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IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ANTAGÓNICA DE HONGOS AISLADOS DE LA CUENCA DEL RIO TIETÊ

RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO Bucaramanga,

Colombia Diciembre 3 de

2018

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ANTAGÓNICA DE HONGOS AISLADOS DE LA CUENCA DEL RIO TIETÊ

RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

Informe técnico de grado Presentado como requisito parcial para optar el título de

Bacteriólogo y Laboratorista clínico

UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO Bucaramanga,

Colombia Diciembre 3 de

2018

Gracias a Dios y a mamita María por

darme fortaleza y sabiduría en los

momentos de dificultad.

A mis padres por su amor, dedicación,

apoyo y entrega lo cual me ayudo a

culminar esta etapa de mi vida

incondicional.

A mis hermanos por confiar en mí y

siempre estar ahí dándome una mano.

.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Diana Carolina Duque Castaño por sus conocimientos,

comprensión, apoyo, dedicación y cariño.

Profesor Welintong Luiz de Araujo por su valiosa gestión para facilitar la

realización de este trabajo y su valiosa orientación.

A la Universidad De Santander UDES, este lugar tan particular, tan difícil de

definir, que sin lugar a dudas impactó profundamente mi camino.

Tabla de Contenidos

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1

2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 3

2.1 Objetivo general ........................................................................................................ 3

2.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 3

3. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 4

4. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 5

4.1 Muestras y preservación de las muestras ........................................................... 5

4.2 Extracción y manipulación del ADN genómico .................................................... 5

4.3 Amplificación de la región its1-5,8s-its2 del ADN ribosómico ........................... 5

4.4 Actividad antagónica ................................................................................................ 6

5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS ......................................................... 7

5.1 Extracción y manipulación del ADN genómico .................................................... 7

5.2 Amplificación PCR .................................................................................................... 7

5.3 Análisis genómico de los hongos aislados de la cuenca del rio Tiete ............. 8

5.4 Actividad antagónica .............................................................................................. 11

6. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 12

7. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 14

8. LISTA DE REFERENCIAS ............................................................................................ 15

ii

Índice de figuras

Figura 1. ADN genómico de alto peso molecular.. .................................................. 7

Figura 2. Amplificación de la región ITS1-5,8S-ITS2.. ............................................. 7

Figura 3. Clasificación de los hongos por Orden. .................................................... 8

Figura 4. Clasificación de los hongos por género.. ................................................. 8

Figura 5. Hongos por calidad del agua de donde fueron aislados.. ........................ 9

Figura 6.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con óptima calidad de agua. 9

Figura 7.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con buena calidad de agua..

...................................................................................................................... 10

Figura 8.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con pésima calidad de agua..

...................................................................................................................... 10

Figura 9.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con mala calidad de agua.. 10

Figura 10 Confrontación en placa entre Ceratocystis paradoxa y hongos aislados

del Río Tietê .................................................................................................. 11

iii

Índice de anexos

Anexo A Secuencias ............................................................................................... 1

Anexo B. Antagonismo ........................................................................................... 1

Anexo C. Fotografías de los 50 hongos preservados y antagonismo. ..................... 2

iv

RESUMEN

TÍTULO: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ANTAGÓNICA DE HONGOS

AISLADOS DE LA CUENCA DEL RÍO TIETÊ

AUTORA: RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

KEY WORDS: Microorganismo, control biológico, antagonismo, caracterización de

hongos, factores físico químicos.

DESCRIPCIÓN: Los rápidos cambios en el factor ambiental y la falta de estudios sobre la diversidad y el antagonismo de los hongos presentes en el ambiente acuático, son uno de los elementos que motivan este estudio. Como objetivo principal, se propone la evaluación de la capacidad antagónica de hongos aislados de la cuenca del río Tietê, cuyo análisis permita proponer métodos alternativos de control biológico que posibiliten una minimización de las problemáticas económicas y ambientales causadas a la industria biotecnológica. Además de lo anterior, se plantea una contribución en la optimización de buenas prácticas agrícolas y de aplicación y manejo biotecnológico. Como vemos, en el estudio realizado se involucran las disciplinas de la Ecología Microbiana y la Genética de Microorganismos, con el fin de caracterizar la diversidad microbiana en el Río Tietê. Para lograr lo anterior, se preservaron 50 hongos de la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP). Estas cepas fueron recuperadas y aisladas, eliminando su contaminación con bacterias, hongos y levaduras. Finalmente, mediante la caracterización de la actividad antagónica de los hongos contra el Fitotagógeno Ceratocystis Paradoxa, se da un paso hacia el camino en la búsqueda de hongos con potencial de uso como agentes de control biológico de interés agrícola en la comunidad de hongos aislados del Río Tietê. Aumentando así, además del entendimiento, la comprensión científica sobre las comunidades de hongos presentes en esta importante cuenca, ocasionando de esta manera una mejora en la aplicación de técnicas de biología molecular para la identificación de los hongos.

v

ABSTRACT

TITTLE: IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION ANTAGONIST OF

ISOLATED FUNGI FROM THE RIVER BASIN TIETÊ

AUTHORS: RUBY JESMITH GRANADOS PLATA

KEY WORDS: Microorganism, biological control, antagonism, chharacterization of

fungus, physical chemical factor.

