FACULTAD DE MEDICINA

CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

“Impacto funcional de las propiedades biofísicas y farmacológicas del receptor NMDA compuesto por

subunidades NR2(A-D)” (Revisión)

Tesis para obtener el grado de:

Maestro en Ciencias Fisiológicas

Presenta:

QFB. Pedro Daniel Salazar Fajardo

Asesor:

Dr. Sergio Humberto Elenes Zepeda

Colima, Col. Septiembre del 2010

i

Dedicatoria

Este trabajo está dedicado 

con mucho cariño, 

a Danny y Odette, 

mis sobrinos. 

ii

Agradecimientos

A mis padres por su apoyo incondicional durante mi preparación

profesional. A mis hermanos, por su compañía.

Al Dr. Sergio Humberto Elenes Zepeda, por brindarme su atención y

asesoría durante la elaboración de este trabajo.

Al Dr. Humberto Cruzblanca y Dr. Oscar Gonzales Pérez, por el valioso

tiempo dedicado a la revisión del escrito.

Al apoyo diario del Dr. Jesús Lara Chávez, al Dr. Ricardo Navarro y su

equipo de trabajo: Dr. Eloy Moreno, M.C. Alberto Rodríguez, IBQ. Elizabeth

Guzmán y QFB. Julio Rodríguez.

También a Rosy, Adriana, Chucho, Letty, Chayito, Goyo y Miguel, personal

del CUIB.

Y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por el

financiamiento al proyecto 49304 y su beca de manutención número CVU/becario:

231965/209124.

iii

Índice

Contenido

Página

Dedicatoria i

Agradecimientos ii

Índice iiii

Índice de figuras iivi

Índice de tablas viii

Abreviaturas ix

Resumen xi

Abstract xii

I. INTRODUCCIÓN 1

II. MARCO TEÓRICO 3

2.1 Los receptores de glutamato. 3

2.2 Receptores del tipo NMDA.

2.2.1 Topología del NMDAR.

2.2.2 Estequiometría del NMDAR.

2.2.2.1 La subunidad NR1.

2.2.2.2 La subunidad NR3.

2.2.2.3 La subunidad NR2.

2.2.2.3.1 Conductancias de la subunidad NR2.

2.2.2.3.2 Transiciones directas.

5

5

6

7

8

9

9

12

2.3 Cinética del Receptor NMDA.

2.3.1 Componentes glutamatérgicos postsinápticos.

2.3.2 Tiempo de activación

2.3.3 Tiempo de desactivación

2.3.4 Desensibilización del NMDAR.

15

15

16

18

20

2.3.5 Análisis de las aperturas y cierres de receptores

NR1|NR2A y NR1|NR2D. 23

2.3.5.1 Tiempo crítico. 23

iv

2.3.5.2 Distribución de la longitud de trenes. 24

2.3.5.3 Alineación y suma de trenes.

2.3.6 Cinética de la subunidad NR2C

2.3.6 Cinética de la subunidad NR2B

25

28

29

2.3.8. Implicaciones fisiológicas de la subunidad NR2D. 31

2.4 Patrones de expresión de los subtipos de NMDARs

2.4.1 Distribución de las subunidades NR1 y NR2 en el desarrollo.

2.4.2 Distribución de NR1 y NR2 en cerebro adulto.

2.4.3 Receptores NMDA triheterómeros.

33

33

36

37

2.5 Papel funcional del receptor NMDA en el SNC.

2.5.1 Proteínas postsinápticas asociadas al NMDAR.

2.5.2 Organización del NMDAR en las sinápsis.

2.5.2.1 Tráfico del NMDAR.

2.5.3. Plasticidad sináptica.

2.5.3.1 Plasticidad en sinápsis excitatorias.

2.5.3.2 Control bidireccional de los procesos de LTP y LTD

por el NMDAR.

2.5.3.3 Mantenimiento de LTP por el receptor NMDA.

2.5.3.4 Mantenimiento de LTP por el receptor NMDA.

39

40

40

41

43

44

45

46

48

2.6 Farmacología del receptor NMDA.

2.6.1 Fármacos que actúan en el sitio de unión del agonista.

2.6.1.1 Sitio de unión de glutamato de la subunidad NR2.

2.6.1.2 Sitio de unión de glicina de la subunidad NR1.

2.6.2 Fármacos que bloquean el poro del canal.

2.6.3 Fármacos que actúan en el sitio NTD.

2.6.4 Modulación por poliaminas.

2.6.5 Modulación por protones (H+).

2.6.7 Posibles sitios moduladores del NMDAR.

50

50

50

53

53

55

57

59

60

2.7 Usos clínicos de moduladores del NMDAR

2.7.1 Compuestos no selectivos.

2.7.1.1 Antagonistas competitivos.

2.7.2.1 Bloqueadores del poro

63

63

63

63

v

2.7.2 Antagonistas selectivas de la subunidad NR2B

2.7.3 Dolor.

2.7.4 Huntington

2.7.5 Parkinson

2.7.6 Depresión mayor

2.7.7 Esquizofrenia

64

64

65

65

66

66

III. CONCLUSIONES 69

IV. PERSPECTIVAS 71

V. BIBLIOGRAFÍA 73

vi

Índice de Figuras

Número de Figura Descripción Página

Figura 1 Clasificación de los receptores de glutamato. 3

Figura 2 Agonistas fisiológicos del receptor NMDA. 4

Figura 3 Topología de las subunidades del NMDAR. 5

Figura 4 Estequiometría del NMDAR. 6

Figura 5 Diversidad de las subunidades del receptor

NMDA.

7

Figura 6 Conductancia principal y sub-estado de

receptores NR1|NR2D.

10

Figura 7 Conductancia del receptor NMDAR. 10

Figura 8 Efecto del calcio en la conductancia del canal del

receptor NMDA.

11

Figura 9 Transiciones directas del receptor NMDA. 13

Figura 10 Componentes glutamatérgicos postsinápticos. 16

Figura 11 Tiempo de activación de la subunidad NR2. 17

Figura 12 Activación de las subunidades NR2A y NR2D. 17

Figura 13 Curso temporal de desactivación del NMDAR. 18

Figura 14 Tiempo de recuperación de la desensibilización

del NMDAR.

20

Figura 15 Desensibilización de los subtipos NR2 para

pulsos largos de agonista.

21

Figura 16 Modelo simplificado de la cinética del NMDAR. 22

Figura 17 Distribución de los estados cerrados de

receptores NR1a|NR2A y NR1a|NR2D.

23

Figura 18 Distribución de las longitudes de los trenes de

receptores NR1a|NR2A y NR1a|NR2D.

24

Figura 19 Trenes de NR1a/NR2A. 26

Figura 20 Trenes de NR1a/NR2D. 27

vii

Figura 21 Análisis de aperturas y cierres de receptores

NR1|NR2C.

29

Figura 22 Cinética del receptor NMDA. 30

Figura 23 Distribución y nivel de expresión de NR1 y NR2

en el desarrollo.

34

Figura 24 Distribución de NR2 en cerebro adulto. 36

Figura 25 Esquema del complejo del receptor NMDA. 39

Figura 26 Organización del NMDAR en la sinápsis. 41

Figura 27 Tráfico del NMDAR en sinapsis CA1- Scaffer

nacientes.

42

Figura 28 Mecanismos de mantenimiento de LTP mediado

por los NMDARs.

47

Figura 29 Sitios con potencial farmacológico del NMDAR. 51

Figura 30 Principales fármacos que actúan sobre el

receptor NMDA.

52

Figura 31 Dependecia del voltaje del bloqueo por Mg2 54

Figura 32 Nueva generación de compuestos NR2B. 56

Figura 33 Efecto del zinc 57

viii

Índice de Tablas

Número de Tabla Descripción Página

Tabla 1 Porpiedades de los subtipos NR2 del NMDAR. 14

Tabla 2 Expresión de las subunidades NR2 (A-D). 35

Tabla 3 IC50 de los principales compuestos moduladores

del NMDAR

61

Tabla 4 Selectividad de compuestos moduladores del

Receptor NMDA.

62

ix

Abreviaturas

ABD dominio de unión del agonista

ADNc Acido desoxirribonucleico codificante

AMPA ácido propiónico de α-amino, 3-hidroxi, 5-metil,

4-isoxazol

AMPAR (s) Receptor (es) AMPA

A2AR Receptor de adenosina tipo 2A

7-CKA ácido 7-cloroquinurénico

Ca2+ Calcio

C-terminal Carboxilo terminal

CP 101,606 acido (R)-4-(3-fosfonopropil) piperazina-2-

carboxylico

5,7-DCKA ácido 5,7-dicloroquinurénico

EPSCs corrientes postsinápticas excitatorias

HEK-293 Células embrionarias humanas de riñón 293

iGluR (s) Receptor (es) ionotrópico (s) de glutamato

kDa Unidad de masa atómica (Dalton= Da) a la

tercera potencia (kilo=k)

K+ Potasio

LTD Depresión a largo plazo

LTP Potenciación a largo plazo

Mg2+ Magnesio

mGluR1-8 Receptor metabotrópico de glutamato (tipo 1-8)

MK-801 Dizolcipina

mM milimolar

Ms milisegundos

mV Unidad de voltaje(Volts) x10-3

Na+ Sodio

NMDA N-metil-D-aspartato

NMDA-EPSC Corrientes postsinápticas excitatorias mediadas

por el receptor NMDA

NMDAR (s) Receptor (es) NMDA

Receptores no-NMDA Receptores AMPA y Kainato

x

NOS Óxido nítrico sintetasa

2NR1|2NRA Receptor NMDA compuesto por dos

subunidades NR1 y dos subunidades NR2A

2NR1/2NR3AB Receptores NMDA compuestos por dos

subunidades NR1 y dos NR3A (ó dos NR3B)

NR1-3 Receptor NMDA 1, NR2, NR3

NR1 ABD Dominio ABD de la subunidad NR1

NR2A-D Receptor NMDA 2A, NR2B, NR2C, NR2D

NR2 ABD Dominio ABD de la subunidad NR2

NR3A-B Receptor NMDA 3A, NR3B

NTD Dominio amino terminal

N-terminal Amino terminal

pA Amperio (A) = Unidad de intensidad de corriente

= Coulumb/s pico=1x10-12

PAMPA ácido (RS)-4-(fosfonometil)-piperazina-2-

carboxylico

PCP Fenilciclidina

pH Potencial Hidronio

PDS-95 Proteínas de la densidad postsináptica de

95kDa

pS unidad de conductancia (Siemens) x10-12

(pico)

PPDA Ácido (2R,3S)-1-(fenantrenil-2-carbonil)

piperazina-2, 3-dicarboxílico

(R)-AP5 (R)-2-amino-5-fosfonoheptanoato

(R)-AP7 (R)-2-amino-7-fosfonoheptanoato

(R)-CPP ácido (R)-4-(3-fosfonopropil) piperazina-2-

carboxylico

Ro 25-6981 hidrocloruro de (aR,bS)-a-(hidroxifenil)-b-metil-

4-(fenilmetil)-1-piperidinpropanol

SNC Sistema nervioso central

TCP Tionil-ciclohexil-piperidina

TM1-4 Segmentos transmembranales 1, 2, 3 y 4

Zn2+ Zinc

τ Constante de desactivación

xi

Resumen

El neurotransmisor excitatorio que predomina en el sistema nervioso

central es el L-glutamato. Activa receptores del tipo metabotrópicos (GluR1-8) e

ionotrópicos (NMDA y no-NMDA). Los receptores NMDA (NMDARs) son

complejos tetraméricos con un canal iónico permeable a Na+, K+ y Ca2+. Están

ensamblados por la combinación de subunidades de las familias NR1 (NR1a-4b),

NR2 (A-D) y NR3 (A y B). La expresión de dos subunidades NR1 es esencial para

garantizar la funcionalidad de este receptor. Las subunidades NR2 (A-D)

determinan la variación de sus propiedades biofísicas: activación, desactivación y

desensibilización oscilan del orden de milisegundos hasta segundos y tienen un

efecto directo en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias

mediadas por estos receptores. La contribución en el aumento de calcio

intracelular y las enzimas intracelulares confieren a la activación del receptor

NMDA un papel muy importante en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. La

familia NR3 tiene un efecto modulatorio del tipo inhibitorio. Una gran variedad de

compuestos y moduladores endógenos como el Mg2+, Zn2+, pH y poliaminas

regulan la actividad del canal según la subunidad NR2 presente. La expresión de

cada subtipo en la membrana sináptica es gobernada por diversos factores como:

el desarrollo neuronal, distribución, activación sináptica normal, bloqueo y

desregulación; todas ellas, aumentando su diversidad fisiológica funcional. El

estudio y manipulación del NMDAR ha sido complicado por la falta de fármacos

capaces de distinguir entre las diferentes subunidades que pueden integrarlo. Por

tal motivo, continúa abierto un campo de estudio que ayude a elucidar las

determinantes biofísicas y farmacológicas que gobiernan la función del receptor

NMDA.

Palabras clave: L-glutamato, Receptor NMDA, subtipos NR2.

xii

Abstract

The predominant excitatory neurotrasmisor in the central nervous system is

the L-glutamate. This amino acid active metabotropics (GluR1-8) and ionotrópic

(NMDA and non-NMDA) receptors. The NMDA receptors are tetramer complex

having an ion channel permeant to Na+, K+ and Ca2+. They are ensemble by the

combination of two subunits of NR1 (NR1a-4b), NR2(A-D) and NR3(A,B) families.

The expression of two NR1 subunits is essential to ensure the function of this

receptor. The NR2(A-D) subunits play a main role on theirs biophysical properties:

activation, deactivation and desensitization could have a duration from millisecond

to several seconds and have a direct effect to postsynaptic excitatory current

through these receptors. Their contribution to increase the intracellular calcium

and the among of intracellular enzyme by the activation processes of NMDA play

an important role in physiological and pathological process. On the other hand, the

NR3 family has an inhibitory modulation. A broad among of endogenous

compounds like Mg2+, Zn2+, pH and polyamines can regulated the single channel

activity according to the NR2 subunits. The expression of each subunit in the

synapses is regulated by many factors like: neural development, distribution,

regular function of the synapse, blocked and deregulation; all of them increasing

theirs diversity physiological function. The studies and manipulation of NMDAR

receptors have been complicated because of lack of drugs to selective bond to

each subunit. On this way, there are many studies taken place to understand the

biophysical and pharmacological that regulated the NMDA function.

Clave words: L-glutamate, NMDA receptor, NR2 suptypes.

 

1

I. INTRODUCCIÓN

El neurotransmisor excitatorio que predomina en el sistema nervioso de los

mamíferos es el glutamato. Sus receptores son del tipo metabotrópicos (mGluR1-8)

e ionotrópicos (AMPA, Kainato y NMDA). El receptor del tipo NMDA juega un papel

muy importante en la transmisión sináptica debido a su alta permeabilidad al Ca2+.

Participando en la excitabilidad general, en la regulación de la actividad de

segundos mensajeros y enzimas intracelulares de las neuronas (Dingledine et al,

1999) y en la patogénesis de padecimientos neurodegenerativos mediante

mecanismos de actividad excesiva (Choi, 1992), sobreexpresión (Li et al, 2003) e

hipofunción (Woo et al, 2008). Este receptor es un tetrámero, conformado por

diferentes combinaciones de siete subunidades que están clasificadas dentro de

tres familias: NR1, NR2 (A-D) y NR3 (A-B). Dos subunidades deben ser NR1 para

asegurar la funcionalidad del receptor, las demás son combinaciones homo- y

heterólogas entre las familias NR2 y NR3. Mientras que los subtipos NR3 ejercen

una modulación negativa sobre la actividad del canal, la mayor diversidad biofísicas

y farmacológicas del NMDAR varían principalmente por la subunidad NR2 presente

(Cull-Candy et al, 2001) y hasta el momento no han sido completamente

caracterizadas (Wyllie et al, 1998; Banke and Traynelis, 2003; Dravid et al, 2008).

