IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE BACTERIAS CULTIVABLES ...
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IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE BACTERIAS CULTIVABLES ASOCIADAS A LOS CICLOS DEL CARBONO Y NITROGENO EN LAS CUENCAS DE LOS RIOS LA VIEJA Y OTUN (EJE CAFETERO – COLOMBIA) ANA MARIA CUBILLOS CÁRDENAS TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de BIÓLOGA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA Bogotá, D. C. Febrero de 2009
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IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE BACTERIAS CULTIVABLES
ASOCIADAS A LOS CICLOS DEL CARBONO Y NITROGENO EN LAS
CUENCAS DE LOS RIOS LA VIEJA Y OTUN
(EJE CAFETERO – COLOMBIA)
ANA MARIA CUBILLOS CÁRDENAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
BIÓLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá, D. C.
Febrero de 2009
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y
a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE BACTERIAS CULTIVABLES
ASOCIADAS A LOS CICLOS DEL CARBONO Y NITROGENO EN LAS
CUENCAS DE LOS RIOS LA VIEJA Y OTUN
(EJE CAFETERO – COLOMBIA)
ANA MARIA CUBILLOS CÁRDENAS
APROBADO
________________________
Fabio Roldán, PhD
Director
___________________ ____________________
José Salvador Montaña Ziv Arbeli
Jurado Jurado
IDENTIFICACIÓN TAXONOMICA DE BACTERIAS CULTIVABLES
ASOCIADAS A LOS CICLOS DEL CARBONO Y NITROGENO EN LAS
CUENCAS DE LOS RIOS LA VIEJA Y OTUN
(EJE CAFETERO – COLOMBIA)
ANA MARIA CUBILLOS CÁRDENAS
APROBADO
__________________________ ________________________
Ingrid Schuler, PhD Andrea Forero
Decana Académica Directora de Carrera
Agradezco a Dios por guiarme, protegerme y regalarme cada día millones de
bendiciones; a mis padres, Carlos Cubillos y Astrid Cárdenas, por el cuidado,
comprensión, apoyo y amor diario; a mi hermano Carlos por regalarme cada día un
poco de alegría; a Juan F, quien es una persona de gran importancia para mi,
gracias por tu apoyo y comprensión incondicional y Erika, por su amistad, apoyo,
comprensión y alegría durante todo el tiempo que trabajamos juntas, te considero
una persona excelente y una amiga totalmente incondicional.
Ana María Cubillos Cárdena
I
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Investigación en Biodiversidad y Recursos Genéticos (CIEBREG) y a la
Vicerrectoría de la Pontificia Universidad Javeriana por la financiación para el
desarrollo del presente trabajo.
Al Doctor Fabio Roldán quien dirigió la investigación, por el apoyo y el tiempo
brindado con amabilidad, paciencia y comprensión a lo largo del estudio.
A Victoria Vallejo por su apoyo constante durante el desarrollo del trabajo y por su
colaboración durante el desarrollo de la fase de laboratorio.
A Erika García por su constante apoyo y colaboración durante todo el desarrollo del
estudio y por su amistad en todo momento.
Al Doctor Wilson Terán por su apoyo durante la fase de laboratorio.
A Habib Yanine por su amistad y colaboración durante la fase de laboratorio.
A María Gómez por su paciencia y apoyo en el mantenimiento de las bacterias
asociadas al ciclo del nitrógeno, las cuales fueron utilizadas en el presente estudio.
A Ricardo Amaya, Aidé Sofia Muñoz, Carolina Díaz, Carolina Rubiano, Yamile
Díaz, Sra. Miryam Peña, y a todos los integrantes de USBA por la colaboración
brindada en todo momento.
A la UNESIS por su apoyo durante la toma de las muestras y a todas las personas que
influyeron y ayudaron en la realización del presente trabajo.
II
Tabla de contenido
LISTA DE TABLAS………….…………………………………………………….IV
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………….V
LISTA DE ANEXOS……………………………………………………………….VI
RESUMEN………………………………………………………………………..VIII
ABSTRACT……………………………………………………………………......IX
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... i
2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 3
2.1 El suelo............................................................................................................................ 3
2.1.1 Propiedades físicas del suelo. ................................................................................... 4
2.1.2 Propiedades químicas del suelo. .............................................................................. 7
2.2 Cobertura vegetal .......................................................................................................... 10
2.3 Las bacterias edáficas ................................................................................................... 11
2.3.1 El ciclo del nitrógeno y los grupos de bacterias asociadas. ................................... 13
2.3.2 El ciclo del carbono y bacterias asociadas. ............................................................ 15
2.4 Los servicios ecosistémicos y su importancia para las comunidades humanas. ........... 17
2.4. Efecto de las actividades antropogénicas sobre la degradación de los suelos. ............ 19
2.4.1 Degradación física del suelo .................................................................................. 21
2.4.2 Degradación química del suelo .............................................................................. 21
2.4.3 Degradación biológica del suelo ............................................................................ 21
2.5 Métodos para evaluar la densidad y riqueza de las comunidades de bacterias edáficas.
............................................................................................................................................ 24
2.5.1 Técnicas dependientes de cultivo ........................................................................... 24
2.5.2 Técnicas independientes de cultivo. ....................................................................... 27
3. PROBLEMA Y JUSTIFICACION .............................................................................. 29
4. OBJETIVOS .................................................................................................................... 31
4.1 Objetivo general ............................................................................................................ 31
III
4.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 31
5. HIPÓTESIS ...................................................................................................................... 32
5.1 Predicción 1 .................................................................................................................. 32
6. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 33
6.1 Área de estudio ............................................................................................................. 33
6.1.1 Cuenca del río La vieja .......................................................................................... 33
6.1.2 Cuenca del río Otún ............................................................................................... 34
6.2 Metodología de muestreo .............................................................................................. 35
6.3 Métodos......................................................................................................................... 37
6.3.1 Extracción de DNA a partir de aislamientos puros ................................................ 38
6.3.2. Descripción de los iniciadores utilizados. ............................................................. 40
6.3.3. Amplificación de la región V3 de la subunidad 16S ribosomal. ........................... 40
6.3.4 Detección de los productos de PCR ....................................................................... 41
6.3.5 Secuenciación de los productos de PCR y análisis bioinformáticos. ..................... 42
6.3.6 Análisis de los aislamientos identificados taxonómicamente con relación a los usos
de suelo evaluados. ......................................................................................................... 42
7. RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................................. 43
7.1 Identificación taxonómica de los aislamientos obtenidos para cada grupo funcional. . 43
7.1.1 Bacterias degradadoras de hidrocarburos. .............................................................. 43
7.1.2 Bacterias desnitrificantes. ...................................................................................... 48
7.1.3 Bacterias nitrificantes (BOA y BON). ................................................................... 50
7.2.1 Bacterias degradadoras de hidrocarburos en las cuencas de los ríos La vieja y
Otún................................................................................................................................. 53
7.2.2 Bacterias desnitrificantes en las cuencas de los ríos La vieja y Otún. ................... 63
7.3 Relación de los usos del suelo estudiados de acuerdo a la composición de las
comunidades de bacterias cultivables. ................................................................................ 68
8. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 72
9. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 73
10. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 74
ANEXOS……...……………………………………………………………………..97
IV
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de los microorganismos según el tipo de
nutrición………………………………………………………….………...…….12
Tabla 2. Categorías asignadas a diferentes servicios ecosistémicos………..….18
Tabla 3. Ventajas y desventajas de las técnicas dependientes de cultivo para el
estudio de bacterias cultivables…………………………………………….…....25
Tabla 4. Definición de algunas técnicas dependientes de cultivo……………….26
Tabla 5. Ventajas y desventajas de las técnicas independientes de cultivo……..27
Tabla 6. Definición de algunas técnicas independientes de cultivo……………..28
Tabla 7. Usos del suelo seleccionados y fincas muestreadas en la cuenca del río
La vieja...................................................................................................................34
Tabla 8. Usos del suelo seleccionados y fincas muestreadas en la cuenca del río
Otún........................................................................................................................35
Tabla 9. Microorganismos degradadores de hidrocarburos y de compuestos de
interés ambiental con los cuales se presentó similaridad
…………………………………………………………………………………..47
Tabla 10. Presencia-ausencia de géneros en los diferentes usos del suelo en la
cuenca del río La vieja (Junio y Septiembre 2006) (A) y en la cuenca del río Otún
(Junio y Septiembre 2006) (B)…………………………………………………59
Tabla 11. Presencia-ausencia de géneros desnitrificantes en los diferentes usos
del suelo en la cuenca del río La vieja (Junio y Septiembre 2006) (A) y en la
cuenca del río Otún (Junio y Septiembre 2006) (B)……………………………..67
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Metodología de muestreo empleada durante el estudio………….….….36
Figura 2 Géneros de bacterias en la cuenca del río La Vieja (Junio – Septiembre de
2006), n= 40...…………………………………..........................................................45
Figura 3. Géneros de bacterias en la cuenca del río Otún (Junio – Septiembre de
2006), n= 62……………………………………..………………………….….…..45
Figura 4. Géneros de bacterias desnitrificantes en la cuenca del río La Vieja (Junio –
Septiembre de 2006), n= 22……………………….…................................................49
Figura 5. Géneros de bacterias en la cuenca del río Otún (Junio – Septiembre de
2006), n= 12. …………………………………………………………………...……50
Figura 6. Número de aislamientos bacterianos diferentes de BDH en los usos de
suelo estudiados, cuenca del río La Vieja…………………………………………...55
Figura 7. Número de aislamientos bacterianos diferentes de BDH en los usos de
suelo estudiados, cuenca del río Otún. ………………………………………..…….57
Figura 8. Comportamiento anual de la precipitación media mensual para las áreas de
muestreo……………………………………………………………….…...……….62
Figura 9. Número de aislamientos bacterianos diferentes desnitrificantes en los usos
de suelo estudiados, cuenca del río La Vieja……………………………….……….66
Figura 10. Número de aislamientos bacterianos diferentes desnitrificantes en los usos
de suelo estudiados, cuenca del río Otún.……………………...…………….…...…66
Figura 11. Dendograma de similaridad con base en la composición taxonómica de
aislamientos bacterianos identificados en la cuenca del río La vieja (Junio y
Septiembre)………………………………………………..........................................69
Figura 12. Dendograma de similaridad con base en la composición taxonómica de
aislamientos bacterianos identificados en la cuenca del río Otún (Junio y
Septiembre)………………………………………………………………………..…71
VI
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Departamentos donde se tomaron las muestras de suelo para el estudio en el
eje cafetero (Colombia)……………………………………………………………...97
Anexo 2. Cuenca del río La vieja y distribución de los sistemas productivos del
área...............................................................................................................................98
Anexo 3. Cuenca del río Otún y distribución de los sistemas productivos del
área…………………………………………………………………………..….…..99
Anexo 4A. Preparación del buffer TE………………………………………….......100
Anexo 4B. Preparación del buffer de carga para corrido de electroforesis en
agarosa……………………………………………………………………….…….100
Anexo 5A. Preparación del gel de agarosa al 1% y al 2% p/v………………….….101
Anexo 5B. Preparación del buffer TAE 0.5X………………………………….…..101
Anexo 6. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los
genes 16S rDNA de BDH, en la cuenca del río La Vieja………………...…….......102
Anexo 7. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los
genes 16S rDNA de BDH, en la cuenca del río Otún……………..…………....….103
Anexo 8. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los
genes 16S rDNA de bacterias desnitrificantes, en la cuenca del río La Vieja…..…105
Anexo 9. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los
genes 16S rDNA de bacterias desnitrificantes, en la cuenca del río Otún………….106
Anexo 10. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes
usos de suelo estudiados y el número de aislamientos diferentes en la cuenca del río
La vieja, Junio. ……………………...……………………………………………...107
Anexo 11. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes
usos de suelo estudiados y el número de aislamientos diferentes en la cuenca del río
La vieja, Septiembre……………………. ……………………................................108
VII
Anexo 12. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes
usos de suelo estudiados y el número de aislamientos diferentes en la cuenca del río
Otún, Junio. …………………………………………………………………..……109
Anexo 13. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes
usos de suelo estudiados y el número de aislamientos diferentes en la cuenca del río
Otún, Septiembre. .....................................................................................................110
Anexo 14. Distribución de los aislamientos identificados de bacterias desnitrificantes
en los diferentes usos de suelo estudiados y el número de aislamientos diferentes en la
cuenca del río La vieja, Junio. ……………………………………………………111
Anexo 15. Distribución de los aislamientos identificados desnitrificantes en los
diferentes usos de suelo estudiados y el número de aislamientos diferentes en la
cuenca del río La vieja, Septiembre……………………………………………….112
Anexo 16. Distribución de los aislamientos identificados de denitrificantes en los
diferentes usos de suelo estudiados y el número de aislamientos diferentes en la
cuenca del río Otún (Junio y Septiembre)…….........................………………..…..113
VIII
RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue identificar taxonómicamente los aislamientos
obtenidos para cuatro grupos funcionales bacterianos cultivables asociados a los
ciclos del carbono (bacterias degradadoras de HCs - BDH) y del nitrógeno
denitrificantes y oxidadoras de nitrito - BON y amonio - BOA) en las cuencas de los
ríos La vieja y Otún en la región cafetera colombiana. Se realizaron dos eventos de
muestreo, los cuales corresponden a épocas transicionales de lluvias (Junio y
Septiembre de 2006) seleccionando tres usos del suelo representativos para cada
cuenca. Para cada uso del suelo se eligieron dos fincas y en cada una se tomaron tres
puntos, obteniéndose 96 muestras de suelo (48 en cada muestreo). Las muestras de
suelo fueron procesadas por otros investigadores en estudios anteriores, donde se
aislaron un gran número de bacterias, las cuales fueron identificadas
taxonómicamente en el presente estudio utilizando técnicas moleculares como PCR
de la subunidad 16S rDNA y posterior secuenciación. Se obtuvo un mayor número de
aislamientos identificados para el grupo de bacterias degradadoras de hidrocarburos
en comparación con los grupos de bacterias asociadas al ciclo del nitrógeno. El
número de aislamientos bacterianos diferentes de BDH fue variable entre los
diferentes usos del suelo y entre las épocas de muestreo, observándose una tendencia
de aumento en el mes de Septiembre. Los usos del suelo se asociaron de acuerdo a la
composición de las comunidades de bacterias cultivables y se observaron
agrupaciones de aquellos suelos intervenidos por el hombre. En cuanto a BON y
BOA, se obtuvieron muy pocos aislamientos identificados, y un gran número de
aislamientos mostraron similaridad con secuencias de 16S rDNA de bacterias no
cultivadas hasta el momento.
Palabras claves: bacterias edáficas, PCR, subunidad 16S ribosomal, uso del suelo.
IX
ABSTRACT
The objective of the present study was to do a taxonomic identification of bacterial
isolates belonging to four cultivable bacterial functional groups linked to the carbon
cycle (hydrocarbon degrading bacteria – HDB) and nitrogen cycle (denitrifying,
nitrite oxidizer – NOB and ammonium oxidizer – AOB) in the La vieja and Otún
basin rivers in the colombian coffee region. We carried out two sampling event,
corresponding to transitional periods of precipitations (June and September, 2006)
selecting three representative soil uses for each basin. In each soil use we choose two
representative farms and in each of them we choose three sites, obtaining a sum of 96
soil samples (48 for each sampling event). The soil samples were processed by other
researchers in past investigations, where they isolate a great number of bacterias, and
in this study they were submitted to taxonomic identification through PCR of the 16S
rDNA and posterior sequencing. We obtained a bigger number of isolates for the
hydrocarbon bacterial group in comparison with groups linked to the nitrogen cycle.
The number of different isolates of HDB was variable between the different soil uses
and between the sampling events, observing a rising for September. The soil uses
clustered in agreement with the composition of the cultivable bacterial communities,
and we observed clusters formed by those soils most disturbed by man. With respect
to NOB and AOB, we obtain very few identified isolates, and a great number of
isolates genetically related with 16S ribosomal parcial sequences belonging to non
cultivable bacteria at this time.
Key words: edafic bacterias, PCR, 16S ribosomal subunit, soil use.
1
1. INTRODUCCIÓN
El desarrollo de las comunidades humanas ha generado la transformación de
diferentes ecosistemas de manera parcial o total con el fin de utilizar los suelos para
obtener alimentos y bienes, lo cual viene acompañado del uso de insumos agrícolas
(plaguicidas y fertilizantes) para aumentar la productividad de estos sistemas. Estas
acciones han producido diferentes tipos de degradación en los suelos, generando
graves consecuencias para los ecosistemas terrestres y acuáticos.
El suelo es un sistema complejo, heterogéneo y dinámico que provee un rango amplio
de hábitats capaces de soportar a todos los organismos vivos. Un solo gramo de suelo
puede albergar un estimado de 108 bacterias, de las cuales se pueden encontrar
cientos de especies diferentes. Esta gran diversidad de especies cumple funciones
importantes en el mantenimiento de los procesos ecosistémicos, ya que al parecer, los
microorganismos son los únicos capaces de sostener la biosfera sin la presencia de
macro organismos.
Se ha determinado que las bacterias edáficas presentan una alta sensibilidad a
cualquier cambio en su entorno, lo cual genera consecuencias directas sobre los ciclos
biogeoquímicos en los cuales participan y afecta procesos importantes como el ciclaje
de nutrientes y la productividad del ecosistema. Por esto, las bacterias han sido
utilizadas como indicadores del grado de disturbio de los ecosistemas, lo cual se
refleja en cambios estructurales y de composición de las comunidades en
comparación con sitios poco o nada intervenidos por el hombre.
El presente trabajo se desarrolló en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología
Ambiental (USBA), la cual se encuentra vinculada al centro de excelencia CIEBREG
(Centro de investigaciones en biodiversidad y recursos genéticos) en el proyecto
2
denominado Valoración de bienes y servicios ambientales de la biodiversidad para el
desarrollo sostenible de paisajes rurales en el complejo ecorregional Andes del Norte
(CEAN). Cabe aclarar, que los aislamientos utilizados en el presente trabajo fueron
obtenidos en estudios anteriores desarrollados en la USBA dentro del CIEBREG, en
los cuales se determinaron las abundancias parciales de cada grupo funcional en los
usos de suelo evaluados.
El objetivo del presente trabajo fue identificar taxonómicamente los aislamientos
obtenidos para cuatro grupos funcionales bacterianos cultivables asociados a los
ciclos del carbono (bacterias degradadoras de HCs - BDH) y del nitrógeno (bacterias
oxidadoras de nitrito - BON, oxidadoras de amonio - BOA y denitrificantes) en las
cuencas de los ríos La vieja y Otún en la región cafetera colombiana.Para cumplir
este objetivo, se realizó una identificación taxonómica de los aislamientos obtenidos
para cada grupo funcional, se determinó el número de aislamientos bacterianos
difererentes para cada grupo en cada uso del suelo evaluado y finalmente se
relacionaron los diferentes usos del suelo de acuerdo a la composición de la
comunidad bacteriana cultivable.
3
2. MARCO TEÓRICO
2.1 El suelo.
El suelo es definido como aquella zona sobre la superficie terrestre conformada por
materiales orgánicos y materiales minerales no consolidados, el cual provee un
ambiente para los organismos vivos (Voroney, 2007). Adicionalmente, es
considerado como un sistema capaz de soportar el crecimiento de las plantas y
organismos superiores debido a que alberga nutrientes, minerales y materia orgánica.
En esta zona de la superficie terrestre, los materiales orgánicos son descompuestos
para formar agregados húmicos estables de tal modo que se liberen aquellos
nutrientes útiles para los organismos (Lavelle y Spain, 2003).
