos de parasporinas, pero

muestra identidad con las proteínas Cry del Bacillus thuringiensis y las toxinas aerolisinas

del tipo β-formadoras de poros (β-TFPs). También se pudo determinar que la parasporina

PS5 contiene un dominio conservado similar al de la toxina épsilon producida por

Clostridium perfringens (Ekino et al., 2014), Aktar et al 2019 confirman la hipótesis de que

a pasasporina PS5 podría ser una proteína β-PFT que luego de ser tratada con proteinasa

K, tras la activación, se unen a una molécula receptora específica y se oligomeriza para

formar poros y aumentar la permeabilidad celular y lisar la célula (Aktar et al 2019), hasta

la fecha se sabe muy poco sobre el mecanismo de acción de esta parasporina.

Ammons y colaboradores en el 2015 aislaron 10 cepas de Bt de la isla caribeña de Trinidad

y en 5 de estas cepas aisladas de estiércol recogido directamente del recto del ganado

encontraron dos nuevas parasporinas en estudio llamadas por el momento PS5-1 Y PS5-

2, al realizar un alineamiento de estas dos nuevas parasporinas se observa que son 51%

homólogas entre sí y tienen similitud con la PS5Aa1 de 41% y 45% respectivamente, así

mismo por su bajo nivel de homología de aminoácidos podrían indicar que se trate de otra

nueva clase de parasporina o expandir el nivel de diversidad dentro de la actual clase


parasporina 5, es algo que hasta la fecha se encuentra en estudio por el “Committee of

Parasporin Classification and Nomenclature” (Ammons et al., 2016).


A partir de la cepa M019 de Bt, se aisló la parasporina 6 (toxina CP84), que exhibe 56,4%

de porcentaje de identidad con la toxina Cry1 de los tres dominios. Aunque esta

parasporina puede tener regiones peptídicas adicionales en el tercer dominio, pero todavía

esto no está muy claro ya que se conoce muy poco sobre el mecanismo de acción de esta

parasporina pues se ha estudiado muy poco. (Krishnan, 2013). Aktar et al 2019 observan

que una vez la parasporina PS6 ha sido activada, se une a la molécula receptora y aumenta

la síntesis intracelular de Ca2 +, proteínas y ADN, seguido de la formación de vacuolas.

Como resultado, se produce una inflamación celular que conduce a la degradación de la

proteína relacionada con la apoptosis (Procaspase-3 y Poly ADP-ribosa polimerasa) y la

apoptosis de las células. La parasporina 6 muestra citotoxicidad preferencial hacia las

células HepG2 y HeLa, con CL50 a 2,3 μg / mL y 7,2 μg / mL, respectivamente, que son

menores que las toxicidades que muestra la parasporina 1 y parasporina 2 contra estas

células de cáncer humano (Xu et al., 2014). Las pro-toxinas de PS1 y PS6 comparten una

secuencia conservada en sus primeros 50 residuos de aminoácidos y tras ser activadas

por proteólisis, dos de sus tres péptidos generados, conforman un heterodímero tóxico

(Espino, 2014).


1.10 Cáncer

El cáncer es una patología provocada por un grupo de células que se multiplican sin control

y de manera autónoma, invadiendo localmente y a distancia otros tejidos; además de la

capacidad de evadir la apoptosis, de inducir angiogénesis sostenida. Estas alteraciones

del ciclo celular se deben a las mutaciones en los genes que codifican para proteínas

involucradas que lo controlan, en el cual pueden ser inducidos por diversos agentes.

(INC,2017).

El ciclo celular debe asegurar que el ADN sea fielmente replicado una vez durante la fase

S y que las copias cromosómicas idénticas se distribuyan por igual a dos células hijas

durante la fase M. Los procesos oncogénicos ejercen su mayor efecto dirigiéndose a

reguladores particulares de fases de progresión (GI). Durante la fase G, las células

responden a señales extracelulares ya sea avanzando hacia otra división o retirándose del

ciclo a un estado de reposo (Ir), la progresión de G normalmente se basa en la estimulación

por mitógenos y puede ser bloqueada por citocinas antiproliferativas. Las células

cancerosas abandonan estos controles y tienden a permanecer en ciclo, proliferándose

continuamente. (Sherr et al 1996)

En todos los tipos de cáncer, algunas de las células del cuerpo empiezan a dividirse sin

detenerse y se diseminan a los tejidos de alrededor. En el cáncer el proceso ordenado del

crecimiento de las células y su división se descontrola, las células viejas o dañadas

sobreviven, y células nuevas se forman cuando no son necesarias. Estas células

adicionales pueden dividirse sin interrupción y pueden formar masas que se llaman

tumores (Wong, 2012).

Esta enfermedad contribuye a cambios genéticos que pueden afectar a todos los genes

de la célula, por ejemplo: i) Proto-oncogenes: se dedican al crecimiento y división celular

normal. Cuando se convierten en oncogenes les permiten a las células que crezcan y


sobrevivan cuando no deberían. ii) Genes supresores de tumores: se dedican también a

controlar el crecimiento y la división celular, cuando estos genes se ven afectados las

células pueden dividirse incontroladamente y iii) genes reparadores del ADN: se dedican

a arreglar un DNA dañado. Las células con mutaciones en estos 3 tipos de genes pueden

causar que las células se hagan cancerosas. El cáncer va más allá de las alteraciones de

una única célula, el microambiente del tejido lo define. Los tumores cancerosos son

malignos, lo que significa que se pueden extender a los tejidos cercanos o los pueden

invadir. Además, al crecer estos tumores, algunas células cancerosas pueden

desprenderse y moverse a lugares distantes del cuerpo por medio del sistema circulatorio

o del sistema linfático y formar nuevos tumores lejos del tumor original. (NIH, 2019)

El cáncer constituye un serio problema de salud para la humanidad, y se estima que se

incrementará rápidamente en los próximos años. El cáncer es la segunda causa de muerte

en el mundo; en 2015, ocasionó 8,8 millones de defunciones. Casi una de cada seis

defunciones en el mundo se debe a esta enfermedad. Cerca del 70% de las muertes por

cáncer se registran en países de ingresos medios y bajos. En 2015, solo el 35% de estos

países informaron que la sanidad pública contaba con servicios de patología para atender

a la población en general y las infecciones oncogénicas. De acuerdo a las estimaciones

emitidas por la Agencia Internacional de Investigaciones en Cáncer para el 2020, se

pronostica que la mayoría de los 16 millones de casos nuevos y los 12 millones de muertes

por cáncer, ocurrirán en los países en vías de desarrollo. (Molina et al., 2013). La detección

de cáncer en una fase avanzada por falta de diagnósticos y tratamientos son problemas

frecuentes. El impacto económico del cáncer a nivel mundial va en aumento, según las

estimaciones, el costo total atribuible a la enfermedad en 2010 ascendió a US$ 1,16

billones. Sólo uno de cada cinco países de ingresos medianos o bajos dispone de los datos

necesarios para impulsar políticas de lucha contra la enfermedad (OMS, 2017).


