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4OMBRE: CÓRDOVA BARRIOS CLAUDIA

MATRICULA: 90338682

TELCFONO: 742-9921

/LICENCIATURA: BlOLOGlA EXPERIMENTAL.

JDIVISIÓN: CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD.

UNIDAD: IZTAPALAPA

TRIMESTRE LECTIVO: 98-0

NOMBRE DEL PROYECTO: ESTUDIOS BACTERIOLOGICOS, EPlDEMlOLOGlCOS Y DE BlOLOGlA MOLECULAR EN Salmonella enteritidis.

/TITULO DEL TRABAJO: UTILIZACIÓN DE PROTEINAS DE Salmonella enteritidis COMO ANTIGENOS EN LA PRUEBA DE WESTERN BLOT o ‘INMUNOTRANSFERENCIA”.

ic LUGAR DE REALIZACIÓN: CENID-MICROBIOLOGIA. INIFAPSAGAR (SECRETARIA DE AGRICULTURA Y GANADERIA RURAL).

FECHA DE INICIO: 29 DE JUNIO DE 1998.

/FECHA DE TERMINACIÓN: 29 DE DICIEMBRE DE 1 9 9

CLAVE DE REGISTRO: BE.015.98 JUNIO 29190

ALUMNA: CLAUDIA CbRDOVA BARRIOS

ic e /ASESOR INTERNO:QBP RAFAELA TAPIA A.

PROFA.ASOCIAD0 D TIEMPO COMPLETO DEPTO. CIENCIAS DE LA SALUD. i.

ASESOR EXTERNO: DR. VICTOR R. TENORIO GUTIERRU.

RESPONSABLE DEL PROYECTO DE ~~ -~

BIOTECNOLOG~A. CENID-MICROBIOLOGIA

2 3:

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r[' L l. UTILIZACIÓN DE PROTEíNAS DE Salmonella

enteritidis COMO ANTIGENOS EN LA e If

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INMUNOTRANSFERENCIA

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7-

JUSTIFICACIÓN Y NATURALEZA DEL PROYECTO.

Se ha incrementado el interés del papel que juegan las

proteínas de la membrana externa (PME) como agentes de

diagnóstico y como antígenos para elaborar vacunas.

Dada la significante incidencia en los países en vías de

desarrollo y el carácter invasivo de Salmonella enteritidis como

agente causal de gastroenteritis, resulta importante desarrollar

técnicas de diagnóstico rápidas y especificas, así como vacunas

contra esta enfermedad. Por tal motivo se ha sugerido que las

proteínas de la membrana externa (PME) de Salmonella enteritidis y

en particular las porinas puedan ser útiles para tales fines.

La industria pecuaria mexicana, se ha incrementado cada dia

mas, sin embargo existen algunos problemas que todavía no se

superan como son; la adquisición de animales mejorados

genéticamente y la compra de vacunas, así como, la falta de control

de algunas enfermedades (Rizo 1988).

El interés por incrementar el consumo de productos pecuarios

nacionales libres de agentes microbianos potencialmente patógenos

para el hombre como es el caso de Salmonella, obliga a la

adquisición de prácticas de producción adecuadas además de

técnicas de diagnóstico y tratamiento que generen productos libres

de Salmonella y así evitar la presencia de portadores.

Las Salmonellas ocasionan grandes pérdidas económicas en la

industria avícola, además de que ciertos serotipos son capaces de

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.a.

producir gastroenteritis en humanos entre otras enfermedades. En la

última década se han encontrado reportes que indican la presencia

de brotes de gastroenteritis en humanos por consumo de productos

pecuarios contaminados con Salmonella, incluso se ha reportado a

los serotipos de Salmonella enteritidis (Se.) como causantes de

gastroenteritis, siendo los productos alimenticios como son la

leche y los productos pecuarios las causas más comunes de

infección.

Las bacterias del género Salmonella son bacilos Gram

negativos relativamente gruesos. Por lo general no son

encapsulados y su envoltura celular esta constituida por una

membrana externa y una interna, entre estas se encuentra una fina

capa de peptidoglicanos.