El suelo ejerce 5 funciones principales en los ecosistemas:
1. Provee un soporte mecánico para el crecimiento de las plantas (Bronick y Lal,
2005).
2. Proporciona un hábitat para la mayoría de los organismos (NRCS, 2008).
3. Almacena materiales orgánicos en muchos estadíos de descomposición (p.e.
raíces de plantas muertas recientemente y materiales humificados antiguos y
complejos).
4. Permite el ciclaje de nutrientes a través de diferentes ciclos biogeoquímicos
(NRCS, 2008).
5. Liberar elementos de gran importancia biológica y pedológica (p.e. ciertas
formas de hierro y aluminio). Durante el proceso de descomposición de
materiales orgánicos, estos elementos son liberados de forma controlada en
formas inorgánicas, proceso denominado mineralización. De esta manera las
raíces de las plantas y otros organismos edáficos pueden utilizarlos para
obtener energía (Lavelle y Spain, 2003).
4
6. Almacena agua para soportar el crecimiento de plantas y otros organismos
(Bronick y Lal, 2005).
La biota que habita el suelo genera cambios en la distribución y estructura de los
componentes abióticos, y como resultado se forman microhábitats de tamaños y
condiciones ambientales diferentes (Badano et al., 2007). Dentro de esta biota se
encuentran organismos (p.e. anélidos, termitas, hormigas) que modifican físicamente
el suelo al promover cambios sobre la agregación, porosidad y disponibilidad de la
materia orgánica. Adicionalmente, están los microorganismos, que originan cambios
químicos al mediar transformaciones de sustratos orgánicos a inorgánicos mediante
actividades bioquímicas de degradación propias de su metabolismo (Lavelle y Spain,
2003). Los cambios físico-químicos dirigidos por los microorganismos, generan gran
diversidad de hábitats y consecuentemente mayor diversidad de especies (Jouquet et
al., 2006).
2.1.1 Propiedades físicas del suelo.
El estudio de las propiedades físicas del suelo es considerado de gran importancia
debido a que determinan la presencia o ausencia de los organismos en un sitio
determinado (Bronick y Lal, 2005). Además, estas propiedades varían según la escala
de estudio, para microorganismos se estudian fracciones de suelo de micrómetros,
mientras que para organismos superiores se estudian rangos de hábitat de metros o
incluso paisajes enteros (Voroney, 2007).
5
2.1.1.1 Textura y estructura.
La textura esta determinada por el tamaño de las partículas inorgánicas en el suelo,
las cuales se han clasificado en tres categorías: arena (0.05 – 2 mm), limo (0.002 –
0.05 mm) y arcilla (<0.002 mm) (Lavelle y Spain, 2003). La estructura del suelo es
definida de acuerdo al tamaño, forma y disposición de las partículas y poros, la
continuidad de los poros y la capacidad de estos para retener y transmitir fluidos,
sustancias orgánicas e inorgánicas (Bronick y Lal, 2005). La estructura, ha sido
considerada importante para las bacterias edáficas, debido a que se relaciona con el
nivel de actividad de estas en un determinado suelo (Bronick y Lal, 2005).
2.1.1.2 Temperatura.
Se ha determinado que este factor influye en las tasas de procesos físicos, químicos y
biológicos (Lavelle y Spain, 2003). Así, un incremento de la temperatura induce un
cambio en la actividad enzimática, en la abundancia (Wardle, 2005) y composición
de las comunidades de bacterias, debido a que una temperatura demasiado elevada
genera procesos de inactivación enzimática la cual afecta algunas especies de
bacterias no adaptadas a estas condiciones. Passianoto y col. (2004) determinaron que
existe una relación inversa entre las emisiones de oxido nítrico (NO) y la temperatura
del suelo, cuando la temperatura era mayor a 35°C se observó una disminución en las
emisiones de NO. Esta disminución atribuyó que las bacterias nitrificantes
disminuyeron la velocidad a la cual se llevaban a cabo los procesos relacionados con
la nitrificación, debido a que la velocidad de dichos procesos se vió afectada por la
temperatura, teniendo en cuenta que el rango adecuado de este proceso se encuentra
entre 30 y 35°C. En otro estudio realizado por Reth y col. (2005), se hallaron
correlaciones positivas entre la temperatura del suelo y la producción de CO2
proveniente de la actividad de bacterias heterótrofas. Sin embargo, encontrar una
6
relación directa e individual entre la temperatura y la actividad biológica no es
sencillo ya que existen otros factores como el pH o la humedad del suelo, que pueden
disminuir el metabolismo celular si los valores se encuentran fuera del rango óptimo
para las bacterias (Voroney, 2007; Steinweg et al., 2008).
2.1.1.3 Contenido de agua.
La humedad contenida en el suelo afecta el agua disponible para los organismos. Así
mismo, afecta la aireación del suelo, la naturaleza y la cantidad de materiales
solubles, la presión osmótica y el pH de la solución del suelo. Esta propiedad es
considerada de gran importancia debido a que actúa como un agente transportador a
través del cual se difunden gran cantidad de moléculas las cuales son nutrientes para
las bacterias que los toman disueltos. El agua actúa como un solvente y como un
reactante para reacciones químicas y biológicas importantes. El contenido de agua
puede ser medido con base en su masa, así, la masa de agua que se pierde por
evaporación en un suelo sometido a 105°C se denomina contenido gravimétrico
(Voroney, 2007). Se han realizado varios estudios a través de los cuales se ha
demostrado como los cambios en la humedad del suelo afectan las comunidades de
bacterias. Stark y col. (1995), determinaron que un descenso de la humedad del suelo
causa deshidratación celular y un descenso del 75% de las tasas de nitrificación en
bacterias oxidadoras de amonio. Esto es debido a que las bacterias edáficas necesitan
de ambientes hidratados para prevenir la plasmólisis, mantener la integridad celular y
obtener sus nutrientes. Cuando ocurre un descenso de la humedad del suelo, la
solución se vuelve más concentrada y las bacterias deberán elevar su concentración
interna de solutos para no morir. Al elevar la concentración interna de solutos, se
inhibe la actividad enzimática debido a que una disminución del potencial de agua
reduce el grado de hidratación de las enzimas, las cuales cambian de conformación y
así mismo se afecta su funcionamiento (Stark et al., 1995). En otro estudio más
reciente realizado por Horz y col. (2004), se observó que un aumento en la humedad
7
del suelo generó una menor disponibilidad del nitrógeno del suelo y generándose un
cambio en la comunidad de bacterias oxidadoras de amonio.
2.1.2 Propiedades químicas del suelo.
Las propiedades químicas varían de un suelo a otro, dependiendo de la composición
del material parental original y de los factores que acompañaron la formación del
mismo (Bardgett et al., 2005). Son consideradas de gran importancia, ya que afectan
las relaciones planta-suelo, la calidad del agua, la capacidad amortiguadora del suelo,
la disponibilidad de nutrientes (USDA, 1996) y ejercen grandes efectos sobre las
comunidades de bacterias edáficas (Voroney, 2007). Debido a que la solución del
suelo es considerada como un electrolito débil, compuesto de gran variedad de
aniones y cationes (Stotzky, 1997), su bioquímica está determinada por reacciones de
oxido-reducción y por reacciones ácido-base, las cuales controlan el movimiento de
electrones hacia moléculas aceptoras de electrones alternativas (Voroney, 2007).
Además, cualquier cambio en la composición iónica de la solución del suelo puede
tener efectos sobre el crecimiento y la actividad de las bacterias edáficas (Stotzky,
1997; Wang et al., 2008).
2.1.2.1 pH
El pH se refiere a la concentración y proporción de iones hidrógeno H+ e hidroxilos
OH-
provenientes de la disociación del agua. En una solución neutral (pH= 7.0), el
número de iones hidrogeno es igual al número de iones hidroxilo, y cualquier cambio
en esta proporción genera un cambio del pH hacia un estado mas ácido (< 7.0) o mas
básico (>7.0) (McArthur, 2006).
8
Esta propiedad química es considerada de gran importancia debido a que influye
sobre un gran número de factores que afectan la actividad microbiana (Voroney,
2007). Se ha observado que los microorganismos tienen rangos de pH óptimos para
su crecimiento los cuales se encuentran generalmente cercanos a la neutralidad (entre
6 y 7), igualmente se ha determinado que la disponibilidad de nutrientes es mayor
dentro de ese rango (Lavelle y Spain, 2003). En un estudio realizado por
Pommerening-Röser y Koops (2005), se determinó que las bacterias oxidadoras de
amonio del género Nitrosospira se distribuyeron a lo largo de gradientes de pH en
suelos ácidos, lo cual pudo ser a que en este género existen especies que poseen
sistemas para la toma de la úrea, los cuales funcionan a pH diferentes. Así, se observó
que a pH neutros las tasas de ureolisis aumentaron.
2.1.2.2 Materia orgánica
La materia orgánica es introducida al suelo por pequeñas adiciones de hojarasca,
raíces y animales en descomposición, que varían en su complejidad física, química
(relación C:N) y espacial, creando parches ricos en nutrientes (Hodge et al., 2000). Se
caracteriza por ser amorfa, su composición es variable y una porción de esta se
encuentra en flujo constante debido a la acción de los microorganismos que la utilizan
para obtener energía. Se han determinado dos clases de materia orgánica (Stanley,
1995): a) con sustancias húmicas, las cuales forman la mayoría de la materia orgánica
y se descompone lentamente. Son compuestos químicamente complejos con pesos
moleculares elevados y b) con sustancias no húmicas, las cuales son degradadas por
microorganismos, por lo cual desaparece rápidamente. Esta formada por
carbohidratos, proteínas, aminoácidos, grasas, ceras, alcanos y ácidos organicos de
bajo peso molecular.
9
La materia orgánica presenta la siguiente composición química (Stanley, 1995):
C=50%; O=39%; N=5%; H=5%; P=0.5% y S=0.5%. Sin embargo, estos valores
pueden variar de un suelo a otro, dependiendo del tipo de suelo y de el tipo de uso
que se le de a este. En términos generales, la materia orgánica del suelo provee
muchas de las fuentes de energía y de los nutrientes esenciales para los
microorganismos (Swinton et al., 2007).
La cantidad de materia orgánica esta determinada por diferentes factores como las
condiciones climáticas, la aireación del suelo, pH, población microbiana edáfica,
practicas de manejo agrícola, fertilización, irrigación y erosión, entre muchos factores
más (Cathcart, 2003).
2.1.2.3 Nutrientes
Son elementos y compuestos que según su abundancia en el ambiente han sido
divididos en macronutrientes (C, O, H, N, S y P) y micronutrientes (Mn, Zn, Co, Mo,
Ni y Cu). Son considerados de gran importancia porque forman parte de
carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, enzimas y cofactores que
participan en procesos de catálisis y mantenimiento de la estructura de diferentes
moléculas orgánicas importantes para el desarrollo de los seres vivos. En el caso de
las bacterias, utilizan los nutrientes para producir energía y formar nuevos
componentes celulares para aumentar su biomasa (Prescott et al., 2005).
Aunque los nutrientes son encontrados naturalmente en el suelo como resultado de
los ciclos biogeoquímicos, estos pueden ingresar al sistema por vías alternas mediante
el uso de pesticidas, fertilizantes o mediante procesos de descomposición de
organismos muertos.
10
Das y Mukherjee (2000) demostraron que al utilizar plaguicidas con diferentes
composiciones (hidrocarburos clorinados, organofosfatados, carbamato y grupos
sintéticos de piretroides), estos eran degradados por microorganismos utilizando los
residuos como nutrientes para su crecimiento. Igualmente, los mismos investigadores
argumentan que al aplicar un plaguicida habrá bacterias que no estén adaptadas para
sobrevivir, consecuentemente morirán y entrarán en un proceso de descomposición
natural liberando al ambiente los nutrientes. Por el contrario, las bacterias que si
sobrevivieron utilizaron los nutrientes liberados y aumentaron su biomasa, como es el
caso de las actinobacterias del género Streptomyces.
2.2 Cobertura vegetal
Se refiere a la capa de vegetación natural que cubre la superficie terrestre, la cual es
definida por el Instituto de Hidrología, Meteorología y Medio Ambiente (IDEAM,
2001) como aquella unidad delimitada por sus características físicas y ambientales a
partir de imágenes de satélite.
La cobertura vegetal es un factor biótico que determina la composición de las
comunidades microbianas ya que todas las especies de plantas poseen y expulsan a la
rizósfera compuestos carbonados diferentes, los cuales pueden alterar las
características físico-químicas del suelo, favoreciendo el crecimiento de especies de
bacterias diferentes dependiendo de la composición de la cobertura vegetal (Nüsslein
y Tiedje, 1999).
En un estudio realizado por Kong y col. (2008), se observó que al comparar dos
variedades de arroz, una que expulsaba a la rizósfera compuestos alelopáticos y la
otra variedad no, se encontraron diferencias entre las comunidades de bacterias
asociadas a cada una de las variedades. Se determinó, que los cultivos de arroz
11
alelopáticos pueden reducir las poblaciones de bacterias cultivables y no cultivables
en comparación con la variedad de arroz no alelopática. En otro estudio, realizado por
Kozdrój y van Elsas (2000), se realizó un experimento al despositar una mezcla de
azucares, ácidos orgánicos y aminoácidos en un suelo, simulando un proceso de
rizodeposición por parte de las plantas. Los resultados obtenidos demostraron que la
rizodeposición condujo a un aumento en la abundancia de bacterias heterótrofas
cultivables y a cambios en la estructura de las comunidades bacterianas.
2.3 Las bacterias edáficas
Son células procariotas que se caracterizan por poseer rRNA bacteriano y lípidos de
membrana, principalmente diésteres de diacil glicerol (Prescott et al., 2005). Miden
entre 0.3 – 3 µm y exhiben gran variedad de formas (p.e. bacilos, cocos, vibrios y
fusiforme) dependiendo de la especie y del momento específico del ciclo de cultivo
(Koch, 2006). Actualmente, son consideradas como el grupo que presenta la mayor
diversidad taxonómica y funcional existente sobre la tierra (Killham y Prosser, 2007).
Las bacterias edáficas se han clasificado en diferentes grupos de acuerdo al tipo de
nutrición que presenten (Tabla 1).
12
Tabla 1. Clasificación de los microorganismos según el tipo de nutrición.
Tipo de nutrición Fuente de
energía
Donador de
electrones
Fuente de
carbono
Microorganismos
representativos
Autótrofo fotolitotrófico Luz solar Hidrógeno
inorgánico CO2
Cianobacterias
Bacterias purpuras y
verdes
Heterótrofo
fotoorganotrófico Luz solar
Hidrógeno
orgánico
Compuesto
orgánico,
CO2
Bacterias purpura y
verde no sulfurosa.
Autótrofo
quimiolitotrófico
Compuesto
inorgánico
Compuestos
inorgánicos CO2
Bacterias oxidadoras de
azufre.
Bacterias nitrificantes
Bacterias oxidadoras de
hierro.
Heterótrofo
quimioorganotrófico
Compuesto
orgánico
Compuestos
orgánicos
Compuesto
orgánico
Mayoría de bacterias no
fotosintéticas (incluidas
la mayoría de
patógenos)
Tomado de Prescott y col. (2005).
Existen otros grupos los cuales se definen de acuerdo a la respuesta que presenten
frente a un proceso específico del ecosistema o frente a condiciones ambientales
determinadas, los cuales han sido denominados grupos funcionales (Hooper et
al.,2005). Son grupos polifiléticos de especies que comparten características
fisiológicas, bioquímicas o tróficas y juegan roles equivalentes en las comunidades
naturales y los ecosistemas. Por ejemplo, algunas características compartidas pueden
ser el hábitat en el que viven los organismos del grupo, la biomasa o la estructura que
imparten en la comunidad, las tasas de crecimiento o la forma en que obtienen
energía para crecer (Steneck, 2001).
Las bacterias edáficas que integran los diferentes grupos funcionales son
consideradas de gran importancia para el funcionamiento adecuado de los ciclos
13
biogeoquímicos, debido a que permiten el movimiento y la conversión de diferentes
compuestos reciclando los nutrientes. Así mismo, las bacterias se involucran en
procesos de descomposición de materia orgánica y contaminantes (Wolf y Wagner,
2005), los cuales son considerados como un peligro para la salud y bienestar de las
comunidades humanas y la fauna silvestre.
2.3.1 El ciclo del nitrógeno y los grupos de bacterias asociadas.
Las bacterias asociadas al ciclo del nitrógeno cumplen una función básica dentro del
ecosistema la cual consiste en hacer disponible el nitrógeno, convirtiendo aquellas
formas no disponibles del elemento (p.e. que se encuentran adheridas a la materia
orgánica del suelo, restos de animales, raíces de plantas o en la atmósfera) en
compuestos que puedan ser utilizados por otros organismos (p.e. NH4+
y NO3-) y
consecuentemente permitiendo que el elemento sea reciclado a través de las redes
tróficas. La importancia de que este elemento sea reciclado radica en que es un
componente esencial de proteínas, material genético, clorofila y otra gran cantidad de
moléculas orgánicas importantes (Vitousek, et al., 1997).
El ciclo del nitrógeno está dividido en varias etapas las cuales son mediadas por
diferentes grupos funcionales: bacterias fijadoras de nitrógeno, las bacterias
nitrificantes (BOA y BON), denitrificantes (reductoras de nitrato) (McArthur, 2006) y
un grupo de bacterias capaces de oxidar el amonio hasta nitrógeno atmosférico bajo
condiciones anaerobias, proceso denominado Anammox (Shivaraman y Shivaraman,
2003).
La primera etapa de este ciclo se denomina fijación de nitrógeno, proceso llevado a
cabo por bacterias libres, simbióticas y cianobacterias. Consiste en la unión de
moléculas de nitrógeno atmosférico (N2) y moléculas de oxígeno o hidrógeno para
14
formar compuestos inorgánicos como amonio (NH4+) y nitrato (NO3
-) los cuales son
utilizados por otras bacterias edáficas y por las plantas (Vitousek et al., 1997).
La nitrificación es la segunda etapa dentro de este ciclo, es realizado por el grupo
BOA conformado por bacterias aerobias quimiolitoautótrofas quienes son capaces de
oxidar el ión amonio (NH4+) hasta nitrito (NO2
-) (p.e. Nitrosomonas) y el grupo BON
oxida el nitrito hasta nitrato (NO3-) (p.e. Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus y
Nitrospira) (Millenium Ecosystem Assessment, 2005).
La desnitrificación es la tercera etapa llevada a cabo por bacterias anaerobias o
facultativas que pueden ser autótrofas o heterótrofas. Durante este proceso ocurre una
reducción de algunas formas oxidadas del nitrógeno (p.e. NO2- y NO3
-) mientras
ocurre oxidación de la materia orgánica, para obtener como producto final moléculas
de nitrógeno atmosférico (N2) (McArthur, 2006).
Una última etapa descubierta, ha sido denominada Anammox, es un proceso llevado a
cabo bajo condiciones anaerobias, donde el amonio (NH4+) es oxidado hasta
nitrógeno atmosférico (N2) mediante la siguiente reacción (Shivaraman y
Shivaraman, 2003):
NH4+
+ NO2- =
N2 + 2H2O
Al parecer, el nitrito (NO2-) es utilizado como aceptor de electrones y el dióxido de
carbono (CO2) como la única fuente de carbono para el crecimiento (Shivaraman y
Shivaraman, 2003).
15
2.3.2 El ciclo del carbono y bacterias asociadas.
El carbono es considerado un elemento esencial para la vida del planeta, debido a que
es un elemento estructural (Lavelle y Spain, 2003) que forma aproximadamente la
mitad de la biomasa de plantas, animales y microorganismos (Skole et al., 1997).