Según la organización mundial de la salud el cáncer de mama es uno de los cánceres con

mayor número de muertes en el mundo y es el segundo tipo de cáncer más frecuente en

las mujeres de las regiones menos desarrolladas, más del 85% de esas muertes se

produjeron en países de ingresos bajos y medianos (OMS, 2017). Así mismo el cáncer de

próstata es la cuarta causa de muerte en Colombia. Estos dos tipos de cáncer tienen mayor

mortalidad en las ciudades de Manizales, Barranquilla, Pasto y Bucaramanga según el

instituto nacional de Cancerología – ESE (INC, 2019)

2. Justificación

El cáncer constituye un serio problema de salud para la humanidad, se estima que se

incrementará rápidamente en los próximos años. Según el Instituto Nacional de Cáncer de

Estados Unidos, los casos mundiales aumentarán en un 50%, en el 2012 ocurrieron 14

millones de casos mientras que en el 2030 serán 21 millones aproximadamente; así mimo,

las muertes mundiales por esta enfermedad aumentarán en un 60%, dado que en el 2012

ocurrieron 8 millones y se estima que en el 2030 aumentara 13 millones de muertes por

esta enfermedad, el 60% de esas muertes ocurrirán en África, Asia, Latino América y

Centro América (INC, 2019).

El cáncer siendo una de las principales causas de muerte, es un problema de salud tanto

para los países desarrollados como para los países en vía de desarrollo (OMS, 2018). A

pesar de los avances en los tratamientos contra el cáncer, la tasa de mortalidad por esta

enfermedad mortal sigue siendo muy alta. Debido al desarrollo de resistencia por parte de

las células cancerosas hacia los fármacos quimioterapéuticos actuales contra el cáncer,

se están realizando intensos esfuerzos de investigación para identificar nuevos agentes

terapéuticos, para combatir células cancerosas que sean económicamente factibles de

producir en grandes cantidades y que sean específicos, y que al mismo tiempo no generen

efectos adversos tan severos como los generados por la radioterapia y quimioterapia

(Olmos et al., 201). Se cree que las parasporinas (PS) son potenciales candidatos para la

20 IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE Bacillus thuringiensis CON


terapia anticancerígena por su acción selectiva y por su bajo costo de producción pues su

naturaleza termoestable en solución acuosa las haría adecuadas para la producción

industrial (Katayama et al., 2007, Ohba et al., 2009., Aktar et al 2019). Las proteínas

anticancerígenas tienden a ser ricas en aminoácidos como leucina, glicina e iso-leucina y

algunos de los grupos de las parasporinas son ricas en estos aminoácidos, las cuales las

podrían clasificar como proteínas anticancerígenas potenciales. (Aktar et al 2019 & Tyagi

et al., 2013)

Actualmente en el laboratorio de Biopesticidas del instituto de biotecnología de la

Universidad Nacional se tiene 115 cepas de Bacillus thuringiensis nativas de Colombia que

no presentaron actividad insecticida en estudios previos, a partir de estos antecedentes se

planteó un estudio preliminar para identificar posibles genes que codifiquen proteínas Cry

parasporinas de cepas nativas de Bacillus thuringiensis con posible actividad citotóxica

sobre líneas celulares de cáncer MDA-MB231 (Cáncer de mama) y PC-3 (Cáncer de

próstata).

3. Pregunta de investigación e hipótesis.

¿En cepas nativas de Colombia de Bacillus thuringiensis se encuentran proteínas Cry con

actividad citotóxica?

Hipótesis

Proteína Cry parasporina de cepas nativas de Bacillus thuringiensis tiene actividad

citotóxica contra la línea celular de MDA-MB231(Cáncer de mama) y/o PC-3 (Cáncer de

próstata).



4. Objetivos

4.1 Objetivo General

Identificar proteínas parasporinas con actividad citotóxica en cepas nativas de Colombia

de Bacillus thuringiensis.

4.2 Objetivos Específicos

• Diseñar primers para la detección de los genes de las diferentes clases de

parasporinas.

• Amplificar por PCR y analizar por electroforesis la presencia de los genes de

parasporinas

• Determinar actividad citotóxica de las parasporinas en líneas celulares de cáncer

5. Materiales y Métodos

5.1 Cepas bacterianas

En este estudio se utilizaron 115 cepas de Bacillus thuringiensis que se encuentran en el

cepario de biopesticidas del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de

Colombia, para su crecimiento se cultivaron en agar Luria de Bertani: Bacto-Triptona 1%,

Extracto de levadura 0.5%, NaCl 1%, pH 7.3

Como cepas control se utilizó la cepa HD1 como control negativo ya que esta cepa no

contiene ningún gen de pasasporina PS, y como control positivo la cepa 4R2 Bt subespecie

dakota donada por la Universidad de Ohio ya que contiene el gen de la parasporina PS2 y

Bt subespecie israelensis como control hemolítico ya que es una cepa con 100% de

capacidad hemolítica.

5.2 Cultivo celular.

Se cultivó las líneas celulares PC-3 (Cáncer de próstata) y MAD (Cáncer de mama) en

medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y

antibiótico 100 U/ml de penicilina y estreptomicina 100 µg/ml en frascos de cultivo de 75

𝑐𝑚2, se incubaron a 37ºC con 5% de CO2. Se realizó cambio de medio cada dos días. Las

líneas celulares fueron donadas por la Universidad FUCS de Colombia.



Se trataron con solución EDTA-tripsina 0.03%, las células adherentes en crecimiento

exponencial con una confluencia del 90%, para degradar las proteínas de adherencia que

las mantienen unidas entre sí y a la superficie del frasco de cultivo para obtener una

suspensión celular (Castillo, D. 2019), se tomó una alícuota, se realizó una dilución 1:2 con

solución de azul de tripán al 4% y se realizó conteo celular en cámara de Neubauer.

5.3 Solubilización de los cristales y activación de la proteína

Se incubaron las 118 cepas de Bt (incluidos controles) en medio liquido Luria Bertani al

0.5X, se incubaron a 30°C a 150rpm y se observó su esporulación por tinción de Gram en

un microscopio a un aumento de 100x. Cuando se llegó al 100% de esporulación del

cultivo, se recuperó por centrifugación a 150000 rpm durante 15 min a 4°C la mezcla de

esporas-cristal. Se centrifugó a 11000 rpm durante 4 minutos 3 veces para lavar el pellet:

i) agua destilada, ii) solución salina al 0.9% iii) agua destilada. Se solubilizó el pellet (250

mg peso húmedo en 1 mL) en el siguiente buffer: 50 mM de Na2CO3 (pH 10,5), 10 mM de

DTT y 1 mM de EDTA durante 1 h a 37ºC (Mizuki et al., 1999). Se centrifugó a 10000 rpm

durante 10 minutos a 4 ° C. Se recuperó el sobrenadante en un tubo eppendorf de 1.5 mL

y se digirieron las soluciones de proteínas (1mg /ml) con proteinasa K (60 μg / ml) durante

90 minutos a 37 ° C, se detuvó la actividad proteolítica mediante la adición de PMSF 1mM.