La principal repercusión de la variabilidad biofísica del receptor NMDA inferida por

las subunidades NR2, es sobre la cinética de desactivación del canal, que oscila

entre los 54ms para el subtipo NR2A hasta 1700ms para NR2D (Vicini et al, 1998)

implicando una diferencia en la duración de las corrientes postsinápticas que

pueden alcanzar el orden de segundos (Lester et al, 1990). El estudio del impacto

funcional del receptor NMDA ha sido complejo por varios factores: i) la distribución

particular de cada subunidad NR2 (Monyer et al, 1994), ii) la regulación de los

patrones de expresión durante procesos fisiológicos y fisiopatológicos (Fox et al,

1999; Takai et al, 2003), iii) las diferentes vías de señalización ligadas a cada

subtipo (Lau and Zukin, 2007; Rebola et al, 2009), y finalmente iv) la falta de

selectividad de las moléculas que modulan la actividad del canal (Paoletti and

Neyton, 2007; Mony et al, 2009).

 

2

En esta revisión, pretendemos mostrar las principales características

biofísicas determinantes de la cinética del receptor NMDA en las sinápsis y el

impacto funcional que exhibe en algunos procesos fisiológicos, principalmente en la

plasticidad sináptica. Así como algunos aspectos farmacológicos que hoy en día se

han tomado en cuenta como estrategias para el estudio y manipulación de los

receptores NMDA.

 

3

II. MARCO TEÓRICO

2.1 Los receptores de glutamato

El Glutamato es el neurotransmisor excitatorio que predomina en el sistema

nervioso central (SNC) de los mamíferos. Dentro de la clasificación de los receptores

que responden a este aminoácido, se encuentran del tipo metabotrópicos e

ionotrópicos (Ver figura 1). Los receptores metabotrópicos están clasificados dentro

de tres grupos (Grupo 1-3) y hasta el momento se han encontrado ocho diferentes

(mGlu1-8). En los ionotrópicos encontramos tres tipos de receptores, los cuales

están caracterizados en función del agonista utilizado para su identificación; AMPA

(ácido propiónico de α-amino, 3-hidroxi, 5-metil, 4-isoxazol), Kainato y NMDA (N-

Metil-D-Aspartato) (Dingledine et al, 1999).

Generalmente la expresión de los receptores NMDA y no-NMDA (AMPA y

kainato) es sobre el mismo elemento postsináptico. Los receptores ionotrópicos de

Figura 1. Clasificación de los Receptores de Glutamato. Los receptores metabotrópicos de glutamato son ocho (mGlu1-8) y están clasificados dentro de tres grupos (Grupo 1-3). En los receptores ionotrópicos encontramos los receptores AMPA, Kainato y NMDA, caracterizados de acuerdo al agonista utilizado en su diferenciación. Los receptores NMDA son complejos tetraméricos formado por combinaciones de las subunidades NR1, NR2 y/o NR3. (Modificada de www.bris.ac.uk)

 

 

4

glutamato presentan una secuencia homóloga similar que sugiere un origen evolutivo

común (Dingledine et al, 1999).

Dentro de los tres tipos de receptores ionotrópicos de glutamato, los

receptores NMDA (NMDAR) participan en la excitabilidad general y mecanismos de

señalización intracelular gracias a su permeabilidad al sodio, potasio y calcio. Este

último ión puede mantener la despolarización de la membrana y modular la actividad

de segundos mensajeros y enzimas intracelulares de neuronas. Para activarse, los

receptores NMDA necesitan dos moléculas de L-glutamato y dos moléculas de

glicina, aunque también el aspartato pude fungir como agonista y la D-serina como

coagonista (Ver figura 2). Algunos de los procesos donde está involucrada la

activación de los NMDAR son: la transmisión excitatoria, plasticidad sináptica (LTP y

LTD), desarrollo y maduración neuronal (Asztely and Gustafon, 1995) y en

patogénesis de desordenes neurodegenerativos mediante mecanismos de

excitotoxicidad (provocada por una excesiva entrada de calcio a la neurona) (Choi,

1992).

Figura 2. Agonistas fisiológicos del receptor NMDA. El glutamato (forma ionizada del ácido glutámico) es el agonista principal del receptor NMDA y la glicina es el co-agonista. El NMDAR también puede ser activado por aspartato y D-serina (Imágenes de www.scitopics.com).

 

5

El receptor NMDA (NMDAR) posee propiedades farmacológicas y funcionales

únicas. Además de su alta permeabilidad al calcio (corriente fraccional de Ca2+

~13%) (Elenes et al, 2009), el NMDAR presenta una cinética de

activación/desactivación lenta (con relación a los receptores AMPA) y en potenciales

de membrana en reposo, el poro del canal se encuentra bloqueado por iones

magnesio (Mg+2) en el lado extracelular, este bloqueo es dependiente de voltaje por

lo tanto puede ser retirado despolarizando la membrana (↑-50mV) (Cull-Candy et al,

2001).

         

2.2 Receptores del tipo NMDA

2.2.1 Topología del NMDAR

Estructuralmente, las subunidades del receptor NMDA presentan una

topología transmembranal común (Ver Figura 3), la cual se caracteriza por un amino

terminal (N-terminal) extracelular largo, una región en la membrana compuesta por

tres segmentos (TM1-4) más un asa re-entrante en la zona del poro (TM2), un asa

extracelular entre los segmentos TM3-TM4 (región S2) y un carboxilo terminal (C-

Figura 3. Topología de las subunidades del NMDAR. Caracterizada por su gran N-terminal extracelular, los segmentos transmembranales TM1-4 más su asa re-entrante en la región del poro (TM2), un asa extracelular entre los segmentos TM3-TM4 y el C-terminal citoplasmático. (Modificada de Johnson, 2003).

 

6

terminal) citoplasmático que contiene sitios de interacción para proteínas

intracelulares. La región N-terminal contiene dos dominios; el dominio de unión del

agonista (ABD) dentro de la región S1 y el dominio N-terminal (NTD), ambos con

múltiples sitios blanco farmacológico (Dingledine et al, 1999).

2.2.2 Estequiometría del NMDAR

El receptor NMDA está formado por un complejo heteromultimérico de cuatro

subunidades (Béhé et al, 1995) (Ver Figura 4). Estas subunidades están clasificadas

dentro de tres familias definidas por su secuencia homóloga: NMDA Receptor 1

(NR1), NR2 y NR3. Se requieren dos subunidades NR1 expresadas en la

arquitectura del receptor para que sea funcional, las dos subunidades restantes son

combinaciones homo- y heterólogas entre las familia NR2 (A-D) y NR3 (A y B) (Cull-

Candy et al, 2001).

Figura 4. Estequiometría del Receptor NMDA. Comprendida por cuatro subunidades. Dos subunidades NR1 son necesarias para la funcionalidad del receptor. Las otras dos son combinaciones entre los subtipos NR2 y NR3. El sitio de unión para el L-glutamato está en NR2, mientras que NR1 posee el sitio para la glicina. Ambas tienen varios sitios blancos farmacológicos (www.scitopics.com).

 

7

2.2.2.1 La subunidad NR1

La Subunidad NR1 (NMDA receptor 1) es esencial para la función del receptor

NMDA. Presenta el sitio de unión para la glicina, el co-agonista (Cull-Candy et al,

2001). Esta subunidad es codificada por un solo gen, pero existen ocho isoformas

(NR1a-4b) por “splicing” alternativo en tres sitios diferentes (exón 5, 21 y 22) (Ver

figura 5). El exón 5 codifica una secuencia de 21 aminoácidos en el amino terminal, y

los otros dos exones para secuencias adyacentes de 37 y 38 aminoácidos en el C-

terminal (Das et. al, 1998). El tipo de isoforma de NR1 involucrada en la formación

del receptor le confiere al canal variación en algunas de sus propiedades. Por

ejemplo, la sensibilidad al pH de los NMDARs es determinado por la presencia del

exón 5 (en el amino terminal de NR1). A pH fisiológico los receptores que incluyen

esta variante se activan completamente, mientras que los receptores que carecen del

exón 5 están inhibidos de forma parcial (Traynelis et al, 1995). La diferente

sensibilidad a los protones de receptores NMDA postsinápticos influye

importantemente en la transmisión sináptica (Ver tema 2.4.6).

Figura 5. Diversidad de las subunidades del receptor NMDA. a) Dendrograma de la secuencia de aminoácidos completa de las subuidades del NMDAR de rata (excepto NRB humana). b) Representación de los polipeptidos de la subunidad NR2. Las líneas negras representan los segmentos transmembranales y el asa reentrante (línea gris). Los asteriscos indican las zonas de “splicing alternativos” (Cull-Candy et al, 2001).

 

8

2.2.2.2 La subunidad NR3

La tercera familia está compuesta por las subunidades NR3A y NR3B, cada

una codificada por su propio gen. El sub-tipo NR3A presenta dos isoformas y se

encuentran ampliamente distribuidas en el cerebro. NR3B no ha mostrado variantes

y su expresión predomina en neuronas motoras (Cull-Candy et al, 2001). Estas

subunidades solo son funcionales si están co-expresadas con NR1 y NR2 (Das et al,

1998). La co-expresión de la subunidad NR3A con NR1 y NR2A (receptores

NR1|NR2A|NR3A) forma canales que presentan una reducción en la conductancia a

nivel de canal unitario y disminuye también la permeabilidad al Ca+2 (Cull-Candy et

al, 2001). Para receptores NMDA que contienen solo las subunidades NR3A ó NR3B

(receptores NR1|2NR3A/B) han mostrado una función modulatoria negativa en el

canal y cuando están unidos solo con la subunidad NR1 forman receptores

ionotrópicos con apertura dependiente solo de glicina, que a pesar de las

propiedades inhibitorias de este neurotransmisor, en estos receptores (NR1|NR3A/B)

la glicina genera una actividad excitatoria (Chatterton et al, 2002).

Los receptores NR1|2NR3A/B son impermeables al calcio, resistentes al

bloqueo por magnesio, MK-801 y memantina (Cull-Candy et al, 2001). Se ha

encontrado que la subunidad NR3A se asocia con NR2A y NR2B en el cerebro

adulto, sugiriéndose la presencia de receptores NMDA triheterómeros compuestos

por combinaciones NR1|NR2A/B|NR3A. La presencia de diferentes combinaciones

de subunidades en los receptores NMDA, en especial las de la familia NR2, confiere

al canal variabilidad en sus propiedades cinéticas y farmacológicas (Dingledine et al,

1999).

 

9

2.2.2.3 La subunidad NR2

La familia NR2 está formada por cuatro subtipos: NR2A, NR2B, NR2C y

NR2D, provenientes de genes diferentes. La subunidad NR2C presenta dos

isoformas que generan polipéptidos truncados después de la región TM1 ó TM3. El

subtipo NR2D tiene una isoforma por transcripción diferencial en el C-terminal,

produciendo una secuencia de 33 aminoácido adicionales, similar a NR3A con una

isoforma de 20 aminoácidos en su carboxilo terminal. La s subunidades NR2B, NR2C

y NR2D también presentan una variante en una región no traducida en la posición 52

(Ver figura 5b) (Cull-Candy et al, 20001).

A diferencia de NR1, la distribución de los subtipos NR2 está restringida para

ciertos núcleos definidos dentro del SNC y sus patrones de expresión cambian

durante el desarrollo (Monyer et al, 1994) (Ver tema 2.4). La subunidad NR2 es la

principal determinante de la diversidad funcional de los receptores NMDA. Influye en

su sensibilidad farmacológica y en muchas de sus propiedades biofísicas,

principalmente en su conductancia (Stern et al, 1992; Wyllie et al, 1996), cinética de

desactivación y desensibilización del receptor (Vicini et al, 1998), afectando

directamente en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias (Lester et al,

1990).

2.2.2.3.1 Conductancias de la subunidad NR2

El receptor NMDA posee un canal iónico permeable a cationes: Na+, K+ y

Ca2+. Este canal ostenta un nivel principal de conductancia y un sub-estado (Ver

figura 6). La magnitud de ambos niveles depende de cada subunidad NR2. Las

subunidades NR2A y NR2B (ambas con secuencia TM2 idéntica) tienen

conductancias muy similares llamadas; conductancias largas (Ver Figura 7a, b). Las

dos conducen principalmente a 50pS y además, presentan un breve subnivel de

40pS con tiempos de apertura y frecuencia de subniveles idénticas (Stern et al,

1992). En cambio, las subunidades NR2C y NR2D presentan conductancias más

cortas (Ver Figura 7c, d), una de 35pS y un subnivel de 17pS. Sin embargo, hay

diferencias en la manera en que conducen estas dos subunidades. Las repuestas de

 

10

NR2C son aperturas breves en sus dos subniveles, con misma duración. Mientras

que la mayoría de las aperturas de NR2D ocurren en el subnivel de 17pS (Wyllie et

al, 1996).

Figura 7. Conductancia del Receptor NMDA. A y B. Las conductancias largas de 54pS y 41pS características de las subunidades NR2A y NR2B. B y C, conductancias cortas de 30 y 16pS producidas por las subunidades NR2C y NR2D. (Modificada de Stern et al, 1992: Wyllie et al, 1996).

Figura 6. Conductancia principal y sub-estado de receptores NR1|NR2D. Los receptores NMDA ensamblados por subunidades NR2 exhiben dos niveles de conductancias al activarse (Modificada de Wyllie et al, 1996).

 

11

Figura 8. Efecto del calcio en la conductancia del canal del receptor NMDA. A) La concentración del calcio extracelular (0, 0.85 y 5mM) afecta directamente los niveles de conductancia del canal del NMDAR, reduciéndola conforme el calcio aumenta. B) Los dos sub-estados de conductancia se vuelven indistinguibles cuando la el medio extracelular está libre de calcio. (Modificada de Wyllie et al, 1996).

 

12

La presencia del sub-estado de conducción del canal del receptor NMDA se

debe al Ca2+ (Wyllie et al, 1996). Cuya permeabilidad en este canal (estudiado en

subtipos NR2A) exhibe una corriente fraccional ~13% (Elenes et al, 2009). Aunque

en diferentes condiciones de calcio externo se ha observado que la magnitud del

subnivel puede variar (Wyllie et al, 1996; Gibb and Colquhoun, 1992; Lester et al,

1990; Vicini et al, 1998). Un incremento de calcio produce una disminución en la

conductancia del canal, afectando de diferente manera los dos niveles de

conductancias (Ver figura 8A), mientras que en condiciones libres de calcio la

diferencia entre los dos sub-estados es indistinguible (Ver figura 8B) (Gibb and

Colquhoun, 1992).

Los niveles de conductancias largas estudiadas en receptores recombinantes

por Stern y cols. (1992) son muy similares a los encontrados en neuronas CA1 de

hipocampo activados por L-glutamato en rata adulta (Gibb and Colquhoun, 1992).

También se había observado desde hace tiempo la presencia de receptores NMDA

de baja conductancia y sensibilidad a magnesio reducida en varios tipos de

neuronas, incluyendo de cerebelo en cultivo (Cull-Candy and Usowicz 1987), médula

espinal (Momiyama et al, 1996), giro dentado (Pifia-Crespo and Gibb 1996) y en

células Purkinje y granulares de cerebelo (Farrant et al, 1994).