Este elemento se encuentra formando gran parte de la litósfera (incluyendo los
suelos), la biósfera, la atmósfera, la hidrósfera y la transferencia de este ocurre como
parte del ciclo global del carbono (Skole et al., 1997; Lavelle y Spain, 2003).
El carbono es transferido al suelo principalmente a través de la hojarasca, mediante
procesos de descomposición y por medio de los exudados de las plantas. Los
microorganismos edáficos participan activamente en procesos de descomposición de
la hojarasca, de la materia orgánica, y mediante estos procesos toman el carbono y lo
incorporan al suelo el cual puede encontrarse en diferentes formas químicas para
obtener en energía y aumentar su biomasa. Al mismo tiempo, el carbono es liberado
en forma de CO2 como producto del metabolismo microbiano, el cual es utilizado por
las plantas para llevar a cabo procesos como la fotosíntesis y la respiración para
formar biomasa (Lavelle y Spain, 2003). De esta manera, se puede observar como la
actividad bioquímica de los microorganismos conduce una parte del ciclo del carbono
a través de una porción biótica en la litósfera (Hättenschwiler et al., 2005).
Las bacterias degradadoras de hidrocarburos son consideradas de gran importancia
para el funcionamiento de muchos procesos ecosistémicos como el ciclaje de
nutrientes (Wolf y Wagner, 2005), la descomposición de materia orgánica (Nüsslein
y Tiedje, 1999) y la oxidación de compuestos residuales orgánicos que permiten la
degradación y eliminación de sustancias nocivas, consideradas como xenobióticos
(p.e. pesticidas), con un potencial elevado de persistencia y bioacumulación en el
ambiente (Zohair et al., 2006).
16
Estas bacterias son encontradas comúnmente formando parte de la biota edáfica y
utilizan diversos compuestos orgánicos para obtener energía y sintetizar nuevas
células (biomasa) (Wolf y Wagner, 2005). Algunos de los compuestos utilizados se
encuentran formando parte de la materia orgánica de los suelos (p.e. alcanos y
carbohidratos) (Stanley, 1995), pueden formar parte de residuos vegetales en
descomposición (p.e. complejo ligno-celulosa) (Martínková et al., 2008) o bien
pueden ser producidos y transportados al suelo mediante los exudados de las plantas
(Nüsslein y Tiedje, 1999). Nilsson y Björdal (2008) y Vargas y col. (2007)
determinaron la presencia de bacterias degradadoras del complejo ligno-celulosa a
partir de muestras provenientes de madera vegetal y de compostaje respectivamente.
Así mismo, los componentes residuales de fertilizantes y pesticidas pueden ser
utilizados como fuente de carbono y energía por estas bacterias debido a que en
algunos casos los productos contienen compuestos orgánicos como hidrocarburos
aromáticos (p.e. naftaleno, dibenzoantraceno) (Zohair et al., 2006; Hui Mo et al.,
2007).
Dentro de los géneros mas representativos de estas bacterias se encuentran Bacillus,
Corynebacterium, Pseudomonas, Flavobacterium, Micrococcus, Acinetobacter,
Aerococcus (Ayotamuno et al., 2006) y Micobacterium (Supaphol et al., 2006), los
cuales han sido aislados de ambientes terrestres.
17
2.4 Los servicios ecosistémicos y su importancia para las comunidades humanas.
Los servicios ecosistémicos son definidos como aquellos beneficios derivados de la
transformación de los recursos naturales, los cuales contribuyen al bienestar
económico y social de las comunidades humanas (Binning et al., 2001). Sin embargo,
el problema que enfrentan actualmente las comunidades humanas es que los servicios
ecosistémicos están declinando, y así mismo lo harán los beneficios obtenidos a partir
de estos (Millenium Ecosystem Assessment, 2005) y son considerados como
procesos complejos con un elevado nivel de sofisticación para que puedan ser
reproducidos por el hombre incluso con una alta tecnología. Además, los servicios
ecosistémicos no son reconocidos adecuadamente por los mercados económicos,
leyes gubernamentales y prácticas de manejo de los suelos (Binning et al., 2001). Los
servicios ecosistémicos han sido clasificados en cuatro categorías (Tabla 2).
18
Tabla 2. Categorías asignadas a diferentes servicios ecosistémicos.
Categoría
de servicios
ecosistémicos
Servicio
ecosistémico Importancia Problema
Causa del
problema
Asociado a
provisión de bienes
Salud de sistemas
acuáticos
Proveen agua
potable para
consumo de
animales y
humanos.
Acidez de los
cuerpos de agua.
Escorrentía de
nutrientes dañinos
para la salud.
Uso de fertilizantes
y pesticidas
Soportan la vida del
planeta
Polinización
Permite la
regeneración de
plantas, la
producción de frutas
y semillas que serán
consumidas por
animales y
humanos.
Algunos cultivos de
frutas poseen
pequeñas cantidades
de polen, así que
deben ser recibir
polinizaciones
extras.
Disminución de
polinizadores
nativos e
introducción de
especies exóticas.
Ciclaje de nutrientes
Permite hacer
disponibles muchos
nutrientes para las
plantas.
Recirculación de
nutrientes a través
de distintos niveles
tróficos.
Disminución de
especies que
participan
activamente en los
ciclos
biogeoquímicos.
Cambios de las
propiedades físico-
químicas del suelo a
causa de actividades
antrópicas
(agrícolas,
ganadería, cultivos
forestales, entre
otros).
Mantenimiento de
la salud del suelo
Provee un medio
físico y químico
adecuado para
desarrollo de
plantas y biota.
Permite cultivos y
producción agrícola.
Perdida de
fertilidad,
acidificación y
compactación.
Uso indiscriminado
de insumos
agrícolas y uso de
herramientas
agrícolas para
preparación del
suelo.
Mantenimiento y
regeneración de
hábitats
Mantiene
poblaciones viables
de la biota, manejo
de vegetación para
producción de
semillas.
Cambios en el uso
de la tierra.
Uso de la tierra con
fines industriales y
de producción para
sostenimiento de
comunidades
humanas.
Mantenimiento y
provisión de
recursos genéticos
Sostiene los
sistemas de
producción,
mantener y
regenerar hábitats
naturales. Asegurar
la resiliencia de los
ecosistemas.
Pérdida continua de
especies nativas.
Transformación de
ecosistemas
naturales en
agroecosistemas,
sistemas forestales,
entre otros.
Regulación de
procesos
ecosistémicos
Regulación del
clima
Regulación de los
patrones climáticos
relacionados en la
producción agrícola
y ganadera.
Emisión de gases de
invernadero
Dióxido de carbono
producido por
industrias
Control de plagas y Controla Uso intensivo de Apariencia del
19
enfermedades organismos no
deseados.
Importante en
agricultura e
industrias
ganaderas.
Requerida para
regeneración de
hábitats naturales y
mantener la biota
edáfica.
pesticidas. producto para ser
aceptado en el
mercado.
Servicios culturales
no asociados a
beneficios
materiales
Regulación del
cause de los ríos y
los niveles de agua
subterránea
Mantener seguridad
de los turistas.
Ofrecer actividades
de atracción
turística.
Bajos niveles de
agua pueden
impactar el turismo,
en el caso de lagos,
lagunas y ríos.
Desvío del cauce de
cuerpos de agua
para irrigar otras
zonas.
Adaptado de Binning y col. (2001) y Millenium Ecosystem Assessment (2005).
2.4. Efecto de las actividades antropogénicas sobre la degradación de los suelos.
En el último siglo se ha observado un aumento en la densidad de las poblaciones
humanas, lo cual ha generado una enorme demanda alimenticia, y para cubrirla ha
sido necesario aumentar la productividad de los suelos reemplazando enormes
extensiones de tierras por zonas agrícolas y ganaderas (FAO, 2003; Antama, 2008).
Sumado a lo anterior, el uso de insumos químicos externos (pesticidas y fertilizantes)
se ha elevado, generando problemas de degradación y contaminación de los suelos y
muchas veces de aguas subterráneas (Ongley, 1997).
Los cambios en el uso del suelo afectan con mayor o menor intensidad la cubierta del
mismo, entendiéndose como cubierta transformada aquella que ha sido sustituida
completamente por otra, como es el caso de los bosques tropicales que a lo largo de
grandes extensiones han sido transformados en cubiertas de pasto y una gran variedad
de cultivos (Murray et al. 2005).
Según datos estadísticos de la FAO (2003), se ha encontrado que a nivel mundial el
área total de tierra degradada es del 26% del cual el 9% se debe a transformaciones
20
con un objetivo agrícola. Así mismo, en Colombia se ha encontrado que el 18% del
área del país se encuentra degradada, del cual el 2% corresponde a zonas agrícolas
(FAO, 2003).
Esta información permite plantear nuevas preguntas de investigación sobre los
problemas generados en los ecosistemas debido a las transformaciones de las
diferentes coberturas vegetales. Diferentes estudios han determinado la presencia de
cambios en los procesos ecológicos asociados a los servicios ecosistémicos (Mailly et
al., 1997; Nüsslein y Tiedje, 1999; Webster et al., 2002; Bossio et al., 2005; Bastida
et al., 2006). Uno de los servicios más afectados es el ciclaje de nutrientes, debido a
las variaciones en las comunidades de microorganismos responsables del
funcionamiento de los diferentes ciclos biogeoquímicos (Stuart et al., 2000); como
consecuencia, habrá una disminución de los bienes asociados a este servicio, por
ejemplo, disminución de la fertilidad del suelo para obtención de alimentos, la cual
deberá ser mantenida mediante el uso de fertilizantes por un agotamiento de los
nutrientes naturales del suelo (Mailly et al., 1997).
Frecuentemente, cualquier cambio en el uso del suelo está asociado al
establecimiento de tierras agrícolas o ganaderas para consumo humano, lo cual
conlleva al uso de diferentes prácticas con el fin de aumentar la productividad de los
suelos. Se ha observado que el tipo de practica agrícola o pecuaria utilizada puede
generar diferentes formas de degradación en los suelos: física (erosión y
compactación), química (acidificación, disminución de nutrientes, contaminación) y
biológica (pérdida de diversidad) (Girvan et al., 2003).
21
2.4.1 Degradación física del suelo
Se ha determinado que ciertas prácticas agrícolas tradicionales pueden generar un
cambio en la estructura de los suelos (Blanco et al., 2005), la cual es una
característica considerada de gran importancia debido a que se relaciona con el
movimiento y la retención de agua, erosión y el ciclaje de nutrientes (Torsvik y
Øvreås, 2002). Adicionalmente la estructura puede afectar la penetración de raíces, la
producción del cultivo y la agregación de las partículas del suelo (Bronick y Lal,
2005).
2.4.2 Degradación química del suelo
Para el caso de la degradación química del suelo, se ha encontrado que algunas
prácticas empleadas en sistemas de cultivo convencional conducen a una pérdida de
la fertilidad del suelo por disminución de nutrientes, contaminación de aguas
subterráneas debido a procesos de lixiviación de minerales y acidificación del suelo
debido al uso de fertilizantes (Ribón et al., 2003; Liu et al., 2007). Bronick y Lal
(2005) encontraron que la aplicación de nutrientes y fertilizantes químicos en zonas
cultivadas disminuye las concentraciones de carbono orgánico, alteran el pH y
generan cambios en las concentraciones de electrolitos.
2.4.3 Degradación biológica del suelo
La disminución de la diversidad biológica puede ocurrir de una forma directa o
indirecta:
Directa: se produce cuando el uso de algún insumo produce un efecto inhibitorio en
la actividad y función de determinadas comunidades de bacterias edáficas. Johnsen y
col. (2001) determinaron que el uso de algunos plaguicidas genera toxicidad para
22
aquellas bacterias asociadas al ciclo del nitrógeno (nitrificantes). Posiblemente, el
efecto tóxico es debido a las altas concentraciones de nitrógeno que presentan
algunos productos, lo cual posiblemente hace que el suelo llegue a un estado de
saturación del elemento inhibiendo la actividad enzimática de las bacterias (Frey et
al., 2004). Esto concuerda con otros estudios donde se identificó el efecto de ciertos
compuestos como cloratos, cianatos y plaguicidas organoclorados (insecticidas)
(Ahmed et al., 1998) encontrándose que estos inhiben directamente el desarrollo de
bacterias asociadas al ciclo del nitrógeno (p.e. Géneros Nitrobacter y Nitrospira)
(Millennium Ecosystem Assessment, 2005).
Indirecta: en estos casos las comunidades de bacterias se ven afectadas debido a
cambios de una o varias propiedades físico-químicas necesarias para su permanencia
(p.e. nutrientes, pH, humedad, entre otros). Un estudio realizado por Liu y col
(2007), afirma que el uso de fertilizantes conduce a una acidificación del suelo
limitando el crecimiento y actividad de las bacterias nitrificantes (Nitrosomonas y
Nitrobacter). Los resultados obtenidos por estos investigadores son respaldados por
Millennium Ecosystem Assessment (2005), quienes afirman que estas bacterias
requieren un pH alcalino para que exista un equilibrio entre las formas NH4+ y NH3
+,
y así poder lleva a cabo el proceso de nitrificación; cuando se altera el equilibrio de
estos dos iones se observa un efecto inhibitorio de los dos géneros de bacterias debido
a que son sensibles a su propio sustrato.
En otro estudio realizado por Bronick y Lal, (2005), se determinó un cambio de las
comunidades de bacterias al variar el tipo de fertilizante utilizado (fertilización con
estiércol vs. otro fertilizante). Esto es debido a que la fertilización con estiércol
promueve una mejor estructura del suelo, un aumento de las concentraciones de
materia orgánica, aumento de la heterogeneidad física del sitio y por último un
aumento de sustratos disponibles para metabolizar (Øvreås y Torsvik, 1998).
23
En la investigación realizada por Nannipieri y col (2003) y Bais y col. (2006) se
observa cómo los cambios de la cobertura vegetal afectan de manera indirecta las
comunidades de bacterias edáficas. La anterior afirmación se sustenta en que la
estructura de las comunidades vegetales se asocia fuertemente a la estructura de las
comunidades de bacterias debido a procesos relacionados con la oferta y
disponibilidad de nutrientes (p.e. rizodeposición y descomposición de hojarasca y
raíces), lo cual genera la existencia de relaciones interespecíficas. Así, los exudados
de raíces vegetales ejercen presiones selectivas sobre el crecimiento de determinadas
bacterias al alterar la composición química de la rizósfera (Bais et al., 2006). A su
vez, las bacterias seleccionadas afectan la composición y cantidad de los
componentes del exudado al participar en procesos como el rompimiento celular de
las raíces, metabolismo celular y la nutrición de las plantas (Yang y Crowley, 2000).
Debido a los efectos negativos generados por el uso y manejo indiscriminado de
fertilizantes y plaguicidas sobre las propiedades físico-químicas del suelo y
consecuentemente en las comunidades de bacterias edáficas, este tipo de prácticas ha
sido muy criticado. No obstante, Sturz y col. (2004) llevaron a cabo un estudio en
donde se observó un efecto positivo por parte de estos insumos sobre las
comunidades bacterianas del suelo. Encontraron que al utilizar fertilizantes sulfatados
se observa un aumento de la riqueza de especies y abundancia de las poblaciones.
Como una alternativa menos invasiva se han propuesto prácticas como la rotación de
cultivos teniendo en cuenta la cobertura vegetal usada, debido a que se han observado
efectos positivos sobre las propiedades del suelo al aumentar los contenidos de
carbono, la infiltración de agua, el ciclaje de nutrientes, las tasas de respiración, la
mineralización de nitrógeno y la biomasa bacteriana. Consecuentemente, estas
prácticas conllevan a un cambio positivo en la estructura de las comunidades de
bacterias edáficas (Bronick y Lal, 2005).
24
No obstante, aún poniendo en práctica determinadas técnicas agrícolas amigables con
el ambiente, el problema de fondo generado a partir del uso de insumos orgánicos o
inorgánicos, es que el nivel de nutrientes, los procesos microbianos y las fracciones
de materia orgánica que se ciclan activamente es diferente en comparación con
aquellos sitios poco o nada intervenidos (Compton y Boone, 2000) y muchos de estos
cambios generan una pérdida de la diversidad de bacterias edáficas, la cual cumple
funciones importantes como proveer, regular (Millennium Ecosystem Assessment,
2005) y soportar diferentes servicios ecosistémicos ofrecidos por la naturaleza (Stuart
et al., 2000).
2.5 Métodos para evaluar la densidad y riqueza de las comunidades de bacterias
edáficas.
Existe una gran variedad de métodos para estudiar las comunidades de bacterias del
suelo, los cuales se pueden dividir en dos categorías: dependientes de cultivo e
independientes de cultivo. Estos métodos permiten obtener información sobre las
comunidades de bacterias edáficas, bien sea mediante el uso de medios de cultivo
selectivos o a través de técnicas especializadas para extraer el DNA de las bacterias
directamente de las muestras (Hill et al., 2000; Dahllöf, 2002).Sin embargo, los dos
métodos se utilizan para responder a preguntas diferentes, aún cuando estas se
relacionen con diversidad microbiana.
2.5.1 Técnicas dependientes de cultivo
Estas técnicas son utilizadas frecuentemente para cuantificar el número de células en
una muestra ambiental (Blodgett, 2003) y para establecer niveles de perfiles
fisiológicos que permiten medir la diversidad microbiana (Kirk et al., 2004). Se
basan en el uso de medios selectivos enriquecidos con los nutrientes necesarios para
25
un crecimiento adecuado de los microorganismos (Fry, 2004). Este tipo de técnicas
presentan ventajas y desventajas dependiendo del tipo de información que se quiere
obtener (Tabla 3).
Tabla 3. Ventajas y desventajas de las técnicas dependientes de cultivo para el estudio
de bacterias cultivables.
Ventajas Desventajas
Permitir el establecimiento de colecciones de
microorganismos aislados de diferentes hábitats (p.e.
suelo, agua de mar, rios y lagos) (Fry, 2004).
Problemas e incertidumbre al momento de clasificar
taxonómicamente los microorganismos ya que se hace
uso exclusivo de información fisiológica y morfológica
(Fry, 2004).
Permiten estudiar gran variedad de funciones
fisiológicas específicas y propias de diferentes grupos
(p.e. nitrificantes, denitrificantes, metanogénicas,
degradadoras de hidrocarburos) (Fry, 2004).
En situaciones de estrés ambiental las bacterias pueden
entrar en un estado denominado “viable pero no
cultivable”, es decir, se detectan sus funciones
metabólicas pero no son cultivables por métodos
tradicionales (Colwell, 2000).
Permite cuantificar y estudiar aquellas células viables
en una muestra ambiental (Fry, 2004).
No permite detectar los microorganismos no cultivables
(Kirk et al., 2004).
Permite estudiar el componente cultivable de los suelos
el cual es el que contribuye en mayor medida a los
procesos del ecosistema (Ellis et al., 2003).
Se favorecen aquellos microorganismos que presentan
un crecimiento rápido (Rønn y Mørk, 2005).
Dentro de las técnicas dependientes de cultivo se encuentran el número más probable
(NMP), los recuentos viables en placa (Blodgett, 2003), los cultivos por extinción
(Fry, 2004) y los niveles de perfiles fisiológicos de la comunidad (Kirk et al., 2004)
(Tabla 4).
26
Tabla 4. Definición de algunas técnicas dependientes de cultivo.
Técnica Definición Importancia Estudios
Número más
probable
(NMP)
Permite determinar la concentración de
células en una muestra (Haines, 1996;
Wrenn y Venosa, 1996).
Considerada de gran
importancia en estudios de
bacterias especialistas en
algún proceso fisiológico
(Fry, 2004).