DESCRIPTION: The fast changes in the environmental factor and the shortage of studies about diversity and antagonism of fungus present in the aquatic circles are one of the elements that motivate this study. As a principal objective, it is proposed the evaluation of the antagonistic ability of the isolated fungi from the river basin Tietê whose análisis permit propose alternating method to biological control that make posible a minimization of the economic and environmental problems caused to the biotechnological industry. As well as, it is posed a contribution in the optimization to good farming practices and the application and biotechnological use. As we see, in the study completed the disciplines of microbial ecology and the genetics of microorganisms are involved in order to characterize the microbial diversity in the river Tietê. To achieve the above, 50 fungi were preserved from the collection of the Laboratory of Molecular Biology and Microbial Ecology of the University of Sao Paulo (LABMEM/USP).These strains were recovered and isolated, eliminating their contamination with bacteria, fungi and yeast. Finally, by characterizing the antagonistic activity of fungi against the phytogeogenic Ceratocystis Paradox, a step is taken towards the path in the search for fungi with potential for use as agents of biological control of agricultural interest, in the community of fungi isolated from the Tietê river, increasing besides the understanding, the scientific understanding about the communities of fungi present in this important basin an improvement in the application of molecular biology techniques for the identification of fungi.

1

1. INTRODUCCIÓN El Río Tietê es uno de los más conocidos de América Latina y del mundo, con enorme importancia económica para la región Sudeste de Brasil y principalmente para el estado de São Paulo (Grupo Opersan, 2016), desempeña un importante papel en el abastecimiento y producción de energía eléctrica para la población (König de Oliveira, 2014). Es el más extenso del territorio Paulista, nace limpia y crista en Salesopolis. (Ickiwaki, 2017), pasa por Biritiba-Mirim, donde ya es posible ver los primeros signos de contaminación de las aguas causadas por fertilizantes y agrotóxicos. (König de Oliveira, 2014). En la ciudad de Mogi das Cruzes, se inicia el lanzamiento de las alcantarillas domésticas e industriales sin ningún tratamiento. (Vera, 2015). En Guarulhos, en el tramo de São Paulo, el índice de contaminación alcanza su nivel más alto. (Ickiwaki, 2017). Los microorganismos representan la mayor biodiversidad de la tierra y por eso están presentes en todos los ambientes terrestres desarrollando innumerables procesos (Vera, 2015). En aguas dulces, los microorganismos actúan en la descomposición de materia orgánica y equilibrio ambiental, pudiendo ser sensibles a los cambios ocurridos en el medio ambiente, alterando su estructura. (Bucci, Szempruch, Caldwell, & Ellis, 2014). Algunos microorganismos desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de los ambientes de agua dulce, reciclando compuestos orgánicos y actuando en los ciclos biogeoquímicos de estos ecosistemas (Ickiwaki, 2017). La biodiversidad de estos ambientes puede ser fácilmente impactada por contaminantes como herbicidas, plaguicidas, metales pesados, exceso de materia orgánica e incluso por la introducción de bacterias no nativas al ambiente (Sadowsky, 2013). Estos factores pueden modificar significativamente la estructura de la comunidad microbiana, tanto en la columna de agua como en el sedimento de los ríos, alterando la presencia de microorganismos en este ecosistema (Bucci, Szempruch, Caldwell, & Ellis, 2014). Existen pocos estudios sobre la biodiversidad de microorganismos del Río Tietê, lo que implican escaso conocimiento (Díaz Cárdenas & Baena, 2015) sumado a la falta de datos de secuencias moleculares, que complica los estudios comparativos de microorganismos, especialmente hongos acuáticos (Cunha, et al. 2011) A pesar de la importancia de los hongos en el ambiente acuático, pocos estudios sobre diversidad y antagonismo se han realizado en este ambiente. A medida que se producen diversos cambios ambientales, esto con lleva a la desaparición de algunas especies de hongos cuyo hábitat está ampliamente determinado por factores como el fotoperiodo, la temperatura y la demanda de nutrientes. (Vanessa Gelorini, 2012). Sin embargo, estos factores ambientales y su importancia relativa sobre los microorganismos aún permanecen oscuros. De esta forma, se hacen necesarios trabajos enfocados en el conocimiento de la diversidad y caracterización

2

de hongos y cómo las variaciones ambientales pueden afectar a esta comunidad en los ecosistemas acuáticos. (Vera, 2015) La caracterización de la comunidad fúngica del Río Tietê es dependiente de los factores fisicoquímicos. Sin embargo, el número de aislados no permite definir la identificación y la caracterización de la actividad antagónica de los hongos fitopatogenos presentes en este rio (Vera, 2015).