Por último, se determinó la concentración de proteína total por el Método de Bradford

(1976) con albúmina de suero bovino como estándar, y se realizó electroforesis SDS-

PAGE. Se almacenó a -20° C hasta su uso. (Yasutake et al 2008).

Materiales y métodos 25

5.4 Diseño de Primers

Se realizó la búsqueda de secuencias de parasporinas registradas en el GenBank del NCBI

que han sido clasificadas por el “Committee of Parasporin Classification and

Nomenclature”.

5.4.1 Alineamientos de las secuencias reportadas de PS

Se realizó un alineamiento con las regiones codificadoras (CDS) de las secuencias

obtenidas utilizando los programas Clustal W. Los alineamientos se hicieron con las

secuencias de cada grupo de PS, es decir, se alineó las 11 clases de parasporinas del

grupo PS1, las 3 clases de parasporinas del grupo PS2 y las 2 clases de parasporinas del

grupo PS3. Sólo hay una clase de parasporina en los grupos PS4, PS5 Y PS6, por esta

razón no se les hace este alineamiento. Se eligieron las regiones más conservadas de los

genes, del mismo grupo de parasporinas, la diferencia de nucleótidos entre secuencias fue

máximo de 100-200 pb y posterior a esto se alineó todos los grupos de PS (PS1-PS2-PS3-

PS4-PS5-PS6).

5.4.2 Diseño y Análisis de Primers.

Se realizó el diseño de los primer según los criterios reportados por Deininger, 1990: i) Los

primers tengan aproximadamente entre 19-21 nucleótidos, ii) La diferencia de temperatura

entre ellos no sea mayor a 4°C iii) No haya formación de Hairpin, no sea auto

complementario, y no tengan complementariedad entre ellos.

Se utilizó los programas primer-BLAST, Primer 3, Oligo Analyzer y SnapGene para analizar

estos primers y se realizó una simulación de PCR in silico por el programa SnapGene.



5.5 Identificación de genes PS en Bt nativos por PCR

Se llevó a cabo por el método reportado por Cerón et al., 1994 & Cerón et al., 1995, se

sembraron las 115 cepas de Bacillus thuringiensis más sus controles en agar Luria Bertani

durante 12h. Se tomó una azada de una sola colonia y se transfirió a 0.1 mL de agua

destilada. Se llevó a ebullición durante 10 minutos para lisar las células. Se transfirió 15 µl

del lisado celular resultante a un tubo eppendorf que contenía entre 0,5 a 2.5 U de la

enzima Taq ADN polimerasa, 0.1 a 0.5 µM de cada uno de los primers utilizados en la

reacción, y 2,5 mM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfatos y 10 µl de

buffer, en un volumen total de 50 µl.

La amplificación se realizó con un termociclador de ADN (MJ Research,Inc. PTC-100)

mediante los siguientes pasos: i) desnaturalización (2 min a 95°C), ii) 30 ciclos, cada ciclo

que consiste en la desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto, alineamiento a 48ºC durante

1 minuto, y extensión a 72ºC durante 1 minuto, iii) extensión final (72°C por 5 min). Los

productos de amplificación se analizaron en un gel de agarosa al 3%.

5.6 Actividad Hemolítica

Se tomaron 4mL de muestra de sangre un paciente donante con consentimiento informado,

posteriormente se lavaron los eritrocitos humanos tres veces por centrifugación a 2500

rpm por 10 minutos con solución salina 0.9%. Se realizó una suspensión de eritrocitos a

una concentración del 2% (v / v) en el mismo buffer.

Para los ensayos, en un tubo eppendorf de 1.5 mL se colocó 100 µl de la suspensión de

eritrocitos al 2% y se homogenizó 100 µl de la proteína soluble activa a 3 concentraciones

diferentes (1mg/mL, 500 µg/mL y 250 µg/mL) que se obtuvo en el numeral 6.3. Se incubó

durante 18 h a 27°C. Pasado este tiempo, se centrifugó a 4500 rpm durante 10 minutos,

Materiales y métodos 27

se tomó el sobrenadante y se leyó a una absorbancia de 540 nm. Este procedimiento se

realizó para cada una de las 118 proteínas solubles tratadas con proteinasa K (Incluido

controles). Cada ensayo se hizo por duplicado en 3 periodos de tiempo diferente.

La actividad hemolítica se definió como la actividad requerida para aumentar la

absorbancia a 540 nm después de 18 h de incubación a 27 °C. (Ohba, M.1996)

El grado de actividad hemolítica se clasificó basándose en su absorbancia a 540 nm:

Absorbancia > 1.00, Alto (+ + +); 0.99 > 0.51, Moderado (+ +); 0.50 > 0.21, Bajo (+); <0.2,

no hemolítico (-). Las proteínas con niveles de + a + + + en la actividad hemolítica se

consideraron cepas hemolíticas. (Mizuki et al 1999, Uemori et al 2007 & Chubicka et al

2018)

Las proteínas que presentaron Absorbancia <0.2, no hemolíticas (-), se les realiza la

prueba de citotoxicidad ya que se considerarán como potenciales proteínas parasporinas

PS.

5.7 Ensayo de citotoxicidad

Para los ensayos de viabilidad celular, se cultivó las células PC-3 (10,000 células / pozo)

y MDA-MB231 (12,000 células / pozo), en placas estériles de 96 pozos y se incubaron a

las mismas condiciones del cultivo por 24 horas. Se adicionó la proteína tratada con

proteinasa K a 4 concentraciones diferentes (0.1, 1, 10 y 100 μg/mL) y se incubó durante

48 horas. La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo colorimétrico de resazurina

(Hamid et al 2004). Adicionar a cada pozo 10 μl de resazurina y 90 μl del medio e incubar

durante 4 horas en las condiciones del cultivo estándar (37ºC con 5% de CO2.), en un lector

de placas TECAN GENios y se leyó a 535nm longitud de onda de excitación y 595 longitud

de onda de emisión. Cada prueba se realizaró por triplicado y se repitió tres veces.