El hábitat de las Salmonellas es normalmente el tracto intestinal

del hombre y otros animales.

A los microorganismos del género Salmonella comúnmente se

les describe como parásitos intracelulares facultativos, que crecen

primero dentro de los macrófagos que están fijos en el hígado y en el

bazo. Los animales infectados pueden presentar un cuadro agudo,

crónico o pasar inadvertido (portadores), en cualquiera de los casos

la Salmonella es eliminada en la excreta y es una fuente potencial

de contaminación para otros animales.

El género Salmonella está constituido por más de 2,200

serotipos la mayoria corresponde a Salmonella enteritidis,

microorganismo causante de una infección alimenticia que produce

gastroenteritis, los síntomas aparecen entre 6 y 8 horas después de

la ingestión de agua Ó alimentos contaminados y en el transcurso de

una semana son seguidos por dolor abdominal , diarrea y se puede

llegar a tener fiebre. La severidad del dolor y la diarrea varían

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ampliamente de una persona a otra, en unos casos apenas se

detecta diarrea con dolor parecido a la apendicitis que van desde

diarrea leve hasta diarrea con sangre. Si los síntomas persisten, la

infección continua y hay excreción de bacteria por más de 3 meses,

del 1 a 3 % de personas puede continuar excretando bacterias por

más de un año ( esto es, un portador crónico).

Recientemente se ha encontrado que las gallinas pueden

también transmitir Salmonella enteritidis antes y después de la

ovoposición, entonces la idea de que un huevo se encuentre integro,

no implica que no este contaminado. La gastroenteritis también

puede resultar de un inadecuado cocimiento del pollo ylo del huevo.

La mayoría de los casos de gastroenteritis ocurre en niños

menores de 10 años, en donde los síntomas tienden a ser más

severos. La infección puede llegar a ser sistémica en infantes y en

adultos inmunodeprimidos como son pacientes con cáncer y SIDA.

Para el diagnóstico de la salmonelosis aviar se utilizan métodos

comunes como el cultivo el cual toma de 24 a 36 hr, sin embargo por

este método los portadores no son detectados por lo que seria

necesario, encontrar otras técnicas más rápidas y seguras para

detectarlos.

Recientes estudios hechos por Verdugo- Rodríguez et.al, han

reportado que las Proteínas de la Membrana Externa de Salmonella

fyphi están involucrados en la inducción de protección al reto con la

bacteria homóloga, en el modelo murino (12).

*I Parece adecuado el interés que recientemente han adquirido

los antígenos de la membrana externa de las bacterias gram- I

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negativas, para ser empleados como inmunógenos protectores, ya

que por su naturaleza proteica y su localización inducen anticuerpos

de alta afinidad y favorecen la respuesta celular, la cual genera una

inmunidad prolongada, que es crucial en la defensa contra

patógenos intracelulares como Salmonella &phi , por otro lado, estas

pPME pueden ser una herramienta útil para el diagnóstico de

Salmonella enteritidis en aves (Vázquez et. al).

La separación de proteínas se logra mediante electroforésis

en gel de poliacrilarnida (EGPA), en la cual las proteínas se

mueven por acción de una corriente eléctrica aplicada a través de un

gel compuesto de molécula de acrilamida unidas mediante enlaces

transversos para formar una malla molecular. El movimiento relativo

de proteínas a través de un gel de poliacrilamida depende del

tamaño, forma y densidad de carga (carga por unidad de masa) de

las proteínas. Cuando mayor sea la densidad de carga, la proteína

avanza con mayor fuerza a través del gel y por lo tanto su velocidad

de migración es más rápida, mientras más grande sea la proteína se

queda retenida en la parte superior del gel y las de menor tamaño

migraran a la parte inferior del gel.