3

2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general

Evaluar la capacidad antagónica de los hongos aislados de la cuenca del

Río Tietê con el fin de buscar nuevas alternativas en control biológico en

cultivos.

2.2 Objetivos específicos

Extraer DNA genómico de los hongos de la cuenca del Río Tietê.

Realizar la identificación molecular de los hongos de la cuenca del Río Tietê

mediante ITS.

Evaluar la actividad antagónica contra el hongo fitopatógeno Ceratocystis

paradoxa.

Preservar los hongos usando diferentes metodologías.

4

3. JUSTIFICACIÓN

Estudios realizados en el Rio Tietê, han evaluado la diversidad microbiana, con el fin de buscan caracterizar la diversidad de hongos y bacterias por diferentes métodos que son independientes de cultivo. Este estudio ha sido la base inicial para el desarrollo de investigaciones para el control de plagas y enfermedades (de la Cruz Leyva, Zamudio Maya, Corona Cruz, González de la Cruz, & Rojas Herrera, 2014). El manejo biológico de los cultivos, se presenta como una alternativa ecológica y eficaz frente a los numerosos y crecientes problemas causados por hongos patógenos presentes en la cuenta del rio que no han sido identificados (Pereira Chaves, 2013). Por lo tanto, el presente trabajo forma parte de un amplio estudio que involucra las áreas de Ecología Microbiana y Genética de Microorganismos, que buscan caracterizar la diversidad microbiana en el Río Tietê. Las bacterias y hongos aislados en estos estudios son mantenidos en la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP). El presente estudio busca mejorar la identificación de algunos de los hongos de la colección del LABMEM/USP aislados del Rio Tietê y realizar una caracterización de su potencial uso como agentes de control biológico contra un hongo fitopatógeno, con el propósito de proponer alternativas para el manejo de la pudrición de las plantas en los cultivos, contribuyendo a la optimización de Buenas Prácticas Agrícolas y manejo biotecnológico. El principal objetivo del estudio consiste en desarrollar y promover estrategias para el manejo integrado de plagas y enfermedades dentro de un enfoque efectivo y ecológicamente seguro basado tanto en una combinación de prácticas de control como el uso de agentes biocontroladores (Ceballos, 2009), por lo que la ejecución de este trabajo de investigación es de gran importancia ya que por medio del aislamiento y caracterización de los hongos aislados de la cuenca del rio Tiete actúen como agentes biocontroladores de Ceratocysti paradoxa. Por lo tanto se ha planteado una alternativa de biocontrol para este fitopatógeno, causante de grandes pérdidas económicas a nivel biotecnológico.

5

4. METODOLOGÍA 4.1 Muestras y preservación de las muestras

Se preservaron 50 hongos de la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP). Estas cepas fueron recuperadas y aisladas, eliminando contaminación con bacterias, hongos y levaduras. El método de Castellani, garantiza la preservación adecuada de los hongos filamentosos (Panizo y Colaboradores en 2005), es un método simple y eficaz que da estabilidad y supervivencia por largos periodos de tiempo a los diferentes géneros de hongos aislados. (Bueno y Gallardo en 1996). Cada aislado fue preservado usando dos métodos: conservación a metabolismo reducido en agua desionizada conocida como “proceso de Castellani” y criopreservación en glicerol al 30%. Para ambas técnicas se tomaron en torno a 6 fragmentos cuadrados de aproximadamente 0.5 cm de lado del cultivo axénico en el medio BDA y se depositaron en microtubos con agua desionizada, para el proceso de Castellani y con una solución acuosa de glicerol al 30% v/v, para la criopreservación. Los microtubos del proceso de Castellani fueron almacenados a 4 °C, los microtubos criopreservados fueron almacenados a -20 °C. Todos los preservados fueron conservados en la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la Universidad de São Paulo (LABMEM/USP). 4.2 Extracción y manipulación del ADN genómico