Se determinó las diferencias significativas con un análisis de varianza ANOVA,

considerando un p<0.05 como significativo. Los datos se expresaron como valores

promedio ± ESM (error estándar de la media). Los valores de CE50 teóricos fueron

estimados usando el modelo Log dosis vs respuesta. Para este análisis se empleó el

software GraphPad prism versión 8.1.2 para Windows. Por medio de estos valores CE50 se

hizó una escala cualitativa del efecto citotóxico, de acuerdo a los siguientes parámetros:

>100 μg/mL ningún efecto o muy baja citotoxicidad (-); <99-10 μg/mL, poca citotoxicidad

(+); <9-1 μg/mL citotoxicidad moderada (++); <0.99-0.1 μg/mL citotoxicidad alta (+++); <

0.01 μg/mL citotoxicidad extremadamente alta (++++), en base a estudios previos (Mizuki

et al 1999).

Las gráficas de Dosis-Respuesta, se obtuvieron mediante el porcentaje de supervivencia

que corresponden a la relación entre el valor de fluorescencia promedio obtenida para cada

concentración y el valor de fluorescencia promedio obtenido para el control de crecimiento,

restando previamente a cada valor el promedio de fluorescencia del blanco respectivo. Por

lo cual se tuvo en cuenta la siguiente ecuación:

Se calculó la desviación estándar y el coeficiente de variación de cada grupo de datos,

para determinar si la dispersión entre estos datos es menor al 20%, siendo este el límite.

% Supervicencia celular =

6. Resultados y discusión

6.1 Cepas bacterianas

Para tener mayor facilidad en el momento del estudio se nombraron las cepas de Bacillus

thuringiensis que se encuentran en el cepario de biopesticidas del IBUN con el número del

orden en el que se iban estudiando de 1 a 118 (tabla 2).

Tabla 2 Listado de cepas utilizadas en el estudio y controles: Control negativo de parasporinas PS cepa N° 1 (HD1), control positivo de parasporina PS2 cepa N° 2(4R2). Control positivo de hemolisis y citotoxicidad cepa N° 118 (Bt israeliensis).



6.2 Diseño de Primers

6.2.1 Búsqueda y alineamientos de las secuencias reportadas de PS

Se realizó la búsqueda de las 19 secuencias reportadas de las diferentes parasporinas por

el “Committee of Parasporin Classification and Nomenclature”, registradas en el GenBank

del NCBI en la base de datos Nucleotide y se notifica su respectivo número de acceso

(Tabla 3).

Tabla 3. Secuencias reportadas en Nucleotide y su respectivo número de acceso

Resultados y discusión 31

Al analizar las secuencias obtenidas por el GeneBank en Nucleotide se observa como

estas 19 secuencias están divididas en 6 grupos diferentes. Por ello se procede a realizar

un alineamiento entre las mismas secuencias de cada uno de los grupos utilizando el

programa Clustal w el cual permite alinear más de dos secuencias. Al realizar el

alineamiento de las secuencias de ADN de cada uno de los grupos de parasporinas (Anexo

3,4 y 5) se identificó que las 11 clases de PS1 presentan un porcentaje de identidad de

86% (anexo 2) lo cual coincide con lo reportado por Krishnan, 2013. Las PS2Aa1 y la

parasporina PS2Aa2 tienen un porcentaje de identidad de 98% pero al alinearlas con la

PS2Ab1 se reduce a 84% (anexo 3) ya que tiene dos GAPs. El primer GAP está ubicado

desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 72 de las secuencias PS2Aa1y PS2Aa2 y el

segundo GAP se encuentra al final de la secuencia desde el nucleótido 986 hasta el

nucleótido 1017, debido a la longitud de la secuencia (Anexo 4), resultado que se corrobora

con el estudio reportado por Hayakawa et al., 2007 donde se evidencia que al ellos

identificar la parasporina PS2Ab1 por primera vez observaron que esta PS mostró una

homología significativa de 84% de identidad con las parasporinas PS2Aa, donde un

análisis filogenético revela un alto grado de relación entre PS2Ab y PS2A. La estructura

de la parasporina PS2Ab ha sido poco estudiada por lo cual no se sabe muy bien hasta la

fecha la diferencia entre estas, pero se ha observado que PS2Ab tiene una actividad

citotóxica más alta hacia las líneas celulares de leucemia MOLT-4 y Jurkat respecto que

la PS2A (Hayakawa et al., 2007). Yamashita et al., 2005 reportan que la PS3Aa1 y

PS3Ab1tienen un porcentaje de identidad de 88.1%, resultado similar con el de este

estudio ya que se observa en la tabla 4 que al alinear estas dos parasporinas se evidencia

un 88.9% de identidad. Las PS3 solo difieren en su longitud en 12 pb (Anexo 5) pero en el

centro de la secuencia desde el nucleótido ubicado en la posición 1620 hasta la posición

2065 no se observa regiones conservadas en su alineamiento haciendo que el porcentaje



de identidad se reduzca (Anexo 5). Así mismo ellos reportan que estas dos proteínas tienen

los 5 bloques conservados de las proteínas Cry insecticidas, pero aun así solo tienen un

20% de identidad con este grupo de proteínas Cry (Yamashita et al., 2005)

Al tener estos resultados de alineamiento de cada una de las clases de parasproinas donde

se presentan de 2 a más de una secuencia, se identificó las regiones conservadas entre

ellas y se observó que esta era la zona apta para realizar un par de primers que amplificara

todas las clases del mismo grupo de parasporinas. Es decir, un solo par de primer para las

PS1 que identifique sus 11 clases diferentes. Un par de primers para las PS2 que

identifique las 3 clases de este grupo y un par de primers para las 2 clases de parasporina

PS3.

Se quería observar si estas zonas conservadas eran únicas de cada grupo o si las

compartían con los demás, por esto se tomó una secuencia de cada uno de los 6 grupos

diferentes y se observó que tenían un porcentaje de identidad de 20% (Tabla 4), se

evidencia como este grupo de parasporinas es bastante heterogéneo y como sugiere Ohba

et al., 2019 a esto en este caso se le podría conferir su diferente mecanismo de acción y

su acción selectiva hacia diferentes tipos de líneas celulares de cáncer (ohba et al 2009).

De igual manera se observó que no hay zonas conservadas entre ellas (Anexo 6) y que se

podía diseñar primers específicos para cada grupo de parasporinas, es decir que el par de

primers solo me reconozca una región única dentro de toda la secuencia y que no se

encuentra en los otros grupos de parasporinas.


Tabla 4. Resultados de porcentajes de identidad al realizar alineamientos de las 11

clases de parasporina PS1, 3 clases de la parasporina PS2, 2 clases de la parasporina

PS3 y los 6 grupos de todas las parasporinas (PS1-PS6).

6.2.3 Diseño y Análisis de Primers.

Una vez establecidas las zonas para diseñar los primers se siguieron los criterios

establecidos en la metodología 5.4.2.