Una vez separadas las proteínas en el gel las áreas de las

bandas proteicas se pueden seccionar y aislar las proteínas

individualmente, o también presionar el gel contra un trozo de papel

filtro de nitrocelulosa y someter a tratamiento adicional de

electroforésis para desplazar las proteínas fuera del gel y

absorberlas sobre la superficie de la nitrocelulosa. Este último

procedimiento, llamado mancha Western, se puede emplear para

identificar bandas individuales de proteínas por su interacción con

anticuerpos específicos.

OBJETIVO GENERAL:

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Obtención de las proteínas de membrana externa de los tres

fagotipos de Salmonella enteritidis para utilizarlas como antígeno en

la prueba de Western Blot.

OBJETIVOS PARTICULARES:

I. Preparación de proteinas de Membrana Externa de Salmonella

enteritidis fagotipo 4, fagotipo 8 y fagotipo 13.

2. Análisis de las Proteínas de Membrana Externa (PME) de

Salmonella enteritidis en geles de Poliacrilamida -DSS.

3. Determinar la reactividad de la ,PME con Anticuerpos Específicos

mediante Inmunotransferencia.

MATERIAL:

MATERIAL BIOL~GICO:

CEPAS BACTERIANAS

Cepas de: Salmonella enteritidis fago 4, fago 8 y fago 13.

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MEDIOS DE CULTIVOS:

Medios de mantenimiento con glicerol.

Medios de Luria-Bertani.

Medios Agar nutritivo.

Medio de Salmonella -Shigella.

COLORANTES:

-Cristal violeta.

-Safranins al 0.5%

-Azul de Coomasie.

REACTIVOS:

-Tris-OH (hidroximetil amina).

-SDS (dodecil sulfato de sodio).

-Glicerol

,-Pironina

- Alcohol-acetona.

-Acid0 acético.

-Tris (0.025 M)

-Gicina (0.192M)

-Metano1

SOLUCIONES:

-Solución de lugol.

-Amortiguador de Laemmli (buffer de muestra).

-Buffer de Lisis.

-Solución Temed (N,N,N',N'-Tetramethil Ethilenediamine) al 8.4%

-Solución destiñidora.

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-Acrilamida de 30%.

-Bis-acrilamida

-Persulfato de amonio al 12%.

-Stock 8X buffer de transferencia

-Buffer 2X.

INSTRUMENTAL:

-Microscopio

-incubadora

-Cámara electroforética (Mini V-8 Gibco)

-Vortex

-Mechero

-Centrifuga (BECKMAN MODELO J-6B)

-Jeringa de Hamilton.

-Baño maría

CRISTALERIA ESTÉRIL DE USO COMÚN EN

MICROBIOLOGí A:

-Matraz erlenmeyer de 250 ml.

-Cajas de petri

MICELANEOS: -Papel de Nitrocelulosa -Papel Whatman. -Fibras. -Portaobjetos

-cu breobjetos

METODOLOGíA

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Las cepas de S.enteritidis fagotipo 13, fagotipo 8 y

fagotipo 4 se sembraron en matraces erlen-meyer de 250 ml

que contenían 125 ml del medio BHI (caldo nutritivo A) que se

incubó a 37OC por 24 hrs, después del desarrollo de cada una

de las cepas de Salmonella enteritidis se les realizó una prueba

de pureza mediante una tinción de Gram, y además se

realizaron pruebas bioquímicas y serológicas.

Se obtuvieron las proteínas de la membrana externa por el

método de Laemmli (54, la suspención con las Proteínas de la

Membrana Externa se sometió a un corrimiento electroforético

para separar e identificar las proteínas por su peso molecular

se corrieron simultaneamente dos geles de poliacrilamida al

12%, uno se tiño con azul de Coomasie para detectar a las

proteínas (Gel No 1) y con el otro gel (Gel No 2) se realizo

inmunotransferencia para determinar la reactividad de las ,PME

con anticuerpos específicos de azul de Coomasie se procedió

al análisis y detección de ,PME especificas Sa/mone//a

enteritidis, este último gel se revélo con diaminobencidina la

reacción se para con abundante agua destilada fría de tal

forma que aquellas proteínas de membrana externa que

presentan reacción antigeno-anticuerpo se observaron como

bandas obscuras. Finalmente se procede al análisis de

resultados.

