IDENTIFICACIÓN EN Entamoeba histolytica DE UNA PROTEÍNA

SEMEJANTE A LA PARAFLAGELAR DE Tripanosoma sp y

Leishmania sp

Clave del Proyecto: 20060676

Responsable: Dr Saúl Rojas Hernández

ESM

RESUMEN Entamoeba histolytica es un parásito estricto que no presenta organelos

diferenciados típicos para la locomoción. Aunque se ha sugerido que la actina, la

proteìna mas abundante en su citoplasma se ha relacionado con la motilidad

celular así como, en la invasión tisular de esta amiba. En este trabajo se

analizaron los bancos genomicos de Entamoeba histolytica

(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica/) y se encontraron dos secuencias

que mostraron homología con el gen de la proteína paraflagelar de 69 y 73 kDa de

Tripanosoma sp y Leishmania sp. Tomando en cuenta estos datos, y utilizando la

técnica de RT-PCR se identifico dos secuencias (Ent1963c12.p1k and Ent

Ent1963c12.q1k) las cuales tienen una gran homología con la proteína

paraflagelar de 73 kDa de Trypanosoma sp and Leishmania sp. Por otro lado

utilizando un suero de conejo anti-H-SDWSETQRQKLRG-OH una secuencia de

aminoácidos correspondiente a los residuos 39-51 de la proteína paraflagelar de

73 kDa de Trypanosoma brucei; se detecto por inmunoblot una banda de 114 kDa

en extractos totales de E. histolytica. Por inmunohistoquímica, esta proteína fue

localizada en los trofozoítos de E. histolytica en el citoplasma cerca de la

membrana celular, cuando las amibas se preincubaron con Con A. Estos

resultados nos estarían indicando que la proteína de 114 kDa de E. histolytica

podría estar participando en la locomoción de E. histolytica y sería la primera

evidencia en E. histolytica existe una proteína paraflagelar parecida a la de

Tripanosoma.

1

INTRODUCCIÓN

Tripanosoma brucei es un protozoario parásito causante de la enfermedad del

sueño en humanos, se transmite a través de un vector la mosca Tsetse (Glossina

palpalis) y afecta a aproximadamente a 60 millones de personas en África (2,3).

Todos los Trypanosomatidos poseen un organelo, el cinetoplastido que contiene

DNA y se localiza dentro de una voluminosa y larga mitocondria, los flagelos

tienen su origen en una cavidad y sus cuerpos básales se localizan encima o

cerca del cinetoplasto (2). El flagelo esta compuesto de el axonema microtubular

(motor celular) y la proteína paraflagelar (PPF) altamente organizada y útil en la

movilidad celular (4).

La PPF es un componente único en kinetoplastidos, euglenophytas y

dinoflagelados, en estudios recientes tanto a nivel bioquímico, genético e

inmunológico han demostrado la presencia de dos proteínas PPF de 69 y 73 kDa

en varios (3).

Los trofozoitos de Entamoeba histolytica son células capaces de penetrar tejidos y

producir lesiones en diferentes órganos de hospederos humanos. Como parásitos

estrictos no presentan organelos típicos bien diferenciados como es la mitocondria,

aparto de Golgi, retículo endoplásmico rugoso centríolos y microtúbulos (8),

poseen una gran plasticidad, movilidad y recambio de membrana plasmática,

características que son reguladas por una interacción coordinada entre el

citoesqueleto y la superficie celular; se ha identificado la actina como la proteína

más abundante del citoesqueleto de Entamoeba histolytica y que esta asociada a

funciones de movimiento y en mecanismos de patogenicidad (5).

Recientemente y gracias a las técnicas de Biología molecular se han identificado

secuencias genómicas que han permitido la identificación de nuevas proteínas.

Esto han permitido la caracterización de genes específicos, particularmente

asociados a cepas patógenas y ello ha ayudado a comprender los mecanismos

de patogenicidad amibiana. Como se ha mencionado anteriormente, en la

Entamoeba histolytica se conoce a la actina como una proteína asociada a

funciones de movilidad y patogenicidad, sin embargo nosotros hemos identificado

2

una secuencia en el banco genómico de Entamoeba histolytica que comparte un

90% de homología con la proteína PFR de otros parásitos de importancia como

Tripanosomatidos. Esto nos hace suponer que la Entamoeba histolytica pudiera

tener una proteína diferente a la actina que le pudiera conferir movilidad y que

además pudiera estar involucrada en la patogenicidad de esta. Por esta razón

decidimos primeramente identificar en Entamoeba histolytica el gen que transcribe

para esta proteína en tripanosomas y posteriormente identificar la proteína.