Cuando hablamos de especificidad de un primer nos referimos a que este solo debe

reconocer una secuencia única dentro del ADN molde, esta especificidad se analizó con

el programa SnapGene donde se realizó la PCR teórica (in silico) y se evidencia

gráficamente que los primers diseñados son específicos y solo reconocen la región que se

estableció que se reconociera (Figura 2), así mismo al analizarlo en primer-BLAST nos

dice que estos primer son específicos para el ADN molde ya que no reconocen otro objetivo

de Bacillus thuringiensis en la base de datos del NCBI. Estos primers tienen una longitud

entre 19-21 pb (Tabla 5), como se reporta en Deininger, 1990 se aconseja que un primer

tenga una longitud entre 18-24 pb ya que esto aumenta la posibilidad de que el primer sea

más específico y solo se encuentre en una región de la secuencia. La temperatura del

primer dependerá de dicha longitud y de la composición del primer, para obtener la Tm

teórico (temperatura de fusión entre primer y ADN molde) de cada primer se realizó con la

formula Tm=2(A+T) +4(G+C) (Kotrla, T. 2015), donde se evidencia que es una fórmula

para obtener la Tm manualmente sin ayuda de ningún software. Después de realizar esta



Tm manual se corroboro con diferentes programas, Primer PLUS y Primer3, donde se

observa que la diferencia de temperatura entre los primers diseñados es de 1- 2°C (Tabla

5), como lo reporta Martínez & Rincón, 2004 este es un punto crucial para el diseño de

primers ya que se aconseja que para mayor eficiencia de la PCR los primers no tengan

una Tm mayor de 4°C o algunos primers podrían no amplificar. Así mismo Diaz et al., 2018

aconseja que en cuanto a la composición del primer de G y C sea mayor de 40% ya que

esto asegura la unión estable entre el primer y el ADN molde, como se evidencia en la

tabla 5 la mayoría de los primers diseñados tienen un contenido de G-C entre un 40-47%.

Para el diseño de estos primers tambien se analizó que no fueran auto complementarios

evitando la formación de Hairpin y tampoco fuera complementario entre el directo y el

reverso, para evitar la formación de dímeros ya que como reporta Kaur & Makrigiorgos,

2003 al ocurrir estos fenómenos el primer se pliega sobre sí mismo en una estructura de

doble cadena interfiriendo con el pegado al ADN molde, y disminuyendo la formación del

producto que se necesita. Esto se analizó con los programas Oligo Analizer, Primer PLUS

y Primer3 donde nos muestran que los primers son óptimos para su uso ya que no presenta

la formación de ninguno de estos. En la figura 3 se puede observar el producto amplificado

de cada par de primers de la PCR teórica (insilico) donde se evidencia que se pueden

diferenciar por su peso molecular, y en el caso de realizar una PCR múltiple, se pueda

diferenciar cada producto amplificado fácilmente y saber a qué tipo de gen corresponde,

criterio crucial para este tipo de PCR (Espino, 2014).


Tabla 5. Características de los primers diseños



Figura 2. Simulación de PCR in silico con los 6 pares de primers diseñados, amplifican solo el ADN template que se quería y una sola región mostrándonos estabilidad y especificidad


Figura 3. Análisis electroforético teórico de Gel de Agarosa al 1% con los productos de PCR realizados simulada in silico en el programa SnapGene donde en el primer pozo se ubicó el marcador, pozo 2: PS1, pozo 3: PS2, pozo 4: PS3, pozo 5: PS4, pozo 6: PS5, pozo 7: PS6, se puede observar el producto de amplificación con sus respectivos pesos moleculares

219



6.3 Identificación de genes PS en Bt nativos por PCR

Se probó diferentes concentraciones para la Mix de la PCR múltiple y diferentes

temperaturas de alineamiento donde se estandarizó: 9.2µl de H2O, 10 µl de buffer, 6 µl

MgC, 2.5µl DNTPs, 2 2µl c/u primers, 0.3µl Taq polimerasa, 10µl de DNA, para un volumen

total de 50µl; con una temperatura de alineamiento de 55ºC.

Una vez estandarizada la PCR, se les realizó a las 115 cepas (tabla 2), para analizar si

estas cepas nativas contenían alguno de los 6 genes de parasporinas PS reportados hasta

la fecha. Las condiciones de la PCR fueron: desnaturalización (2 min a 95°C), seguido de

un programa de 30 ciclos, cada ciclo consiste en la desnaturalización a 94ºC durante 1

minuto, alineamiento a 55ºC durante 1 minuto, y extensión a 72ºC durante 1 minuto; un

paso de extensión final (4°C por 5 min).

Al realizar la PCR para las 115 cepas Bacillus thuringiensis nativas de Colombia no se

observó que amplificara algún producto ya que como se evidencia en la figura 4 al realizar

la PCR múltiple solo se observa que amplifica el control positivo. Como único control

positivo se tiene la cepa 4R2 otorgada por la Universidad de Ohio que contiene el gen de

la parasporina PS2 ya que las otras cepas control se encuentran bajo procesos de patentes

y no se lograron conseguir. Lo cual se podría inferir que en ninguna de las 115 cepas

nativas se encuentra el gen de la parasporina PS2.

Como se ha reportado en estudios previos por Cerón et al., 1995 en el grupo de

investigación de biopesticidas ha sido posible estandarizar PCR múltiple para proteínas

Cry insecticidas anteriormente, razón por la cual se decide utilizar esta metodología.

Algunos problemas frecuentes que se pueden presentar en una PCR múltiple es que los

controles amplifiquen en ocasiones y en otras no, esto se puede deber a que la Tm de los

primers no es similar entre ellas (Bolívar et al., 2014), en este estudio se descarta dicha


posibilidad ya que sus Tm no difieren de 2ºC y su control positivo siempre amplificó

mostrando que esta PCR múltiple es estable.

Así mismo se observa que en el continente de América en islas del Caribe, Trinidad, en el

estudio de Ammons et al., 2016 reportan que mediante la técnica de PCR no fue posible

identificar dos nuevas clases de parasporinas debido a que no se conocía su secuencia,

para encontrarlas fue con diversos estudios de actividad hemolítica, citotóxica y

secuenciación dando origen a dos nuevas clases de parasporinas, por lo cual se evidencia

que la PCR no es el único medio de identificación de proteínas PS y que al no dar resultado

en ella no significa que no se encuentre ninguna parasporina pues es una técnica que

puede excluir a nuevos tipos de proteínas anti-cancerígenas con baja similitud a las PS

de la literatura (Espino, 2014), sugiriendo así que este grupo de 115 cepas nativas podrían

tener nuevos tipos de proteínas PS citotóxicas no reportados hasta la fecha.