ESQUEMA DE TRABAJO S. enteritidis fago I 3 r-i Cepas S. enteritidis fago 8 S. enteritidis fago 4 1 1

Sembrar en 125 mi. de medio Luria Bertani.

Tinción de Gram

1 ml del

cultivo

I Centrifugar 5000 rpmll0

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TÉCNICAS UTILIZADAS:

a) Extracción de Proteínas de la Membrana Externa,

Método de Laemmli.

1.- Sembrar las cepas puras en 70 ml. Del medio BHI incubar a 37

“C por 24 hrs.

2.- AI cultivo de 24 hrs. Se les realiza prueba de pureza por medio de

la tinción de Gram . 3.- Obtener el paquete celular por centrifugación (beckman modelo J-

6B) a 5000 r.p.m. por 20 minutos.

4.- Separar el sobrenadante por decantación del paquete celular.

5.- Tomar 100 microlitros del paquete celular y depositarlos en tubos

eppendorff perfectamente identificados.

6.- Agregar 1 O0 microlitros del amortiguador de Laemmli y se mezcla

en un vortex.

7.- Hervir la mezcla a I OOc a baño maria por 5 minutos.

8.- Centrifugar la mezcla a 10,000 r.p.m. por 5 minutos.

9.- Rescatar el sobrenadante y desechar el paquete celular.

10.- Agregar al sobrenadante 2-p-mercaptoetanol al 10% de volumen

final poner en baño maria por 1 minuto.

11.- Utilizar de inmediato para separar las proteínas por

electroforésis.

b) Corrimiento Electroforético en geles de poliacrilamida

para análisis de Proteínas (EGPA-DSS).

La electroforésis se lleva a cabo por duplicado en geles

desnaturalizantes de poliacrilamida (PAGE-SDS) de 14 x 10 cms. y

0.75 mm. de grosor en una cámara vertical (slab gel unit se-400). El

gel No. 1 se utiliza para determinar el peso molecular de las P.M.E.

después de teñirlo con azul de Coomasie. El Gel No. 2 se utiliza para

transferir a papel de nitrocelulosa (PNC) y realizar la transferencia.

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El procedimiento es el siguiente:

1 .- Se ensamblan las placas de vidrio.

2- Se prepara el gel separador al 12% como se indica a

continuación: Buffer pH 8.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 mi.

Acrilamida-bisacrilamida al 30% ----------- 4 ml.

Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.75 ml.

Temed al 8.4% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 microlitros.

Persulfato de amonio al 12.5% -----------I O0 microlitros

Una vez preparado se vierte entre las placas de vidrio y se deja

polimerizar.

3.- Se prepara el gel

continuación:

concentrador al 4% como se indica a

Buffer pH 6.8 1 ml

Acrilamida-bisacrilamida al 30% ------- 0.66 mi Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.33 ml

Temed al 8.4% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 microlitros,

Persulfato de amonio al 12.5%-------- 40 microlitros.

Se adiciona con cuidado y rapidez sobre el gel de separación y

finalmente se coloca el peine, el cual se retira cuando el gel haya

polimerizado para que los carriles queden bien definidos.

4.- Tomar 1 rnl de la muestra y centrifugar 5 minutos en

microcentrífuga (5' x 10 O00 r.p.m.) y resuspender la pastilla en

62.5~1 de TRIS 0.0625 M a un pH de 6.8 con inhibidores de

proteasas (DIFP 5Mm, PMSF 2Mm, NEM 5Mm, PHMB 1OMm

Leupectina 2pM) mas 62.5 pI de buffer de muestra 2X para PAGE-

SDS e incubar 5' en agua hirviendo, centrifugar 5' X 10 O00 r.p.m. y

recuperar el sobrenadante.

5.- Colocar 20 microlitros de cada muestra con una jeringa

Hamilton dentro de los carriles del gel concentrador. Junto con las

muestras, se corre en los pozos adyacentes proteínas de peso r I“

molecular conocido (Marcadores de peso molecular).