2.2.2.3.2 Transiciones directas

Las transiciones directas son consideradas como un cambio en los niveles

de conductancias de un canal abierto, desde un nivel principal a un sub-estado (ej.

de 51pS a 40pS). Esta propiedad que sirve como criterio de exclusión entre las

subunidades de conductancias cortas (NR2C y NR2D) (Ver Figura 9). Solo para el

caso de la subunidad NR2D, la frecuencia de transiciones entre el nivel principal de

conductancia y el sub-estado presenta una asimetría temporal, es decir, los eventos

de 41pS a 18pS son más frecuentes (60%) que los eventos de 18 a 41pS (40%)

(Wyllie et al, 1996).

 

13

En las células de Purkinje en la primera semana de desarrollo, se había

observado previamente la presencia de mRNA de la subunidad NR2D (Akazawa et

al, 1994) y posteriormente se notó que los canales expresados elucidaban

conductancias cortas con una asimetría en sus transiciones (Momiyama et al, 1996),

consistente con la observada en la subunidad NR2D con receptores expresados en

ovocitos de Xenopus por Wyllie y cols. (1996).

Además de la conductancia del receptor NMDA, otras propiedades del

NMDAR varían también, como la sensibilidad al bloqueo por magnesio cambia

notablemente entre los subtipos NR2 del receptor NMDA. En receptores

recombinantes compuestos por las subunidades NR1|2NR2A ó NR1|2NR2B son más

susceptibles al bloqueo por Mg+2 (2.4 y 2.1μM) que receptores compuestos por

NR1|NR2C ó NR1|NR2D (14.2 y 10.2μM). Por tal motivo, los diferentes subtipos de

Figura 9. Transiciones directas del receptor NMDA. Transiciones entre sus niveles de conductancias cortas (41-18pS) y conductancias largas (54-41pS). Las conductancias cortas son características de las subunidades NR2C y NR2D, mientras que las subunidades NR2A y NR2B son responsables de las conductancias largas. A y B; la subunidad NR2D presenta una asimetría de transición (22% de 18 -41pS y 78% para la transición 41-18pS). C; la proporción entre los niveles largos (54-41pS) de las subunidades NR2A y NR2B es simétrico (47% en 41-54pS y 54% de 54-41pS) (Jones and Gibb, 2005).

 

14

receptores NMDA son activados a distintos rangos de potencial de membrana.

Adicionalmente, la sensibilidad por el L-glutamato, desensibilización, cinética de

desactivación, así como una diferente sensibilidad farmacológica, son propiedades

que también se encuentran influenciadas por la subunidad NR2 presente (ver tabla 1)

y marcan una diferencia en el umbral de activación, modulación y duración de las

corrientes postsinápticas excitatorias mediadas por el receptor NMDA (NMDA-EPSC)

(Cull-Candy et al, 2001; Lester et al, 1992).

Tabla 1. Propiedades de los subtipos NR2 del receptor NMDA.

  NR1|NR2A NR1|NR2B NR1|NR2C  NR1|NR2D 

Conductancia (pS)  50/40   50/40  ~38/18  ~38/18 35 

Transiciones entre conductancias  simétricas  simétricas  simétricas  asimétricas 67% de 38→18 

Constante de desensibilización (ms) 510  440  235  No exhibe 

Constante de desactivación (ms)  54  280  306  1700 

Glutamato  DE50 (μM) 

2.8  1.2  0.9  0.4 

Bloqueo por Mg2+ IC50 (μM)  2.4  2.1  14.2  10.2 

Inhibición por Zn2+ IC50 (μM)  0.02  2.0  20  10 

inhibición por ifenprodil DE50 (μM)  >30  0.15  >30  >30 

Bloqueo por argiotoxina‐636 IC50 (μM)  0.009  0.005  0.46  ND 

Abreviaturas: pS, picoSiemens; ms, milisegundos; DE50, dosis efectiva 50%; IC50, concentración inhibitoria 50%; μM, micromolar. (Wyllie et al, 1996; Vicini et al, 1998; Paoletti and Neyton, 2007; Dravid and Traynelis, ).

 

15

2.3 Cinética del receptor NMDA

El glutamato se libera de las vesículas de las neuronas presinápticas en la

hendidura sináptica a manera de breves pulsos durante un pequeño instante,

alcanzándose concentraciones alrededor de 1mM que caen con una constante de

tiempo de 1ms, el cual es suficiente para desarrollar su función, activando

principalmente dos tipos de receptores postsinápticos: los NMDA y no-NMDA

(AMPA y Kainato), aunque también se encuentran algunos mGluR post- y

presinápticos (Mayer and Westbrook, 1987).

2.3.1 Componentes glutamatérgicos postsinápticos

La señal glutamatérgica general desencadenada en la región postsináptica se

conforma principalmente por un componente rápido, seguido de uno lento. El primero

en generarse es mediado por los receptores no-NMDA, mientras que el componente

de los receptores NMDA aparece con una lenta activación (con relación a los no-

NMDA) y una larga fase en decaimiento (Ver figura 10) (Nestler et al, 2001).

Comparativamente, las fases de decaimiento de los dos componentes difieren al

menos en unas cien veces a razón de la diferente afinidad con que L-glutamato se

une a estos dos tipos de receptores. Una baja afinidad, implica una constante de

rapidez de disociación (k-1) alta del complejo neurotransmisor-receptor y con ello, un

efecto macroscópico con cinética rápida. Por el contrario, el L-glutamato se une a los

receptores NMDA con mayor afinidad provocando que su efecto sea más

prolongado, con un tiempo suficiente para que el receptor NMDA pueda abrirse y

cerrarse repetidas veces (Lester and Jahr, 1992).

Las propiedades biofísicas de un receptor determinan su modo de

funcionamiento. Como se ha observado, la mayoría de las propiedades biofísicas y

farmacológicas del receptor NMDA dependen de la subunidad NR2 (A-D) expresada.

La principal repercusión ésta variación biofísica de los receptores NMDA es sobre la

duración de sus corrientes postsinápticas excitatorias (NMDA-EPSC), que

específicamente es afectada directamente por el tiempo de desactivación del

receptor NMDA (Lester et al, 1990).

 

16

2.3.2 Tiempo de activación

El tiempo de activación de los receptores NMDA es más lento en comparación

con los receptores AMPA (Ver figura 10). Representa el tiempo de compuerta del

canal una vez que se ha unido el agonista (k1) y dentro de las subunidades NR2

existe una variación. Recientemente se determinó el tiempo de activación de la

subunidad NR2C (Dravid and Traynelis, 2009) con un valor de 4.6ms después de ser

activada con glutamato 1mM; glicina 0.5mM/5ms (Ver figura 11). Con respecto a los

subtipos NR2A y NR2D sabemos que difieren considerablemente por experimentos

de Wyllie y cols. (1998), el subtipo NR2A presenta una constante de 13.4+/-3.9ms,

mayor que NR2D (Ver figura 12).

 

Figura 10. Componentes glutamatérgicos postsinápticos. El glutamato genera dos componentes postsinápticos que pueden ser separados farmacológicamente. En voltajes positivos, el antagonista D-APV bloquea los receptores NMDA (izquierda) revelando el componente rápido generado por los AMPARs. Por el contrario, el bloqueo de los receptores AMPA con CNQX (derecha) deja visible un componente de activación y desactivación lenta regulado por los NMDARs. Para voltajes negativos solamente se refleja participación de los receptores AMPA debido al bloqueo por Mg2+ de los NMDARs a este potencial de membrana (Modificada de Nestler et al, 20001).

 

17

 

 

 

 

 

Figura 11. Tiempo de activación de receptores NR1|NR2C. La línea arriba del trazo (izquierda) muestra un pulso de 5ms de aplicación de gltamato 1mM y 0.5 de glicina que desencadena la activación del receptor NMDA. El tiempo que tarda en abrirse el canal fue de 4.6ms (derecha) (Dravid and Traynelis, 2009).

Figura 12. Activación de las subunidades NR2A y NR2D. Experimentos de Wyllie y cols. (1998) aplicando 1mM de glutamato y 20μM de glicina (línea encima de los trazos) revelan una diferencia en la cinética de activación y desactivación entre los subtipos NR2A (13.4ms) y NR2D (Modificada de Wyllie et al, 1998).

 

18

2.3.3 Tiempo de desactivación del NMDAR

La constante de desactivación de un receptor ionotrópico, es el tiempo que

dura en caer su corriente (hasta un 37% del pico, de acuerdo al modelo que

describe un comportamiento exponencial) una vez que el agonista es removido de su

sitio de unión. Para caso del NMDAR, su tiempo de desactivación juega un papel

muy importante para producir respuestas de diferente duración en la comunicación

interneuronal a nivel sináptico (Lester and Jahr, 1992). Las cuales pueden ser muy

rápidas como las generadas en receptores di-homólogos NR1|NR2A, ó corrientes

más prolongadas inferidas por la subunidad NR2D (Vicini et al, 1998) que difieren

~30 veces implicando más de 1.5 segundos de diferencia.

Figura 13. Curso temporal de desactivación. Corrientes del receptor NMDA en células HEK-293 trasnfectadas con los diferentes ADNc de las cuatro subunidades de la familia NR2 (NR2A-D). Las corrientes fueron activadas por la aplicación de L-glutamato (1mM) durante 1 ms (línea debajo de cada trazo). Los cuatro subtipos NR2 presentaron similar activación rápida (<0.5ms), mientras que los tiempos de desactivación variaron de 54, 280, 306 y 1700ms para las subunidades NR2A, NR2B, NR2C y NR2D, respectivamente. (Vicini et al, 1998).

 

19

La diferencia entre los tiempos de desactivación de receptores NMDA

compuestos por diferentes subtipos NR2 es muy notable (Ver Figura 13). La NR2A

es la subunidad que tiene la cinética de desactivación más rápida (τ=54ms), mientras

que NR2D es la más lenta (≈1700ms). Para el caso de las subunidades NR2B y

NR2C, sus tiempos de desactivación son relativamente similares, 280 y 306ms,

respectivamente. La subunidad NR1 no está involucrada en la desactivación del

receptor NMDA (Vicini et al, 1998).

Después de un pulso breve de agonista (Glutamato 1mM; 20μM glicina), la

cinética del receptor NMDA presenta una activación aparentemente similar para

todos los subtipos NR2, después le sigue una lenta desactivación que se ajusta bien

a dos componentes exponenciales. Esta cinética está comprendida por dos fases;

primero se encuentra una fase rápida, seguida de una más lenta. La contribución de

ambas fases; rápida y lenta, determinan la constante τ. La proporción del

componente rápido se va reduciendo conforme el orden NR2A>NR2B>NR2C>NR2D

y viceversa para la proporción del componente lento (Vicini et al, 1998). Los factores

que participan en la generación de ambos componentes, rápido y lento, pueden

ayudar a explicar el comportamiento en la cinética de los receptores NMDA

ensamblados por cada subunidad NR2 y aún son sujeto de estudio. La afinidad con

que se une al glutamato a cada una de ellas es un factor que influye en el

componente rápido. Por ejemplo, la subunidad NR2 ostenta el componente más

rápido, proporcional a la poca afinidad del glutamato por esta subunidad, ya que se

requieren 2.8μM, dosis 7 veces mayor a NR2D (0.4 μM), subtipo cuyo componente

rápido contribuye poco en la desactivación. Conducta similar para NR2A (0.9 μM) y

NR2B (1.2 μM) (Leste and Jahr, 1992). La desensibilización es un factor que influye

en el componente lento de la desactivación del NMDAR.

 

20

2.3.4 Desensibilización del NMDAR

La desensibilización es un proceso reversible de adaptación, en donde la

respuesta celular es reducida ante la presencia de un estímulo prolongado. Para

receptores que tienen acoplado un canal iónico (como el receptor NMDA), ellos

traducen señales químicas en impulsos eléctricos abriendo su poro transmembranal

en respuesta a la unión de su molécula neurotransmisora. Después de la activación,

varios receptores entran a un estado desensibilizado, donde el canal iónico ya no

conduce pero el neurotransmisor permanece unido (Alberts et al, 2002).

Vicini y cols. (1998) determinaron el tiempo de salida de la desensibilización

de receptores NR1|NR2A y NR1|NR2B. Este periodo se refiere al tiempo que tarda

en recuperarse el total de los receptores que fueron desensibilizados después de

haber recibido un pre-pulso de agonista (12ms), y es determinado aplicando un

segundo pulso de prueba diferentes intervalos de tiempo (40, 80, 200-1200ms) con

respecto al pre-pulso. A la subunidad NR2A, quien presenta la cinética de

Figura 14. Tiempo de Recuperación de la desensibilización del Receptor NMDA. Receptores constituidos por las subunidades NR2A y NR2B. La subunidad NR2A es afectada muy poco por el fenómeno de desensibilización (~10%) (A), mientras que el subtipo NR2B presenta una desensibilización más prominente (~60%) (B) y su salida de la desensibilización es hasta los 1200 ms (C). (Vicini et al, 1998).

 

21

desactivación más rápida, parece no afectarle el fenómeno de la desensibilización

para pulsos breves de agonista (Ver Figura 14A), ya que exhibe una tenue entrada al

estado desensibilizado (10-15%), mientras que la subunidad NR2B (Ver Figura 14B),

quien sufre una desensibilización alrededor del 60% y requiere de 1200ms para

recuperarse de la desensibilización (Ver Figura 14C) muestra un componente lento

más prolongado en su cinética de desactivación (Vicini et al, 1998).

Protocolos con pulsos largo de agonista ayudan a observar de una mejor

manera la aportación de la desensibilización al componente lento de desactivación,

El componente lento más pronunciado de las subunidades NR2 es el de la subunidad

NR2D (Wyllie et al, 1998), esta subunidad no muestra desensibilización aparente

Figura 15. Desensibilización de los subtipos NR2 para pulsos largos de agonista. A. Corriente de NR2A generada por 4s de aplicación de agonista (glutamato 1mM; glicina 20μM) que muestra una constante de decaimiento de 510ms. B. 1mM; glicina 20μM durante 3s genera una entrada a la desensibilización de 440ms en NR2B. C. La subunidad NR2C presenta una constante de 325ms mientras que NR2D (D) no exhibe desensibilización aparente (Modificadas de: Dravid and Traynelis, 2009; Banke and Traynelis, 2003; Wyllie et al, 1998).

 

22

(Figura 15D), lo cual es congruente con su cinética. Entre los subtipos NR2B y NR2A

(Figura 15A, B), el tipo NR2B presenta un componente lento más prolongado (Vicini

et al, 1998) porque su entrada a la desensibilización es más lenta 440ms (Banke and

Traynelis, 2003) contra 510ms en NR2A (Wyllie et al, 1998). De manera similar

NR2C (Figura 15C) que por su desensibilización de 235ms genera un componente

lento mayor que NR2B (Dravid and Traynelis, 2009) (Ver figura13).

Inicialmente, una vez unidos los agonistas, el NMDAR desencadena ráfagas

de aperturas, después hay una alta probabilidad que el poro del canal vuelva a

abrirse ó que entre a un estado desensibilizado. Saliendo de la desensibilización, el

receptor puede abrirse otra vez antes de que el neurotransmisor se disocie (Ver

Figura 16) (Lester and Jahr, 1992). De esta manera, la entrada y salida de la

desensibilización del NMDAR participa en la generación del componente lento de su

cinética de desactivación. Pero aunque la lenta recuperación de la desensibilización

es parcialmente responsable de la cinética de desactivación del NMDAR, las

diferencias entre las constantes de desactivación encontradas por Lester y Jahr

(1992) usando un agonista de baja afinidad (desensibilizador pobre; L-Cisteato),

indica la presencia de más factores involucrados en la cinética de desactivación de

los NMDAR.

Figura 16. Modelo simplificado de la cinética del NMDAR. Receptor NMDA (R) con sitios de unión para dos moléculas de agonista (A). Una vez unidas las dos moléculas de agonista al receptor (A2R), éste puede abrirse (A2R*) ó entrar a un estado desensibilizado (A2D) (Lester et al., 1992).