Coulon y
Delille (2003)
Janssen y col.
(2002)
Klemedtsson
y col. (1999)
Recuento en placa
Cuantifica el número de bacterias capaces
de crecer sobre un medio sólido
determinado (Vallejo, 2004).
Es usado frecuentemente
para cuantificar el número
de heterótrofos totales
(Bartram et al., 2003;
Pepper et al., 2004).
Coorevits y
col. (2008)
Han y col.
(2007)
Pepper y col.
(2004)
Cultivos por
extinción
Cuantifica el número de bacterias en una
muestra realizando una dilución inicial de la
muestra (Fry, 2004).
Permiten un crecimiento
más rápido de bacterias
oxidadoras de amonio
(Aakra et al., 1999).
Aakra y col.
(1999)
Gómez y col.
(2004)
Mintie y col.
(2003)
Niveles de perfiles
fisiológicos de la
comunidad
Técnica que utiliza placas comerciales de
96 pozos para establecer la diversidad
funcional potencial de las poblaciones de
bacterias a través de los patrones de uso
utilizando varias fuentes de carbono (Kirk
et al., 2004).
Permite diferenciar entre
comunidades de bacterias
(Kirk et al., 2004).
Shishido y
col. (2008)
Travis y col.
(2008)
Chang y col.
(2007)
Consenso
intragenico
repetitivo de
enterobacterias.
(ERIC-PCR)
(Judd et al., 1993).
Técnica que se basa en la amplificación de
secuencias denominadas ERIC, las cuales
son repeticiones invertidas altamente
conservadas, no muestran homologías
significativas entre ellas y normalmente se
encuentran en regiones intergénicas
transcritas (De Sisto et al., 2008; Zhang et
al., 2008)
Permite identificar y
diferenciar aislamientos
bacterianos (De Sisto et
al., 2008; Zhang et al.,
2008).
De Sisto y
col. (2008)
Zhang y col.
(2008).
27
2.5.2 Técnicas independientes de cultivo.
Permiten realizar análisis de composición de las comunidades microbianas mediante
técnicas avanzadas de microscopía de fluorescencia y técnicas moleculares que
permiten la extracción del DNA directamente del suelo (Smalla, 2004), además de
cuantificar e identificar genes específicos de ciertos microorganismos o de
determinados grupos microbianos (Hill et al., 2000) (Tabla 5).
Tabla 5. Ventajas y desventajas de las técnicas independientes de cultivo.
Ventajas Desventajas
El análisis del DNA provee información de la
diversidad de comunidades bacterianas de muestras
ambientales o de la ausencia o presencia de
determinados genes (p.e. genes relacionado con
resistencia a antibióticos) (Smalla, 2004)
El análisis de moléculas de DNA no permite obtener
conclusiones relacionadas con la actividad metabólica
de los miembros de la comunidad o bien de la
expresión génica de los mismos (Smalla, 2004)
Mediante el análisis comparativo de genes
pertenecientes a rDNA en combinación con el análisis
de genes funcionales, es posible obtener e integrar
información sobre diversidad filogenética y funcional
potencial de las comunidades microbianas (Torsvik y
Øvreås, 2002).
Durante la etapa de amplificación (PCR) se presentan
algunos problemas relacionados con el tipo de iniciador
utilizado (Torsvik y Øvreås, 2002). Por ejemplo, la
amplificación y la detección de las secuencias depende
del tipo de iniciador utilizado, además, un mismo gen
en diferentes microorganismos puede tener afinidades
diferentes hacia un mismo iniciador, afectando los
resultados obtenidos (Hill et al., 2000).
Permiten obtener información taxonómica y funcional
de aquellos microorganismos no cultivables
(Hugenholtz et al., 1998).
Algunas células procariotas son más fáciles de lisar que
otras, consecuentemente, una lisis incompleta de
algunas especies puede arrojar resultados que
subestimen la diversidad o la actividad (Hill et al.,
2000).
Dentro de las técnicas independientes de cultivo se encuentran aquellas relacionadas
con el análisis de ácidos nucleicos, ácidos grasos de fosfolípidos y técnicas de
microscopía como hibridación de sondas de ácidos nucleicos marcados con
fluorescencia (Hill et al., 2000) (Tabla 6).
28
Tabla 6. Definición de algunas técnicas independientes de cultivo.
Técnica Definición y estudios
Reacción en cadena de la
polimerasa.
(PCR)
(Roux, 2008).
La PCR es una técnica que permite obtener múltiples copias de una
secuencia determinada a partir de unas pocas copias de la secuencia
molde.
(Axelrood et al., 2002; Zhou et al., 2008)
Electroforesis en gel con gradiente
denaturante/Electroforesis en gel con
gradiente de temperaura.
(DGGE/TGGE)
(Muyzer y Smalla, 1998; Muyzer,
1999).
Separa fragmentos de DNA de igual longitud pero con secuencias
diferentes. La separación se basa en la movilidad electroforética de
fragmentos de DNA de doble cadena parcialmente unidos a través de un
gradiente denaturante o de temperatura Permite realizar análisis de las
comunidades de bacterias sin necesidad de caracterizar taxonómicamente
cada una de las secuencias.
(Siddique et al., 2006; Li et al., 2007; Weiss et al., 2007).
Análisis de espaciadores intergenicos
ribosomales
(RISA-PCR)
(Hartmann et al., 2005).
Permite determinar la heterogeneidad y longitud de las regiones
intergénicas espaciadoras 16S–23S, además, se puede distinguir entre
especies microbianas relacionadas.
(Mohammed et al., 2005; Mestre et al., 2007).
Análisis de restricción de DNA
ribosomal amplificado (ARDRA)
(Heyndrickx et al., 1996).
Permite obtener fragmentos de DNA ribosomal mediante el uso de
enzimas de restricción específicas.
(Aquilanti et al., 2004; Ntougias et al., 2004; Viti y Giovannetti, 2005).
Polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción
(RFLP)
(NCBI, 2008).
Permite diferenciar secuencias de DNA homólogas que pueden ser
detectadas mediante la presencia de fragmentos de diferentes tamaños
después de haber digerido el DNA mediante endonucleasas de restricción
específicas.
Graff y Stubner (2003)
Fremont y col. (1999)
Polimorfismos en fragmentos de
restricción amplificados.
(AFLP)
(Lin et al., 1996).
El DNA del genoma bacteriano es sometido a digestión mediante enzimas
de restricción ligadas a adaptadores. Posteriormente se amplifica la región
de DNA mediante iniciadores específicos y finalmente se realiza una
electroforesis de los fragmentos obtenidos.
Lin y col. (1996)
La Rosa y col. (2006)
Capello y col. (2008)
Análisis de ácidos grasos
fosfolipídicos
(PLFA)
Los ácidos grasos de fosfolípidos son moléculas de marcaje que se
encuentran en la membrana celular de los microorganismos. Son
utilizados para establecer la estructura de las comunidades microbianas,
(Hill et al.,2000; Liang et al.,2008 y Hamer et al., 2008).
29
3. PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Colombia es el segundo país del mundo después de Brasil con mayor riqueza de
especies, donde en promedio una de cada diez especies de fauna y flora del mundo
habita aquí. Según reportes de Sistemas de información sobre biodiversidad de
Colombia (SIB, 2008), la región andina colombiana posee 1808 especies (distribuidas
entre aves (974), mamíferos (177), reptiles (277) y anfibios (380). Sin embargo, en
Colombia existen pocos estudios donde se investigue la diversidad de bacterias
edáficas, aun conociendo la importancia de sus funciones sobre diferentes procesos
ecosistémicos como los ciclos biogeoquímicos, la descontaminación de diferentes
ambientes y el mantenimiento de la fertilidad del suelo.
La ecorregión cafetera colombiana ha sido considerada de gran importancia debido a
la gran biodiversidad que alberga, como resultado de una gran variedad de climas,
paisajes, recursos hídricos y condiciones ambientales. Además, es una región con un
potencial económico fuerte debido a que presenta suelos fértiles, aptos para el
desarrollo de cultivos y actividades agropecuarias. Estos aspectos, convierten esta
región en unos de los principales ejes para el desarrollo social y económico del país
(CIEBREG, 2006).
Debido al potencial económico de la región, se han establecido diferentes sistemas
productivos como los agrícolas, ganaderos y forestales, los cuales han generado
transformaciones de los paisajes naturales y la pérdida o modificación de diferentes
hábitats importantes para el mantenimiento de la diversidad biológica. Estas
transformaciones han generado cambios drásticos en la estructura de las comunidades
vegetales, lo cual junto con el uso de insumos agrícolas conducen a una degradación
biológica y fisicoquímica de los suelos. Consecuentemente, los suelos pierden sus
propiedades de autosostenimiento y con el paso del tiempo se transformarán en tierras
con poca fertilidad (Swinton et al., 2007). Sumado a lo anterior, los insumos
30
agrícolas aplicados (pesticidas y fertilizantes) muchas veces se filtran a través del
suelo y entran en contacto con aguas subterráneas, generándose grandes peligros para
la salud de las comunidades que ingieran estas aguas contaminadas (Swinton, et al.,
2007) debido a que muchos de estos productos contienen compuestos que pueden
causar diversas enfermedades o incluso la muerte. El problema radica en que las
poblaciones de agricultores y ganaderos no son conscientes de las consecuencias que
traen las actividades realizadas por ellos mismos, debido a la falta de información
técnica y de puentes de comunicación entre las comunidades de la zona y los grupos
científicos.
El CIEBREG, es un centro de investigaciones que busca generar información valiosa
a través de la cual se puedan plantear acciones para la conservación biológica de
diferentes áreas en el eje cafetero colombiano, mediante actividades que permitan el
intercambio de información científica y tradicional con las comunidades humanas
rurales que habitan la región. El presente trabajo al hacer parte del CIEBREG, aporta
información importante que permite determinar si las prácticas agropecuarias
utilizadas en el eje cafetero colombiano están originando cambios en la riqueza de las
comunidades de bacterias cultivables edáficas y consecuentemente cambios en los
procesos ecosistémicos a los cuales están asociadas. Así mismo, los aislamientos de
bacterias obtenidos en el presente estudio pueden ser utilizados como posibles
candidatos para proyectos relacionados con biorremediación de ambientes
contaminados con hidrocarburos, pesticidas o estudios de las bacterias asociadas al
ciclo del nitrógeno.
31
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Identificar taxonómicamente los aislamientos obtenidos para cuatro grupos
funcionales bacterianos cultivables asociados a los ciclos del carbono y del nitrógeno
en las cuencas de los ríos La vieja y Otún en la región cafetera colombiana.
4.2 Objetivos específicos
Identificar taxonomicamente los aislamientos obtenidos para cada grupo
funcional.
Determinar el número de aislamientos bacterianos cultivables diferentes para
cada grupo funcional en cada uno de los suelos estudiados.
Relacionar los usos del suelo estudiados de acuerdo a la composición de las
comunidades de bacterias cultivables.
32
5. HIPÓTESIS
El uso del suelo junto con la cobertura vegetal y los parámetros fisicoquímicos
influyen en la distribución y riqueza de bacterias cultivables de los grupos
funcionales determinados para el presente estudio: oxidadoras de nitrito (BON),
oxidadoras de amonio (BOA), denitrificantes y degradadoras de hidrocarburos
(BDH).
5.1 Predicción 1: La riqueza de bacterias cultivables será menor en aquellos suelos
con intervención antrópica a diferencia de aquellos suelos poco o nada intervenidos.
Lo anterior, se debe a que la aplicación de ciertos insumos como plaguicidas y
fertilizantes genera cambios en las propiedades fisicoquímicas del suelo, alterando las
concentraciones y formas químicas de nutrientes disponibles para las bacterias
(Buckley and Schmidt, 2003; Bossio et al., 2005; Nogueira et al., 2006). De esta
manera, se genera una selección diferencial sobre la comunidad bacteriana como
respuesta a la disponibilidad y presencia de nutrientes (Maclean, 2005). Las
condiciones presentes favorecerían aquellas especies capaces de soportar altas
concentraciones de nitrógeno y carbono en forma de NO3- , NH4
+ y compuestos
orgánicos. Al reducirse la heterogeneidad de nichos en el suelo se genera un
incremento de la abundancia y disminución de la riqueza taxonómica de aquellos
grupos capaces de desarrollarse allí (Bruns et al., 1999).
33
6. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se desarrolló en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología
Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana. En el estudio se realizó
una identificación taxonómica de los aislamientos obtenidos para 4 grupos
funcionales bacterianos cultivables asociados a los ciclos del carbono y del nitrógeno,
extraídos de diferentes suelos con intervención antrópica (cultivos, pastizales para
ganadería, guaduales y plantaciones de pino) y otros poco o nada intervenidos
(bosques secundarios). Para esto se realizó una identificación taxonómica de aquellos
aislamientos que se logró amplificar una región de la subunidad 16S ribosomal,
posteriormente se enviaron a secuenciar los productos.
6.1 Área de estudio
El muestreo se llevó a cabo en las áreas rurales de los departamentos del Quindío y
Risaralda, ubicados en la Ecorregión Cafetera Colombiana sobre la cordillera central
(Anexo A). Al interior de esta ecorregión se delimitaron dos cuencas hidrográficas
correspondientes a los ríos La Vieja y El Otún, las cuales fueron seleccionadas por el
CIEBREG debido a su heterogeneidad espacial, gradiente altitudinal y estructura del
paisaje (Camargo, 2006).
6.1.1 Cuenca del río La vieja
Esta cuenca se encuentra localizada en el centro occidente de Colombia incluyendo
los departamentos del Quindío y Risaralda y cuenta con una extensión de 2,836 km2
(Anexo B). El clima se caracteriza por tener precipitaciones anuales superiores a los
2000 mm2 y se calcula una humedad relativa del 80% con una temperatura promedio
de 20°C (CIEBREG, 2006). Al interior de la cuenca se seleccionaron los usos del
34
suelo más representativos y predominantes (Roldan, 2007) (Tabla 7), y se escogieron
bosques secundarios para tomarlos como referencia y comparar entre suelos
intervenidos y poco intervenidos. Posteriormente se seleccionaron dos fincas para
cada uso del suelo, teniendo en cuenta el tiempo de establecimiento de la actividad
agropecuaria de mínimo 10 años.
Tabla 7. Usos del suelo seleccionados y fincas muestreadas en la cuenca del río La
vieja.
Uso del suelo Nombre de las Fincas
Guadual La comarca
La Ramada
Cultivos de café asociados a plátano El bolsillo
La Alegría
Pastizal para ganadería Villa Jimena
La Ramada
Bosque secundario Bremen
La granja
6.1.2 Cuenca del río Otún
La cuenca hidrográfica del río Otún nace en el parque Nacional Natural de los
Nevados en el municipio de Pereira. El área total de la cuenca es de 494 km2
y se
encuentra localizada entre los 1800 msnm hasta los 5200 msnm. El clima se
caracteriza por precipitaciones anuales que alcanzan valores medios cercanos a 2700
mm, y se calcula una temperatura promedio de 16°C. Al interior de esta cuenca, se
observan actividades agrícolas predominantes como los cultivos de cebolla y
aromáticas, así mismo, se encuentran plantaciones de pino y bosques con vegetación
arbórea (Camargo, 2006).
35
Se seleccionaron los usos del suelo más representativos y predominantes (Tabla 8) y
posteriormente se seleccionaron dos fincas para cada uso del suelo, teniendo en
cuenta el tiempo de establecimiento de la actividad agropecuaria de mínimo 10 años.
Al igual que en la cuenca La Vieja, se tuvieron en cuenta dos bosques secundarios
para comparar entre suelos intervenidos y poco intervenidos.
Tabla 8. Usos del suelo seleccionados y fincas muestreadas en la cuenca del río Otún.
Uso del suelo Nombre de las Fincas
Guadual Mandalay
La Playa
Monocultivos de cebolla Bella vista
Macarena
Plantaciones forestales de pino Playa rica
Lisbrán
Bosque secundario La pastora
Santa Helena
6.2 Metodología de muestreo
En cada una de las fincas, se seleccionaron tres puntos de muestreo (ubicados a > de
30 m de los bordes) y en cada uno de ellos se estableció un cuadrante de 2.5 m x 2.5
m. En cada cuadrante se seleccionaron 5 puntos (vértices y centro) a partir de los
cuales se tomaron muestras a 15 cm de profundidad mediante el uso de barrenos
(Figura 1A). Estas muestras fueron homogenizadas y mezcladas (Figura 1B) para
obtener una muestra compuesta de aproximadamente 500g, las cuales se depositaron
en bolsas whirlpack® resellables estériles y debidamente rotuladas (fecha, cobertura,
nombre de la finca y punto de muestreo) (Figura 1C). Las muestras fueron
conservadas en refrigeración (4-6°C) hasta su análisis.
36
Figura 1. Metodología de muestreo empleada durante el estudio.
Se realizaron dos eventos de muestreo en Junio (época seca) y Septiembre (época de
lluvias) del 2006, obteniéndose un total de 96 muestras compuestas de suelo (48 por
cada evento de muestreo).
37
6.3 Métodos
Los aislamientos de bacterias puras cultivables se obtuvieron a partir de otros
estudios realizados en USBA por Gómez (2007) (obtención de BON, BOA y
denitrificantes), y Vallejo (2007) (obtención de BDH). Para el crecimiento de BON,
se tuvo en cuenta el consumo de nitrito, el cual se evidenció con la adición del
reactivo de Gries Llovais (Merck) que reacciona con el nitrito produciendo un
diazocompuesto que posteriormente reacciona con una amina aromática, formando un
compuesto de color rojo. La presencia de estas bacterias en el medio se tomo como
positiva para aquellos medios que no se tornaban de color rojo.
Para visualizar el crecimiento de BOA, se tuvo en cuenta la presencia de nitritos en el
medio al adicionar el indicador difenilamina cristal. La presencia de las bacterias se
consideró positiva si el medio se tornaba azul, porque esto indicaba que las bacterias
habían oxidado el amonio presente y lo habían transformado en nitrito.
Para el aislamiento de BON y BOA se utilizó la técnica de extinción por dilución y a
partir de las diluciones positivas mas altas se realizaron nuevamente diluciones
seriadas en base 10 utilizando el medio de cultivo especifico para cada grupo y
finalmente se realizó siembra en medio sólido.
Para el crecimiento de bacterias desnitrificantes, se tuvo en cuenta la presencia de
turbidez en el medio de cultivo y también el consumo de nitrito y nitrato lo cual se
evidenció al aplicar el indicador difenilamina al medio. Se consideraron positivos
aquellos tubos que mostraron ausencia de color azul, lo cual indicó la utilización del
nitrato presente en el medio. Para el aislamiento de las bacterias se tomó 1ml de las
diluciones más altas positivas y se sembraron en medio líquido mineral y medio
38
solido usando la técnica de tubo rodado y esto se repitió hasta obtener cultivos
axénicos.
Para las Para las BDH, se empleó el medio de cultivo Bushnell-Haas y diesel como
única fuente de carbono y como indicador de actividad microbiana se utilizó el
reactivo XTT (sales de tetrazolio) el cual es reducido por los microorganismos con la
formación del compuesto formazan.
Los aislamientos de cada grupo funcional fueron preservados a -80°C en medio skim
milk según el protocolo de criopreservación Simione (1998). A partir de los
aislamientos de bacterias puras obtenidos de estos estudios, se realizó una extracción
del DNA bacteriano, posteriormente se amplificó la región V3 correspondiente a la
subunidad 16S ribosomal y finalmente se enviaron a secuenciar los productos
amplificados para realizar una identificación taxonómica de los aislamientos
obtenidos.