Los fragmentos de micelio de cultivos de 7 a 15 días crecidos en medio BDA a 28 °C, fueron inoculados sobre membranas de celofán esterilizadas en autoclave y colocadas en la superficie de placas con medio BDA. El cultivo fue incubado por 7 a 15 días a 28 °C. Después del cultivo, el micelio fue triturado en nitrógeno líquido y el ADN genómico fue extraído con "Wizard® Genomic DNA Purification Kit" (Promega) y la calidad de la muestra fue evaluada en gel de agarosa (1% p / v) con "SYBR® "Safe DNA Gel Stain" (Thermo Fisher Scientific). 4.3 Amplificación de la región its1-5,8s-its2 del ADN ribosómico

La región ITS1-5,8S-ITS2 del ADN ribosómico fue amplificada con los primers universales para el reino Fungi, ITS-1 (5`TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`) e ITS-4 (5`TCCTCCGTTATTGATATGC-3`), los cuales amplifican una región de aproximadamente 600pb (WHITE et al., 1990). Las reacciones fueron preparadas en un volumen final de 100μL, conteniendo ADN genómico (1,0ng / μL), 1X de buffer de la enzima, 0,2mM de dNTPs, 0,2 μM del primer ITS1, 0,2 μM del primer ITS-4 y 2,5U/μL de Easy®Taq DNA polimerasa. El termociclador fue programado para una desnaturalización inicial de 5 minutos a 94 °C, seguido de 30 ciclos de 94 °C durante

6

30 segundos; 30 segundos a 55 °C; 1 minuto a 72 °C y una extensión final de 10 minutos a 72 °C en termociclador (VERITI 96-WELL THERMAL CYCLER, 0.2ML, Applied Biosystems). Los productos de PCR se analizaron en gel de Agarosa (1% p/v) con "SYBR® Safe ADN Gel Stain" (Thermo Fisher Scientific), junto con el marcador de peso molecular "1 Kb Plus DNA Ladder" (Thermo Fisher Scientific)). Y posteriormente, fueron purificados utilizando "Wizard® SV Gel y PCR Clean-Up System" (Promega). Las muestras fueron enviadas para secuenciación por el método de SANGER. 4.4 Actividad antagónica

Se desarrollaron pruebas de antagonismo usando la metodología de confrontación en placa, se empleó medio BDA para evaluar a los hongos de la colección del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana contra el hongo fitopatógeno Ceratocystis paradoxa. Se colocó un disco de 7mm de diámetro del fitopatógeno y otro del posible biocontrolador en placas con BDA a 3 cm de distancia (Correa et al. 2007) Las placas fueron incubadas a 28 °C por 5 a 6 días (SCORZONI et al., 2007). Todos los ensayos se realizaron en triplicado.

7

5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS 5.1 Extracción y manipulación del ADN genómico

Se realizó la extracción de ADN genómico de los 50 hongos. Se obtuvo ADN de alto peso molecular, apto para realizar la amplificación de la región ITS1-5,8S-ITS2 utilizada en la identificación (figura1).

Figura 1. ADN genómico de alto peso molecular. Extracción de algunas de las cepas de hongos aislados del Río Tietê. Se usó gel de agarosa al 1% con Sybersafe.

5.2 Amplificación PCR

Se amplifico de la región ITS1-5,8S-ITS2 de 40 de los hongos utilizados en el análisis, también se realizó purificación de estas. (Figura2).

Figura 2. Amplificación de la región ITS1-5,8S-ITS2 de los hongos aislados de la cuenca del Río Tietê. Se usó gel de agarosa al 1% con Sybersafe.

8

5.3 Análisis genómico de los hongos aislados de la cuenca del rio Tiete

Para el análisis de los datos de secuenciación se usaron las bases de datos The Ribosomal Database Project (RDP), National Center Biotechnology Information (NCBI) empleando la herramienta BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y UNITE. De los 40 hongos 20 correspondieron al orden Pleosporales, 6 Eurotiales, 5 Hypocreales, 2 Sordariales, 1 Xylariales, 1 Saccharomycetales, 1 Polyporales, 1 Diaporthales, 1 Coniochaetales y 1 Chaetothyriales. (Figura3.) En la clasificación preliminar de los hongos por género, Penicillium fue el más frecuente, seguido de Microsphaeropsis, Pyrenochaeta, preussia, Gliomastix, Ochrocladosporium, Fimetariella, Didymella, Paraconiothyrium y Gibberella(Figura4.)

Figura 3. Clasificación de los hongos por Orden. Las barras indican el número de hongos aislados de la cuenca del Río Tietê.

Figura 4. Categorización de los hongos por género. Secuencias de los hongos aislados de la cuenca del Río Tietê. (NCBI).