 

23

2.3.5 Análisis de aperturas y cierres de receptores NR1|NR2A y NR1|NR2D

La cinética de las aperturas y cierres (trenes) del canal acoplado al receptor

NMDA es otro factor que ayuda explicar la cinética de desactivación de cada subtipo

NR2. Como las subunidades NR2A y NR2D son los subtipos que han mostrado

mayor diferencia en su cinética de desactivación (54 y 1700ms, respectivamente)

Wyllie y cols., (1998) estudiaron el comportamiento de la activación de las

subunidades NR2A y NR2D del receptor NMDA a nivel de canal unitario, ambas

subunidades mostraron tres tiempos de aperturas: NR2A: 0.062+/-4ms; 31%, 1.01+/-

0.13; 16% y 3.64+/-0.51; 54% y NR2D: 0.098+/-19; 20%, 0.872+/-0.091; 34% y

2.58+/-0.14; 46%.

2.3.5.1 Tiempo crítico

El análisis de los estados cerrados de Wyllie y cols. (1998) en experimentos

de parche de membrana, con una aplicación continua de agonista a bajas

concentraciones (glutamato 100nM) mostró cinco componentes exponenciales para

la subunidad NR2A y seis para NR2D (Ver figura 17A y B).

 

 

 

 

 

Figura 17. Distribución de los estados cerrados de receptores NR1a|NR2A (A) y NR1a|NR2D (B). Cada registro de canal unitario con bajas concentraciones de glutamato (100nM) generan una distribución de sus estados cerrados los cuales se ajustan a cinco (NR2A) y seis (NR2D) componentes exponenciales. Los tiempos críticos para cada subtipo son 88 y 1019ms, respectivamente (Wyllie et al, 1998).

 

24

Mediante este análisis se pudo determinar el tiempo crítico (tcrit) para cada

subtipo: NR2A 88 ms y NR2D 1019 ms. Este tiempo es necesario separar el grupo de

aperturas y cierres (trenes) de dos canales unitarios activados a diferentes tiempos,

en otras palabras, es el tiempo del estado cerrado, a nivel de canal unitario, que

separa la activación de un canal con respecto a otro. Para el caso de la subunidad

NR2A, la distribución de los estados cerrados no mayor a 88ms son considerados

como la activación de un solo canal. Mientras que para el subtipo NR2D el tiempo de

cierre que separa la actividad de dos canales fue 1019ms. El tiempo critico es

determinado ubicando el valle que se encuentra entre el último y penúltimo

componente de cada gráfica de la distribución de los estados cerrados.

 

 

 

2.3.5.2 Distribución de la longitud de trenes

Considerando el tiempo crítico, Wyllie y cols. (1998) pudieron determinar que la

distribución de la longitud de los diferentes trenes durante cada activación del canal

de ambas subunidades (NR2A y NR2D) se ajustaban a seis componentes

Figura 18. Distribución de las longitudes de los trenes de receptores NR1a|NR2A (A) y NR1a|NR2D (B). La distribución de la longitud de los trenes de ambas subunidades se ajusta a seis componentes exponenciales con diferentes áreas (Wyllie et al, 1998).

 

25

exponenciales a diferentes proporciones: NR1a|NR2A: 42μs (39%), 380μs (8%),

1.88ms (8%), 4.08ms (14%) y 201ms (14%); NR1a/NR2D: 71μs (8%), 1.03ms (18%),

4.71ms (14%), 65.6ms (6%), 1405ms (31%) y 5175ms (23%) (Ver figura 18). Esto

quiere decir que la activación de cada una de estas subunidades se puede dar en

promedio con seis diferentes tipos trenes con diferente probabilidad de apertura

dentro de ellos (0.35+/-0.05 y 0.04+/-0.02 para NR2A y NR2D, respectivamente). La

subunidad NR2D posee los trenes de mayor duración (1405ms y 5175ms) con una

mayor proporción (31% y 23%, respectivamente), mientras que el subtipo NR2A

presenta trenes de menor longitud de tiempo (menor a 201ms).

2.3.5.3 Alineación y suma de trenes

La alineación de los trenes de cada subtipo muestra que la duración de los

trenes más largo de la subunidad NR2D fue de 45 segundos, mientras que los de la

subunidad NR2A nunca sobrepasaron los 1500 ms. Wyllie y colaboradores (1998)

alinearon los trenes de cada subtipo (1403 de NR2A y 647 de NR2D) en el inicio de

cada activación (Ver figura19A y 20A) y los sumaron para cada uno de ellos,

observando que en los trazos generados, las constantes de tiempo del ajuste

exponencial para el decaimiento de la corriente de cada subtipo (Ver figura 19B y

20B) es similar al descrito por las constantes de tiempo identificadas por la

distribución de la longitud de los trenes (Ver figura 18) y es congruente con las

constantes de desactivación descritas para cada subunidad (Ver figura 13).

El trabajo de Wyllie y cols. (1998) nos muestra claramente que la constante de

desactivación de cada subunidad NR2 (A-D), es un reflejo de la variación en el

comportamiento de las aperturas y cierres (trenes) del canal al activarse cada subtipo

de receptor NMDA. Y a razón de que los cuatro subtipos NR2 contribuyen de diferente

manera en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias (Lester et al, 1992)

es importante comprender el comportamiento cinético de cada una de ellas, su

probabilidad de apertura, duración de las mismas, longitud de sus trenes y la

influencia del tiempo de desensibilización, para poder entender la variación en sus

constantes de desactivación.

 

26

 

 

 

 

Figura 19. Trenes de NR1a/NR2A. A, alineación de los diferentes trenes generados por el subtipo NR2A en el inicio de cada apertura. B, trazo de la suma de 1403 trenes alineados, la línea punteada superpuesta es el ajuste exponencial con seis componentes: 201ms, 40.6ms, 4.08ms, 1.88ms, 0.380ms y 0.042ms. C, ilustración expandida del tiempo base del ajuste del pico en B. (Wyllie et al, 1998)

 

27

  

 

 

 

 

Figura 20. Trenes de NR1a/NR2D. A, alineación de los diferentes trenes generados por la subunidad NR2D al inicio de cada activación, se muestra la expansión de un fragmento. B, trazo de la suma de los 647 trenes alineados, la línea punteada superpuesta es el ajuste exponencial a cuatro componentes: 5174ms, 1405ms, 65.6ms, 4.71ms, 0.380ms y 0.042ms (Wyllie et al, 1998).

 

28

2.3.6 Cinética de la subunidad NR2C

La subunidad NR2C ostenta algunas propiedades similares al subtipo NR2D.

Receptores NR1|NR2C y NR1|NR2D expresados en ovocitos de Xenopus, ambos

han mostrado dos niveles de conductancias en condiciones fisiológicas de pH y

presentan menor dependencia de voltaje para el desbloqueo por Mg2+ que las

subunidades NR2A y NR2D (Stern et al, 1992; Clarke and Johnson, 2006). Un

análisis de aperturas y cierres de receptores NR1|NR2C en registro de parche de

membrana, en presencia de concentraciones efectivas máximas de agonista

(glutamato 1mM; glicina 0.5mM) (Ver figura 21A), en este mismo sistema, revelaron

que su probabilidad de apertura es baja (0.011+/-0.02) y el tiempo de apertura es

muy corto (0.52+/-0.04ms) (Ver figura 21B) (Dravid and Traynelis, 2009), la

probabilidad de apertura difiere en un orden de 44 y 10 veces en comparación con

las subunidades NR2A (0.35) y NR2B (0.11), respectivamente. (Banke and Traynelis,

2003; Erreger et al, 2005) pero es muy similar a la probabilidad de apertura dentro de

los trenes de la subunidad NR2D (0.04) (Wyllie et al, 1998), pero su bajo tiempo de

apertura nos señala que es la subunidad NR2 el subtipo de menor estabilidad por el

estado abierto. Los estados cerrados de NR2C muestra periodos largos que exceden

los 100ms (Ver figura 21C), reflejando el grado de desensibilización de esta

subunidad (Dravid and Traynelis, 2009).

 

29

 

 

 

 

2.3.7 Receptores NR1|NR2B

Las subunidades NR2B y NR2C poseen una constante de desactivación y

similar (Vicini et al, 1998), Pero difieren en algunos parámetros dentro de los trenes,

el más notable es la duración en el estado abierto del canal. La activación de

receptores NR1|NR2B activados por glutamato 1mM; glicina 20μM durante 3ms

evoca trenes con una duración de apertura de 3.2ms, (Ver figura 22a) con 0.46+/-

0.06 de probabilidad de apertura dentro de ellos (Ver figura 22b), similar a NR2A. Los

Figura 21. Análisis de aperturas y cierres de receptores NR1|NR2C. Obtenidos de corrientes unitarias de registros de parches de membrana utilizando concentraciones efectivas máximas de agonistas (gllutamato 1mM; glicina 0.5mM). A. histograma de frecuencia de 2647 estados abiertos, mostrando una corta duración principal de 0.54ms. B. histograma de 2646 estados cerrados ajustados a cinco componentes. Los estados cerrados de NR2C muestra periodos largos que exceden los 100ms (Dravid and Traynelis, 2009).

 

30

trenes de NR2B revelados estaban separados por cinco estados cerrados: 0.1 (29%),

0.89 (43%), 15.2 (22%), 69.6 (7%) y 1060ms (6%) (Ver figura 22c) (Banke and

Traynelis, 2003). Sería interesante ver la contribución de la longitud de los trenes de

ambas subunidades sobre el comportamiento de sus corrientes macroscópicas de

desactivación (Ver figura 13).

Figura 22. Cinética del receptor NMDA. a. trenes de receptores NR2B evocadas por glutamato 1mM; glicina 20μM/ 3ms. b. Distribución del estado abierto (3.2ms) y c, una distribución de estados cerrados que se ajustan a 5 componentes (Banke and Traynelis, 2005).

 

31

2.3.8 Implicaciones fisiológicas de la subunidad NR2  

La diferente cinética que le confieren las subunidades NR2 al receptor NMDA

tiene varias implicaciones fisiológicas, debido a que estos subtipos muestran

diferentes patrones de expresión en el sistema nervioso central (Monyer et al, 1994)

que cambian con el desarrollo (Takai et al, 2003) y con la experiencia (Ver tema 2.4).

Por ejemplo, la subunidad NR2A se encuentra ampliamente distribuida a través del

SNC y los subtipos de receptores NMDA que contienen esta subunidad regulan

corrientes postsinápticas excitatorias en muchas sinápsis centrales (Ej. hipocampo,

células de Purkinje, mesencéfalo y diencéfalo) (Takai et al 2003), mientras que de la

subunidad NR2D no hay evidencias claras de su participación en la regulación de las

zona sináptica (Momiyama et al, 1996), además, la cinética lenta de receptores

NR1a/NR2D implicaría que las corrientes mediadas por esta combinación duraría

varios segundos (τ=1700ms) en comparación con las otras subunidades NR2

(τ<481ms) (Vicini et al, 1998).

La subunidad NR2D se ha observado en etapas embrionarias en mesencéfalo

y medula espinal con un pico máximo de expresión en el día postnatal siete (Monyer

et al, 1994). En cerebelo la presencia de receptores NR1a/NR2D somáticos pero solo

en la primera semana de nacimiento (Akazawa et al, 1994). También las neuronas

del asta dorsal de la médula espinal expresan receptores NMDA que contienen la

subunidad NR2D pero no se sabe si estos receptores regulan las EPSCs ó si son

receptores extrasinápticos (Momiyama et al, 1996).

Es factible que los receptores NMDA que expresan la subunidad NR2D

podrían ser activados de modo basal por el glutamato libre, ya que presentan una

alta afinidad este neurotransmisor, son poco sensibles al bloqueo por magnesio y la

respuesta que genera este subtipo es sostenida. Esta actividad podría resultar en

una lenta pero prolongada entrada de calcio a las células que se encuentran

expresando esta subunidad en particular, coordinando la actividad pre- y

postsináptica permitiendo cierto grado de flexibilidad temporal para la formación de

ciertas sinápsis en el desarrollo (Wyllie et al, 1998), que es la etapa de mayor

expresión de la subunidad NR2D (Monyer et al, 1994).    

 

32

Por otra parte, la subunidad NR2C abunda en el cerebro adulto de rata,

apareciendo después de los primeros 10 días postnatales (Karavanova et al, 2007),

está presente también en bulbo olfatorio, tálamo y en interneuronas de la corteza

cerebral e hipotálamo (Monyer et al, 1994). Estudios sobre neuronas granulares del

cerebelo de ratones NR2C knockout muestran un aumento en sus corrientes

postsinápticas excitatorias, sustentando la baja probabilidad de apertura de los

receptores NR1|NR2C (Lu et al, 2006), pero a pesar de su baja probabilidad de

apertura esta subunidad contribuye significativamente en las corrientes

características de las sinápsis de células granulares de cerebelo (Dravid and

Traynelis, 2009). Primero, porque se ha observado en estas células una cinética

lenta de desactivación congruente con NR2C, la amplitud de las corrientes evocadas

en ratones NR2C knockout es aproximadamente 2 veces mayor en comparación con

ratones nativos y el decaimiento de las corrientes es más rápido, congruente con la

alta probabilidad de apertura y la caída de las corrientes de los receptores NR2A y

NR2B que podrían estar remplazando al subtipo NR2C (Cathala et al, 2000).

Adicionalmente, las propiedades biofísicas del receptor NMDA compuestos

por subunidades NR2 solo han sido estudiadas en receptor di-homólogos (Dingledine

et al, 1999; Vicini et al, 1998, Wyllie and Traynelis) y aun no están caracterizadas

completamente (Banke and Traynelis, 2003; Dravid and Traynelis, 2009), Pero la

estequiometría del receptor NMDA no solo puede estar formada por di-homólogos de

las subunidades de la familia NR2 (NR1|NR2A ó NR|NR2B, etc.), hay evidencia de

receptores que tienen incorporada dos subtipos diferentes (Green and Gibb, 2001;

Jones and Gibb, 2005) (además de los complejos ternarios que la subunidad NR3

puede generar en combinación con NR1 y NR2), turnado más complejas las

propiedades biofísicas y farmacológicas del receptor NMDA (Vicini et al, 1998;

Paoletti and Hatton, 2005).

 

 

 

 

33

2.4 Patrones de expresión de los subtipos de NMDARs

2.4.1 Distribución de NR1 y NR2 en el desarrollo

El nivel de expresión de las subunidades NR2 varía con la etapa de desarrollo

pero la distribución de cada subunidad casi no ha mostrado cambios respectivos con

la edad (ver tabla 2). Para el caso de la subunidad NR1 que es esencial para la

formación de NMDAR funcionales, no se ha mostrado evidencia de su expresión en

la región temporal de la corteza cerebral e hipocampo en etapas embrionarias, pero

en neonatos su expresión está ampliamente distribuida en todo el sistema nervioso

central, tal como en la corteza cerebral, células de Purkinje, mesencéfalo y

diencéfalo (Ver Figura 23), siendo las neuronas de la corteza cerebral y las células

piramidales del hipocampo donde se muestra mayor intensidad de expresión. La

subunidad NR2A y NR2C tienen patrones de expresión similar a NR1 en esta etapa.

Pero la expresión de la subunidad NR2B tiene diferencias en su intensidad y en su

distribución. NR2B se ha observado desde etapas embrionarias a varios días

postnatales en el hipocampo y en la región temporal de la corteza cerebral (Takai et

al, 2003).