6.- Las muestras en el gel concentrador se corren a 60 volts,

posteriormente el gel separador se corre a 100 volts. Se considera

que es tiempo suficiente de corrimiento cuando el colorante de

referencia (pironina) llega al final del gel de separación

ti-

k I* 7.- Obtener cuidadosamente los geles. El gel No 2 se utilizara para

I I.

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inmunotransferencia y el Gel No 1 es para determinación del Peso

Molecular

8.- A partir de este punto solo se trabaja con el Gel No 1 . El Gel se

coloca en azul de Coomasie (solución teñidora) por 30 minutos con I

agitación constante o 24 hrs sin agitación. * ,-

9.- Pasar a la solución destiñidora haciendo cambios de esta hasta

que el colorante se elimine parcialmente del gel, las bandas de

proteínas se observan perfectamente aproximadamente despues de

I:: *r *I- 1̂ 24 horas

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, b. . , 10.- Rehidratar en una solución de ácido acético al 10% por 10

minutos. .,...

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11 .- Se procede a la lectura. Se toma la fotografía y se analizan las

proteínas.

12.-Se construye una curva patrón que muestre la relación entre los

logaritmo natural (in) de los pesos moleculares de los marcadores de

Peso Molecular (ejes y) y la Movilidad Relativa de las proteínas

estándar (ejes x).

Esta relación es directamente proporcional y por tanto debe

formar una línea recta, la cual debe ser ajustada mediante el

tratamiento matemático de mínimos cuadrados y a través de

regresión lineal, determinar los valores de "Y" de las muestras

desconocidas.

PROTEINA

X= Rf de los Marcadores de Peso Molecular(MPM).

Y=Logaritmo Natural de pesos moleculares de los MPM

Donde:

Rf = Coeficiente de movilidad relativa.

PM (KDa) LnPM 1

Cálculo de Coeficiente de Movilidad Relativa.

La movilidad relativa de las proteínas contenidas en las muestras,

es el desplazamiento que tienen con respecto a la distancia total que

corre la muestra, dato que se obtiene con la siguiente fórmula:

-Miosina

-Fosforilasa p

-Alb. Sér. Bovina

-0voalbúrnina

a- chimiotripsinógeno

-p-Lactolobulina

-Lisozirna

Rf = Corrimiento de los MPM ( bandas o proteínas) cms.

Corrimiento de la muestra.

200 5.3

97.43 4.6

68 4.2

43 3.7

25.7 3.2

18.4 2.9

14.3 2.66

Valores de los coeficientes de movilidad relativa (Rf) y logaritmo

natural del peso molecular de las proteínas patrón.

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c) Técnica de Western Blot Ó Inmunotransferencia.

I.-Utilizando la técnica de Corrimiento electroforético en geles de

Poliacrilamida-SDS antes mencionada se corre cada uno de las

muestras de Proteína de Membrana Externa de Salmonella enteritidis

y se obtiene un gel que nombramos Gel No 2 sobre estos geles se

aplica la técnica de inmunotransferencia que se cita a continuación:

11.-TRANSFERENCIA

1 _- Se preparo una hoja de papel de Nitrocelulosa y 2 hojas de papel

Whatman de el tamaño del gel.

2.- Se Sumergio totalmente la membrana de Nitrocelulosa, el Papel

Whatman y las fibras en buffer de transferencia I X y eliminar las

burbujas de los soportes.

STOCK 8X buffer de transferencia:

Tris (0.025 M) --------------12.1 l g 1500 ml

Glicina (0.1 92M) ------------57.689/500 ml

BUFFER 2X

STOCK 8X ____________r-------- 400 ml

METANOL ...................... 800 ml

AGUA BIDESTILADA --------2800 ml

3000 ml

3.-Ensamblar el gel con el papel de Nitrocelulosa, el papel Whattman

y las fibras en forma de sandwich para la transferencia como se

muestra abajo. Deben permanecer todas los componentes húmedos,

y asegurarse de que el sandwich este bien ensamblado.