0

5

10

15

20

25

0

1

2

3

4

5

6

Pen

icill

ium

Mic

rosp

hae

rop

sis

Pyr

eno

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pre

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Ph

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9

Los hongos aislados de la cuenca del Río Tietê, fueron obtenidos de puntos de muestreo con diferente calidad de agua (CETESB). De los 40 aislados identificados18 fueron aislados de puntos con buena calidad de agua, 12 de puntos con calidad pésima, 7 con calidad mala y 3 con calidad óptima (Figura 5).

Figura 5. Hongos por calidad del agua de donde fueron aislados. Número de hongos aislados según la calidad del agua en el punto de muestreo.

Figura 6.Ordenes de hongos de puntos de colecta con calidad óptima de agua. Se identificaron hongos de los órdenes Pleosporales, Capnoidales y Eutoriales

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

BUENA PESIMA MALA OPTIMA

0

1

2

Pleosporales Capnodiales Eurotiales

10

Figura 7.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con buena calidad de agua. Se encontraron en mayor número Pleosporales y Hypocreales.

Figura 8.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con pésima calidad de agua. El orden Hypocreales fue el más común entre estos aislados.

Figura 9.Ordenes de hongos de puntos de muestreo con mala calidad de agua. El orden Pleosporales fue el más común entre estos aislados.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Pleosporales Hypocreales Xylariales Eurotiales

0

1

2

3

4

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Pleosporales Eurotiales Polyporales

11

5.4 Actividad antagónica

Cada confrontación en placa se registró solamente como positivo, si ejerció algún grado de inhibición sobre el crecimiento del hongo; o como negativo, si no ejerció ninguna inhibición

FNBA 10-3 (Aspergillus creber) Positivo

FNBA 25-01 (Phoma sp.) Positivo

FNBA 27-03 (Dothideomycetes sp.) Positivo

FNBA 19-03 (Coniochaetahoffmannii) Positivo

Figura 10. Confrontación en placa entre Ceratocystis paradoxa y hongos aislados del Río Tiet

12

6. DISCUSIÓN En el presente trabajo fueron identificados hongos del Río Tietê, aislados en el estudio de Ortiz Vera (2015), cuya identificación no había sido satisfactoria. Los hongos identificados pertenecen al filo Ascomycota y Basidiomycota (anexo1). Estos resultados son congruentes con el de Ortiz Vera, ya que el cual el 94% de los hongos aislados pertenecen al filo Ascomycota y el 6% al filo Basidiomycota. Algunos de los géneros más comunes en la clasificación preliminar de aislados de ambientes limpios son Penicillium y Aspergillus. Estudios evaluaron que la diversidad y riqueza de la comunidad fúngica del agua de la Cuenca del Río Tietê específicamente los ambientes acuáticos altamente contaminados alteran aquellos géneros presentes (de Carvalho, 2016), siendo principalmente aislado el género Davidiella, seguido por Ascomycota, Penicillium y Pleosporales (Vera Ortiz, 2015),En la clasificación preliminar de los hongos por género en este estudio el más frecuente es Penicillium, seguido de Microsphaeropsis, Pyrenochaeta, preussia, Gliomastix, Ochrocladosporium, Fimetariella, Didymella, Paraconiothyrium y Gibberella. La clasificación de la calidad de agua establecida por la compañía ambiental del estado de São Paulo (CETESB) (tabla1.), se basa en los parámetros de: demanda bioquímica de oxigeno (D.B.O), fósforo total, nitrógeno amoniacal, nitrógeno total, oxígeno disuelto (O.D.), pH, temperatura, conductividad, nitrato y turbidez. (Vera Ortiz, 2015). La calidad del agua de los puntos de muestreo del Río Tietê donde se aislaron las muestras del presente estudio obedece a esta clasificación (anexo1). La mayoría de las muestras secuenciadas pertenecen a ambientes de calidad buena, seguido de ambientes de calidad pésima. Sin embargo, se pudo observar que el orden más frecuente en estos ambientes pertenece al orden Pleosporales. Tabla1: Informes de Calidad de las aguas superficiales en el Estado de São Paulo

Categoria Ponderación

OPTIMO 79<IQA≤100

BUENA 51<IQA≤79

REGULAR 36<IQA≤51

MALA 19<IQA≤36

PESIMA <IQA≤19

Los resultados de la evaluación de la actividad antagónica de las cepas de hongos aisladas frente al hongo fitopatogénico Ceratocystis paradoxa, (anexo 2 y anexo 3). Mostró que 4 de los 50 aislamientos inhibieron el crecimiento del hongo.