6.3.1 Extracción de DNA a partir de aislamientos puros
Se evaluaron 2 métodos de extracción de DNA, por ebullición a 95°C (Innis et al.,
1993; Ausubel et al., 1999; Sambrook, y Russell, 2001; Moreno (2006), y otro
enzimático utilizando lisozima (Mantilla et al., 2006; Platero et al., 2007).
Inicialmente se evaluó la extracción por el método de ebullición a 95°C. Sin
embargo, debido a que el DNA de un gran número de aislamientos no pudo ser
extraído en buenas condiciones mediante este método para ser utilizado en la PCR, se
evaluó el método enzimático con lisozima.
El método de ebullición consistió en tomar una pequeña cantidad de colonias
mediante una asada, la cual fue resuspendida en 50-100 µl de buffer TE estéril
39
(Anexo 4A). La suspensión se sometió a 95°C por 15 min utilizando un termociclador
(BIORAD, My Cycler) para extraer el DNA bacteriano mediante un proceso de lisis
térmica. Posteriormente, se centrifugó la suspensión a 13,000 rpm durante 1 min y se
almacenó a -20°C máximo por 24 horas, hasta que fuera utilizado como DNA molde
para la PCR.
Para el método enzimático se resuspendió una pequeña cantidad de colonias mediante
una asada en 90 µl de buffer TES (ácido N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-
aminoethanesulfonic) (Anexo 4B) y 10µl de lisozima (10 µg/mL). La solución fue
homogeneizada utilizando un vórtex hasta observar una solución turbia la cual fue
incubada durante 30 min a 37°C. Se agregaron 600 µl de buffer de lisis (Anexo 4C)
frío y se mezcló por inversión. Se incubó a temperatura ambiente (20-25°C) durante
10 min. Se agregaron 175 µl de NaCl 5M para permitir la precipitación de proteínas,
la solución se mezcló por inversión y se incubó en hielo durante 5 min, la solución se
centrifugó a 10,000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se transfirió a un tubo
nuevo. Se adicionaron 480 µl de isopropanol y 48 µl de acetato de sodio para permitir
la precipitación de los ácidos nucleicos en una solución con una concentración alta de
sales (Sambrook, 2001), las soluciones se mezclaron por inversión y se incubaron en
hielo durante 5 min. Pasado el tiempo indicado, la solución se centrifugó a 13,000
rpm durante 10 min y se desechó el sobrenadante. Finalmente, se agregaron 400 µl de
etanol frío al 70% v/v y se mezcló por inversión, se centrifugó a 10,000 rpm durante
5 min y se desechó el sobrenadante. El tubo se dejó secando en una incubadora a
temperatura ambiente (20-25°C) y una vez se evaporó el etanol sobrante, el DNA fue
resuspendido en 50-100µl buffer TE (Tris 10 mM-EDTA 1mM) estéril y almacenado
a -20°C hasta su utilización como DNA molde para la PCR.
El DNA extraído fue examinado a través de una electroforesis horizontal en gel de
agarosa al 1% p/v (Anexo 5), utilizando buffer TAE 0.5X y 0,2 µl de bromuro de
40
etidio a una concentración de 10mg/ml para visualizar el DNA. Se agregó 5 µl del
producto de extracción y 3 µl de buffer de carga (Anexo 4D).
6.3.2. Descripción de los iniciadores utilizados.
Se utilizaron los iniciadores universales para la región V3 del dominio bacteria 341F
y 907R (Muyzer et al., 1993; Casamayor et al., 2000) con las siguientes secuencias:
341F CCT ACG GGA GGC AGC AG y 907R CCG TCA ATT CMT TTG AGT
TT. Estos iniciadores han sido utilizados en muchos estudios de ecología y
sistemática para amplificar genes de la subunidad 16S ribosomal (Øvreås y Torsvik,
1998; Ishii et al., 2000; Yoshida et al., 2005; Héry et al., 2008) y se obtiene un
producto amplificado de ~ 585 pb.
6.3.3. Amplificación de la región V3 de la subunidad 16S ribosomal.
La PCR se realizó siguiendo la metodología descrita por Krsek y Wellington (1999),
Sarró y col. (2006) y Wilms y col. (2006). Todas las reacciones fueron realizadas
utilizando un volumen final de 25 ml que contenía 0.1-0.3 µM de cada iniciador, 0.25
mM de la mezcla de desoxynucleotidos trifosfatos, buffer incoloro para PCR 1X, 2.5
mM de MgCl2 y 0.025 U/µl de Taq Polimerasa (Kit Taq Polimerasa, Promega) y se
utilizó un volumen de 1-2 µl como DNA molde para la amplificación a partir del
producto de extracción de DNA diluido.
El programa utilizado consistió en una fase inicial de denaturación a 94°C por 1 min,
la fase de anillamiento a 54°C durante 1 min y finalmente 10 min a 72°C para la fase
de elongación, con una extensión de 35 ciclos y una fase de extensión final de 72°C
por 10 min (Krsek y Wellington, 1999; Sarró et al., 2006; Wilms, et al., 2006).
41
Sin embargo, para algunas bacterias fue necesario optimizar el protocolo de PCR
debido a que no se lograba un producto de amplificación: se disminuyó la
temperatura de anillamiento a 52,8°C, se aumentó la concentración de iniciadores a
0.3 µM y se aumentó el volumen de DNA molde a 2 µL. Las condiciones restantes se
mantuvieron como se explicó anteriormente.
Para algunos casos específicos, se realizó una PCR semianidada, la cual consiste en
realizar una segunda ronda de amplificación (reamplificación) utilizando como DNA
molde el producto de PCR de la primera ronda de amplificación. Para esto, se realizó
una dilución 1/10 del producto obtenido de la primera PCR, se tomaron 2 µl del
producto y se disminuyeron el número de ciclos de amplificación de 35 a 22. Este
método se realizó con el objetivo de aumentar la concentración de DNA amplificado
para algunas muestras que presentaban concentraciones muy bajas, lo cual se
evidenció al observar bandas tenues al realizar la electroforesis en gel de agarosa.
6.3.4 Detección de los productos de PCR
El DNA amplificado fue examinado a través de una electroforesis horizontal en gel
de agarosa al 2% p/v (Anexo 5A), utilizando 2 µl de bromuro de etidio a una
concentración de 10 mg/ml para visualizar el DNA. Para esto se realizó una mezcla
que contenía 5 µL del producto de PCR y 3 µL de buffer de carga 2X. Para la
electroforesis se utilizaron 100 voltios constantes durante 50 min, utilizando buffer
TAE 0.5X (Anexo 5B). Las bandas obtenidas en el gel se visualizaron en un
analizador de imágenes (BIORAD) y la amplificación se confirmó al verificar la
presencia o ausencia de las bandas.
42
6.3.5 Secuenciación de los productos de PCR y análisis bioinformáticos.
Los productos obtenidos mediante la técnica de la PCR fueron enviados a secuenciar
a Macrogen Inc®
(Gasan-dong Geumchun-gu Seould, Korea). Las secuencias fueron
analizadas utilizando la versión StandAlone del programa blastn, empleando el
algoritmo de Smith-Waterman, V. 2.2.9 recuperada de la página del Centro Nacional
de Información Biológica (NCBI). Los parámetros de puntaje empleados para
construir los alineamientos locales, son los parámetros por defecto del programa
(tamaño de palabra 11nt, puntaje: Match/Missmatch 2-3 Gap: 5 apertura 2 extensión).
Los alineamientos se evaluaron contra la base de datos RDP (Ribosomal DataBase
Project) V. 10, actualizada el 30 de octubre de 2008, y cuenta con 706.103
secuencias curadas de 16s RNAs. Los resultados fueron obtenidos en formatos XML
y parseados usando el programa BXMLParser V.0.2.1
(http://Bioinf.uniandes.edu.co), recuperando los tres hits más significativos por
secuencia.
6.3.6 Análisis de los aislamientos identificados taxonómicamente con relación a
los usos de suelo evaluados.
Para relacionar los diferentes usos de suelo evaluados de acuerdo a la composición de
la comunidad de bacterias degradadoras, se utilizó el programa estadístico
Palaeontological Statistics (PAST, ver. 1.34, http://folk.uio.no/ohammer/past), el cual
ha sido empleado por otros investigadores para calcular índices de diversidad o de
similaridad (Ma et al., 2008; Vivas et al., 2009). Para generar los clusters se empleó
el algoritmo Paired group y el índice de similaridad de Dice-Sorensen.
43
7. RESULTADOS Y DISCUSION
7.1 Identificación taxonómica de los aislamientos obtenidos para cada grupo
funcional.
7.1.1 Bacterias degradadoras de hidrocarburos.
Se enviaron a secuenciar 126 productos de PCR con secuencias del 16S rDNA, de las
cuales se lograron identificar 102 (80%), 16 (12%) presentaron homología con
secuencias de DNA de bacterias no cultivables con porcentajes de similaridad entre
86-100%, y 8 (6%) aislamientos no pudieron ser identificados, posiblemente debido a
una baja calidad del DNA amplificado. Es importante resaltar, que algunos de los
aislamientos que se asociaron con secuencias parciales de 16S rDNA de bacterias
reportadas como no cultivables (AJ609012, EF562245, DQ539039) posiblemente
pueden ser considerados como el primer aislamiento obtenido de esas bacterias. Sin
embargo, es necesario realizar más estudios de tipo molecular para verificar este
hecho.
Se encontró que la mayoría de los aislamientos identificados presentaron porcentajes
de similitud >90% con relación a las secuencias encontradas en la base de datos RDP.
Sin embargo, 6 aislamientos identificados presentaron porcentajes de similitud
inferiores, entre 81-89%, los cuales fueron relacionados con Pseudomonas
aeruginosa [DQ103761] (81%), Achromobacter xylosoxidans subsp. xilosoxidans
[AY753652] (84%), Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis [EU67001.1] (86%),
Pseudomonas aeruginosa [AY748891] (87%), Pseudomonas azelaica [FJ227303]
(88%) y por último Bizionia sp. Sp D58-E09 [DQ873780] (89%).
Los aislamientos identificados taxonómicamente corresponden a 18 géneros de
bacterias: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Bacillus,
Bizionia, Brevibacterium, Burkholderia, Chryseobacterium, Delftia, Lactobacillus,
44
Pantoea, Pedobacter, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Stenotrophomonas y
Streptomyces. Estos géneros han sido reportados en diferentes estudios en los cuales
se evaluó su capacidad para degradar hidrocarburos (Gadd, 2006; Nielsen et al.,
2006; Thavasi et al., 2007).
Para la cuenca del río La Vieja, se identificaron 40 aislamientos, distribuidos en 4
divisiones del dominio Bacteria de la siguiente manera: 2 aislamientos fueron
ubicados en la división Actinobacteria (subdivisión Actinobacteria), 33 en la división
Proteobacteria (6 en la subdivisión β-proteobacteria y 27 en la subdivisión γ-
proteobacteria), 3 aislamientos en la división Bacteroidetes (2 en la subdivisión
Flavobacteria y 1 en la subdivisión Sphingobacteria) y por último 1 en la división
Firmicutes (subdivisión Bacilli) (Anexo 6).
Para la cuenca del río Otún, se identificaron 62 aislamientos, distribuidos en 3
divisiones del dominio Bacteria de la siguiente manera: 3 aislamientos en la división
Actinobacteria (subdivisión Actinobacteria), 57 en la división Proteobacteria (1 en la
subdivisión α-proteobacteria, 18 en la subdivisión β-proteobacteria, 38 en la
subdivisión γ-proteobacteria), y por último 2 aislamientos en la división Firmicutes
(subdisivión Bacilli) (Anexo 7).
La mayoría de los aislamientos identificados están representados por los géneros
Pseudomonas, Acinetobacter, Achromobacter, Stenotrophomonas y Burkholderia
(cuenca La vieja) (Figura 2) y Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas y
Burkholderia (cuenca de Otún) (Figura 3).
45
Figura 2. Géneros de bacterias en la cuenca del río La Vieja (Junio – Septiembre de
2006), n= 40.
Figura 3. Géneros de bacterias en la cuenca del río Otún (Junio – Septiembre de
2006), n= 62.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Pseudomonas
Acinetobacter
Stenotrophomonas
Burkholderia
Alcaligenes
Delftia
Rhodococcus
Achromobacter
Lactobacillus
Ralstonia
Agrobacterium
Bacillus
Brevibacterium
Numero de aislamientos correspondientes al género
Gén
ero
s d
e b
acte
rias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Pseudomonas
Acinetobacter
Achromobacter
Stenotrophomonas
Burkholderia
Bacillus
Bizionia
Chryseobacterium
Pantoea
Pedobacter
Ralstonia
Rhodococcus
Streptomyces
Numero de aislamientos correspondientes al género
Gén
ero
s d
e b
acte
rias
46
Los géneros de bacterias encontrados han sido reportados en diferentes estudios como
capaces de degradar hidrocarburos (Müller et al., 2001; Nielsen et al., 2006;
Cerniglia y Sutherland, 2006; Thavasi et al., 2007; Basso et al., 2008; Phillips et al.,
2008; Zhang et al., 2008). Además, han sido reportadas por su capacidad de degradar
diferentes compuestos de interés ambiental (Tabla 9).
Es importante mencionar que las bacterias del presente estudio fueron aisladas por su
capacidad de degradar diesel, lo cual fue demostrado experimentalmente por Vallejo
y col. (2007). En las dos cuencas evaluadas, el género de bacterias predominante
entre los aislamientos identificados fue Pseudomonas (29%), el cual es considerado
ubicuo y con una gran versatilidad metabólica, lo cual le confiere una gran capacidad
para utilizar diferentes sustratos para su metabolismo y crecimiento. Así lo
demuestran Jussila y col. (2006) en un estudio donde se evaluó la diversidad genética
de bacterias cultivables asociadas a la rizósfera de suelos contaminados, y se encontró
que el género Pseudomonas fue uno de los más abundantes (14%), y se caracterizó
por su capacidad para degradar m-toluato.
47
Tabla 9. Microorganismos degradadores de hidrocarburos y de compuestos de interés
ambiental con los cuales se presentó similaridad.
Aislamiento Compuesto degradado Lugar de aislamiento Referencia
221 Solventes orgánicos Estudio no publicado
Pseudomonas
aeruginosa
[DQ889450] NCBI
193 Sulfuro orgánico Raíces de eucaliptos Rhodococcus fascians
[DQ386111] NCBI
296
Diesel Suelo antártico
Rhodococcus
erythropolis
Powell y col. (2006)
[EU481631] NCBI
213 2,4-diclorofenol Estudio no publicado
(sometido 2008)
Burkholderia cepacia
[EU497966] NCBI
218 Combustible Pozos de combustible
nuclear.
Burkholderia cepacia
[AY509957] NCBI
211 Pesticida (ometoato)
Cultivos de algodón
contaminados con
ometoato.
Alcaligenes sp.
[EF032603] NCBI
223 Compuestos orgánicos
volátiles
Estudio no publicado
(sometido 2004)
Achromobacter
xylosoxidans subsp.
Xylosoxidans
[AY753652] NCBI
255 Orto-clorobenzoato, Estudio no publicado
(sometido 2001)
Achromobacter
xylosoxidans subsp.
xylosoxidans
[AF439314] NCBI
388 Arsénico
Suelos de minas de plata
y oro contaminadas con
arsénico.
Achromobacter
xylosoxidans subsp.
xylosoxidans
[EF623833] NCBI
401 Glifosato Estudio no publicado
(sometido 2007)
Achromobacter
xylosoxidans subsp.
xylosoxidans
[EU006066] NCBI
228 Uranio Pilas con residuos
mineros de uranio.
Agrobacterium sp.
[AJ295674] NCBI
229 Alquil benceno sulfonato
lineal
Planta de tratamiento de
residuos.
Delftia acidovorans
[CP000884] NCBI
261 Fenol Aguas residuales Acinetobacter sp.
[AF390089] NCBI
281
305
315
MTBE (metil terbutil
éter) Estudio no publicado
(sometido 2008)
Acinetobacter
calcoaceticus
[EU427316] NCBI
[EU27315] NCBI
[EF151807] NCBI
TAME (amil metil éter)
di-N-butil talato
246 Fosfato mineral Rizósfera de cultivos de Pantoea agglomerans
48
(solubilizador) trigo. [EU047555] NCBI
300 Alaclor, (herbicida
agrícola)
Suelo previamente
tratado con el herbicida
alaclor.
Streptomyces sp.
[AF534565] NCBI
303 Metales pesados Residuos de minería Brevibacterium sp.
[EF612292] NCBI
325 MTBE (metil butil éter) Estudio no publicado
(sometido 2008)
Bacillus simplex
[EU427320] NCBI ETBE (etil butil éter)
7.1.2 Bacterias desnitrificantes.
Se enviaron a secuenciar 44 productos de PCR con secuencias parciales del 16S
rDNA, de las cuales se lograron identificar 30 (68%), mientras que 9 (20%)
presentaron homología con secuencias de DNA de bacterias reportadas como no
cultivables con porcentajes de similaridad entre 92-99%, y 8 (18%) aislamientos no
pudieron ser identificados, posiblemente debido a una baja calidad del DNA
amplificado. Al igual que las bacterias degradadoras que se relacionaron con no
cultivables, es necesario realizar mayores estudios de tipo molecular para verificar
este hecho.
Se encontró que la mayoría de los aislamientos identificados presentaron porcentajes
de similitud >90% con relación a las secuencias parciales de 16S rDNA publicadas en
el GenBank. Sin embargo, 1 aislamiento presentó un porcentaje del 86%, el cual
presentó homología con Microvirgula aerodenitrificans [AJ467013].
Los aislamientos que se lograron identificar taxonómicamente corresponden a 8
géneros de bacterias: Bacillus, Citrobacter, Comamonadaceae, Enterobacter,
Klebsiella, Microvirgula, Pantoea, y Pseudomonas, los cuales han sido reportados en
otros estudios como bacterias que participan durante el proceso de denitrificación en
el ciclo del nitrógeno (Cofman y Levine, 1986; Patureau et al., 2000; Rösch et al.,
2002; Braker y Tiedje, 2003; Dandie et al., 2007; Morozkina y Zvyagilskaya, 2007).
49
0 1 2 3 4 5 6 7
Pseudomonas
Klebsiella
Citrobacter
Comamonadaceae
Microvirgula
Bacillus
Número de aislamientos correspondientes al género
Gén
ero
s d
e b
acte
rias
Para la cuenca del río La Vieja, se identificaron 19 aislamientos, distribuidos en 2
divisiones del dominio Bacteria de la siguiente manera: 18 aislamientos se ubicaron
en la división Proteobacteria (3 en la subdivisión β-proteobacteria y 15 en la
subdivisión γ-proteobacteria) y 1 aislamiento en la división Firmicutes (subdivisión
Bacillales) (Anexo 8).
Para la cuenca del río Otún, se identificaron 11 aislamientos, distribuidos en 2
divisiones del dominio Bacteria de la siguiente manera: 8 en la división
Proteobacteria (2 en la subdivisión β-proteobacteria y 6 en la subdivisión γ-
proteobacteria), y por último 3 aislamientos en la división Firmicutes (subdisivión
Bacillales) (Anexo 9).
Para las cuencas de La vieja y Otún, los géneros representativos corresponden a
Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter, Comamonadaceae y Microvirgula (cuenca La
vieja) (Figura 4) y Klebsiella, Bacillus, Enterobacter y Microvirgula (cuenca Otún)
(Figura 5).
Figura 4. Géneros de bacterias desnitrificantes en la cuenca del río La Vieja (Junio –
Septiembre de 2006), n= 22.
50
Figura 5. Géneros de bacterias en la cuenca del río Otún (Junio – Septiembre de
2006), n= 12.