También se realizará secuenciación para hacer un análisis de la secuencia de esta

nueva variante. El objetivo del presente trabajo fue identificar una proteína

semejante a PFR en Entamoeba histolytica mediante técnicas de RTP-PCR, e

Inmunodetección.

3

MATERIAL Y MÉTODOS

Cultivo de amibas. Se trabajó con trofozoítos de Entamoeba histolytica de la cepa HM1:IMSS, la cual

se cultivó en medio axénico de acuerdo al procedimiento de Diamond (9). Las

amibas se cosecharon durante la fase logarítmica de crecimiento, se despegan

por congelación y se lavaron por centrifugación a 1500 g por 10 minutos con

solución de fosfatos (PBS). Posteriormente a la pastilla celular se le agregó 1 ml

de cóctel de inhibidores de proteasas. Las amibas se rompieron por ciclos de

congelación y ebullición. El extracto resultante se almacenó a -70°C. La

concentración de proteínas se determinó por la técnica de Bradford (10).

Extracción de RNA total de Entamoeba histolytica. Las amibas se cosecharon en fase logarítmica y se lavaron con PBS,

posteriormente se obtuvo el RNA total utilizando el kit Perfect RNATM, Eukaryotic,

Mini (Eppendorf). El RNA purificado se cuantifico usando GENESYSTM 10 Series

(ThermoSpectronic). 5 µg de RNA fueron separados en un gel de agarosa al 5%

que contenía bromuro de etidio en buffer MOPS y 0.2 M de formaldehído. Para

prevenir la contaminación del RNA, las muestras fueron tratados con DNase

(invotrogen) antes de la transcripción reversa. Las muestras fueron almacenadas a

-70ªC

Ensayos de RT-PCR 0.5 µg of RNA fueron transcritos en 20 µl buffer de reacción cMaster RTplusPCR

System (Eppendorf), la reacción se llevo a cabo en un termociclador (Mastercycle

thermocycler Eppendorf). El protocolo se realizo a 50°C 30 min, 94°C 2min, 35

ciclos de desnaturalización (94°C 10 seg), alinamiento (75°C 30 seg), y la

elongación (68°C 45 seg). Los oligonucleotidos específicos se realizaron a partir

de Trypanosoma brucei, usando el programa Fast PCR program, el cual fue

checado con el programa web program Primer3. La secuencia y tamaño de los

primers fue: 5’-AGCTGGTTGCCGCTGTGGACG-3’ (sense) and 5’-

TGTGGGGACCTGCGCCAACTG-3’ (anti-sense), 308 bp para el gen pfr1, y 5’-

TGAGTCCTGCGGCACAGCAGC-3’ (sense) and 5’-

TCGGATACGTGCAGGTCCTGGAC-3’ (anti-sense), 148 bp para el gen pfr2. 10 µl

4

de cada producto de PCR fue usado para la electroforesis en un gel de agarosa al

2% y se visualizo con bromuro de etidio.

Producción de anticuerpos específicos anti-proteína paraflagelar. Para inmunizar a los conejos se utilizo un péptido que corresponde a los residuos

39-51 de la proteína paraflagelar (H-SDWSETQRQKLRG-OH) de Tripanosoma

brucei, conjugado con la proteína acarreadora toxoide diftérico. El conejo se

inmunizo en tres ocasiones con intervalos de 7 días de acuerdo al siguiente

esquema de inmunización: a) la primera inmunización se realizo por la ruta

subcutanea con 1 mg de proteína paraflagelar más adyuvante completo de Freud

b) la segunda inmunización se realizo con 1 mg de proteína paraflagelar más

adyuvante incompleto de Freíd c) la tercera inmunización se realizo por la ruta

intramuscular con 1 mg de proteína en solución salina. A los siete días de la última

inmunización el conejo se sangro por punción cardiaca y la sangre se se

centrifugó a 2,000 rpm/10 min/4°C para obtener el suero. Para purificar la

inmunoglobulina IgG el suero de conejo se paso por una columna de proteína A la

cual se almacenó a -20°C.

Identificación la proteina paraflagelar por la inmunoglobulina IgG específica.

La proteína paraflagelar se detecto en extractos totales de E. histolytica por

inmunoblot. Se corrió el extracto amibiano (10µg/pozo) en geles de poliacrilamida

al 10%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas

de nitrocelulosa. Posteriormente las membranas se cortaron en tiras y se

bloquearon con leche descremada al 6% toda la noche a 4°C. Las tiras se lavaron

tres veces con PBS-T y se incubaron a 4°C toda la noche con la IgG anti-proteína

paraflagelar diluida 1:100 en PBS-T. Después las tiras se lavaron tres veces con

PBS-T y se incubaron con un anticuerpo peroxidado de cabra anti-IgG de conejo

diluido 1:1000 disuelto en PBS-T, se incubó por 2 h a 37°C o toda la noche a 4°C.