Figura 4. Análisis electroforético de Gel de Agarosa al 3% con los productos de PCR, pozo número 1: Cepa 1 (HD1) control negativo, pozo número 2: Cepa 2 (4R2) control positivo, pozo número 10: Marcador de peso molecular. Se repite este procedimiento hasta analizar las 115 cepas de estudio. Solo se observa amplificación de control positivo.



6.4 Solubilización de los cristales y activación de la proteína

Una vez se realizó la solubilización de las proteínas como lo describe el numeral 5.3

se cuantificaron las proteínas totales de las 115 cepas más controles por el método de

Bradford (1976) para la curva patrón (Anexo 1) donde todas las proteínas solubles se

dejaron a una misma concentración de 1 mg/ mL, para ser utilizadas en los posteriores

ensayos.

A las proteínas solubles tratadas con proteinasa K se les realizó electroforesis SDS-

PAGE con el objetivo de mirar si la proteína fue tratada correctamente, saber los pesos

moleculares de las proteínas de las cepas nativas y compararlos con las parasporinas

PS reportadas hasta la fecha. En la figura 5 se puede observar los diferentes pesos

moleculares de las proteínas 2, 23, 68 y 79 (cepas con las que se continúa hasta el

último momento de este estudio). Al comparar los perfiles proteicos de nuestras cepas

nativas con las parasporinas PS reportadas en la literatura se observa que ninguna se

asemeja con el perfil proteico de la parasporina PS1 ya que como reporta Mizuki et al.,

2000 esta protoxina al ser cortada con proteinasa K como se realizó en este estudio da

origen a 4 proteínas de diferente peso molecular 44, 56,58 y 66 kDa la cual ninguna de

las cepas nativas muestra este perfil. Al comparar nuestra cepa control que tiene el gen

de la parasporina PS2 (cepa número 2) muestra una banda de 28, 30, 38 y 40 kDa

aproximadamente la cual es semejante con los estudios realizados por Kim et al., 2000,

donde esta cepa control (4R2 Bt subespecie dakota) muestra el mismo perfil proteico

de este estudio evidenciando bandas de 28, 30, 38 y 40 kDa a la cual a la proteína de

30 kDa es la que se le confiere ser la responsable de su actividad toxica frente a líneas

celulares de cáncer (Kim et al., 2000 & Brasseur et al., 2015 ), pero ninguna cepa

nativa muestra este mismo perfil, lo cual corroboraría el resultado de PCR donde se


observa que ninguna de las 115 cepas tubo amplificación para la parasporina PS2

teniendo este como único control positivo. Las proteínas de las cepas nativas 68 y 79

dan origen a 4 proteínas de diferentes pesos moleculares, la cepa 68 tiene proteínas

de 18, 27, 37, y 44 kDa y la cepa 79 tiene proteínas de 26, 38, 45 y 103 kDa. Estas dos

cepas se asemejan al perfil proteico de la parasporina PS5 donde el peso de su

proteína en su forma toxica es de 27 kDa aproximadamente (Ohba et al., 2009).

Figura 5. Electroforesis SDS-PAGE de las proteínas nativas hidrolizadas con proteinasa

K de las cepas 2, 68 y 79 con las cuales se llegarán con ellas hasta el último

procedimiento de este ensayo.



6.5 Actividad Hemolítica

Se estudió la actividad hemolítica de las 115 cepas de Bacillus thuringiensis nativas ya que

es una característica de las parasporinas presentar baja o nula actividad. (Mizuki et al.,

2000) se sabe que esta técnica es otro modo de selección de Parasporinas (Katayama et

al., 2007) y se está utilizando para la identificación de nuevas clases de proteínas PS

(Moazamian et al., 2018).

Al realizar el promedio de absorbancias de hemolisis de las 115 proteínas totales de las

cepas nativas se observa que 8 de estas se consideran como cepas no hemolíticas: cepas

14,15, 20, 23, 68, 74, 79, 83 (Anexo 7, tablas 6, 7 y 8) según el grado de clasificación en

su absorbancia que se estandarizó para caracterizar estas proteínas parasporinas PS

(numeral 5.6) ya que ninguna presentó absorbancia >0.2 bajo ninguna de las 3

concentraciones diferentes de proteína analizada (500μg/mL, 250μg/ mL y 125μg/ mL).

La cepa número 2 (Control positivo de parasporina PS2) bajo las 3 concentraciones de

proteína diferentes mostró una absorbancia <0.2 (tablas 6, 7 y 8) considerándose como

cepa sin dicha actividad, presentando el mismo comportamiento reportado por Mizuki et

al., 1999, Kim et al., 2000 e Ito et al., 2004 donde en concentraciones de 500μg/ml de

proteína esta cepa presenta absorbancia <0.2 como en nuestro estudio, caracterizándose

como cepa no hemolítica. La cepa número 118 (Control positivo para cepa hemolítica) da

como resultado bajo las 3 concentraciones diferentes de proteína absorbancias >0.2,

donde bajo 3 concentraciones de proteína diferentes (500μg/ml, 250μg/ml y 125μg/ml) da

absorbancias de 0.9 aproximadamente a 540nm (tablas 6,7 y 8) clasificándose como una

cepa con alta actividad hemolítica según el criterio utilizado para dicha clasificación

(numeral 5.6); esto se debe a que la cepa 118 Bacillus thuringiensis subespecie

israeliensis tiene un mega-plásmido secuenciado en su totalidad recientemente llamado

pBtoxis, que contiene los genes Cry4A, Cry4B, Cry11A y Cyt1A que codifican las


endotoxinas de su cristal, responsables de la actividad insecticida frente a las ordenes

Lepidoptera y Coleoptera y la actividad hemolítica y citolítica de esta cepa, así mismo se

cree que Cyt1A (27 kDa ) daña la membrana celular de los eritrocitos de manera similar a

un detergente como Triton X-100 el cual es considerado 100% hemolítico ( Butko, P. 2003).

Tabla 6. Promedio de absorbancias concentración 500 μg/mL de las 115 cepas y cepas control: cepa número 2: control positivo de la parasporina PS2 (cepa no hemolítica), cepa número 118: control positivo de cepa hemolítica.



Tabla 7. Promedio de absorbancias a una concentración de 250μg/mL de proteína de las 8 cepas sin actividad hemolítica que se observan en la tabla 6. Se les realizó esta prueba a las 115 cepas, a continuación, se muestran solo los datos de las cepas con las que se continuará la investigación para mayor facilidad más las cepas control: cepa número 2: control positivo de la parasporina PS2 (cepa no hemolítica), cepa número 118: control positivo de cepa hemolítica.