Las subunidades NR2A y NR2B abundan más en neuronas centrales,

encontrándose principalmente receptores NMDA formados por heteromultímeros de

NR1, NR2A y NR2B. Las combinaciones NR1|NR2A y NR1|NR2B son las más

predominantes, aunque también se han encontrado receptores triheterómeros de

NR1|NR2A|NR2B (Wenzel et al, 1995).

La subunidad NR2B predomina principalmente en el nacimiento. La expresión

de la subunidad NR2A comienza a manifestarse a las pocas semanas postnatales,

remplazando a la subunidad NR2B. Esto explica porque con la maduración los

cambios en la composición de los NMDARs resultan en EPSCs que presentan una

cinética más rápida y que son notablemente menos sensibles a fármacos

antagonistas de la subunidad NR2B. Se cree que este cambio es una regulación de

los NMDARs que está directamente relacionado con la adquisición de experiencia

durante el desarrollo (López de Armentia and Sah, 2003). Similar a NR2B, la

subunidad NR2D abunda en los primeros días del nacimiento, las zonas donde se ha

 

34

visto su presencia es principalmente en diencéfalo y tallo cerebral, pero su expresión

se ve reducida conforme el desarrollo, encontrándose a esta subunidad

principalmente en algunas zonas del tálamo, tallo cerebral y bulbo olfatorio. (Wenzel

et al, 1997).

.

 

 

 

 

Figura 23. Distribución y nivel de expresión de NR1 y NR2 en el desarrollo. Para NR1 en los días E20 (A) y P7 (B). Y para NR2B en los días E20 (C) y P7 (D). La intensidad de inmunorreactividad es graduada según: (-) negativo, (::) mínimo, (//) ligero, (::) moderado, (•) fuerte. pCx, región parietal de la corteza cerebral. tCx, temporal de la corteza cerebral. Hipocampo. Dc, Diencéfalo. (Takai et al, 2003).

 

35

Tabla 2. Expresión de las subunidades NR2 (A‐D) 

Subunidad  

Día 

Región del cerebro 

Hipocampo Corteza cerebral  Tallo 

Cerebral (Md, Dc) 

Cerebelo Parietal  Temporal 

NR2A 

P14  +++  ++  +++  +  ++ 

P7  +++  +  ++  +  + 

P4  ++  +  ++  +  + 

P1  ++  ‐/+  ++  ‐/+  NE 

E20  +  ‐/+  ++  ‐/+  NE 

E18  ‐/+  ‐  +  ‐  NE 

NR2B 

P14  ++  ‐  ‐/+  ‐  ‐ 

P7   +  ‐  +  ‐  ‐ 

P4  +  ‐/+  +  ‐  ‐ 

P1  +  ‐  +  ‐  NE 

E20  +  ‐  +  ‐  NE 

E18  ‐  ‐  ‐/+  ‐  NE 

NR2C 

P14  +++  ++  ++  +  ++ 

P7  ++  +  ++  +  +++ 

P4  ++  +  ++  +  ++ 

P1  ++  ‐/+  ++  ‐/+  NE 

E20  +  ‐  ++  ‐/+  NE 

E18  ‐/+  ‐  +  ‐  NE 

NR2D P  NE  NE  +++  +++  ‐/+ 

E  NE  ‐  ‐  +++  ‐/+ 

Nota. La intensidad de expresión fue graduada como: -, negativo; -/+ mínimo; + ligeramente; ++, moderado; +++, fuerte; NE, no examinado. Md, mesencéfalo; Dc, diencéfalo (López de Armentia and Sah, 2003; Wenzel et al, 1995).

 

36

2.4.2 Distribución de NR1 y NR2 en cerebro adulto

En cerebros que han alcanzado gran parte del desarrollo, después del día

P21, hay una expresión característica para cada subunidad NR2. Mientras que en el

estado embrionario predominan las subunidades NR2B y NR2D. En cerebro adulto

abunda NR2A en gran parte, pero la presencia de NR2B y NRC quedan restringidas

para ciertas áreas específicas: prosencéfalo (NR2B) y cerebelo (NR2C) (Akazawa et

al, 1994; Monyer et al, 1994). Específicamente la subunidad NR2B está presente en

corteza (especialmente en lamina II y III), amígdala, hipocampo, tálamo bulbo

olfatorio (Ver figura 24). La expresión de NR2D es reducida en cerebro adulto y su

presencia puede estar restringida a zonas extrasinápticas (Mony et al, 2009).

Figura 24. Distribución de NR2 en cerebro adulto. Al día postnatal 21cada subunidad NR2 presenta una distribución característica. A, NR2A: principalmente en bulbo olfatorio, corteza, cerebelo, hipocampo. B, NR2B en corteza, hipocampo, bulbo olfatorio, tálamo y septum. C, NR2C en cerebelo. D, NR2D débilmente en mesencéfalo. E, NR1 ampliamente en todo el sistema nervioso central. F, esquemas de las regiones del cerebro. Cx, corteza; OB, bulbo olfatorio; AC, corteza cingulada anterior; S, septum; Th, tálamo; MB mesencéfalo, Hi, hipocampo y Cb, cerebelo (Mony et al, 2009).

 

37

2.4.2 Receptores NMDA triheterómeros

La presencia de ensambles tri-heteroméricos en varias regiones del sistema

nervioso central. En cerebelo se ha encontrado receptores NR1|NR2A|NR2C y

NR1|NR2A|NR2B en prosencéfalo. En sustancia nigra, hipocampo (P0) y muy

probablemente en lamina I y II de la medula espinal se expresan receptores

NR1|NR2B|NR2D (Green and Gibb, 2001; Jones and Gibb, 2005). El resultado con

los receptores tri-heterómeros es una variación en las propiedades biofísicas y

farmacológicas para las distintas combinaciones. Muy poco se ha trabajado con

estos complejos. En 1998 Vicini y colaboradores transfectaron diferentes

combinaciones de cDNAs de las subunidades NR1, NR2A y NR2B y encontraron un

curso temporal de desactivación intermedio a receptores NR1|NR2A y NR1|NR2B.

También, un estudio farmacológico por Paoletti y Hatton (2005) mostró que la

combinación NR1|NR2A|NR2B retiene sensibilidad a concentraciones sub-

micromolar de zinc e ifenprodil, pero solo se alcanza una inhibición del 20%

aproximadamente. De manera similar, canales NR1|NR2A|NR2C (que contienen solo

un sitio de unión para el zinc) son inhibidos por este metal con una alta potencia pero

con baja eficacia. Por lo tanto, debido a la diferente distribución de los subtipos NR2,

aunado a la presencia de ensambles triheteroméricos y la poca selectividad de los

compuestos que actúan sobre el receptor NMDA, se han complicado las estrategias

farmacológicas que tienen a este receptor como blanco terapéutico (Ver tema 2.7).

 

 

38

 

39

2.5 Papel funcional del receptor NMDA en el SNC

Existen varios parámetros que influyen en la funcionalidad del receptor NMDA.

Primero, la composición del receptor en cada de célula, variante que determina el

nivel de actividad y cinética del canal. Segundo, la localización sub-celular, que pude

ser sináptica o extrasináptica. Y por último, la cascada de señalización a la que están

ligadas cada subunidad del receptor, ya que está presente como un complejo

macromolecular de señalización.

Figura 25. Esquema del complejo del receptor NMDA. Las proteínas mostradas en azul son proteínas citoesqueléticas y de ensamble, amarillas (receptores y enzimas de señalización), en verde las encontradas recientemente. Las moléculas que pertenecen a la misma vía están representadas como el mismo elemento (Sheng and Hyoung, 2000).

 

40

2.5.1 Proteínas postsinápticas asociadas al NMDAR

La apertura de los receptores NMDA inicia cascadas de señalización

citoplasmáticas, ocasionando cambios a largo plazo en las neuronas mediante

mecanismos transducidos por estructuras sub-celulares acopladas al receptor. Al

complejo lo conforman proteínas citoesqueléticas, de ensamble y enzimas de

señalización (Ver figura 25), que interactúan con el NMDAR física y funcionalmente

mediante unión directa con el dominio C-terminal del receptor ó indirectamente

mediante otras proteínas ligadas a él (Sheng and Pak, 2000). Las proteínas más

prominentes en las membranas postsinápticas son las proteínas de la densidad

postsináptica de 95kDa (PSD-95) y SAP-102 (Proteína asociada a la sinápsis de

102kDa). Ambas contienen dominios PDZ, SH3 y GK (Ver figura 26C) que son

estructuras encargadas de la interacción entre proteínas. Sus múltiples dominios

permiten unirse simultáneamente al NMDAR y a otras enzimas como la oxido nítrico

sintetasa (NOS) dependiente de calcio (Sheng abd Hyuong, 2000).

2.5.2 Organización del NMDAR en la sinápsis

El receptor NMDA y los receptores AMPA se encuentran organizados en la

densidad postsináptica (PSD) (Ver figura 26A, área gris), ligada con mGluRs tipo I de

la periferia de la zona sináptica. La sinápsis mejor caracterizada son las de la región

CA1 de hipocampo en ratas. Se ha observado que durante el desarrollo abunda la

presencia de la subunidad NR2B, pero en cerebro maduro aumenta la inserción del

subtipo NR2A, predominando los receptores NR1|NR2A y NR1|NR2A|NR2B. La

subunidad NR2 forma su complejo con la proteína PSD-95 mientras que NR2B con

SAP-102. En las espinas dendríticas se ha identificado una zona de endocitsis

extrasináptica, con componentes como clatrinas y dinaminas, proteínas

especializadas en la endocitosis. De tal manera que los receptores NMDA a

internalizar experimentan una difusión lateral regulada por señales de tráfico (Racz et

al, 2004).

 

41

2.5.2.1 Tráfico del NMDAR

La regulación del tráfico del receptor NMDA depende de señales internas

particulares de cada subunidad (Ver figura 26B). La subunidad NR1 presenta dos

dominios para degradación (YKRH y VWRK) y en condiciones basales expresa el

cassette C1 (lugar de una señal de retención en retículo endoplásmico RRR) y C2.

Pero bajo ciertas condiciones aumenta la expresión de una isoforma de “splicing” que

contiene el cassette C2’, que carece de la señal RRR, aumentando la inserción del

receptor NMDA en la membrana (Yang et al, 2007).

NR2A y NR2B difieren en sus dominios para el tráfico. Ambas poseen una

señal de exportación del retículo endoplásmico HLFY y un sitio que reconoce

dominios PDZ para la interacción con las proteínas del complejo macromolecular.

Figura 26. Organización del NMDAR en la sinápsis. A. En sinápsis CA1-Scaffer de hipocampo en rata, NR2A y NR2B se encuentran en la densidad postsinápticas ligadas a mGluR I mediante su complejo macromolecular de señalización: PSD-95 y SAP-102, respectivamente. B. Señales particulares que regulan el tráfico del NMDAR. C. Dominios de comunes de SAP-102 y PSD-95. (Modificada de Lau and Zukin, 2007).

 

42

Pero difieren en sus señales de internalización (LL en NR2A y YEKL en NR2B) y

degradación (YWKL NR2A y YWQF NR2B). La influencia de estas se ve reflejada en

la diferente velocidad de movilización lateral de cada una. 500x10-4μM2/s para la

subunidad NR2B y NR2A 2x10-4μM2/s, relativamente más estable (Groc et al, 2006).

En sinápsis nacientes (sinaptogénesis), el receptor NMDA sale del retículo

endoplásmico al aparato de Golgi ya ensamblado y ligado a su complejo

macromolecular, y se transporta a través de microtúbulos. NR2B es transportada por

una proteína quinasa de la familia de las quinesinas (KIF17) a través de unas

proteínas adaptadoras (LIN2, 7 y 10). Una vez en la dendrita, la inserción de

receptores NR2B en la membrana es mediante SEC8, un componente del complejo

de exocitosis (Ver figura 27). En este sitio también se une PINS al dominio GK de

SAP-102, para ayudarle con la interacción con otras proteínas. El tráfico basal en las

Figura 27. Tráfico del NMDAR en sinapsis CA1- Scaffer nacientes. El receptor NMDA pasa al aparato de Golgi ya ensamblado y unido a su complejo macromolecular. La subunidad NR2B se transporta mediante microtúbulos con ayuda de KIN17 y LIN. Su inserción en la membrana depende de SEC8 (Lau and Zukin, 2007).

 

43

sinápsis naciente tiene un periodo de trasporte de 1-2 una vez formado el contacto.

Pero la fosforilación por PKC y PKA en varias etapas del tráfico del NMDAR

modifican su velocidad. La fosforilación en Aparato de Golgi retarda la liberación,

mientras que en la dendrita promueve la inserción. Y una vez en membrana, la

desfosforilación de NR2B permite la unión de AP2 favoreciéndose la unión de las

clatrinas para la internalización mediada por dinaminas (Lau and Zukin, 2007).

En algunas regiones, la síntesis e inserción de nuevos receptores NMDA es

en gran parte mediante mecanismos locales, es decir, los nuevos receptores no son

sintetizados en el núcleo, ensamblados y transportados a la sinápsis a través de los

axones. En la corteza visual, la síntesis de nuevas subunidades NR2A se llevan a

cabo mediante un complejo de poliribosomas asociados en compartimientos

membranosos (SPRCs) que actúan como un mini aparato de Golgi y retículo

endoplásmico, localizados cerca de las dendritas. Las modificaciones de

glicosilación, fosforilación, ensamble y empaquetamiento en vesículas se lleva cabo

en mismas dendritas, de esta forma las neuronas disponen de un mecanismo eficaz

para responder rápidamente (~1 hora) en procesos de plasticidad (Fox et al, 1999).

Varios factores influyen en el tráfico del NMDAR. Un bloqueo crónico

promueve la internalización y degradación de la subunidad NR2B, haciendo de la

presencia de NRA más prominente. Pero una excesiva activación promueve la

inserción de NR2B. Estos cambios compensan la contribución de cada subunidad

para los procesos de plasticidad sináptica mediados por los receptores NMDA (Lau

and Zukin, 2007).

2.5.3 Plasticidad sináptica

Se le llama a plasticidad sináptica a los mecanismos que modifican la eficacia

de la sinápsis. Manifestándose de varias maneras: mediante una alteración de la

cantidad de neurotransmisor liberado ó cambios en el número, composición y

funcionamiento de los receptores que responderán al neurotransmisor, entre otros.

La plasticidad sináptica se caracteriza porque permanece aun después de haberse

terminado la señal sináptica y se clasifican de acuerdo a su tipo (si aumenta o

 

44

decrece la eficacia de la sinapsis) y su duración. Algunos de ellos: facilitación

(cientos de milisegundos), aumentación (segundos), depresión (segundos),

potenciación post-tetánica (minutos), potenciación (LTP) y depresión a largo plazo

(LTD) (horas ó días). La inducción de cada uno depende del tipo de estimulación

sináptica y su frecuencia (Nicholls et al, 2001).

Cada subtipo de receptor NMDA contribuye de diferente manera en la

inducción de los procesos de plasticidad en sinápsis excitatorias, debido a diferentes

propiedades del receptor, como el umbral de activación, tiempo de desactivación y la

vía de señalización que activan en particular.

2.5.3.1 Plasticidad en sinápsis excitatorias

Dentro de los mecanismos de plasticidad sináptica, los procesos de LTP y

LTD han recibido mayor importancia porque están implicados en el aprendizaje,

memoria y desarrollo neuronal (Malenka and Bear, 2004). En las sinápsis excitatorias

los principales receptores involucrados son los de glutamato, principalmente del tipo

ionotrópico (AMPA, Kainato y NMDA) (Hollmann and Heinemann, 1994), aunque

también hay participación de mGluRs. El papel del NMDAR funciona como un sensor

de estímulos pre- y postsinápticos para la inducción de los procesos LTP y LTD,

(Malenka and Bear, 2004), también favorecen su desarrollo gracias a su alta

contribución en el aumento del calcio intracelular, ya que este ión puede activar una

gran variedad de enzimas. La LTP y LTD es mediada por los receptores NMDA en

muchas regiones del cerebro (amígdala, neuronas DA, mf-CA3, corteza), pero ha

sido más estudiada en el hipocampo porque esta zona es la más importante en los

procesos de aprendizaje y memoria a corto plazo (Kerchner and Nicoll, 2008;

Newpher and Ehlers, 2009).