Las tiras se lavaron tres veces con PBS-T y se les adicionó la solución reveladora

(4-cloronaftol más peróxido de hidrógeno). Por último se calculo el peso molecular

de la proteína reconocida por el anticuerpo anti-proteína paraflagelar.

Inmunohistoquímica Interacción de trofozoítos de E. histolytica con los anticuerpos anti-PPF

5

Las amibas se cosecharon en fase logarítmica y se lavaron con PBS a 37°C. Se

fijaron con paraformaldehído al 4% por 2 h a 37°C. Se lavaron tres veces con PBS

y se incubaron con cloruro de amonio 50mM durante 2 horas, las amibas se

lavaron y se ajustaron a una concentración de 1X106 trofozoítos por 1 ml en PBS.

Los trofozoítos se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.25% en PBS, después de

lavar las células se incubaron en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en

PBS durante 10 min. Posterior al lavado las amibas se incubaron con el anticuerpo

de conejo anti-PPF 1:250 en PBS-T durante 1h. las amibas se lavaron y se

incubaron con el anticuerpo de chivo anti-IgG de conejo conjugado con HRP

(Sigma) 1:250 durante 1 h. La reacción se revelo con DAB (Zymed). Las muestras

incluyeron en glicerol-gelatina y se montaron en portaobjetos. Los controles

negativos se procesaron de la misma manera pero omitiendo el primer anticuerpo.

a) Formación del capping. Las amibas se cosecharon en fase logarítmica, y se lavaron con PBS a 37 °C, y se

ajustaron a una concentración de 1X106 trofozoítos por 1 ml de PBS.

Posteriormente se incubaron con 50ug/ml de Con-A durante 10 min en agitación,

se realizo lavado rápido con PBS a 37°C y se fijaron con paraformaldehído al 4%

por 2 h a 37°C. Se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con cloruro de

amonio 50mM durante 2 horas, después de lavar las células se agrego una

solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS, durante 10 min. Posterior al

lavado las amibas se incubaron con 50ug/ml de peroxidasa de rabano durante 30

min; se lavaron y la reacción se revelo con DAB (Zymed), posteriormente se

lavaron, incluyeron en glicerol-gelatina y se montaron en portaobjetos. Los

controles de procesaron de la misma manera pero omitiendo la incubación con la

Con-A.

b) Detección de la paraflagelar Las amibas se procesaron de la misma manera hasta el bloqueo con cloruro de

amonio 50mM durante 2 horas, después de lavar los trofozoítos se incubaron con

Triton X-100 al 0.25% en PBS durante 5 min, después de lavar las células se

incubaron en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS durante 10

min. Después de esto las células se incubaron con un suero de conejo anti-PPF

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paraflagelar 1:250 en PBS-T durante 1 h, después de tres lavados con PBS se

aplico el anticuerpo de chivo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Sigma) 1:250

durante 1 h, después de lavar la reacción se revelo con DAB (Zymed), se lavaron

e incluyeron en glicerol-gelatina y se montaron en portaobjetos. Los controles

negativos se procesaron de la misma manera pero omitiendo en primer anticuerpo.

Detección en amibas adheridas a cubreobjetos Las amibas se cosecharon en fase logarítmica y se transfirieron a cubreobjetos

colocados en placas de 24 pozos, se incubaron durante 30 min a 37°C para

permitir la adhesión de los trofozoítos, a cabo el medio de cultivo se retiro y las

células se lavaron con PBS a 37°C y se fijaron durante 30 min con

paraformaldehído al 4% a 37°C. Posteriormente se lavaron con PBS (4 veces) y

se permeabilizaron con una solución de Triton X-100 al 0.25% en PBS durante 5

min, después de lavar se incubaron con cloruro de amonio 50mM durante 30 min,

se lavaron y se agrego una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS,

durante 10 min. Posterior al lavado se incubaron en una solución de caseína al

0.1% en PBS durante 30 min seguido de 4 lavados con PBS. Los cubreobjetos se

incubaron con el suero de conejo anti-PPF 1:1000 en PBS durante 30 min,

después de tres lavados con PBS las células se incubaron con el anticuerpo de

chivo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Sigma) 1:250 durante 30 min,

después de lavar la reacción se revelo con DAB (Zymed). Las células se

deshidrataron en grados crecientes de etanol, se aclararon y los cubreobjetos se

montaron en portaobjetos con resina sintética.