https://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%A3o_Paulo

13

Algunos artículos establecen que es difícil establecer la actividad antagónica mediante la evaluación cualitativa, para incrementar la exactitud de las mediciones de estos ensayos es preferible reportar el crecimiento radial de la inhibición mediante el uso de micrómetros. (Macedo Castillo, Martínez Hernández, & Lara Reyna, 2010), este tipo de medición, asume que el crecimiento radial es una variable constante en todas sus direcciones. El uso de abordaje cuantitativo podría ser el paso a seguir en la caracterización de la actividad antagónica de estos hongos. El género de Aspergillus es de interés para uso como agente de biocontrol, ya que puede controlar hongos causantes de enfermedades específicas de los cultivos, en sitios específicos causados por hongos fisiopatogénos. (Quiroz Sarmiento, Ferrera Cerrato, Alarcón, & Lara Hernández, 2008). Este género fue encontrado en la identificación preliminar de los hongos con actividad antagónica contra Ceratocystis paradoxa. Siendo necesario confirmar la identidad a nivel de género, mediante la construcción de árboles filogenéticas.

14

7. CONCLUSIONES

1. Los hongos utilizados en el presente estudio y preservados en la colección

del Laboratorio de Biología Molecular y Ecología Microbiana de la

Universidad de São Paulo (LABMEM/USP), fueron identificados mediante

técnicas de biología molecular, con lo que se podrá aumentar el

entendimiento sobre la diversidad de las comunidades de hongos del Río

Tietê.

2. Se logro la caracterización de la actividad antagónica de los hongos contra

el fitotagógeno Ceratocystis paradoxa, es un paso inicial en la búsqueda de

hongos con potencial uso como agentes de control biológico de interés

agrícola, en la comunidad de hongos aislados del Río Tietê.

15

8. LISTA DE REFERENCIAS

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VANESSA GELORINI, A. V. (2012). Effects of land use on the fungal spore richness in

smallcrater-lake basins of western Uganda. Revista Fungal Diversity , 125–142.

VERA ORTIZ, Mabel Patricia. (2015). Caracterização da comunidade fúngica do

sedimento e da água do rio Tietê. São Paulo.

1

ANEXOS

Anexo A Secuencias

Classifier: RDP Naive Bayesian rRNA Classifier Version 2.10, Noviembre 2018

Taxonomical Hierarchy: UNITE Fungal ITS trainset 23/11/2018

Query File: resultados.fas

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Confidence threshold (for classification to Root ONLY): 80%

CALIDAD DEL AGUA COD REINO % FILO % CLASE % ORDEN % FAMILIA % GENERO % ESPECIE % IDENTIDAD NCBI % COVERTURA % IDENTIDAD UNITE % SCORE

BOM FNBA 17-27 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 95 Pleosporales 86 Sporormiaceae 32 Preussia 28 Preussia isomera 26 Phoma sp. 99 Pleosporales 99.8

BOM FNBA 17-21 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Didymellaceae 98 Atradidymella 56 Phoma macrostoma48 Dothiorella gregaria 99 100 Neofusicoccum ribis 99.78 830

OTIMO FNBA 27-03 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 91 Pleosporomycetidae91 Phaeosphaeriopsis49 Phaeosphaeria oryzae49 Dothideomycetes sp 100 100 Dothideomycetes 100 876

BOM FNBA 16-05 Fungi 100 Ascomycota 99 Dothideomycetes 72 Pleosporales 54 Phaeosphaeriaceae11 Phaeosphaeria10 Phaeosphaeria phragmitis10 Pleosporales sp. 93 100 Pleosporales 92.54 649

RUIM FNBA 22-02 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Montagnulaceae 100 Microsphaeropsis98 Microsphaeropsis arundinis98 Paraconiothyrium estuarinum100 100 Fungi 100 983

PESIMO FNBA 13-1 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Hypocreales 100 Gliomastix 100 Acremonium polychromum100 Gliomastix polychroma99 100 Acremonium polychromum99.05 939

BOM FNBA 17-3 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 93 Pyrenochaeta 38 Pyrenochaeta sp 24 Fungal sp 99 100 Leptosphaeria 99.7 793

BOM FNBA 17-15 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Montagnulaceae 100 Microsphaeropsis96 Microsphaeropsis arundinis96 Fungal endophyte sp. 96 100 Fungi 95.71 1146

BOM FNBA 25-01 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 95 Pleosporales 87 Sporormiaceae 33 Preussia 32 Preussia isomera 31 Phoma sp. 99 100 Phoma 99.59 885

RUIM FNBA 22-04 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 98 Ochrocladosporium32 Ochrocladosporium elatum18 Fungal sp. 98 100 Fungi 98.35 741