7.1.3 Bacterias nitrificantes (BOA y BON).
BOA: se enviaron a secuenciar 13 secuencias parciales de 16S rDNA, de las cuales se
lograron identificar 9 (69%), 6 (46%) presentaron homología con secuencias de DNA
de bacterias no cultivables con porcentajes de similaridad del 100%, 3 (23%) se
relacionaron con bacterias cultivadas y 4 (30%) aislamientos no pudieron ser
identificados, posiblemente debido a una baja calidad del DNA amplificado.
Es importante resaltar que incluso utilizando los resultados de secuenciación y
alineamiento de las secuencias con ambos iniciadores (341F y 907R) los resultados
son coincidentes para aquellos aislamientos que no pudieron ser identificados. Por
otro lado, en cuanto a los aislamientos que presentaron similaridad con bacterias no
cultivadas, la estudiante de doctorado Victoria Vallejo, ha realizado algunos estudios
de tipo molecular, en los cuales se han utilizado iniciadores específicos para el gen
amoA, el cual se encuentra únicamente en este grupo de bacterias. Las pruebas
0 1 2 3 4 5 6 7
Klebsiella
Bacillus
Enterobacter
Microvirgula
Pantoea
Citrobacter
Número de aislamientos correspondientes al género
Gén
ero
s d
e b
acte
rias
51
realizadas por Vallejo, mostraron resultados positivos de amplificación solamente
para 2 aislamientos pertenecientes a este grupo (12A y 13A) de los 13 que se
mantienen bajo condiciones de criopreservación, lo cual podría indicar que estos
aislamientos son los primeros que se tienen de estas bacterias, las cuales no había
sido posible aislar, sin embargo, es necesario realizar más estudios con el objetivo de
verificar este hecho.
También es importante mencionar, la gran dificultad para cuantificar, cultivar y aislar
estas bacterias, debido a que los cultivos tienden a contaminarse fácilmente con
bacterias y hongos heterotrófos (Aakra et al., 1999). Sin embargo, las fuentes de
contaminación aún no son claras, ya que los medios en los cuales se crecieron las
bacterias no contenían fuentes de carbono orgánicas sino inorgánicas (HCO3-) y los
microorganismos heterótrofos necesitan fuentes de carbono orgánicas para su
crecimiento. Otra posible opción, es que la fuente de carbono orgánica proviniera de
la etapa de lavado del material, el cual era lavado con varsol, identificado como un
solvente compuesto por una mezcla de hidrocarburos aromáticos y alifáticos
(Química Técnica Ltda, 2006) De esta forma, los residuos adheridos a los materiales
posiblemente se mantuvieron aún después de realizar lavados intensivos con agua
destilada, desionizada, de esterilizar el material en autoclave (1 hora a 105°C) y
posteriormente con luz ultravioleta en una cámara de flujo laminar. La aparición de
los microorganismos contaminantes, se ha podido favorecer debido a los largos
tiempos de incubación (1 mes) aún cuando la persona que manipuló los cultivos los
mantuvo en cajas de petri debidamente selladas con papel vinipel y cuando eran
manipuladas los procedimientos se realizaban en cabina de flujo laminar previamente
esterilizada con UV para evitar la contaminación con compuestos volátiles. Estas
bacterias fueron cultivadas y aisladas por la estudiante de maestría Gómez (2007),
quien utilizó la técnica de extinción por dilución (Aakra et al., 1999) para la
obtención de estas y posteriormente realizaron pases sucesivos en cajas de petri.
52
Los 3 aislamientos identificados taxonómicamente, presentaron porcentajes de
similitud elevados (97-100%) con relación a las secuencias parciales de 16S rDNA
publicadas en el GenBank, los cuales presentaron una alta homología con
Chelatobacter sp. Pht-3B (97%) [DQ659453] (Pastizales-cuenca del río La vieja),
este género ha sido reportado por Power y col. (1998) por su capacidad de oxidar
compuestos nitrogenados; Rhizobium sp. MG32 (97%) [AJ746089] (Pastizales-
cuenca del río La vieja) hasta el momento no ha sido reportado como un género capaz
de oxidar el ión amonio, sino como fijador de nitrógeno (Compton et al., 2004). Sin
embargo, algunas especies del género como Rhizobium radiobacter aisladas de
suelos, son capaces de crecer en medios de cultivo con una única fuente de nitrógeno
denominada úrea metileno, la cual es descompuesta por la bacteria produciendo
amonio y dióxido de carbono (Koivunen et al., 2003). Por último, la especie
Nitrobacter hamburgensis (100%) [L35502] (Bosque-cuenca del río Otún) ha sido
reportada ampliamente como un microorganismo capaz de oxidar el ión nitrito
(Aamand et al., 1996; Starkenburg et al., 2008), pero nunca se ha demostrado que sea
capaz de oxidar el ión amonio para obtener energía y crecer.
BON: se enviaron 8 secuencias parciales de 16S rDNA, de las cuales se identificaron
7 (87%), y 1 (12%) aislamiento no pudo ser identificado. Los aislamientos
identificados mostraron alta homología (97-100%) con dos especies bacterianas: 6
aislamientos se relacionaron con Oligotropha carboxidovorans (99-100%)
[AB099660] (Bosques de las dos cuencas, cafetales y guaduales), (97%) [AB099659]
y 1 aislamiento con Rhodopseudomonas palustris (100%) [AB353097] (Monocultivo
de cebolla – cuenca otún). O. carboxidovorans ha sido reportada como una especie
que se caracteriza por ser quimiolitoautótrofa aeróbica o facultativa, con capacidad de
utilizar el monóxido de carbono como donador de electrones en presencia de oxígeno.
Sin embargo, se ha demostrado que pueden crecer en presencia de algunas fuentes de
nitrógeno como úrea, amonio, nitrito y nitrato. Aunque esta especie ha sido separada
taxonómicamente de R. palustris, se ha demostrado que están relacionadas
53
filogenéticamente (Meyer, 2005), además, se ha determinado que R. palustris
también se relaciona filogenéticamente con el género Nitrobacter, el cual es
ampliamente reportado como un oxidador de nitrito (Aamand et al., 1996). Esto
podría explicar el hecho de encontrar estas dos especies dentro del mismo grupo
funcional aun cuando no estén reportadas como oxidadoras de nitrito, además, debido
a la gran versatilidad metabólica de R. palustris, Starkenburg y col. (2008), propone
que aunque no se ha demostrado que esta especie utiliza el ión nitrito como fuente de
energía, el hecho que esté relacionada filogenéticamente con el género Nitrobacter la
convierte en una especie con posible capacidad de oxidar nitrito, para lo cual se hace
necesario realizar un mayor número de estudios.
7.2 Número de aislamientos bacterianos cultivables diferentes para cada grupo
funcional en cada uno de los suelos estudiados.
En el presente estudio, el número de aislamientos bacterianos diferentes se determinó
de acuerdo a la identificación taxonómica realizada anteriormente, separando los
aislamientos por géneros o especies. Se realizó únicamente para los grupos de BDH y
desnitrificantes, debido al bajo número de aislamientos obtenidos para BON y BOA.
7.2.1 Bacterias degradadoras de hidrocarburos en las cuencas de los ríos La
vieja y Otún.
Para el primer evento de muestreo (Junio) en la cuenca del río La Vieja, se observó
que los cultivos de café y los guaduales presentaron el mayor número de aislamientos
bacterianos diferentes con un valor de 4 cada uno, seguido de los bosques y pastizales
con un valor de 2 cada uno (Anexo 10). En el mes de Septiembre, el número de
aislamientos bacterianos diferentes aumentó para todos los usos del suelo, a
excepción de los guaduales, donde se observó una disminución. Así, una vez más los
54
cultivos de café presentaron el mayor número de aislamientos bacterianos diferentes
(7 aislamientos diferentes), seguido de los bosques y los pastizales (cada uno con 5
aislamientos diferentes). En los suelos de guaduales, solo se observó un aislamiento
(Anexo 11), lo cual posiblemente fue debido a inconvenientes durante la etapa de
aislamiento y purificación de las bacterias (Figura 6).
Inicialmente, se esperaba encontrar una mayor variabilidad de aislamientos
bacterianos en suelos de bosques, debido a que en estos ecosistemas existe una mayor
diversidad de coberturas vegetales, las cuales producen gran cantidad de materia
orgánica depositada en los suelos a través de la hojarasca, encontrándose así una
mayor heterogeneidad de sustratos y nichos que generarían la posibilidad de
encontrar una alta variabilidad bacteriana (Bruns et al., 1999). Sin embargo el uso del
suelo correspondiente a cultivos de café fue el que presentó la mayor variabilidad de
aislamientos bacterianos (Figura 6).
El mayor número de aislamientos bacterianos diferentes en guaduales y cafetales
asociados a cultivos de plátano, podría ser explicado por el hecho que son
agroecosistemas que se caracterizan por estimular un desarrollo adecuado de la fauna
silvestre y la biodiversidad, debido a que son capaces de almacenar grandes
volúmenes de agua y aportan gran cantidad de biomasa a través de la hojarasca, la
cual contribuye a los contenidos de materia orgánica en el suelos, ayudando a
mantener la fertilidad. Además, poseen gran capacidad para secuestrar carbono, 560
toneladas / hectárea2 en guaduales y 142.60 toneladas / hectárea
2 en cultivos de café
(Jochenm et al., 2002; FAO, 2008). Adicionalmente, los cultivos de plátano
adyacentes a los cultivos de café, podrían actuar como un tipo de fertilización
orgánica, debido a que aportan biomasa seca y contribuyen al ciclaje de nutrientes en
los sistemas de café (Farfán, 2005) y los residuos vegetales provenientes de los
cultivos de café y plátano poseen compuestos de carbono ricos en energía (p.e.
55
carbohidratos) (Cardona y Sadeghian, 2005), los cuales podrían ser utilizados por las
BDH para aumentar su biomasa.
De acuerdo a las características mencionadas anteriormente, los agroecosistemas de
guaduales y cultivos de café asociados a plátano, probablemente pueden generar
nichos ecológicos adecuados para el desarrollo de las BDH, en comparación con otros
usos del suelo como los pastizales para ganadería, los cuales debido a las actividades
de pastoreo generan impactos ambientales negativos como la erosión, compactación y
estabilidad estructural del suelo, resultante del tránsito constante del ganado. Dichos
impactos sobre el suelo pueden reducir el flujo del agua en el suelo y el volumen de
los espacios ocupados anteriormente por poros con aire y agua, generándose cambios
en el contenido de materia orgánica, entre otras características importantes para el
establecimiento de comunidades bacterianas diversas (Murgueitio, 2003).
Figura 6. Número de aislamientos bacterianos diferentes de BDH en los usos de suelo
estudiados, cuenca del río La vieja.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Bosques Pastizales Cultivos de Café
Guaduales
Nú
me
ro d
e ai
slam
ien
tos
bac
teri
ano
s d
ifer
en
tes
Usos del suelo
Junio
Septiembre
56
En la cuenca del río Otún se observó que en Junio, el uso del suelo que presentó un
número mayor de aislamientos diferentes fue bosques (9 aislamientos diferentes),
seguido de los monocultivos de cebolla (5 aislamientos diferentes), por último las
plantaciones de pino y los guaduales (4 y 3 aislamientos diferentes respectivamente)
(Anexo 12). En el mes de Septiembre, al igual que en la cuenca del río La vieja, se
observó un aumento generalizado en el número de aislamientos bacterianos
diferentes, a excepción de los bosques, donde se observó una disminución (Anexo 13)
(Figura 7).
De acuerdo a la Figura 7, independientemente de la época (Junio o Septiembre), los
usos de suelo de bosques y guaduales el mayor número de aislamientos bacterianos
diferentes. Esto podría ser explicado al conocer que estos ecosistemas se caracterizan
por presentar los mayores contenidos de materia orgánica en comparación con
cualquier otro ecosistema (11.21%) (Chantigny, 2003; Giraldo, 2008), lo cual podría
incidir sobre algunas propiedades físicas y químicas del suelo como la compactación,
el pH, la porosidad, el contenido de agua gravimétrica y la capacidad de intercambio
catiónico. Así, estos suelos pueden tender a ser menos compactos, lo cual genera un
mayor número de espacios porosos que permiten retener mas volúmen de agua y
realizar intercambios gaseosos, propiciando un mejor ambiente para el desarrollo de
los microorganismos edáficos (Giraldo, 2008). Por otra parte, los elevados contenidos
de materia orgánica podrían favorecer el reciclaje de nutrientes y la fertilidad de estos
suelos (Six et al., 2002) a través del retorno de grandes cantidades de materiales
orgánicos de composición variada (Giraldo, 2008), primordiales para preservar la
diversidad del suelo.
En cuanto a los monocultivos de cebolla y plantaciones de pino, se obtuvieron
resultados similares entre las dos épocas evaluadas, y además el número de
aislamientos bacterianos diferentes fue menor en comparación con los suelos de
bosques y guaduales. Posiblemente, los suelos de cebolla al ser altamente
57
intervenidos por el uso de fertilizantes (p.e. NPK) y pesticidas (p.e. Lorsban,
insecticida organofosforado de amplio espectro) son suelos que poseen un menor
numero de nichos ecológicos en los cuales se puedan desarrollar las BDH o
posiblemente los componentes de los pesticidas generen toxicidad sobre algunos
taxones específicos. Para el caso de plantaciones forestales de pino, se ha
determinado que son ecosistemas donde existe una elevada circulación de carbono y
presentan altos contenidos totales de materia orgánica (Ramírez et al., 2007). Sin
embargo, Hofstede y col. (1998) proponen que el proceso de descomposición de
hojarasca en plantaciones forestales de Pinus spp. es lenta, debido a la pobre calidad
del material vegetal (altos contenidos de polifenoles), además estos suelos son
considerados como propensos a sufrir desbalances nutricionales (Hackl et al., 2004)
debido al reemplazo de la cobertura vegetal (p.e. bosques naturales por plantaciones
de coníferas de Pino patula), ya que pordía haber una limitación en la circulación
normal de los bioelementos del suelo y consecuentemente, se podrían ver afectadas
las comunidades microbianas (Hofstede et al., 1998).
Figura 7. Número de aislamientos bacterianos diferentes de BDH en los usos de suelo
estudiados, cuenca del río Otún.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Bosques Monocultivos de cebolla
Plantaciones de pino
Guaduales
Nú
me
ro d
e ai
slam
ien
tos
bac
teri
ano
s d
ifer
en
tes
Usos del suelo
Junio
Septiembre
58
Al analizar cada uso del suelo en las dos épocas del año, no solamente se observan
diferencias en cuanto al número de aislamientos diferentes, sino que se observan
variaciones en los géneros. Así, en la cuenca del río La vieja, se observó que para
bosques y pastizales la composición de géneros es completamente diferente entre
Junio y Septiembre, aun cuando presentan la misma riqueza de aislamientos,
mientras que para los cultivos de café se observó que algunos géneros son comunes
entre Junio y Septiembre como es el caso de Burkholderia y Pseudomonas, y en
Septiembre aparecen otros géneros como Acinetobacter, Ralstonia y Streptomyces.
También se observó que en esta cuenca se encontraron géneros como Acinetobacter,
el cual aparece exclusivamente en Septiembre en los usos de suelo de bosque,
pastizales y cultivos de café y Achromobacter, el cual solo aparece en Septiembre en
bosques y pastizales. Sin embargo, se encontraron otros géneros como Pseudomonas
y Stenotrophomonas, los cuales no muestran un patrón de aparición en alguna época
específica. Finalmente, se encontraron otros géneros los cuales se localizaron en un
solo uso del suelo y en una de las épocas evaluadas, como es el caso de Pantoea
Pedobacter, Ralstonia y Streptomyces (Tabla 10A). Esta información es relevante
ya que explica cómo las comunidades de bacterias cultivables varían dependiendo del
uso del suelo o de la época climática y genera preguntas de investigación para futuros
trabajos, en los cuales se estudie la relación de determinados géneros de bacterias con
variables como el uso del suelo y la temporalidad.
En la cuenca del río Otún, no se observó un cambio en la composición de géneros
bacterianos causado por el uso del suelo. Sin embargo, se observó que algunos
géneros como Acinetobacter, Alcaligenes y Burkholderia aparecen solamente en una
época en algunos usos del suelo (Tabla 10B). Por otro lado, los géneros Pseudomonas
y Stenotrophomonas al igual que en la ventana del río La vieja no muestran un patrón
de aparición en alguna época específica y finalmente, se encontraron géneros únicos
para un uso del suelo en una época específica como son Agrobacterium, Bacillus,
Brevibacterium Delftia, Lactobacillus, Ralstonia, Rhodococcus (Tabla 10B).
59
Tabla 10. Presencia-ausencia de géneros en los diferentes usos del suelo en la cuenca
del río La vieja (Junio y Septiembre 2006) (A) y en la cuenca del río Otún (Junio y
Septiembre 2006) (B).
A)
B)
60
En términos generales, los cambios observados en cuanto a la composición de
géneros bacterianos entre Junio y Septiembre y entre los usos del suelo evaluados,
puede deberse a que los microorganismos edáficos presentan variaciones genéticas y
fisiológicas (Smit et al., 2001), que determinan la respuesta de estos frente a las
variaciones ambientales temporales y a las prácticas de manejo a las cuales son
sometidos. Este es el caso del género Agrobacterium, el cual ha sido encontrado
comúnmente en suelos con alta intervención antrópica como cultivos, ya que se
desarrollan con mayor facilidad en suelos fertilizados (Matheus et al., 2006) o el caso
de Streptomyces, reconocido por degradar residuos de pesticidas en suelos cultivados
(Martin et al., 2006).
Burkholderia es un género que se encontró haciendo parte de diferentes usos del
suelo, desde bosques hasta suelos manejados como cultivos, pastizales y plantaciones
de pino. Es un género reconocido por ser nutricionalmente versátil y de rápido
crecimiento (Nüsslein y Tiedje, 1999), se encuentra bien representado en la rizósfera
y son capaces de degradar varios contaminantes orgánicos (Martin et al., 2006).
Posiblemente, debido a que es un gran competidor por sus elevadas tasas de
crecimiento y por su capacidad de utilizar diferentes compuestos orgánicos, la
mayoría de los aislamientos encontrados en las plantaciones de pino en el mes de
Junio corresponden a este género.
De manera general, se observó que para los usos del suelo estudiados en las dos
cuencas, el número de aislamientos bacterianos diferentes aumentó para el segundo
evento de muestreo (Septiembre) (Figura 6 y 7). Las diferencias encontradas entre las
dos épocas evaluadas, pueden ser explicadas por el efecto que ejerce la temporalidad
y los cambios climáticos asociados, en especial las precipitaciones, sobre la
composición de las comunidades de bacterias edáficas. De acuerdo a datos sobre
precipitaciones en las dos cuencas, se observa que hay diferencias entre las épocas
evaluadas, se observa que en el mes de Septiembre las precipitaciones aumentan en
61
comparación con el mes de Junio, además las lluvias en el mes de Septiembre
corresponden a las primeras precipitaciones después de la época seca, la cual
corresponde a los meses de Julio y Agosto (Figura 8). Estos cambios temporales
pueden conducir a un aumento en la disponibilidad de nutrientes, debido a que estos
se liberan de los agregados del suelo (Austin y Vitousek, 1998; Steenwerth et al.,
2005) mediante procesos como disrupción de agregados y redistribución de la materia
orgánica (Rong et al., 2008), las plantas producen mayor cantidad de exudados ricos
en nutrientes (Diedhiou, 2007) y por último, aquellas precipitaciones que ocurren
seguido de la época seca, generan procesos de descomposición de la hojarasca que se
ha acumulado en el suelo durante la época seca, haciendo disponibles aquellos
nutrientes contenidos en la biomasa vegetal (Cornejo et al., 1994),.