N° de cepa

Promedio de absorbancias

Actividad hemolítica

N° de cepa



2 0.133 - 68 0.126 -

14 0.129 - 74 0.121 -

15 0.113 - 79 0.123 -

20 0.116 - 83 0.112 -

23 0.112 - 118 0.961 +++

Tabla 8. Promedio de absorbancias a una concentración de 125μg/mL de proteína de las 8 cepas sin actividad hemolítica que se observan en la tabla 6 y cepas control. Se les realizó esta prueba a las 115 cepas esta prueba, a continuación, se muestran solo los datos de las cepas con las que se continuará la investigación para mayor facilidad.

N° de cepa



N° de cepa



2 0.133 - 68 0.125 -

14 0.1201 - 74 0.121 -

15 0.113 - 79 0.117 -

20 0.113 - 83 0.114 -

23 0.114 - 118 0.981 +++


6.6 Ensayo de citotoxicidad

Se realizó la determinación de la actividad citotóxica solo con las 8 proteínas de las cepas

de Bacillus thuringiensis nativas de Colombia que no presentaron actividad hemolítica. Los

datos se analizaron mediante una prueba de ANOVA, para saber si hay significancia

(p<0.05) en los datos, y determinar si las 8 proteínas no hemolíticas tienen algún efecto

citotóxico en las líneas celulares: MDA-MB231 (Cáncer de mama) y PC-3 (Cáncer de

próstata).

Al evaluar el efecto del Buffer de carbonatos en el que fueron diluidas las proteínas (control

negativo) y así determinar si se presentaba algún efecto citotóxico contra las líneas

celulares, da como resultado que este no fue superior al 2% (Tabla 9), no hay disminución

de la viabilidad celular significativa con respecto al control de crecimiento (P>0.05)

afirmando que el efecto citotóxico se debe únicamente al efecto de las proteínas sobre las

líneas celulares (Hui, K. et al.,2002).

Al observar los porcentajes de supervivencia del control positivo, proteínas totales de

Bacillus thuringiensis subespecie israeliensis (Tabla 10), frente a las dos líneas celulares

en diferentes concentraciones, el porcentaje de supervivencia de las células disminuyó con

el aumento en la concentración de la proteína teniendo una actividad citotóxica de 100%

en una concentración de 1 μg/ mL. Yasutake et al., 2008 reportan que a una concentración

de 60 μg/ mL de proteína soluble de Bt subespecie israeliensis frente a líneas celulares de

cáncer (HeLa y HepG2) a las 24h observaron actividad citotóxica de 100% donde en este

estudio se observa un comportamiento similar en las líneas celulares MDA-MB231 y PC-

3 donde a dicha concentración se tuvo 100% de actividad, mostrando como la proteína de

este microorganismo es altamente citotóxica frente a cualquier línea celular (Yasutake et

al., 2008), esto es debido a la toxina Cyt1A que actúa formando poros oligómeros en la



membrana y por lo tanto, se rompe, se ha evidenciado que la concentración de la toxina

requerida para su efecto citotóxico es bajo (<1 μg/mL) (Butko, P. 2003).

.

Tabla 9. Porcentaje de supervivencia ± ESM del Buffer de carbonatos con proteinasa K

Tabla 10. Porcentaje de supervivencia ± ESM en las líneas celularesPC-3 y MDA -MB231 frente al control positivo Bacillus thuringiensis subespecie israeliensis

Línea Celular

Concentración de proteína de Bt. israeliensis

0.1 μg/mL 1 μg/mL 10 μg/mL 100μg/mL

MDA-MB231 19%±9.47 0%±1.96 0%±3.74 0%±2.25

PC-3 14%±4.08 0%±2.82 0%±1.01 0%±1.71

En la tabla 11, se observan los porcentajes de supervivencia de las líneas celulares MDA-

MB231 y PC-3 frente a las proteínas no hemolíticas y sus respectivos controles (proteína

2 y 118). Las cepas 23, 68 y 79 presentaron menor porcentaje de supervivencia en una

concentración de 100μg/mL frente a la línea celular de MDA-MB231, 55.2%±10.6,

49.4%±0.82, y 40.4%±2.28 respectivamente y son significativamente diferentes respecto

al control negativo (P<0.05). En la línea celular PC-3 estas mismas proteínas son las que

muestran menor porcentaje de supervivencia, pero se observa como la proteína 23 y 68

tienen un aumento de este, siendo más resistente la línea celular PC-3 que MDA-MB321

para estas 2 proteínas, para la proteína 79 se observa que el porcentaje de sobrevivencia

es similar para las dos líneas celulares, 44.5%± 0.86 para MDA-MB231 y 48.9%±6.28 para


PC-3. Sin embargo las proteínas se consideran promisorias de tener actividad citotóxica sí

su concentración efectiva media (CE50) es menor a 100 μg/mL (Mizuki et al 1999). Las

cepas 68 y 79 muestran un CE50 de 75.19 μg/mL y 36.26 μg/mL respectivamente frente a

la línea celular MDA-MB231 (Tabla 12), la única proteína de cepas nativas que muestra un

CE50 menor de 100 μg/mL para PC-3 es la proteína de la cepa 79 con un CE50 de 74.74

μg/mL, considerándose estas dos cepas nativas promisorias de tener actividad citotóxica.

Estas cepas potenciales de actividad citotóxica según el criterio reportado por Mizuki et al.,

1999 (metodología 5.6) presentan diferentes pesos moleculares, la cepa 68 tiene proteínas

de 18, 27, 37 y 44 kDa aproximadamente, la cepa 79 tiene proteínas de 26, 38, 45 y 103

kDa aproximadamente, donde no se sabe cuál de las proteínas es la que confiere la

capacidad citotóxica, o si es un complejo entre proteínas que confiere dicha actividad,

como lo reporta Katayama et al., 2007.

Se ha reportado que la parasporina PS2 tiene un alto grado de toxicidad para las líneas

celulares de HepG2-cáncer de hepatocito, PC-3-cáncer de próstata, MCF-7 y MDA-MB231

cáncer de mama (Brasseur et al 2015 & Velásquez et al., 2018) esto se evidencia con el

control positivo para la parasporina PS2 ya que tiene un CE50 de 4.5 μg/ml para la línea

celular MDA-MB231 y 2.96 μg/ml para PC-3 en este ensayo (Tabla 12). Brasseur et al.,

2015 reportaron que esta misma cepa (4R2 Bt subespecie dakota) que se tiene en este

estudio como control positivo de PS2 presenta a una concentración de 10 μg/mL de su

proteína soluble 32% de viabilidad frente a la línea celular MDA-MB231( cáncer de mama)

y 13% de viabilidad frente a la línea celular PC-3 ( cáncer de próstata) resultados similares

a los que se obtienen en este estudio pues esta proteína presento 40% de viabilidad en

MDA-MB231 y 28.9% en PC-3, mostrándo que ocurre el mismo comportamiento, es mas

resistente MDA-MB231 que PC-3 debido a la especificidad citotóxica ( acción selectiva)

que tiene cada una de las clases de parasporinas la cual ha sido poca estudiada pero se



cree que al igual que las Cry insecticidas, existe una interacción específica de toxina-

Receptor que confiere la especificidad hacia las células de cáncer. (Katayama et al., 2007).