 

45

2.5.3.2 Control bidireccional de los procesos de LTP y LTD por el NMDAR

Inicialmente, la potenciación a largo plazo (LTP) se presenta con una fase

predominante mediada por los receptores AMPA, seguidos de un componente

relativamente más lento generado por las corrientes postsinápticas excitatorias

mediadas por los receptores NMDA (NMDARs-EPSCs). En comparación con los

receptores AMPA, la inducción de LTP mediada por los receptores NMDA requiere

un umbral de excitación más alto (Aniksztejn and Ben-Ari, 1995).

El glutamato liberado de la terminal presináptica despolariza la membrana

postsináptica por la activación de los receptores AMPA, el voltaje desbloquea al

NMDA por el Mg2+ y generando un flujo de calcio al interior de la célula y activación

de muchas cascadas de señalización intracelulares (Nichols et al, 2001).Se piensa

que la regulación de los procesos de LTP y LTD por los receptores NMDA es

bidireccioal, tomando estos mecanismos como procesos independientes. Esta idea

salió a relucir porque se ha observado que estimulaciones de altas frecuencias

(~100Hz/1s) causa una fuerte activación del NMDAR, permitiendo un gran flujo de

Ca+2 al interior de la célula desencadenando la potenciación. Por el contrario,

estimulaciones a baja frecuencia (5Hz/5-15min) resulta en una moderada activación

de estos canales resultando en una depresión. La respuesta bidireccional radica en

que las estimulaciones de alta y baja frecuencia activan diferentes sub-poblaciones

de receptores NMDA (Hrabetova and Sacktor, 1997). Los receptores NMDA que

contienen las subunidades NR2A y NR2B requieren una despolarización más

pronunciada (-50mV) para lograr desbloquear el poro del canal, mientras que los

NMDAR compuestos por NR2C y NR2D poseen un umbral más bajo (-70mV)

(Monyer et al, 1992). Los mecanismos moleculares de la potenciación y la depresión

están directamente relacionados con estas dos sub-poblaciones de receptores. Las

diferencias en duración y conductancias de aperturas de ambas sub-poblaciones

contribuyen de diferente manera en la regulación del flujo del Ca+2 y por la tanto en la

inducción de LTP y/o LTD (Artola and Singer, 1993; Hansel et al, 1997). La relativa

baja conductancia de NR2D, sumado a su largo tiempo de apertura, puede permitir

 

46

un modesto pero prolongado flujo de calcio el cual es requerido para la inducción de

LTD (Yang et al, 1999).

Los mecanismos por el cual diferentes sub-poblaciones de NMDARs producen

alguna vía de señalización en particular no se han caracterizado completamente.

Pero se ha observado que la señal tiene propiedades espaciotemporales únicas y un

acceso preferente a componentes particulares de cascadas de señalización. Por

ejemplo, NR2C y NR2D poseen un dominio rico en prolina en su C-terminal, y que

en el caso de NR2D, permite la asociación selectiva con dominios homólogos Src de

la quinasa c-ABL. Dividir la función del NMDAR en dos sub-poblaciones diferentes,

para regular la inducción de LTP y LTD independientemente, aumenta la flexibilidad

sináptica (Ishii et al, 1993; Hravetoba et al, 2000).

Las enzimas que pueden ser activadas por el funcionamiento de los

receptores NMDA incluyen: CaMKII (quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina),

calcineurina (proteína fosfatasa 2B), PLA2 (fosfolipasa A2), PLC (fosfolipasa C), PKA

(proteína quinasa A), PKC (proteína quinasa C), NOS (sintetasa de oxido nítrico),

MAPK (proteínas quinasas activadoras del mitógeno) y algunas proteasas,

resultando en un aumento o disminución en la densidad o conductancia de los

receptores NMDA y no-NMDA, entre otros efectos (Kerchner and Nicoll, 2008;

Newpher and Ehlers, 2009).

2.5.3.3 Mantenimiento de LTP por los receptores NMDA

En la potenciación a largo plazo mediada por los receptores NMDA, hay un

flujo de calcio en la neurona postsináptica consecutivo a la activación de los

receptores metabotrópicos de glutamato mGluR tipo 1 y los NMDARs (Kwon and

Castillo, 2008). La magnitud de la señal de calcio puede ser regulada para

mantenimiento de LTP, ya sea por medio de la proteína quinasa C (neuronas DA)

(Harnett et al, 2009) ó mediante la activación de receptores de adenosina A2A

(neuronas mf-CA3) (Ver Figura 28) (Rebola et al, 2008).

 

47

Figura 28. Mecanismos de mantenimiento de LTP mediado por los NMDARs. En sinápsis de neuronas mf-CA3. Estimulaciones de alta frecuencia activa a los receptores NMDA, mGluRs y receptores de adenosina A2A para inducir la LTP. Los receptores mGluR están unidos a la proteína Gq que activa a la fosfolipasa C (PLC) para promover la formación de IP3 (inositol 1, 4,5 trifosfato) y DAG (diacilglicerol). El IP3 provoca liberación de calcio del retículo endoplásmico y en conjunto: el calcio y el DAG activan la proteína quinasa C (PKC). PKC pude activar quinasas de Src, ambas quinasas pueden aumentar la probabilidad de apertura de NMDARs postsinápticos, aumentando la amplitud de la señal de calcio y favorecer la inducción de LTP, además de que modulan la inserción de receptores NMDA en la membrana postsináptica mediante mecanismos dependientes de SNARE. La función de los receptores A2A podría estar participando aumentando el calcio intracelular por la via PLC o potenciando la función de mGluRs (Rebola et al, 2009).

 

48

Las modificaciones a largo plazo de los receptores NMDA durante LTP son a

través de mecanismos que gobiernan su expresión mediante inserción en la

membrana, mediado por proteínas quinasa como PKC, Src y PKA (Grosshans et al,

2002), también por cambios en la composición de las subunidades del receptor

(Peng et al, 2009), por ejemplo, la maduración de los circuitos corticales son

experiencia-dependientes y una privación de sensorial previene muchos de los

cambios que ocurren normalmente en el desarrollo (Crair and Malenka, 1995) como

el incremento de receptores AMPA en la membrana bajo el control de los receptores

NMDA y el aumento en la cinética de desactivación de los receptores NMDA

mediante un aumento de la expresión de la subunidad NR2A en lugar del subtipo

NR2B (Carmignoto and Vicini, 1992). Este último fenómeno ocurre en corteza visual

después de una exposición previa a la luz. La sustitución de NR2B por NR2A reduce

la contribución de las corriente del receptor NMDA en la sinápsis. También se ha

observado la inserción de receptores que presentan la subunidad NR2D después de

LTPs mediadas por NMDARs en giro dentado (Harney et al, 2008), mientras que

otras neuronas (DA) no están asociadas a cambios en las subunidades del NMDAR

(Harnett et al, 2009). En algunos casos (CA1) solo se han observado cambios

rápidos dependientes de actividad en neuronas neonatas más no en adultas (Bellone

and Nicoll, 2007).

 

49

2.5.3.4 Mantenimiento de LTD por el receptor NMDA

En la depresión a largo plazo hay un cambio actividad-dependiente de la

función del receptor NMDA, ocasionando inactivación de los receptores, modulada

por la despolimerización Ca2+-dependiente del citoesqueleto de actina.. En algunas

neuronas (CA3) se ha observado una dependencia de mecanismos de

internalización de NMDARs mediado por dinaminas similar a lo que sucede en los

procesos de LTD de los AMPARs (Montgomery and Madison, 2002) mientras que en

otras células como las del giro dentado no se presenta este tipo de endocitosis

(Morishita et al, 2005). Los receptores metabotrópicos de glutamato del grupo I

(mGluRI) pueden estar asociados en los eventos de internalización en neuronas CA1

aumentando los periodos de depresión (Montgomery et al, 2005). En sinápsis CA1-

Scaffer en el hipocampo la depresión a largo plazo depende de la activación de los

receptores NMDA y también de los mGluR tipo I y 5, resultando en una

internalización mediado por dinaminas de los NMDARs por procesos que incluyen

despolimerización y difusión lateral (Lau and Zukin 2007).

 

50

2.6 Farmacología del Receptor NMDA

Existen varios sitios de acción en donde ciertos fármacos pueden actuar sobre

el receptor NMDA y modular su actividad. Estos son; el sitio de unión al agonista

(ABD), el dominio N-terminal (NTD) y el poro, además de otros sitios aún no

explorados (Ver Figura 29).

2.6.1 Fármacos que actúan en el sitio de unión del agonista (ABD)

El receptor NMDA posee cuatro sitios de unión de agonistas, una en cada

subunidad. Las subunidades NR1 y NR3 poseen el sito para la glicina, mientras que

las subunidades NR2 para el L-glutamato.

2.6.1.1 Sitio de unión de glutamato de la subunidad NR2

Los primeros antagonistas de los NMDARs que actúan en el sitio de unión del

agonista (ABD), fueron derivados de aminoácidos con un grupo ω-fosfórico que

actúan sobre el sitio ABD de las subunidades NR2 (NR2 ABD). Son antagonistas

competitivos. El más usado hasta el momento por su fuerte preferencia por los

receptores NMDA más que por otros tipos de iGluRs (receptores ionotrópicos de

glutamato) es el (R)-2-amino-5-fosfonopentanoato, mejor conocido como AP5 (Kew

and Kemp, 2005). Estos compuestos muestran una pobre selectividad entre los

subtipos NR2 (NR2A>NR2B>NR2>NR2D). La falta de selectividad de estos

compuestos probablemente se debe al alto grado de conservación de la cavidad

donde se une el glutamato en las subunidades NR2 (los 10 residuos de aminoácidos

en NR2A que interactúan directamente con el glutamato, son conservados entre

todas las subunidades NR2 (Furukawa et al, 2005). Los antagonistas (R)-CPP y (R)-

AP7 poseen mayor selectividad (NR2A>>NR2D) que sus homólogos de cadena más

corta PMPA y (R)-AP5 (Ver figura 30), en un orden de selectividad un poco mayor a

10 veces (Ver tabla 3 y 4), respectivamente (Feng et al, 2004). La selectividad de las

moléculas de cadena larga es atribuida a efectos estéricos sobre la cavidad donde se

une el agonista (Feng et al, 2005). Compuestos con anillos aromáticos múltiples

muestran un orden de selectividad diferente: EAB515 y PBPD tienen más afinidad

por las subunidades NR2B y NR2D, LY233536 por NR2B y NR2C, pero sus bajos

 

51

niveles de selectividad limitan su uso. El compuesto PPDA, derivado de PBPD, es

más afín a las subunidades NR2C y NR2D (Feng et al, 2004). La variación de

afinidad de todos estos compuestos que actúan en el sitio NR2 ABD es menor a diez

veces, aunque la selectividad de PBPD fue mejorada un poco por otro compuesto de

estructura similar, el UBP141 que presenta mayor preferencia por la subunidad

NR2B que la NR2D (Buller and Monaghan, 1997).

Figura 29. Sitios con potencial farmacológico del NMDAR. En la región extracelular encontramos a los dominios NTD y ABD. El NR2 ABD une glutamato y el NR1 ABD glicina (ó D-serina). Las flechas blancas indican sitios de unión para agonistas y antagonistas competitivos. Las anaranjadas gruesas sitios de unión de moduladores alostéricos como el zinc endógeno (NTD´s de NR2A y NR2B) o el fármaco ifenprodil (NR2B NTD) ambos actúan como antagonistas no competitivos. El dominio del poro es el sitio de acción para bloqueadores como el Mg2+, MK-801, memantina ó ketamina. Las flechas delgadas anaranjadas muestran sitios de unión para posibles compuestos modulatorios. (Paoletti and Neyton, 2007).

 

52

Figura 30. Principales fármacos que actúan sobre el receptor NMDA. Antagonistas competitivos por el sitio de unión del glutamato (NR2 AB): derivados de aminoácidos con un grupo ω-fosfórico D-(AP5 y D-AP7), PAMPA, CPP (compuestos con un anillo piperazina), SCZ-EAB-515, PBPD, PPDA (compuestos con múltiples anillos aromáticos). Antagonistas competitivos por el sitio de unión de glicina (NR1 ABD): CNQX, DNQX, el acido kinurénico y sus derviados (7-CDK, 5,7-DCKA y [3H] CGP 61594). Bloqueadores del poro: ketamina, dizolcipina (MK-801), PCP (fenilciclidina) y memantina. Moduladores alostéricos negativos que actúan en el sitio N-terminal: ifenprodil y dos de sus derivados (Ro-25-6981 y CP-101,606). (Modificada de Monaghan and Jane, 2009).

 

53

2.6.1.2 Sitio de unión de glicina de la subunidad NR1

Existen antagonistas competitivos por el sitio de unión a glicina (NR1 ABD),

pero de igual manera han mostrado tener poca selectividad, como habría de

esperarse en compuestos con la subunidad NR1 como sitio blanco ya que está

presente en todos los sub-tipos de receptores NMDA. El primero de ellos fue el ácido

Kinurénico (Watson et al, 1988), a partir del cual se han sintetizado nuevo

compuestos (ej. 7-CDK, 5,7-DCKA y CGP 61594) mediante modificaciones

estructurales (Leeson et al, 2003). Los compuestos CNQX y DNQX, antagonistas de

los receptores AMPA, Kainato, que se unen débilmente a los NMDAR, también se

han utilizado como modelos para el diseño de nuevos antagonistas NR1 ABD más

potentes (Honore et al, 1988). Los antagonistas del sitio NR1 ABD han mostrado

tener un mejor radio terapéutico (anticonvulsivantes, neuroprotección, propiedades

analgésicas) y exhiben efectos adversos reducidos en comparación con los

compuestos en comparación con los antagonistas ortostéricos (Leeson and Iversen,

1994).

2.6.2 Fármacos que bloquean el poro del canal

Fisiológicamente, el Mg2+ se encuentra bloqueando el poro del canal cuando el

potencial de membrana está en reposo, este bloqueo es dependiente de voltaje y se

elimina cuando se despolariza la membrana (Ver figura 30) (Mayer et al, 1996). El

bloqueo por magnesio se da porque un residuo de asparagina (N598) en el segmento

M2 produce una constricción en el poro del canal del receptor NMDA, permitiendo el

flujo de calcio pero no de magnesio (Wollmuth and Sobolevsky, 2004), este sitio de

unión del Mg2+ se encuentra en la profundidad del canal y las subunidades más

sensibles a este ión son la NR2A y NR2B en comparación de los subtipos NR2C y

NR2D (Mayer et al, 1996).

Un gran número de compuestos orgánicos inhiben al NMDAR obstruyendo el

poro del canal. Estos compuestos, estructuralmente diversos, son bloqueadores que

requieren una activación previa del receptor. Todos ellos conservan una carga

positiva y actúan de una manera dependiente de voltaje. Normalmente estos

 

54

bloqueadores del poro discriminan muy poco entre los subtipos de receptores NMDA.