PESIMO FNBA 20-03 Fungi 100 Ascomycota 79 Saccharomycetes 68 Saccharomycetales37 Dipodascaceae 37 Geotrichum 37 Geotrichum sp. 22 Geotrichum sp. 100 86 Saccharomycetales 94.98 468

PESIMO FNBA 19-02 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Sordariales 85 Lasiosphaeriaceae81 Fimetariella 68 Fimetariella rabenhorstii68 Uncultured endophytic fungus97 100 Fungi 96.70 701

BOM FNBA 17-25 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Didymellaceae 95 Didymella 93 Phoma novae_verbascicola23 Uncultured Phoma 100 98 Fungi 99.79 854

BOM FNBA 17-31 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Pyrenochaeta 91 Pyrenochaeta sp 68 Ascomycota sp. 100 100 Ascomycota 100 856

RUIM FNBA 11-1 Fungi 100 Basiomycota 100 Agaricomycetes 100 Polyporales 100 Polyporaceae 100 Pycnoporus 100 Trametes sanguinea100 Trametes sanguinea 99 100 Pycnoporus sanguineus 99.83 1062

PESIMO FNBA 19-01 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Hypocreales 100 Nectriaceae 100 Haematonectria95 Fusarium sp. 37 Fusarium lichenicola 100 100 Neocosmospora 100 760

PESIMO FNBA 13-04 Fungi 100 Ascomycota 100 Eurotiomycetes 100 Chaetothyriales100 Herpotrichiellaceae100 Exophiala 100 Exophiala dermatitidis100 Exophiala dermatitidis100 100 Exophiala dermatitidis 100 1068

BOM FNBA 33-6 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 72 Montagnulaceae 72 Paraconiothyrium72 Paraconiothyrium hawaiiense72 fungal sp. 99 100 Fungi 98.5 588

PESIMO FNBA 18-03 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 97 Sordariales 87 Lasiosphaeriaceae81 Fimetariella 69 Fimetariella rabenhorstii69 Sordariomycetes sp. 99 100 Lecythophora 98.5 597

PESIMO FNBA 20-01 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 95 Pyrenochaeta 55 Pyrenochaeta sp 48 Fungal sp. 99 100 Leptosphaeria 99.79 874

OTIMO FNBA 27-2 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Capnodiales 100 Mycosphaerellaceae100 Davidiella 100 Cladosporium rectoides37 Cladosporium cladosporioides100 100 Cladosporium cladosporioides 100 693

BOM FNBA 29-06 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Xylariales 100 Diatrypaceae 100 Diatrypella 100 Diatrypella verruciformis71 Diatrypaceae sp. 99 100 Diatrypaceae 99.35 833

BOM FNBS 06-06 Fungi 100 Ascomycota 100 Eurotiomycetes 100 Eurotiales 100 Trichocomaceae 100 Penicillium 98 Penicillium erythromellis89 Penicillium sp. 98 100 Talaromyces 98.05 712

RUIM FNBA 10-3 Fungi 100 Ascomycota 100 Eurotiomycetes 100 Eurotiales 100 Trichocomaceae 100 Aspergillus 100 Aspergillus versicolor100 Aspergillus creber 100 100 Aspergillus creber 100 852

BOM FNBA 17-21 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Montagnulaceae 100 Microsphaeropsis91 Microsphaeropsis arundinis91 Microsphaeropsis arundinis100 100 Fungi 100 939

RUIM FNBA 12-3 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Didymellaceae 87 Didymella 78 Phoma glomerata 44 Neodidymella thailandicum99 100 Phoma 99.79 891

PESIMO FNBA 18-05 Fungi 100 Ascomycota 100 Eurotiomycetes 100 Eurotiales 100 Trichocomaceae 100 Penicillium 100 Penicillium brevicompactum100 Penicillium brevicompactum100 100 Penicillium brevicompactum100 898

BOM FNBA 25-02 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Montagnulaceae 100 Microsphaeropsis97 Microsphaeropsis arundinis97 Microsphaeropsis arundinis100 100 Fungi 100 944

BOM FNBA 25-05 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Ochrocladosporium37 Coniothyrium telephii16 Fungal endophyte 96 91 Pleosporales 94.82 750

PESIMO FNBA 19-04 Fungi 100 Ascomycota 100 Eurotiomycetes 100 Eurotiales 100 Trichocomaceae 100 Penicillium 100 Penicillium oxalicum100 Penicillium sp. 100 100 Penicillium oxalicum 100 952

PESIMO FNBA 18-01 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Hypocreales 100 Nectriaceae 100 Gibberella 100 Fusarium pseudonygamai96 Fusarium oxysporum 100 100 Fusarium napiforme 100 752