Consecuentemente, se podría favorecer el crecimiento de las poblaciones microbianas
y el aumento del número de aislamientos bacterianos diferentes de las comunidades
por la presencia y disponibilidad de gran variabilidad de compuestos orgánicos para
su metabolismo.
62
Figura 8. Comportamiento anual de la precipitación media mensual para las áreas de
muestreo, series históricas de las estaciones meteorológicas Sorrento (Paraíso)
(Montenegro, Quindío) (A) y la estación meteorológica Los naranjos (Santuario,
Risaralda) (B), de la red de estaciones climatológicas de CENICAFÉ. En el eje de
abscisas, la precipitación en mm y en el eje de ordenadas el tiempo en meses.
(CENICAFÉ, 2008).
63
En estudios anteriores realizados por Vela (2007) y Gómez (2008), se reportó que no
hubo diferencias signficativas entre los usos de suelo evaluados para las siguientes
propiedades físico-químicas: pH, % de humedad, temperatura del suelo y
concentración de nitratos. Debido a esto, los datos no fueron incluidos en el presente
estudio ni se realizó algún tipo de análisis con relación al número de aislamientos
diferentes obtenidos en este estudio.
7.2.2 Bacterias desnitrificantes en las cuencas de los ríos La vieja y Otún.
Para el primer evento de muestreo (Junio) en la cuenca del río La Vieja, se observó
que los suelos de bosques presentaron el mayor número de aislamientos bacterianos
diferentes con un valor de 4, seguido de los suelos de pastizales con un valor de 3,
finalmente los suelos de cultivos de café y guaduales presentaron 2 aislamientos
diferentes cada uno (Anexo 14). Para el segundo evento de muestreo (Septiembre), el
número de aislamientos bacterianos diferentes aumentó solamente para los suelos de
pastizales de 2 a 3, en los otros usos del suelo se mantuvo constante, nunca
disminuyó (Figura 9). En los suelos de guaduales para el mes de Septiembre no se
logró aislar ninguna bacteria (Anexo 15), lo cual posiblemente fue debido a
inconvenientes durante la etapa de aislamiento y purificación de las bacterias.
En la cuenca del río Otún, independientemente del evento de muestreo, se observó
que la variabilidad de aislamientos bacterianos fue bastante baja, se encontraron entre
1 y 2 en cada uso del suelo (Figura 10) (Anexos 16 A y B).
La técnica utilizada para el aislamiento de estas bacterias fue dilución por extinción,
la cual presentó problemas como la contaminación con bacterias que presentaban
elevadas tasas de crecimiento. Otro inconveniente que pudo presentarse durante el
proceso de aislamiento, podría ser que durante los múltiples pases el microorganismo
perdió su viabilidad de crecimiento bajo el sustrato utilizado (Gamble et al., 1977).
64
Debido a los inconvenientes asociados a los métodos dependientes de cultivo, el
estudio de las comunidades de bacterias denitrificantes se deberá abordar mediante
técnicas complementarias independientes de cultivo, las cuales permitan obtener
mayor información acerca de los taxones de bacterias que componen las comunidades
edáficas y de esta manera determinar el efecto real del uso del suelo sobre este grupo
funcional.
Aunque el número de aislamientos diferentes obtenidos para este grupo funcional no
fue elevado debido a los inconvenientes asociados a la técnica mencionados
anteriormente, se observó una tendencia de aumento en suelos de bosques, en la
cuenca del río La vieja. Existen diferentes razones que podrían ayudar a explicar este
hecho, las cuales se relacionan principalmente con las prácticas agrícolas asociadas a
los diferentes usos del suelo, como son el uso de fertilizantes y pesticidas. Se ha
determinado que en suelos agrícolas, las adiciones de nitrógeno mediante el uso de
fertilizantes, pueden conducir a una saturación del elemento en el suelo debido a
concentraciones elevadas, generando un efecto tóxico que inhibe la actividad
enzimática de las bacterias. Así, la comunidad microbiana se verá afectada y
dominarán aquellas bacterias que sean capaces de soportar estas condiciones (Frey et
al., 2004). Además, Liu y col. (2008) y Millenium Ecosystem Assessment (2005)
proponen que el uso indiscriminado de fertilizantes produce acidificación del suelo,
generando un desequilibrio entre las formas NH4+ y NH3
+, como consecuencia, se
generan cambios en los procesos de nitrificación por parte de los géneros
Nitrosomonas y Nitrobacter.
Con respecto al uso de pesticidas, Ahmed y col. (1998) determinaron que el uso de
ciertos compuestos como cloratos, cianatos y plaguicidas organoclorados
(insecticidas) inhiben directamente el desarrollo de bacterias asociadas al ciclo del
nitrógeno, y dependiendo de la composición del agroquímico, se produce un proceso
de selección hacia la dominancia de ciertos taxones bacterianos (Roux et al., 2008).
65
Por otro lado, en suelos cultivados es muy común la adición de algún tipo de
material orgánico para fertilizar el suelo. Sin embargo, se ha encontrado que las
comunidades microbianas pueden verse alteradas por la adición de materiales
orgánicos inestables, que generan procesos de selección sobre aquellas poblaciones
bacterianas que sean más competitivas en cuanto a sus tasas de crecimiento y su
habilidad para absorber nutrientes (Miller et al., 2008). De esta manera, los procesos
de selección actúan como un reductor de la diversidad de especies, manteniendo
aquellas poblaciones de bacterias capaces de sobrevivir bajo esas condiciones
ambientales.
Los suelos de bosques son considerados como poco o nada intervenidos por el
hombre, se caracterizan por poseen mayor heterogeneidad en su composición física y
química (Webster et al., 2002), dando lugar a la creación de un número mayor de
microhabitats con heterogeneidad de sustratos y nichos, los cuales generan la
posibilidad de encontrar una alta riqueza de taxones bacterianos (Bruns et al., 1999).
Por otro lado, las partículas de suelo en los bosques se encuentran como “agregados
empaquetados”, es decir, son suelos que presentan un grado de compactación tal que
permite la generación de pequeños espacios anaerobios, los cuales permitirían un
adecuado desarrollo de las comunidades denitrificantes, las cuales pueden presentar
este tipo de metabolismo (Uchida et al., 2008); caso contrario a lo que se observa en
suelos cultivados y manejados, los cuales son sometidos a procesos de aireación por
actividades como el arado del suelo.
66
0
1
2
3
4
5
Bosques Pastizales Cultivos de café
Guaduales
Nu
me
ro d
e a
isla
mie
nto
s d
ife
ren
tes
Usos del suelo
Junio
Septiembre
0
1
2
3
4
5
Bosques Monocultivos de cebolla
Plantaciones de pino
GuadualesNu
me
ro d
e a
isla
mie
nto
s b
acte
rian
os
dif
ere
nte
s
Usos del suelo
Junio
Septiembre
Figura 9. Número de aislamientos bacterianos diferentes desnitrificantes en los usos
de suelo estudiados, cuenca del río La Vieja.
Figura 10. Número de aislamientos bacterianos diferentes desnitrificantes en los usos
de suelo estudiados, cuenca del río Otún.
67
Al analizar cada uso del suelo en las dos épocas del año, no solamente se observa un
cambio numérico en cuanto al número de aislamientos diferentes, sino que se
observan variaciones en la composición de géneros de los aislamientos identificados.
No obstante, no se observa un patrón de aparición claro en alguna época específica,
aunque si se evidenció que algunos géneros aparecen específicamente en un uso del
suelo, como es el caso del género Bacillus, el cual se encontró únicamente en suelos
cultivados (cultivos de café o monocultivos de cebolla) (Anexo 18A), este género ha
sido reportado anteriormente en suelos cultivados con tomate (Dandie et al., 2007);
así mismo, los géneros Enterobacter y Pantoea se encontraron únicamente en los
suelos de plantaciones de pino en épocas diferentes, y también han sido reportados
como habitantes en suelos de plantaciones de pino (Müller et al., 2004) (Anexo 18
B).
Tabla 11. Presencia-ausencia de géneros desnitrificantes en los diferentes usos del
suelo en la cuenca del río La vieja (Junio y Septiembre 2006) (A) y en la cuenca del río
Otún (Junio y Septiembre 2006) (B).
68
7.3 Relación de los usos del suelo estudiados de acuerdo a la composición de las
comunidades de bacterias cultivables.
Este objetivo solamente se llevó a cabo para el grupo BDH, debido al número tan
bajo de aislamientos identificados para BON, BOA y desnitrificantes.
Para la cuenca del río La vieja, se encontró que de acuerdo a la composición de la
comunidad cultivable de bacterias degradadoras, los usos de suelo evaluados
(teniendo en cuenta los dos eventos de muestreo) se asociaron con porcentajes de
similaridad bajos de la siguiente manera: se generaron dos agrupaciones principales,
la primera agrupación contiene los suelos de bosques y pastizales (0,43 de
similaridad) y la segunda agrupación contiene los suelos de guaduales y cultivos de
café (0,38 de similaridad) (Figura 11).
De acuerdo a los resultados obtenidos, la composición de las comunidades de
bacterias cultivables degradadoras presenta mayor similaridad entre los suelos de
pastizales y bosques y entre los suelos de guaduales y cafetales Sin embargo, se
esperaba encontrar una asociación entre las comunidades de pastizales y cafetales,
sabiendo que estos suelos son altamente intervenidos por el hombre mediante el uso
de fertilizantes y pesticidas, generando presiones selectivas similares que permitan el
establecimiento de comunidades bacterianas parecidas en composición. Sin embargo,
en un estudio realizado por Sadeghian y col. (1999) en suelos de sistemas
agropecuarios y forestales en el departamento del Quindío, encontraron que los suelos
de guaduales y cafetales se agrupan de acuerdo al pH de los suelos y a los contenidos
de elementos como el Ca, Mg y K. Esta información podría indicar que aunque la
dinámica edáfica y las prácticas agrícolas asociadas a cafetales y guaduales son
diferentes, los suelos de estos agroecosistemas pueden presentar ciertas características
similares que podrían influir en la composición de las comunidades bacterianas
69
edáficas, generando fuerzas de selección sobre determinados taxones de bacterias. La
similaridad de las comunidades bacterianas entre suelos de pastizales y bosques,
podría ser explicada por el tipo de prácticas agropecuarias que son realizadas en los
pastizales.
Figura 11. Dendograma de similaridad con base en la composición taxonómica de
aislamientos bacterianos identificados en la cuenca del río La vieja (Junio y
Septiembre).
De acuerdo a las encuestas realizadas a los finqueros sobre el manejo y uso del suelo
de estos pastizales, estos suelos son sometidos a rotación con cultivos de café, se
70
utiliza el compostaje y adicionan residuos orgánicos como la gallinaza para fertilizar.
Este tipo de actividades conducen a incrementos en las concentraciones de carbono
orgánico, aumentan la porosidad, disminuyen la compactación de los suelos (Bronick
y Lal, 2005) y proveen gran cantidad y variabilidad de compuestos orgánicos que
pueden ser utilizados por las bacterias edáficas para su crecimiento. Sin embargo, hay
que tener en cuenta la historia de manejo que han tenido los suelos de los bosques
analizados en el presente estudio, debido a que son áreas que antiguamente fueron
utilizadas con fines agropecuarios, posteriormente fueron abandonadas y actualmente
se encuentran en procesos de regeneración natural desde hace 20 a 40 años.
Posiblemente, estos suelos aún no han recuperado las propiedades físicas, químicas y
biológicas que caracterizan los suelos de bosques primarios y necesitan de tiempos
más largos para volver a su estado natural. Compton y Boone (2000) explican que
durante la recuperación de bosques en áreas del sureste de los Estados Unidos incluso
después de 30 - 50 años de sucesión vegetal, no se ha observado una recuperación
total de los suelos en cuanto a los contenidos de materia orgánica y de nitrógeno.
Para la cuenca del río Otún, se encontró que de acuerdo a la composición de la
comunidad cultivable de bacterias degradadoras, los usos de suelo evaluados
(teniendo en cuenta los dos eventos de muestreo) se asociaron en tres grupos
principales con valores de similaridad bajos: las plantaciones de pino y los
monocultivos de cebolla (0,38 de similaridad), estos a su vez con los guaduales (0,32
de similaridad) y por último los bosques, se observan como un uso del suelo aparte, el
cual se asocia a los grupos anteriores con 0,27 de similaridad (Figura 12). Los
resultados obtenidos fueron los esperados, al encontrar que las comunidades
bacterianas edáficas en suelos de bosques y guaduales son menos similares que las
comunidades de bacterias encontradas en suelos intervenidos constantemente por el
hombre (monocultivos de cebolla y plantaciones de pino). Así, el uso de prácticas
agroforestales como la aplicación de fertilizantes, pesticidas (en cultivos) o podas
71
selectivas que originan un horizonte O heterogéneo (plantaciones de pino) (Berdugo
et al., 2006), podrían generar cambios en las propiedades fisicas, químicas y
biológicas de los suelos produciendo una disminución de la riqueza de aislamientos y
cambios en la composición de las comunidades bacterianas.
Figura 12. Dendograma de similaridad con base en la composición taxonómica de
aislamientos bacterianos identificados en la cuenca del río Otún (Junio y Septiembre).
72
8. CONCLUSIONES
De manera general, se recuperó un mayor número de aislamientos bacterianos
diferentes para el mes de Septiembre en todos los usos de suelo evaluados y se
observaron cambios en la composición de las comunidades entre las dos épocas
evaluadas, ya que se recuperaron géneros únicos para cada mes.
Los suelos de bosques y guaduales presentaron el mayor número de aislamientos
bacterianos diferentes de BDH en la cuenca del río Otún, debido a las propiedades
físicas y químicas que presentan estos ecosistemas.
Las técnicas utilizadas en estudios anteriores para el aislamiento y purificación de
bacterias de BON, BOA y denitrificantes, no permitieron la obtención de un número
suficiente de aislamientos para relacionar los usos de suelo de acuerdo a la
composición de las comunidades bacterianas.
Los aislamientos 12 y 13 correspondientes al grupo BOA, podrían ser considerados
como el primer aislamiento de esa bacteria, debido a que presentaron porcentajes de
similitud del 100% con la secuencia parcial 16S ribosomal de una bacteria no
cultivada hasta el momento. Esto es apoyado por los resultados de amplificación
positiva con iniciadores específicos para el gen amoA.
73
9. RECOMENDACIONES
Es necesario combinar los métodos empleados con técnicas independientes de cultivo
que permitan obtener información más detallada y específica de cada grupo
taxonómico (p.e. abundancia) para realizar análisis de diversidad de las comunidades.
Evaluar las actividades enzimáticas in situ de las comunidades de bacterias edáficas,
que permitan obtener información de la calidad del suelo y los ciclos biogeoquímicos
en los cuales median procesos.
Se recomienda evaluar los grupos funcionales investigados en el presente estudio en
diferentes épocas del año y no solamente durante épocas transicionales de lluvia, para
determinar patrones de comportamiento de los diferentes grupos a lo largo del año.
Evaluar parámetros fisicoquímicos como la textura y estructura de las muestras de
suelo analizadas y la concentración de algunos nutrientes como carbono orgánico y
NO3- , los cuales podrían influir sobre la composición de las comunidades de
microorganismos.
Es necesario realizar encuestas más detalladas acerca del uso del suelo en cada finca,
como estado del cultivo, fecha de aplicación de plaguicidas, fertilizantes y sobretodo
indagar acerca del historial de uso de cada suelo estudiado.
74
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97
ANEXOS
Anexo 1. Departamentos donde se tomaron las muestras de suelo para el estudio
en el eje cafetero (Colombia).
98
Anexo 2. Cuenca del río La vieja y distribución de los sistemas productivos del
área (CIEBREG, 2006).
99
Anexo 3. Cuenca del río Otún y distribución de los sistemas productivos del área
(CIEBREG, 2006).
100
Anexo 4A. Preparación del buffer TE.
Se utilizan los siguientes reactivos y soluciones:
tris HCL 10 mM a pH 8,0
EDTA 1 mM a pH 8,0
El peso del tris es de 121.14g
Disolver en la mitad de agua que se va a preparar y ajustar el pH con HCl puro.
Posteriormente se adiciona el volumen restante de agua. Autoclavar por 15 minutos.
Anexo 4B. Preparación del buffer de carga para corrido de electroforesis en
agarosa.
Agregar:
Azul de bromofenol- Cantidad: 0.05g- Concentración final: 0.5%.
Xylene cyanol- cantidad: 0,05g- Concentración final: 0.5%
Buffer TAE 1X- Cantidad: 10 mL- concentración final: 1X
Almacenar a temperatura ambiente.
101
Anexo 5A. Preparación del gel de agarosa al 1% y al 2% p/v.
Pesar la cantidad adecuada de agarosa utilizando únicamente la cuchara asignada para
tal fin. Disolver la agarosa en buffer TAE 0.5X hasta que no se observen cristales o
grumos. Adicionar 5 µl de bromuro de etidio para 100 mL, cuando lo adicione
verifique que la agarosa no esté muy caliente para evitar inhalar vapores de bromuro.
Durante esta fase trabaje solo con guantes de nitrilo azul, debido a que el bromuro es
mutagénico. Una vez adicionado y disuelto el bromuro, colóquelo sobre la cama de
electroforesis con su respectivo peine. Adicione buffer de carga a las muestras en una
relación 3:5. Espere aproximadamente 30 minutos a que solidifique el gel y cargue
las muestras.
Anexo 5B. Preparación del buffer TAE 0.5X.
Pesar 242 g de Tris base, adicionar 57.1 de acido acético glacial y 100 mL de EDTA
0.5 M (pH 8.0). Finalmente, ajustar a 1000 mL con agua desionizada y esterilizar. A
partir de esta solución se prepara el volumen deseado para correr la electroforesis en
gel de agarosa a una concentración de 0.5-1X (V1C1= V2C2). Almacenar a
temperatura ambiente.
102
Anexo 6. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los genes 16S rDNA de BDH, en la cuenca del
río La Vieja.
División Subdivisión Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] Identidad de
nucleótidos (%)
Actinobacteria Actinobacteria 193/16132112 Rhodococcus fascians [DQ386111] 94
300/26122311 Streptomyces sp. LS143 [AF534565] 96
Proteobacteria β-proteobacteria
199/16141112 Burkholderia cepacia[AB272341] 99
205/16121312 Burkholderia cepacia [AB272341] 98
218INT/16122111 Burkholderia cepacia [AY509957] 97
255/261323111
Achromobacter xylosoxidans subsp.
Xylosoxidans [AF439314] 100
266/261212111 Ralstonia sp. LR35 [EU263295] 100
412/261221121 Burkholderia sp. JB1 [AJ011509] 100
γ-proteobacteria
242/16122312
Stenotrophomonas sp. Pd-S-(s)-e-D-2(5)
[AB242928] 95
224/161122111 Stenotrophomonas maltophilia [DQ103763] 100
311/261321112 Stenotrophomonas maltophilia [EF580914] 100
328/261422111 Stenotrophomonas maltophilia [AY445079] 100
269/26111311 Stenotrophomonas sp. Da-16 [EU073955] 99
246/16122211 Pantoea agglomerans [EU047555] 100
206
INT/16112311-1 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] 97
206XTT/16112311
-2 Pseudomonas aeruginosa [EF016296] 97
391/261312111 Acinetobacter calcoaceticus [EU090892] 100
393/261312112 Acinetobacter calcoaceticus [EU022688] 100
394/261313112
Achromobacter xylosoxidans subsp.