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RESULTADOS Y DISCUSION

Como ha sido reportado, Tripanosoma tiene dos isoformas de PFR (3). Nuestros

resultados de RT-PCR demostraron la presencia de la isoforma PFR1 de

Tripanosoma en E. histolytica (Fig. 1). Esta proteína tiene un peso de 73 kDa y el

gen que codifica para esta tiene un tamaño de 1702 pb.

Posteriormente en otros ensayos de RT-PCR utilizamos otro juego de primers

(PFR-A y PFR-B) para tratar de obtener el mRNA de esa proteína y después

secuenciar estos amplicones. Los resultados muestran dos amplicones que

pudieran ser los que esperamos ya que el tamaño en pb es aproximadamente el

esperado. (Fig. 1A y 1C). Estos amplicones se purificaron para su posterior

secuenciación (Fig. 1B y 1D).

Detección de proteínas de E. histolytica por inmublot. Extractos totales de E. histolytica se separaron por electroforesis, posteriormente

se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con

el anticuerpo anti-PPF, y por ultimo se agrego un anticuerpo peroxidado de chivo

anti conejo. Una vez revelada la reacción se observo que el anticuerpo anti-PPF

reconoció una banda de 114 kDa (Fig. 2).

Identificación en E. histolytica de una proteina similar a la paraflagelar de Tripanosoma brucei Detección en células en solución. Se observo que las amibas presentan una ligera reacción positiva en su

citoplasma, sin que sea evidente una localización específica de la reacción. (Fig. 1)

Detección de la proteína paraflagelar en amibas preincubadas con concanavalina A. Las amibas incubadas previamente con Con-A mostraron

reacción positiva al péptido en zonas bien localizadas de su citoplasma cercano a

la membrana celular, que probablemente corresponden a las zonas de formación

del capuchón. (Fig. 2b)

Detección en células adheridas a cubreobjetos.

8

Las amibas mostraron en su citoplasma reacción positiva al péptido, siendo esta

de mayor intensidad en expansiones citoplasmáticas de la célula, que

posiblemente corresponden a puntos de adhesión de la célula al sustrato.

A BMarcador Marcador 1000 pb 1000 pb

930 pb 930 pb

C DMarcador Marcador 1000 pb 1000 pb

760pb 760pb

Fig.1 Presencia de genes para la proteína paraflagelar en E. histolytica. A

partir del RNA total de E. histolytica se sintetizaron cadenas complementarias de

cDNA utilizando los primers diseñados a partir de los genes pfr1 y pfr2 de

Trypanosoma brucei, posteriormente por PCR se amplificaron las cadenas de

DNA. Tanto el cDNA como el DNA se separaron en geles de agarosa y se tiñeron

con bromuro de etidio. En A se muestra el cDNA de la banda PFR-A (930pb) y en

B el DNA. En C DNA y D el DNA de la banda PFR-B (750pb).

c

9

250150100

75

50

37

25

1 2

Fig. 2 Inmunodetección de la proteína paraflagelar en extractos de E. histolytica.

Extractos totales de E. histolytica se corrieron por electroforesis, posteriormente

las proteínas se transfirieron a papeles de nitrocelulosa. Las tiras de nitrocelulosa

se incubaron con el anticuerpo anti-PPF. 1. Marcadores de peso molecular. 2.

proteínas detectada por el anticuerpo anti-PPF.

10

Fig 3. inmunoreactividad del anticuerpo anti-PPf y Con A con trofozoítos de E. histolytica . Los trofozítos de E. histolytica se incubaron con el anticuerpo

anti-PPF o con concanavalina. Para el caso de la Con A se agrego peroxidasa de

rabano y para la PPF se agrego un anticuerpo de chivo anti-conejo peroxidado. La

reacción se revelo con diaminobencidiba. En A y B se observa que las amibas

presentan una ligera reacción positiva en su citoplasma, sin que sea evidente una

localización específica de la reacción. En C y D se observa que la Con-A

reconoce a los trofozoítos, los que en su mayoría presentaron la formación de un

capuchón con esta lectina. En E y F las amibas incubadas previamente con Con-

A mostraron reacción positiva al péptido en zonas bien localizadas de su

citoplasma cercano a la membrana celular, que probablemente corresponden a las

zonas de formación del capuchón. En G y H Las amibas mostraron en su

11

citoplasma reacción positiva al péptido, siendo esta de mayor intensidad en

expansiones citoplasmáticas de la célula, que posiblemente corresponden a

puntos de adhesión de la célula al sustrato.

En resumen, los resultados demuestran que en los trofozoítos de E. histolytica se

encuentra un gen que codifica para una proteína que tiene similitud estructural con

la proteína paraflagelar de Tripanosoma. Actualmente se desconoce cual es la

función de la proteína en E. histolytica. Suponemos que puede participar en el

movimiento de los trofozoítos

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