BOM FNBA 32-03 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Hypocreales 100 Nectriaceae 100 Gibberella 100 Fusarium pseudonygamaiFusarium oxysporum 100 100 Fusarium napiforme 100 863

OTIMO FNBA 23-7 Fungi 100 Ascomycota 100 Eurotiomycetes 100 Eurotiales 100 Trichocomaceae 100 Penicillium 95 Penicillium roseopurpureum62 Penicillium terrigenum 99 100 Penicillium terrigenum 99.79 876

BOM FNBA 32-02 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Phoma 99 Phoma epicoccina 55 Epicoccum nigrum 100 100 Epicoccum 100 887

RUIM FNBA 22-01 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Montagnulaceae 100 Paraconiothyrium81 Paraconiothyrium cyclothyrioides81 Uncultured fungus clone100 100 Fungi 100 928

RUIM FNBA 10-1 Fungi 100 Ascomycota 100 Eurotiomycetes 100 Eurotiales 100 Trichocomaceae 100 Penicillium 100 Penicillium griseofulvum60 Fungal sp. 99 100 Penicillium 100 885

BOM FNBS 06-16 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Hypocreales 100 Gliomastix 100 Acremonium polychromum100 Gliomastix polychroma99 100 Acremonium polychromum99.80 922

PESIMO FNBA 19-03 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Coniochaetales100 Coniochaetaceae100 Lecythophora100 Lecythophora hoffmannii100 Coniochaeta hoffmannii99 100 Coniochaeta 99.79 859

PESIMO FNBA 18-04 Fungi 100 Ascomycota 100 Sordariomycetes 100 Diaporthales 100 Diaporthaceae 100 Phomopsis 100 Phomopsis loropetali60 Diaporthe arecae 100 100 Diaporthe arecae 100 931

BOM FNBA 16-03 Fungi 100 Ascomycota 100 Dothideomycetes 100 Pleosporales 100 Pyrenochaeta100 Pyrenochaeta sp 100 Pyrenochaeta sp. 99 100 Pyrenochaeta 99.59 883

1

Anexo B. Antagonismo

FNBS 06-06 X Negativo x Negativo X Negativo

FNBS 06-16 X Negativo x Negativo X Negativo

FNBA 10-1 X Negativo x Negativo X Negativo

FNBA 10-3 x Positivo x Positivo (inhibe esporulación) X Negativo








FNBA 16-03 x Positivo x Negativo X Negativo


FNBA 17-12b X Negativo x Negativo X Negativo


FNBA 17-21 x Positivo x Positivo X Negativo





FNBA 17-27 X Negativo x Negativo X Positivo

FNBA 17-31 X Negativo x Positivo X Positivo




FNBA 18-04 x Positivo x Negativo X Negativo




FNBA 19-03 x Positivo x Positivo X Negativo

FNBA 19-04 x Negativo x Negativo X Negativo










FNBA 25-01 x Positivo x Positivo X Positivo




FNBA 27-03 X Positivo x Positivo X Positivo




FNBA 32-03 X Positivo x Negativo X Negativo

FNBA 33-6 X Positivo x Positivo X Negativo

Codigo Antagonismo 1 Antagonismo 2 Antagonismo 3

2

Anexo C. Fotografías de los 50 hongos preservados y antagonismo.

COD. FOTO ANVERSO FOTO REVERSO ANTAGONISMO

FNBS 06-06

FNBS 06-16

FNBA 10-1

FNBA 10-3

FNBA 11-1

FNBA 12-1

FNBA 12-3

FNBA 12-5

FNBA 13-1

3

FNBA 13-3

FNBA 13-04

FNBA 16-03

FNBA 16-05

FNBA 17-

12b

FNBA 17-15

FNBA 17-21

FNBA 17-23

FNBA 17-24

FNBA 17-25

FNBA 17-26

4

FNBA 17-27

FNBA 17-31

FNBA 17-33

FNBA 18-01

FNBA 18-03

FNBA 18-04

FNBA 18-05

FNBA 19-01

FNBA 19-02

FNBA 19-03

FNBA 19-04

5

FNBA 19-05

FNBA 20-01

FNBA 20-03

FNBA 20-04

FNBA 22-01

FNBA 22-02

FNBA 22-04

FNBA 23-7

FNBA 25-01

FNBA 25-02

6

FNBA 25-05

FNBA 27-2

FNBA 27-03

FNBA 29-04

FNBA 29-06

FNBA 32-02

FNBA 32-03

FNBA 33-6

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN …...de hongos y cómo las variaciones ambientales pueden...

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