Xylosoxidans [EU006066] 100
310/261413115 Acinetobacter calcoaceticus [EF432578] 100
388/261413114
Achromobacter xylosoxidans subsp.
Xylosoxidans [EF623833] 100
390/261413112 Pseudomonas sp. SPS-8 [AM689949] 100
Proteobacteria γ-proteobacteria
401/261412112
Achromobacter xylosoxidans subsp.
Xylosoxidans [EU006066] 100
286/261422112 Pseudomonas aeruginosa [EU515133] 100
276/26121311 Pseudomonas aeruginosa [AY748891] 87
288/261221111 Pseudomonas aeruginosa [DQ641680] 100
289/262222112 Acinetobacter calcoaceticus [EF432578] 100
295/261221112 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] 100
313/261221122 Acinetobacter sp. M9 [EU427315] 99
314/26122212 Acinetobacter calcoaceticus [EF432578] 100
103
Firmicutes Bacilli 325/261322112 Bacillus simplex [EU427320] 97
Bacteroidetes Flavobacteria
196/16141312 Chryseobacterium sp. 42 [EF154282] 98
400/261313111 Bizionia sp. sp. D58-E09 [DQ873780] 89
Sphingobacteria 207/161121111 Pedobacter wanjuense [AM279217] 100
104
Anexo 7. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los genes 16S rDNA de BDH, en la cuenca del
río Otún.
División Subdivisión Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] Identidad de nucleótidos
(%)
Actinobacteria Actinobacteria
296/262112121
Rhodococcus erythropolis
[EU481631] 100
280/262112123 Rhodococcus sp. Y1E [EU293153] 90
303/262113113
Brevibacterium sp. K4-07D
[EF612292] 100
Proteobacteria
α-proteobacteria 228/16222311
Agrobacterium sp. IrT-JG14-24
[AJ295674] 91
β-proteobacteria
223/16231312
Achromobacter xylosoxidans subsp.
Xylosoxidans [AY753652] 84
406/262312112
Achromobacter xylosoxidans subsp.
Xylosoxidans [DQ413030] 100
211/16221111 Alcaligenes sp. LBO-1 [EF032603] 100
409/26212111 Alcaligenes sp. LBO-1 [EF032603] 100
234/16232311 Alcaligenes sp. STC1 [AB046605] 98
336/26212312
Alcaligenes sp. TS-MOSK-5
[AB234301] 100
243/16221212
Burkholderia cenocepacia MC0-3
[CP000959] 100
249/16241212
Burkholderia cenocepacia MC0-3
[CP000959] 100
222/16232111
Burkholderia cenocepacia MC0-3
[CP000959] 98
216XTT/ 16242111-1
Burkholderia cenocepacia MC0-3
[CP000959] 100
216INT/ 16242111-2
Burkholderia cenocepacia MC0-3
[CP000959] 98
217/16242112 Burkholderia cepacia [AB272341] 99
225/16231311 Burkholderia sp. BCB-17 [AB288295] 85
213/16221312 Burkholderia sp. SBH-10 [EU497966] 100
249/16241212
Burkholderia sp. YC05107
[EU430120] 98
229/16232212 Delftia acidovorans [AB361589] 96
229/16232111
Delftia acidovorans SPH-1
[CP000884] 100
244/16211211 Ralstonia pickettii [EF195098] 100
γ-proteobacteria
281/262221122
Acinetobacter calcoaceticus
[EU427316] 95
312/262222112
Acinetobacter calcoaceticus
[EF432578] 97
318/262212111
Acinetobacter calcoaceticus
[EF432578] 100
105
315/262413122
Acinetobacter calcoaceticus
[EF151807] 90
326/262413121
Acinetobacter calcoaceticus
[EF432578] 100
305/26222311 Acinetobacter sp. M9 [EU427315] 97
304/26211112 Acinetobacter sp. M9 [EU427315] 100
262/26231311 Acinetobacter sp. MH03 [EU182832] 100
220/16231112 Acinetobacter sp. P-155 [AM412159] 100
261/26232212 Acinetobacter sp. W-17 [AF390089] 95
Proteobacteria γ-proteobacteria
395/261322111
Pseudomonas aeruginosa
[DQ103761] 81
238/16231211 Pseudomonas aeruginosa [U38445] 100
233/16232211
Pseudomonas aeruginosa
[DQ103761] 100
221XTT/16212212
Pseudomonas aeruginosa
[DQ889450] 94
221INT(V)/16212212
Pseudomonas aeruginosa
[AY486366] 98
209/16222211 Pseudomonas aeruginosa [EU381200] 95
257/262321111 Pseudomonas aeruginosa [U38445] 95
258/262323121
Pseudomonas aeruginosa
[DQ459316] 99
278/262213111 Pseudomonas aeruginosa [EU515133] 100
317/262212121
Pseudomonas aeruginosa
[DQ103761] 100
332/262211122 Pseudomonas azelaica [FJ227303] 88
256/262323122
Pseudomonas sp. 2,4BNP
[DQ300307] 100
259/262321112 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] 100
274/26242311 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] 100
268/26212311 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] 100
P_V1P2/16231211
Pseudomonas sp. AUPB02
[EF520791] 95
316/26241212
Pseudomonas sp. DF7EH1
[AJ884889] 94
237/16212311 Pseudomonas sp. L17 [DQ300307] 100
331/262311111
Stenotrophomonas maltophilia
[EU022689] 100
275/26222312
Stenotrophomonas maltophilia
[AY837730] 100
283/262221121
Stenotrophomonas maltophilia
[DQ103763] 100
306/26241211
Stenotrophomonas maltophilia
[AY277550] 91
260/26211312
Stenotrophomonas maltophilia
[DQ103763] 100
106
215/16232312
Stenotrophomonas sp. 7-3
[EU054384] 93
216/16242111
Stenotrophomonas sp. Pd-E-(l)-e-N-
1(2) [AB291845] 90
265/261212112
Stenotrophomonas sp. Pd-S-(s)-e-D-
2(5) [AB242928] 99
323/262112111
Stenotrophomonas sp. Tpl-38
[EU375378] 100
335/262112112
Stenotrophomonas sp. Tpl-38
[EU375378] 100
Firmicutes Bacilli 410/262411112
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
[EU676001.1] 86
321/262222111 Bacillus sphaericus [DQ860125] 96
107
Anexo 8. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los genes 16S rDNA de bacterias
desnitrificantes, en la cuenca del río La Vieja.
División Subdivisión Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] Identidad de
nucleótidos (%)
Proteobacteria
β-proteobacteria
5-1D Microvirgula aerodenitrificans [AJ487013] 86
4-2D Microvirgula aerodenitrificans [AJ487013] 100
11-1D Microvirgula aerodenitrificans [AF455113] 97
γ-proteobacteria
2-2D Citrobacter amalonaticus [AF025370] 100
10-2D Citrobacter amalonaticus [AF025370] 100
9-1D Citrobacter amalonaticus [DQ187379] 99
8-1D Citrobacter farmeri (T) [AF025371] 100
13-1D Klebsiella oxytoca [AY292871] 100
13-2D Klebsiella oxytoca [AY292871] 100
6-1D Klebsiella oxytoca [EU420947] 100
8A-2D Klebsiella oxytoca [EU420947] 100
8B-2D Klebsiella oxytoca [EU420947] 100
19-2D Pseudomonas aeruginosa [DQ103761] 100
18D-1D Pseudomonas aeruginosa [DQ103761] 100
18E-1D Pseudomonas aeruginosa [DQ103761] 100
1-2D Pseudomonas sp. L14 [DQ300313] 100
14-2D Pseudomonas sp. L14 [DQ300313] 99
18C-1D Pseudomonas sp. L14 [DQ300313] 100
Firmicutes Bacillales 21-1D Bacillus azotoformans [AB363732] 99
108
Anexo 9. Taxonomía de los aislamientos con base en secuencias parciales de los genes 16S rDNA de bacterias desnitrificantes,
en la cuenca del río Otún.
División Subdivisión Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] Identidad de
nucleótidos (%)
Proteobacteria
β-proteobacteria 3-2D Microvirgula aerodenitrificans [U89333] 100
7-2D Microvirgula aerodenitrificans [U89333] 100
γ-proteobacteria
18-2D Citrobacter amalonaticus [DQ187379] 100
14-1D Klebsiella oxytoca [AY292871] 100
12-1D Klebsiella sp. AR4 [EF405603] 92
19-1D Pantoea agglomerans [AF130917] 100
15-2D Klebsiella oxytoca [AY292871] 100
20-2D Enterobacter cloacae subsp. cloacae [EF446900] 98
Firmicutes Bacillales
17-2D Bacillus azotoformans [AB363732] 100
10-1D Bacillus azotoformans [AB363732] 99
20-1D Bacillus azotoformans [AB363732] 97
109
Anexo 10. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes usos de suelo estudiados y el
número de aislamientos diferentes en la cuenca del río La vieja, Junio.
La vieja - Junio 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad)
Aislamientos
diferentes
Bosques 193 Rhodococcus fascians[DQ386111] (94%)
2 195 Pseudomonas sp. GS08 [DQ365584] (94%)
Pastizales 196 Chryseobacterium sp. 42 [EF154282] (98%)
2 199 Burkholderia cepacia [AB272341] (99%)
Cafetales
205 Burkholderia cepacia[AB272341] (99%)
4
218INT Burkholderia cepacia [AY509957] (97%)
246 Pantoea agglomerans [EU047555] (100%)
201INT Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (99%)
202 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (100%)
204INT Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (100%)
218XTT Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (100%)
242 Stenotrophomonas sp. Pd-S-(s)-e-D-2(5) [AB242928] (96%)
Guaduales
207 Pedobacter wanjuense[AM279217] (100%)
4 224 Stenotrophomonas maltophilia [DQ103763] (100%)
206INT Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (97%)
206XTT Pseudomonas aeruginosa [EF016296] (97%)
110
Anexo 11. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes usos de suelo estudiados y el número de
aislamientos diferentes en la cuenca del río La vieja, Septiembre.
La vieja - Septiembre 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad)
Aislamientos
diferentes
Bosques
391 Acinetobacter calcoaceticus [EU090892] (100%)
5
393 Acinetobacter calcoaceticus [EU022688] (100%)
255 Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans [AF439314] (100%)
394 Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans [EU006066] (100%)
325 Bacillus simplex[EU427320] (97%)
400 Bizionia sp. sp. D58-E09 [DQ873780] (89%)
311 Stenotrophomonas maltophilia [EF580914] (100%)
Pastizales
310 Acinetobacter calcoaceticus[EF432578] (100%)
5
388 Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans [EF623833] (100%)
401 Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans [EU006066] (100%)
286 Pseudomonas aeruginosa [EU515133] (100%)
390 Pseudomonas sp. SPS-8 [AM689949] (100%)
328 Stenotrophomonas maltophilia [AY445079] (100%)
Cafetales
289 Acinetobacter calcoaceticus [EF432578] (100%)
7
314 Acinetobacter calcoaceticus[EF432578] (100%)
313 Acinetobacter sp. M9 [EU427315] (100%)
412 Burkholderia sp. JB1[AJ011509] (100%)
276 Pseudomonas aeruginosa [AY748891] (87%)
288 Pseudomonas aeruginosa[DQ641680] (100%)
295 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (100%)
266 Ralstonia sp. LR35 [EU263295] (100%)
300 Streptomyces sp. LS143 [AF534565] (96%)
Guaduales 269 Stenotrophomonas sp. Da-16 [EU073955] (99%) 1
111
Anexo 12. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes usos de suelo estudiados y el número de
aislamientos diferentes en la cuenca del río Otún, Junio.
Otún - Junio 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad) Aislamientos diferentes
Bosques
220 Acinetobacter sp. P-155 [AM412159] (100%)
9
223
Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans [AY753652]
(84%)
234 Alcaligenes sp. STC1 [AB046605] (98%)
222 Burkholderia cenocepacia MC0-3 [CP000959] (98%)
225 Burkholderia sp. BCB-17 [AB288295] (85%)
229 Delftia acidovorans SPH-1 [CP000884] (100%)
233INT Delftia acidovorans [AB361589] (96%)
233XTT Pseudomonas aeruginosa [DQ103761] (100%)
238 Pseudomonas aeruginosa [U38445] (100%)
238 Pseudomonas sp. AUPB02 [EF520791] (95%)
215 Stenotrophomonas sp. 7-3 [EU054384] (93%)
Monocultivos de
cebolla
228 Agrobacterium sp. IrT-JG14-24[AJ295674] (91%)
5
211 Alcaligenes sp. LBO-1 [EF032603] (100%)
243 Burkholderia cenocepacia MC0-3 [CP000959] (100%)
213 Burkholderia sp. SBH-10 [EU497966] (100%)
209 Pseudomonas aeruginosa [EU381200] (95%)
Plantaciones de
pino
216INT Burkholderia cenocepacia MC0-3 [CP000959] (98%)
4
216XTT Burkholderia cenocepacia MC0-3 [CP000959] (100%)
249 Burkholderia cenocepacia MC0-3 [CP000959] (100%)
217 Burkholderia cepacia [AB272341] (99%)
249 Burkholderia sp. YC05107 [EU430120] (98%)
216XTT-2 Stenotrophomonas sp. Pd-E-(l)-e-N-1(2) [AB291845] (90%)
Guaduales
221XTT Pseudomonas aeruginosa [DQ889450] (94%)
3 221INT(V) Pseudomonas aeruginosa [AY486366] (98%)
237 Pseudomonas sp. L17 [DQ300307] (100%)
244 Ralstonia pickettii [EF195098] (100%)
112
Anexo 13. Distribución de los aislamientos identificados de BDH en los diferentes usos de suelo estudiados y el número de
aislamientos diferentes en la cuenca del río Otún, Septiembre.
Otún - Septiembre 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad) Aislamientos diferentes
Bosques
261 Acinetobacter sp. W-17 [AF390089] (95%)
6
262 Acinetobacter sp. MH03 [EU182832] (100%)
406
Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans [DQ413030]
(100%)
257 Pseudomonas aeruginosa [U38445] (95%)
258 Pseudomonas aeruginosa [DQ459316] (99%)
256 Pseudomonas sp. 2,4BNP [DQ300307] (100%)
259 Pseudomonas sp. 2,4BNP [DQ300307] (100%)
331 Stenotrophomonas maltophilia [EU022689] (100%)
Monocultivos
de cebolla
281 Acinetobacter calcoaceticus[EU427316] (95%)
6
312 Acinetobacter calcoaceticus[EF432578] (97%)
318 Acinetobacter calcoaceticus[EF432578] (100%)
305 Acinetobacter sp. M9 [EU427315] (97%)
321 Bacillus sphaericus [DQ860125] (96%)
278 Pseudomonas aeruginosa [EU515133] (100%)
317 Pseudomonas aeruginosa [DQ103761]
332 Pseudomonas azelaica [FJ227303] (88%)
275 Stenotrophomonas maltophilia[AY837730] (100%)
283 Stenotrophomonas maltophilia[DQ103763] (100%)
Plantaciones de
pino
315 Acinetobacter calcoaceticus[EF151807] (90%)
7
326 Acinetobacter calcoaceticus[EF432578] (100%)
274 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (100%)
395 Pseudomonas aeruginosa [DQ103761] (81%)
316 Pseudomonas sp. DF7EH1 [AJ884889] (94%)
265 Stenotrophomonas sp. Pd-S-(s)-e-D-2(5) [AB242928] (99%)
306 Stenotrophomonas maltophilia [AY277550] (91%)
410 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis [EU676001.1] (86%)
Guaduales
304 Acinetobacter sp. M9 [EU427315] (100%)
9
336 Alcaligenes sp. TS-MOSK-5 [AB234301] (100%)
409 Alcaligenes sp. LBO-1[EF032603] (100%)
303 Brevibacterium sp. K4-07D [EF612292] (100%)
268 Pseudomonas sp. 2,4BNP [EF016296] (100%)
280 Rhodococcus sp. Y1E [EU293153] (90%)
296 Rhodococcus erythropolis[EU481631] (100%)
113
323 Stenotrophomonas sp. Tpl-38 [EU375378] (100%)
335 Stenotrophomonas sp. Tpl-38 [EU375378] (100%)
260 Stenotrophomonas maltophilia [DQ103763] (100%)
114
Anexo 14. Distribución de los aislamientos identificados de bacterias desnitrificantes en los diferentes usos de suelo estudiados y el
número de aislamientos diferentes en la cuenca del río La vieja, Junio.
La vieja - Junio 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad) Aislamientos diferentes
Bosques
1 Comamonadaceae bacterium PIV-20-1 [AJ505862] (99%)
4
18C Pseudomonas sp. L14 [DQ300313] (100%)
18D Pseudomonas aeruginosa [DQ103761] (100%)
18E Pseudomonas aeruginosa[DQ103761] (100%)
13 Klebsiella oxytoca[AY292871] (100%)
Pastizales
15 Comamonadaceae bacterium PIV-20-1 [AJ505862] (99%)
3 8 Citrobacter farmeri (T)[AF025371] (100%)
9 Citrobacter amalonaticus [DQ187379] (99%)
Cultivos de café 6 Klebsiella oxytoca[EU420947] (100%)
2 21 Bacillus azotoformans [AB363732] (99%)
Guaduales
11 Microvirgula aerodenitrificans [AF455113] (97%)
2 5 Microvirgula aerodenitrificans [AJ487013] (86%)
17 Comamonadaceae bacterium PIV-20-1 [AJ505862] (99%)
115
Anexo 15. Distribución de los aislamientos identificados desnitrificantes en los diferentes usos de suelo estudiados y el número
de aislamientos diferentes en la cuenca del río La vieja, Septiembre.
La vieja - Septiembre 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad) Aislamientos diferentes
Bosques
1 Pseudomonas sp. L14 [DQ300313] (100%)
4 19 Pseudomonas aeruginosa [DQ103761] (100%)
10 Citrobacter amalonaticus [AF025370] (100%)
13 Klebsiella oxytoca [AY292871] (100%)
Pastizales 2 Citrobacter amalonaticus [AF025370] (100%)
2 14 Pseudomonas sp. L14 [DQ300313] (99%)
Cafetales
8A Klebsiella oxytoca [EU420947] (100%)
2 8B Klebsiella oxytoca [EU420947] (100%)
4 Microvirgula aerodenitrificans [AJ487013] (100%)
Guaduales Ningun aislamiento identificado 0
116
Anexo 16. Distribución de los aislamientos identificados de denitrificantes en los diferentes usos de suelo estudiados y el
número de aislamientos diferentes en la cuenca del río Otún (Junio y Septiembre).
A)
Otún - Junio 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad) Aislamientos diferentes
Bosques 14 Klebsiella oxytoca [AY292871] (100%) 1
Monocultivos de cebolla 10 Bacillus azotoformans [AB363732] (99%)
1 20 Bacillus azotoformans [AB363732] (97%)
Plantaciones de pino 19 Pantoea agglomerans [AF130917] (100%) 1
Guaduales 12 Klebsiella sp. AR4 [EF405603] (92%) 1
B)
Otún - Septiembre 2006
Uso del suelo Aislamiento Identificación [No. Acceso GenBank] (% similaridad) Aislamientos diferentes
Bosques 18 Citrobacter amalonaticus [DQ187379] (100%) 1
Monocultivos de cebolla 17 Bacillus azotoformans [AB363732] (100%)
2 15 Klebsiella oxytoca [AY292871] (100%)
Plantaciones de pino 20 Enterobacter cloacae subsp. cloacae [EF446900] (98%) 1
Guaduales 3 Microvirgula aerodenitrificans (T) [U89333] (100%)
1 7 Microvirgula aerodenitrificans (T) [U89333] (100%)
117