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4.-Se transfirió durante 1 horas a 1 O0 volts.

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5.- Cortar los carriles de los Marcadores de Peso Molecular (MPM) y

se tiñen durante 2 minutos con negro de amido al 0.1% en metanol-

agua-ac. Acético (5:4:1) y desteñir las tiras con solución metanol-

agua -ac. Acético (5:4:1) aproximadamente durante 1 minuto.

6.-Confirmada la transferencia las muestras se, bloquearan

durante tres horas a temperatura ambiente con una solución

bloqueadora de Albúmina serica bovina al 2-3% en TRIZMA-base

1 OmM.

7.- Lavar dos veces con PBS-TWEEN 20 0.05% durante 15

minutos, adicionar el suero de conejo contra Salmonella enteritidis

diluido 1:750 e incubar durante toda la noche a 4OC para que se

realice la reacción antigeno-anticuerpo.

8.- Lavar tres veces por 15 minutos con PBS-TWEEN 20 al

0.05%.

9.- Incubar durante dos horas a temperatura ambiente con la

proteína " A conjugada con peroxidasa diluida 1 : 1 O00 en trizma

base y albúmina serica-bovina 2%.

10.- Lavar tres veces por 15 minutos con PBS.

1 1 .- Revelar con diamino bencidina hasta que aparezcan bandas

negras.

12.- Detener la reacción lavando con abundante agua destilada. .L.

w.

.L...

ACTIVIDADES REALIZADAS

El calendario de actividades estaba propuesta de la siguiente forma:

1, I. El Servicio Social se concluyo hasta el mes de agosto de 1999 debido a

dificultades que se presentarón en el manejo de material biólogico, manejo de las

técnicas disponibilida de reactivos y anticuepos.

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36 Kda

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

36 Kda 37 KDa

De acuerdo al objetivo general y los objetivos particulares

planteados al principio este trabajo consideramos, por los resultados

obtenidos, que se cumplieron aci como las metas propuestas:

1.-Se logro la preparación de las PME de S. enteritidis fagotipo 4,

fagotipo 8 y fagotipo 13 lo que corresponde al primer objetivo

particular.

2.- Se lograron visualizar e identificar las proteínas principales como

fueron las de 37 KDa, 36 KDa y 24 KDa aproximadamente en las

cepas fago 4 I fago 8 y fago 13 de Salmonella enteritidis .

PESOS MOLECULARES DE LAS PROTEINAS ENCONTRADAS

EN LAS CEPAS DE Salmonella enteritidis

3.-AI analizar la inmunotransferencia se observo que las proteínas

con peso molecular de 36 KDa, 35 KDa y 25 KDa aproximadamente

son inmunogénicas ya que fueron reconocidas por los anticuerpos

específicos de Salmonella enteritidis fagotipo 4.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el perfil electroforético de el Gel de Poliacrilamida-SDS al

12% de las Proteínas de la Membran Externa de Salmonella enteritidis

susceptible al fagotipo 4, susceptible al fagotipo 8 y susceptible al

fagotipo 13 (Fotol), se muestran bandas de proteínas bien

definidas y con pesos moleculares de 36 KDa y 25 KDa en el fago 4

y en el fago 8 y una de 37 KDa aproximadamente en el fago 13.

Consideramos que las proteínas del rango de 36 KDa a 37 KDa

obtenidas pertenecen al grupos de las porinas Omp A, estos

resultados concuerdan con los reportados por Verdugo et.al. y

Pelayo R. quienes trabajando con Sulmonellu rhipy encontraron que

las proteínas de Peso molecular aproximadamente de 36 KDa

corresponden a las porinas

Los patrones electroforéticos de las Proteínas de la Membrana

Externa de las tres cepas trabajadas fueron transferidos a papel de

nitrocelulosa para realizar la inmunotransferencia, para esto se

hicieron reaccionar con sueros de conejo hiperinmunes contra

S.enteritidis que a la dilución de 1:750 sirvió para detectar

perfectamente bien las proteínas membranales. En la Foto 2 se

muestra el análisis de Western Blot, en donde se observa que las

proteínas que reaccionaron con el suero hiperinmune de conejo

fueron las de Peso Molecular de 35KDa en la preparación de

S.enteritidis fagotipo 4 y las de 36 KDa y 4 KDa en Salmonella

enteritidis fagotipo 13 por lo que se evidenciaron como bandas

obscuras. En Salmonella enteritidis fagotipo 8 se encontró una

proteína con peso molecular de 36 KDa (Foto 3).