El aumento de viabilidad celular que se muestra en este estudio de aproximadamente 10%

con el reportado por Brasseur et al., 2015 se debe a que ellos purificaron la proteína. La

literatura muestra como las proteínas purificadas y clonadas tienen un mayor efecto

citotóxico (Mizuki et al 2000). Pero se sabe que para estudios de identificación de

parasporinas donde se tiene un gran número de cepas como los reportados por Uemori et

al 2007, Poornima et al., 2010, Gonzales et al., 2011, Lenina et al., 2014, Ammons et al.,

2016, etc, por facilidad de manipulación no se purifica las proteínas ya que igualmente se

evidencia su actividad citotóxica, razón por la cual se decide no purificar en este estudio.

Pero se sugiere que para futuros estudios donde ya solo se tienen seleccionadas estas 2

proteínas nativas como proteínas citotóxicas para aumentar su actividad citotóxica se

debería realizar una purificación previa y una clonación en E. coli, o en cepas acristalíferas

de Bacillus thuringiensis (Espino, 2014).

Así mismo como se observa en diferentes estudios donde las parasporinas pueden

aumentar o disminuir su actividad citotóxica dependiendo de la línea celular a la que se

enfrentan como se reporta en Brasseur et al., 2015 donde la parasporina PS2 frente a la

línea celular OVCAR (cáncer de ovarios) a una concentración de 10 μg/mL tiene un

porcentaje de viabilidad de 87.5% y frente HepG2 (cáncer de hígado) de 5% o la

parasporina PS1 según Poornima et al., 2010 a una concentración de 100 μg/mL frente

a la línea celular U-937 ( cáncer de linfoma) tiene un porcentaje de viabilidad de 43%, y a

HCT250 (cáncer de colon) de 5%, se sugiere que estas dos cepas nativas podrían

aumentar su actividad citotóxica frente a otras líneas celulares diferentes a las de este

estudio dado que los porcentajes de viabilidad de estas cepas son semejantes a los

reportados por Brasseur et al., 2015 y por Poornima et al., 2010 donde a una


concentración de 10 μg/mL las cepas 68 y 79 presentan 84% y 77% de viabilidad y a una

concentración de 100 μg/mL presentan 44% y 48% de viabilidad respectivamente, por lo

que no se puede descartar dicha posibilidad.

Debido a la selectividad que presentan las parasporinas hacia ciertas líneas celulares se

sugiere enfrentar las otras 5 proteínas restantes sin actividad hemolítica que presentaron

un CE50 > 100 μg/mL con otras líneas celulares diferentes a las del estudio teniendo la

posibilidad de que hacia estas si tengan actividad citotóxica.

De igual manera se sugiere realizar una secuenciación de estas proteínas promisorias

para saber si pertenecen a un grupo de parasporinas PS reportado hasta la fecha ya que

se han encontrado en el continente americano recientemente las parasporinas PS1 y PS4

en México (Espino, 2014) o se debe a una nueva clase de parasporina PS como se

encontró en las islas trinidad Venezuela, dos nuevas clases de proteínas PS que aún se

encuentran en estudio por el “Committee of Parasporin Classification and Nomenclature”

(Ammons et al., 2016).



Tabla 11. Porcentaje de supervivencia para las líneas celulares PC-3 y MDA-MB231 frente a las 8 proteínas de las cepas no hemolíticas, proteína de la cepa 2 (control positivo PS2) y proteína 118 (control positivo de cepa citotóxica) a 4 concentraciones diferentes.


Tabla 12. Resultados de citotoxicidad expresados en valores de Concentración efectiva media (CE50) para las líneas celulares MDA-MB231 y PC-3 frente a las proteínas de CE50

menor a 100μg/mL y su control positivo de parasporina PS2.

7. Conclusiones

A partir de la PCR no fue posible identificar parasporinas de PS1 a PS6 en las cepas

nativas.

Por prueba de hemolisis se identificó 8 cepas de las 115 que no presentaron actividad

hemolítica.

Se identificaron 2 cepas nativas de Bacillus thuringiensis: cepas 68 (26, 38, 45 y 103

kDa) y cepa 79 (18, 27, 37 y 44 kDa) promisorias de actividad citotóxica para la línea

celular MDA -MB231 (Cáncer de mama), y 1 cepa nativa: cepa 79 (18, 27, 37 y 44 kDa)

para la línea celular PC-3 (Cáncer de próstata).



8. Recomendaciones

Se sugiere purificar las proteínas para aumentar actividad citotóxica

Se sugiere evaluar las cepas promisorias con actividad citotóxica frente a otras líneas

celulares no evaluadas en el estudio ya que pueden tener actividad toxica hacia otro

tipo de línea celular

Se sugiere secuenciar estas 2 cepas promisorias para conocer su perfil genético y

conocer más sobre ellas.

A. Anexo1. Curva Patrón, Método de Bradford con albumina como estándar

Concentración ug/mL Absorbancia 595 nm

100 0.187

200 0.257

400 0.496

600 0.681

800 0.851

1000 0.971

y = 0.0009x + 0.1067R² = 0.9904

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 200 400 600 800 1000

Ab

sorb

anci

a5

95

nm

Concentración ug/mL

Curva Patrón BSA



B. Anexo 2. A) Porcentaje de identidad entre las 11 clases de parasporina PS1 entre todos los posibles alineamientos entre ellas. B) Longitud de cada secuencia alineada.

Anexos

57

C. Anexo 3. Alineamiento múltiple de las 11 clases de parasporina 1: A) se observan regiones homologas B) regiones que disminuyen el porcentaje de identidad



D. Anexo4. A) Alineamiento de las 3 secuencias PS2 donde el programa CLUSTALW B) nos muestra la longitud de cada secuencia alineada y C) porcentaje de identidad A

Anexos

59

E. Anexo 5. A) Alineamiento de las 2 secuencias PS3 B) la longitud de cada secuencia alineada C) porcentaje de identidad entre las 2 clases de parasporina PS3



F. Anexo 6. Alineamiento múltiple de las 6 clases de parasporinas PS, A: se observa regiones con MATCH entre algunas secuencias, B: regiones con GAPS por diferencias de tamaño y no coincidencia entre las secuencias, C: porcentaje de identidad entre las 6

clases de parasporinas PS.

Anexos

61

G. Anexo 7. Imágenes de ejemplos de cepas hemolíticas vs cepas consideradas como no hemolíticas



H. Anexo 8

9. Referencias bibliográficas

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