Este es el caso para anestésicos disociativos clínicamente utilizados: fenilciclidina

(PCP), tionil-ciclohexil-piperidina (TCP) y ketamina, y para los fármacos memantina

y amantadina. El bloqueador dizolcipina (MK-801) es más potente para bloquear las

subunidades NR2A y NR2B que NR2C y NR2D, pero su diferencia de afinidad es

relativamente pequeña (<10 veces) (Kew and Kemp, 2005). Un patrón de

selectividad similar se ha observado con derivados de poliaminas, como la toxina de

la araña argiotoxina-636 y la N1-dansil-espermina. Interesantemente, estos

bloqueadores muestran una preferencia 50 veces mayor por el par de subunidades

NR2A y NR2B comparado con los subtipos NR2C y NR2D. No se han entendido

completamente las determinantes estructurales que expliquen esta selectividad, pero

se cree que se debe a interacciones hidrofóbicas entre anillos aromáticos del

bloqueador y residuos hidrofóbicos ubicados en el vestíbulo del poro. Por lo tanto,

moléculas con un largo grupo polar podrían ser muy útiles, por lo menos para

diferenciar entre receptores que contengan los subtipos NR2A y NR2B de aquellos

que contengan las subunidades NR2C y NR2D (Raditsch et al, 1993; Chao et al,

1997).

Figura 31. Dependencia de voltaje del bloqueo por Magnesio. La curva corriente-voltaje muestra que concentraciones de magnesio de 1.2mM es suficiente para bloquear el canal del receptor NMDA a potenciales de membrana cercanos al de reposo (-70mM). Conforme el potencial de membrana se despolariza disminuye la afinidad del Mg2+ por su sitio de unión, permitiendo el flujo de los iones. Si se remueve el calcio extracelular (0.0012) el canal permite la corriente a voltajes más negativos. (Nestler et al, 2001).

 

55

Los bloqueadores de alta afinidad como el PCP y MK-801 producen efectos

indeseables como, ataxia y disturbios en el aprendizaje y memoria, por tal motivo se

han restringido su uso en la clínica. La tendencia de estos compuestos para producir

tales efectos adversos se relaciona a su cinética lenta para disociarse del sitio de

unión, permaneciendo por más tiempo dentro del canal (Parson et al, 1999).

2.6.3 Fármacos que actúan en el sitio NTD

Los únicos compuestos orgánicos que han mostrado tener una alta

selectividad entre los subtipos de los NMDARs son el ifenprodil y sus derivados (ej.

Ro 25-6981 y CP-101,606), estas sustancias actúan como antagonistas no

competitivos selectivos de la subunidad NR2B que actúan independientemente del

voltaje. Estos compuestos han mostrado tener un uso terapéutico prometedor en

modelos de dolor neuropático y neuroprotección, por lo que se ha estado trabajado

por identificar nuevos derivados con mayor selectividad y seguridad que el ifenprodil,

porque éste posee un efecto cardiotóxico. El ifenprodil se une al sitio NTD de la

subunidad NR2 (NR2B NTD) ejerciendo una modulación alostérica que aumenta la

inhibición por protones (Pahk and Williams K, 1997; Chenard and Menniti, 1999).

Recientemente se han descrito una diversidad de estructuras antagonistas

selectivas a NR2B con nuevos arreglos estructurales diferentes al ifenprodil

diseñados por varias empresas: que incluye moléculas con anillos indol,

benzimidazol, piridinas, entre otros: como MK-0657 (Ver figura 32, compuesto 1),

Indol- y benzimidazol-2-carboxamidas (compuesto 2), 2-(3,4-dihidro-1H-isoquinolina-

2yl)-piridinas (compuesto 3), benzamidinas (compueto 4), N-(fenilalquil)cinnamidas)

(compuesto 5), N1.(bencil) cinnamamidinas (compuesto 6), 1-benziloxy-4,5-dihidro-

1H-imidazol-2-yl-aminas (compuesto 7), Taisho´s HON0001 (compuesto 8) y di-

imidazoles (compuesto 9). La mayoría de estos compuestos actúan en el orden

nanomolar y aún no se determina si su modo de acción es similar al ifenprodil (Borza

et al, 2007; Suetake-Koga et al, 2006).

 

56

También el Zn2+ modula la función del receptor NMDA uniéndose al sitio NTD,

es un modulador alostérico endógeno, ya que es liberado de las terminales

presinápticas junto con el glutamato, por tal motivo su efecto tiene relevancia

fisiológica (Assaf and Chung, 1984; Smart et al, 2004). Este ión se une solamente a

las subunidades NR2A y NR2B pero con una afinidad mayor a 100 veces por el

subtipo NR2A (Paoletti et al, 1997).

Experimentos recientes en registros de canales unitarios en parches de

membrana de células HEK-293, mostraron que el zinc inhibe a la subunidad NR2A

con IC50 en el rango nanomolar (300nM), reduciendo reversiblemente la duración de

apertura del canal pero no su amplitud de corriente. La asociación del Zn2+ a su sitio

de acción produce efectos similares a cambios de pH (aumento de protones), ya que

Figura 32. Nueva generación de compuestos NR2B selectivos. Varias empresas, como Merck y Roche, entre otras, han patentado una nueva serie de moléculas estructuralmente diferentes al ifenprodil (Mony et al, 2009).

 

57

los canales protonados (Ver tema 2.5.6) se abren con una menor probabilidad de

apertura, sugiriendo que el efecto del zinc es producido aumentando la inhibición por

protones (Ver figura 33), esta interacción fue ajusta a un modelo cinético que predice

la probabilidad de apertura mediante la constante K1, a diferentes concentración de

protones [H+], considerando la ecuación de Hill (1) y la concentración de Zn2+

(Erreger and Traynelis, 2008):

2.6.4 Modulación por poliaminas

Las poliaminas son aminas alifáticas polibásicas que se encuentran cargadas

positivamente a pH fisiológico. En el cerebro existe una gran variedad de poliaminas,

entre ellas: espermina (N,N'-bis(3-aminopropil)-1,4-butanodiamina), espermidina

(N-(3-aminopropil)-1,4-butanodiamina) y putrescina (butano-1,4-diamina). La

mayoría (putrescina, espermina) son sintetizados a partir de la ornitina durante el

ciclo de la urea. Estos compuestos son constituyentes naturales del SNC y existen

en el medio intra- y extracelular a concentraciones considerables para tener

influencia en la neurotransmisión y en el desarrollo neuronal (Shaw and Pateman,

Figura 33. Efecto del zinc. El zinc reduce el estado abierto del canal del receptor NMDA, este efecto depende de las condiciones de pH porque el Zn2+ aumenta la inhibición por protones (Erreger and Traynelis, 2008).

 

58

1973). En neuronas de hipocampo se han observado múltiples efectos por como

potenciación e inhibición poliaminas dependiendo el tipo celular (Benveniste and

Mayer, 1993) por las diferencias en los niveles de expresión de las subunidades NR2

del receptor NMDA.

La liberación de poliaminas de las terminales presinápticas puede modular de

diferente manera la actividad de los receptores NMDA. La espermina aumenta la

afinidad entre la glicina y su sitio de unión (potenciación dependiente de glicina),

mientras que en condiciones saturadas de glicina aumentan la amplitud máxima de la

respuesta de los NMDARs (potenciación independiente de glicina) (McGurk et al,

1990), resultado de la unión de las poliaminas entre lóbulos del dominio amino

terminal favoreciendo el abierto, este efecto estabiliza la interface del dímero ABD

disminuyendo la sensibilidad a protones (Gielen et al, 2008). A potenciales negativos

la espermina también puede producir un bloqueo voltaje-dependiente sobre el

NMDAR. El bloqueo de espermina es similar al producido por iones Mg2+ pero se

puede revertir mediante permeabilidad a potenciales hiperpolarizantes (Benveniste

and Mayer, 1993). Los efectos de las poliaminas dependen de la composición del

receptor NMDA. Los receptores que presentan las isoformas NR1 con el exón 5

carecen de interacción con poliaminas debido a que la secuencia de aminoácidos

que codifica este exón forma un asa superficial con estructura similar a las

poliaminas (Traynelis et al, 1995). Los receptores di-homólogos que presentan la

subunidad NR2A presentan el tipo de potenciación dependiente de glicina y el

bloqueo voltaje dependiente, los receptores con el subtipo NR2C y NR2D no exhiben

ninguno de los efectos de las poliaminas, pero los receptores NR1a|NR2B

(subunidad que abunda durante el desarrollo) si presenta todos los mecanismos de

potenciación e inhibición por poliaminas mencionados (Zhang et al, 1994).

Adicionalmente, hay una interacción alostérica entre la espermina con el ifenprodil, la

unión de uno promueve la disociación del otro (Han et al, 2008).

La espermina que se encuentra en el medio intracelular también modula la

actividad de los receptores NMDA, inhibiendo reversiblemente la actividad del canal

por un mecanismo diferente a la inactivación inducida por calcio y a diferencia del

 

59

efecto inhibitorio de las poliaminas extracelulares, la inhibición intracelular por

espermina no depende de la composición del NMDAR (Turecek et al, 2004).

2.6.5 Modulación por protones (H+).

Los cambios en el pH fisiológico puede modular la actividad de una gran

variedad de canales iónicos incluyendo canales de Ca2+, Na+ y K+ sensibles a voltaje,

canales de K+ rectificadores entrantes, uniones comunicantes, canales de K+

activados por calcio, receptores tipo nicotínicos, GABAA y NMDA, entre otros. Se han

propuesto varios mecanismos de protonación por el cual el pH produce su efecto:

como cambios en la carga de la superficie de la membrana (Hille, 1968), protonación

de carbohidratos (Freeman et al, 2000) y de aminoácidos involucrados en: la unión

del agonista, conducción (Woodhull, 1973) y mecanismos de compuerta mediante

reacomodos estructurales (Schulte and Fakler, 2000).

A pH fisiológico, el receptor NMDA se encuentra inhibido un 50%, el aumento

extracelular del pH incrementa la respuesta del NMDAR mientras que una

disminución disminuye la probabilidad de apertura (Johnson, 2003). La sensibilidad a

protones es influenciada por la presencia de las subunidades NR1 y NR2, incluso

algunos moduladores del NMDAR como el Zn2+ (Erreger and Traynelis, 2008),

ifenprodil y poliaminas actúan, en cierto grado, afectando la modulación por protones

(H+) (Johnson, 2003).

El dominio amino terminal de la subunidad NR1 fue el primer sitio acción del

pH considerado (Ver figura 3), también el dominio NTD de las subunidades NR2A y

NR2B influye en la sensibilidad a protones. Los aminoácidos del dominio NTD NR1

que más afectan la sensibilidad al pH están acomodados en una estructura primaria,

separados entre ellos por decenas de aminoácidos y son parte de la sección que une

los dos lóbulos de este dominio encargados de la apertura y cierre del canal (Low et

al, 2003).

Además del dominio NTD existen dos series de aminoácidos que contribuyen

más en la sensibilidad al pH del receptor NMDA, son las dos secciones que unen el

dominio S2 con los segmentos transmembranales M3 y M4 (dominios M3-S2 y M4-

S2) (Ver figura 3). El dominio S2 constituye el asa extracelular más larga que separa

 

60

los dos dominios transmembranales M3 y M4, y junto con el dominio S1 forman el

sitio de unión del agonista de cada subunidad del NMDAR, mientras que los

aminoácidos del dominio M3-S2 y M4-S2 traducen la señal de compuerta del canal

cuando se une el agonista (Qian and Johnson, 2002). El dominio S2 contiene un

residuo δ2 D-serina en el sitio δ2 (Naur et al, 2007). La mutación de este residuo en

δ2, mGluR1, mGluR6 ó NR1 resulta en una activación constitutiva (sin presencia de

agonista) ó en un aumento en la afinidad por el agonista, dando evidencia de la

participación del dominio S2 en el mecanismo de compuerta del canal (Vogel et al.

2006). Pero no se sabe exactamente la manera en que el grupo de aminoácidos en

M3-S2 y M4-S2 cooperan entre sí ó con S2 para modular la presencia de protones

como una sola entidad.

2.6.6 Posibles sitios moduladores del NMDAR

Hipotéticamente, existen más sitios donde pueden actuar ligandos

extracelulares para modular la actividad del receptor NMDA: a un lado del sitio NR1

NTD (Figura 29, sitio 2) y la interfase del dímero ABD provee otro sitio para nuevos

moduladores alostéricos (Figura 29, sitio 3). En los receptores AMPA, este último

sitio une a moduladores alostéricos positivos que actúan por mecanismos diferentes

como la ciclotiazida, que reduce la desensibilización de los AMPAR y el aniracetam

que enlentece la desactivación del canal estabilizando la interfase ABD favoreciendo

la conformación del estado abierto. De tal manera, dada la fuerte conservación en la

arquitectura del dímero ABD entre los NMDARs y AMPARs, es tentado a especular

que también es un blanco para estos fármacos moduladores. Pero debido a que los

NMDAR presentan poca desensibilización, para identificar moduladores de la

interface del dímero ABD es requerido un protocolo de escaneo buscando posibles

cambios en la cinética de desactivación. Otro sitio candidato es la región que une los

dominios ABD en el segmento transmembranal (Figura 28, sitio 4). En receptores

AMPA, esta zona forma el sitio de interacción de antagonistas no competitivos de la

familia GYKI. Aun no se ha explorado si esta región homóloga en NMDAR pueda unir

también antagonistas (Paoletti and Neyton, 2007).

 

61

Tabla 3. IC50 de los principales compuestos moduladores del NMDAR

Compuesto Subtipo NMDAR

NR1a|NR2A NR1a|NR2B NR1a|NR2C NR1a|NR2D

(R)-AP5

(R)-AP7

PMPA

(R)-CPP

PPDA

7-CKA

5, 7-DCKA

0.3 0.5 1.6 3.7

IC50 (μM)

0.5 4.0 6.0 17

0.8 2.7 3.5 4.2

0.04 0.3 0.6 2.0

0.6 0.3 0.1 0.1

0.6 0.2 0.1 0.6

0.03 0.05 0.2 0.09

Mg2+

PCP

Ketamina

Memantina

MK-801

Argiotoxina-636

N-dansil-spermina

20 20 80 80

IC50 (μM)

a -60 ó -70mV

0.1 0.1 0.2 0.2

0.7 0.5 0.5 0.7

0.9 0.8 ND 0.5

0.01 0.01 0.1 0.1

0.009 0.005 0.46 ND

0.3 0.3 16 13

Zn2+

Ifenprodil

Ro 25-6981

CP 101,606

0.02 2.0 20 10

IC50 (μM)

>30 0.15 >30 >30

>30 0.009 ND ND

>30 0.04 >30 >30

IC50 = inhibición del 50% de la corriente en receptores expresados en ovocitos de Xenopus ó en células HEK-293.ND = No determinado. (Modificada de Paoletti and Neyton, 2007)

 

62

Tabla 4. Selectividad de los compuestos moduladores de los NMDARs

Agente Sitio de Unión Selectividad NR2 Orden de

Selectividad

(R)-AP5 NR2 ABD 2A≈2B>2C≈2D

≤ 10 veces (R)-AP7 NR2 ABD 2A>2B≈2C>2D

PMPA NR2 ABD 2A>2B≈2C≈2D

(R)-CPP NR2 ABD 2A>2B≈2C>2D

PPDA NR2 ABD 2C≈2D>2A≈2B > 10 veces

7-CKA NR1 ABD 2C≈2B>2A≈2D ≤ 10 veces

5, 7-DCKA NR1 ABD 2C≈2B≈2A>2D

Mg2+ Poro 2A≈2B>2C≈2D

≤ 10 veces

PCP Poro 2A≈2B≈2C≈2D

Ketamina Poro 2A≈2B≈2C≈2D

Memantina Poro 2A≈2B≈2D

MK-801 Poro 2A≈2B>2C≈2D

Argiotoxina-636 Poro 2A≈2B>>2C≈2D ~50 veces

N-dansil-spermina Poro 2A≈2B>>2C≈2D

Zn2+ NR2A NTD 2A>>2B>2C≈2D >100 veces

Ifenprodil NR2B NTD 2B>>2A≈2C≈2D

Ro 25-6981 NR2B NTD 2B>>2A≈2C≈2D >3000 veces

CP 101,606 NR2B NTD 2B>>2A≈2C≈2D >700 veces

Abreviaturas: (R)-AP5, (R)-2-amino-5-fosfonoheptanoato; (R)-AP7, (R)-2-amino-7-fosfonoheptanoato; PAMPA, ácido (RS)-4-(fosfonometil)-piperazina-2-carboxílico; (R)-CPP, acido (R)-4-(3-fosfonopropil) piperazina-2-carboxylico; PPDA, ácido (2R,3S)-1-(fenantrenil-2-carbonil)piperazina-2,3-dicarboxílico; 7-CKA, ácido 7-cloroquinurénico; 5,7-DCKA, ácido 5,7-dicloroquinurénico; ácido 7-cloroquinurénico; CNQX, 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona; DNQX, 6,7-Dinitroquinoxalina-2,3-diona; PCP, fenilciclidina; MK-801, dizolcipina; Ro 25-6981, hidrocloruro de (aR,bS)-a-(hidroxifenil)-b-metil-4-(fenilmetil)-1-piperidinpropanol (Modificada de Paoletti and Neyton, 2007).