Podríamos considerar que 1% proteínas de 36 KDa y 37 KDa

que se encontraron en mayor concentración en el corrimiento

electroforético (Foto I), corresponden a las proteínas de 35 y 36

KDa encontradas en el análisis de inmunotransferencia (Foto 2 Y 3)

por lo que además de encontrarse en altas concentraciones son

inmunogénicas, característica que se podría utilizar para el

diagnostico rápido de Sententidis e incluso estos resultados podrían

ser la base para que con posteriores estudios se pudieran utilizar

estas proteínas junto con otras en la preparación de una vacuna

contra tifoidea aviar.

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CONCLUSIONES:

1 .- Se obtuvo un patrón electroforético semejante en los fagotipos 4,

8 y 13 de Salmonella enteritidis (Foto I).

2.-En los patrones electroforeticos se encontraron bandas de

Proteínas de Membrana Externa (PME) en común entre Salmonella

enteritidis fago 4 y fago 8 (36 KDa y 25 KDa) otra muy semejante en

el fago 13 (37 KDa) Foto 1.

3.-La proteína con peso moleculares de 36 KDa se observa en

mayor Concentración (Fotol) en el fagotipo 4 y en el fagotipo 8,

mientras que en el fagotipo 13 se encuentra pero en menor

concentración.

4.-Las proteínas de 36 KDa y 37 KDa se podrían considerar como

porinas OMP A según Verdugo, et.al.

5.- En la lnmunotransferencia se encontró que en los tres fagotipos

de Sulmcmellu enteritidis estudiados se reconocieron a 4 proteínas

antigenicas:

En el fagotipo 4 se reconoció a las proteínas con pesos

molecular de 35 KDa y 26 KDa.

Fagotipo 8 se reconoció a la proteína con peso molecular de 36

KDa

Fagotipo 13 se reconoció a las proteínas con pesos molecular de

36 KDa y 4 KDa. (Foto 2 y 3)

6.- Las proteínas con Peso Molecular de aproximadamente 36 KDa

corresponden a las porinas, estas proteínas las encontramos en alta

concentración (36 y 37 KDa Foto 1 ) además de que encontramos

que son antigenicas lo cual concuerda con los trabajos realizados

por Verdugo et.al. en otra especie de Salmonela.

CRITERIOS DE EVALUACIÓN

El desempeño llevado por la alumna CLAUDIA CORDOVA

BARRIOS fue bueno en su trabajo desarrollado como en su aplicación ya

que logró obtener la preparación de proteínas de SuZmoneffu enteritidis fagotipo 4, fagotipo 8 y fagotipo 13 en geles de Poliacrilamida-SDS al 12%,

llegando a ser reconocidas algunas proteínas de peso moleculares como

las de 37 KDa, 36KDa y 25 KDa de los sueros hiperinmunes desarrollados

en el laboratorio, lo que significa que estas proteínas tienen un carácter

antigénico.

ATTENTAMENTE

Asesor externo: Dr .Víctor Ruben

Tenorio Gutíerrez.

Responsable del proyecto de

Biotecnologia.CENID-MICROBIOLOGIA

BlBLlOGRAFíA

Calnek , B.W. 1995 Enfermedades & las aves. Primera edición en

español. Manual moderno México D.F. pp. 81-119.

i.

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r L

tl

c:

Cárter, G.R. 1985 Fundamentos de bacierioloqía v micoloqía médica.

Ed.Acribia, Zaragoza

Espaíia pp: 19-123, 173-177.

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