 

63

2.7 Uso clínico de moduladores del NMDAR

Un número considerable de padecimientos neurodegenerativos han mostrado

alteraciones en la actividad y/o composición del receptor NMDA. Dentro de los

mecanismos observados incluyen activación excesiva, sobreexpresión, hipofunción,

entre otros. La mayoría de estrategias terapéuticas utilizadas (antagonistas no

competitivos y bloqueadores del poro) hasta el momento no han completado las

fases clínicas por falta de selectividad y seguridad, por lo que continua el estudio con

moléculas más selectivas (principalmente de NR2B). Hoy en día una serie de

compuestos recién identificados selectivos de NR2B, pero de estructura diferente al

ifenprodil, se han sumado al estudio para tratamientos clínicos de padecimientos

como: dolor neuropático, Parkinson, Huntington y depresión mayor. También se ha

puesto interés en la búsqueda y utilización de moduladores alostéricos positivos para

tratamientos de otro tipo de padecimientos como la esquizofrenia.

2.7.1 Compuestos no selectivos

2.7.1.1 Antagonistas competitivos

Los antagonistas competitivos, aquellos que actúan en el sitio ABD, carecen

de selectividad para discriminar entre los subtipos NR2, provocando una inhibición

generalizada y con ello efectos adversos que alteran el comportamiento, sistema

cardiovascular y además poseen actividad citotóxica, por tal motivo no han

funcionado para usos clínicos (Kohr, 2007).

2.7.1.2 Bloqueadores del poro

Algunos bloqueadores del poro también han mostrado dependencia al pH,

aumentando su afinidad por su sitio de unión dentro del poro, pero carecen de buena

selectividad. La memantina fue aprobada en el 2006 para el tratamiento de Alzheimer

para casos severos y moderados gracias a su baja afinidad y cinética rápida de

disociación (Johnson and Kotermanski, 2006;), caso contrario con la ketamina, ésta

permanece atrapada dentro del poro aún cuando se disocia el agonista del receptor.

Este grupo de compuestos podrían ser clínicamente prometedores como

 

64

neuroprotectores si se desarrollaran derivados que presenten mayor selectividad,

conservasen su dependencia al pH y una cinética rápida de desbloqueo, así se

podría actuar sobre la actividad del receptor sin interferir con la transmisión sináptica

normal (Dravid et al, 2007).

2.7.2 Antagonistas selectivos de la subunidad NR2B

Hasta el momento, los compuestos más prometedores son el ifenprodil, sus

derivados y los nuevos antagonistas selectivos de la subunidad NR2B. Son

antagonistas no competitivos que exhiben un grado mayor de selectividad por la

subunidad NR2B, además de ser más eficientes en altos niveles de glutamato y pH

bajo, condiciones que se presentan en ciertas alteraciones del cerebro. Pero casi

ninguno de estos compuestos ha completado las fases clínicas por falta de

seguridad, a pesar de ser efectivos en animales (Paoletii and Neyton, 2007).

Padecimientos como dolor crónico, enfermedad de Huntington, Alzheimer, isquemia

cerebral y depresión mayor son blancos de estudio para el desarrollo de nuevas

terapias basadas en el antagonismo selectivo de los receptores del tipo NMDA, en

especial aquellos que presentan la expresión de la subunidad NR2B.

2.7.3 Dolor

La subunidad NR2B fue relacionada con el dolor crónico debido a la

distribución que presenta este subtipo, expresándose tanto en el hasta dorsal de la

médula espinal, como en algunos centros del SNC como el tálamo y la corteza

cingulada anterior, que están involucradas en la percepción del dolor. Además de

haber varios estudios que revelan la eficacia del ifenprodil y sus derivados en

modelos de dolor agudo, neuropático y visceral (Boyce et al, 1999). Los

compuestos: ketamina y dextrometorfano, han mostrado actividad terapéutica eficaz

en contra del dolor neuropático, pero sus efectos adversos son generalizados debido

a su amplio espectro de acción sobre el NMDAR (Chizh, 2007). Pero el potencial de

los antagonistas de la subunidad NR2B ha ganado mayor precedencia clínica en el

tratamiento del dolor por la eficacia observada por CP-101,606 en un estudio clínico

fase 2 en pacientes con trauma en médula espinal, aunque aún exhibe algunos

 

65

efectos adversos centrales y cardiotóxicos (acción sobre hERG) y carece de

biodisponibilidad oral (Sang et al, 2003). A pesar de las complicaciones, las

empresas Gedeon Richter, Forest Laboratories, Merck y Evotec tienen identificados

nuevos compuestos que han mostrados mejores resultados de seguridad y

disponibilidad en los ensayos clínicos fase 2 (Mony et al, 2009).

2.7.4 Huntington

La enfermedad de Huntington es un padecimiento autosomal dominante,

caracterizada por alteraciones cognoscitivas, psiquiátricas y motoras de progresión

lenta. Ocasionada por la mutación de un gene hereditario llamado Huntington, cuya

proteína presenta una secuencia de poliglutamatos. Esta enfermedad se manifiesta

por pérdida de neuronas GABAérgicas (spiny medianas) en el cuerpo estriatado. La

neurodegeneración en esta zona se debe se da por desregulación de los receptores

NMDA ligado a un aumento en la expresión de la subunidad NR2B (Li et al, 2003).

Por lo tanto, una intervención en las fases tempranas de esta enfermedad, con

antagonistas selectivos de la subunidad NR2B, podría ofrecer un potencial

terapéutico para este desorden.

2.7.5 Parkinson

Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra par compacta tienen sus

axones proyectados directamente al neoestriado. Ambas regiones mantienen

conexión indirecta con la porción motora de la corteza cerebral. Así este sistema

modulatorio de la SNc facilita de alguna manera el inicio del movimiento voluntario

(Boron y Boulpaep, 2003). Una pérdida en el número de neuronas dopaminérgicas

de la sustancia nigra provoca una deficiencia de dopamina estriatal ocasionando el

padecimiento crónico-progresivo conocido como enfermedad de Parkinson, en el

cual hay una pérdida del control del movimiento voluntario. La degeneración de las

neuronas dopaminérgicas en sustancia nigra y la subsecuente depleción de

dopamina en la vía nigro-estriatal resulta en una sobre activación de las

proyecciones glutamatérgicas sobre los núcleos del estriado y ganglio basal (Brazis

et al, 2001). Ha sido propuesto que los NMDARs desarrollan un papel importante en

 

66

el desarrollo de discinesia inducida por levodopa y algunos antagonistas no

selectivos muestran actividad antiparkinsoniana ó antidiscinésica en modelos con

roedores y monos, pero solo la amantadina, antagonista de baja afinidad por los

NMDARs, ha exhibido actividad antidiscinésica en humanos (Del Dotto et al, 2001).

Los antagonistas selectivos de la subunidad NR2B han mostrado mayor eficacia en

modelos preclínicos que los antagonistas de amplio espectro (Wessell et al, 2004).

Pero mientras que el ifenprodil ha fallado en las fases clínicas en terapias junto con

L-dopa, su derivado CP-101,606 dio mejores resultados antidiscinésicos, pero se

requieren dosis asociadas con disociación de la personalidad y amnesia (Nutt et al,

2008). Adicionalmente, el nuevo compuesto MK-0657 adjunto con L-dopa ha

completado recientemente sus estudios clínicos fase 1 pero la empresa Merck no ha

mostrado completamente sus datos aún (Mony et al, 2009).

2.7.6 Depresión mayor

La depresión mayor se manifiesta por trastornos en el estado del ánimo.

Estudios clínicos revelaron efectos antidepresivos de la ketamina que perduran

varios días con una sola administración, pero su aplicación es limitada debido a los

efectos adversos generalizados que ostenta (Zarate et al, 2006). Los antagonistas

selectivos de NR2B también actúan como antidepresivos en estudios preclínicos, se

ha visto que el compuesto CP-101,606 es bien tolerado por lo que el MK-0657 ha

sido sometido a investigación (Preskorn et al, 2008).

2.7.7 Esquizofrenia

Mucha evidencia ha indicado que una modificación de las funciones del

receptor NMDA, reducida o alterada, puede ser la llave característica en el mayor

desorden cognitivo humano, la esquizofrenia (Mohn et al, 1999). Bloqueadores no

selectivos, como el PCP o la ketamina interrumpen la formación de memoria y

causan un síndrome similar a esquizofrenia en humanos, recapitulando síntomas

positivos y negativos y de desorden cognitivo (Tsai and Coile, 2002). Este

decremento en la función del receptor NMDA se puede deber a una sobreexpresión

de la subunidad NR3A, ya que se ha observado que receptores NMDA que contienen

 

67

esta subunidad (NR1|NR2|NR3A) exhiben una reducción de su actividad similar al

inducido por el efecto del PCP y la ketamina, además la permeabilidad al calcio

disminuye significativamente con el subtipo NR3A. Una hipofunción del NMDA

distorsionaría los mecanismos de señalización dependientes de calcio, tal como se

ha observado en esquizofrenia (Lidow M, 2003).

La relación de la esquizofrenia con la hipofunción es aceptada hoy en día por

evidencias neurofisiológicas y bioquímicas (Woo et al, 2008). Estos resultados

indican, que aumentar la actividad de los NMDAR puede ser benéfico para el

tratamiento de desordenes cognitivos. Sabemos que una activación directa de los

receptores por el sitio del glutamato, puede generar excitotoxicidad, pero

aumentando la actividad del sitio del co-agonista glicina es una buena posibilidad y

ha tenido beneficios clínicos (Javitt, 2008).

Otra alternativa prometedora podría residir en el desarrollo de moléculas

capaces de aumentar la actividad del NMDAR a través de sus sitios moduladores

(Potenciadores NMDA ó moduladores alostéricos positivos). Hay dos mecanismos

potenciales a través de los cuales la actividad de los NMDAR puede ser potenciada:

primero, previniendo el cierre del dominido NR2 NTD con compuestos que desplacen

al ligando endógeno Zn+2 y mantener la hendidura del dominio NTD en la

conformación abierta. Segundo, estabilizando el estado abierto del canal

(enlenteciendo la desactivación) ó bloqueando la entrada al estado desensibilizado

con componentes que se unan a la interface del dímero ABD, dando varias

oportunidades para potenciar la actividad del NMDAR y saber si es viable como

blanco para el desarrollo de nuevos tratamientos antipsicóticos (Paoletti and Neyton,

2007).

 

68

 

69

III. CONCLUSIONES

El estudio del receptor NMDA es importante por su gran participación en

muchos procesos sinápticos: fisiológicos y neurodegenerativos, que se llevan a cabo

en el sistema nerviosos central. Estos procesos involucran la excitabilidad general,

plasticidad sináptica y neurodegeneración por excitotoxicidad.

El papel principal de los NMDARs en el cerebro es la inducción y desarrollo de

la potenciación y depresión a largo plazo, se cree que estaos dos mecanismos son

controlados bidireccionalmente, manejándolas como dos procesos con vías

independientes.

Estos mecanismos se llevan a cabo gracias a que este receptor posee un canal

iónico que conduce cationes con alta permeabilidad al Ca2+ y a sus diferentes sub-

poblaciones de receptores, principalmente aquellos que presentan subunidades de la

familia NR2 (A-D), las cuales han mostrado un particulares acceso a proteínas y

enzimas intracelulares, capaces de modular segundos mensajeros involucrados en la

señalización y que pueden influir en la magnitud de la señal de calcio generada,

tráfico y expresión de genes. Pero las bases moleculares mediante el cual el NMDAR

lleva a cabo estas funciones aún no se han identificado completamente.

Existe una gran variedad de subtipos de receptores NMDA derivados de

combinaciones di-homólogas y tri-heterólogas de sus subunidades, distribuidas en el

sistema nervioso central con diferentes patrones espacio-temporales no muy bien

entendidos y con propiedades biofísicas (conductancias, constantes de desactivación

y desensibilización) que también varían dependiendo de las subunidades que lo

ensamblen, tampoco han sido caracterizadas en su totalidad a pesar de influir

significativamente en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias.

Además no se han identificado compuestos completamente selectivos para

discriminar y modular las diferentes subunidades que lo componen, complicando las

estrategias terapéuticas y de manipulación para el estudio del NMDAR.

 

70

Por lo tanto, es necesario continuar investigando al NMDAR para conocer los

mecanismos que gobiernan su participación en el cerebro, encontrar nuevos

compuestos capaces de modularlo e identificar proteínas claves de su

funcionamiento, de esta manera, contar con nuevas estrategias con potencial

farmacológico para la intervención de padecimientos neurodegenerativos que

involucran la desregulación del receptor NMDA.

 

71

IV. PERSPECTIVAS

Conocer la manera en que los diferentes subtipos de receptores NMDA

contribuyen en los procesos de excitotoxicidad y plasticidad sináptica en el sistema

nervioso central sería de gran ayuda para poder entender los mecanismos

involucrados en aprendizaje, memoria, adquisición de experiencia, supervivencia

neuronal y neurodegeneración. Nosotros nos hemos interesado en los subtipos NR2

porque son los que le confieren al receptor mayor variedad farmacológica y funcional

y también se encuentran involucradas en procesos fisiopatológicos.

En nuestro laboratorio contamos con los cDNAs de los subtipos NR1 y NR2,

también el equipo de perfusión rápida necesario para reproducir los tiempos de

activación-desactivación (ver figura 29), entre otros protocolos. Nosotros pretendemos

contribuir en la caracterización de las propiedades biofísicas del canal del NMDAR en

células HEK-293 y en neuronas, así como la modulación y mecanismos que algunos

compuestos ejercen sobre su actividad.

Adicionalmente, el receptor NMDA cuenta con diversos sitios que poseen

potencial farmacológico aun no explorados, como la interfase del dímero ABD (sitio 3,

ver figura 29), el cual es análogo en receptores AMPA, en los cuales los fármacos

ciclotiazida y aniracetam actúan como moduladores alostéricos de tipo positivo y es

posible que para el caso de los receptores NMDA pudieran conservar la actividad y

servir para probarse en modelos de esquizofrenia. Por lo tanto, podríamos aprovechar

el equipo de perfusión rápida para probar la actividad de fármacos de este tipo en el

NMDAR mediante protocolos de estimulación usando receptores con las subunidades

NR2 (A-D).

 

72

 

73

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