ÍNDICE DE CONTENIDOS

1.1. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.1. Antecedentes generales.............................................................................................1 1.2. Antecedentes bibliográficos ......................................................................................2 1.2.1. La vida en ambientes extremos...............................................................................................................2 1.2.2. Enzimas activas a bajas temperaturas ....................................................................................................2 1.2.3. Aplicaciones biotecnológicas de enzimas activas a bajas temperaturas ..............................................3 1.2.4. Enzimas Proteolíticas; proteasas.............................................................................................................4 1.2.4.1. Serina proteasas .......................................................................................................................................5 1.2.5. Aplicaciones industriales de las proteasas .............................................................................................6 1.2.5.1. Industria de alimentos .............................................................................................................................7 1.2.5.2. Industria del cuero ...................................................................................................................................7 1.2.5.3. Usos médicos ...........................................................................................................................................8 1.2.5.4. Industria del detergente ...........................................................................................................................8 1.2.6. Producción de proteínas recombinantes .................................................................................................9 1.2.6.1. Expresión recombinante de proteínas criofílicas ................................................................................ 10 1.3. Descripción del proyecto y justificación..................................................................11 1.4. Objetivos ................................................................................................................12 1.4.1. Objetivo General................................................................................................................................... 12 1.4.2. Objetivos específicos............................................................................................................................ 12

2.2. METODOLOGIAMETODOLOGIA .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 1313

2.1. Materiales...............................................................................................................13 2.1.1. Cepas bacterianas ................................................................................................................................. 13 2.1.2. Reactivos ............................................................................................................................................... 13 2.1.3. Enzimas de restricción.......................................................................................................................... 14 2.2. Métodos..................................................................................................................15 2.2.1. Búsqueda de la secuencia 5’ del gen t7 mediante la técnica de Genome Walking ........................... 15 2.2.1.1. Diseño de partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia 5’ del gen t7 ....................... 15 2.2.1.2. Digestión del DNA genómico y elongación ....................................................................................... 16 2.2.1.3. Construcción del oligo-adaptador........................................................................................................ 16 2.2.1.4. Construcción de la genoteca-adaptador............................................................................................... 16 2.2.1.5. Amplificación del extremo 5’ del gen t7............................................................................................. 17 2.2.1.6. Secuenciación y análisis del extremos 5’ del gen t7 .......................................................................... 17 2.2.2. Diseño de partidores para el clonamiento del gen t7 en los vectores de expresión.......................... 18 2.2.3. Amplificación de DNA mediante PCR ............................................................................................... 19 2.2.4. Purificación de fragmentos amplificados de DNA desde geles de agarosa...................................... 19 2.2.5. Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy ........................................................................ 20 2.2.6. Transformación de células electrocompetentes DH5α ...................................................................... 20 2.2.7. Digestión de DNA plasmidial y linearización de los vectores de expresión .................................... 20 2.2.8. Ligación de los insertos en los vectores de expresión........................................................................ 21 2.2.9. Clonamiento de los constructos en células DH5α.............................................................................. 21

2.2.10. Clonamiento de los plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3) y TB1................ 22 2.2.11. Pruebas de actividad proteasa extracelular ......................................................................................... 22 2.2.12. Expresión recombinante de la proteasa T7 en E. coli ........................................................................ 23 2.2.13. Purificación de la proteína recombinante T7 ...................................................................................... 23 2.2.14. Electroforesis de proteínas SDS-PAGE .............................................................................................. 24 2.2.15. Zimograma de proteasas ...................................................................................................................... 25 2.2.16. Ensayo de actividad en medio líquido con sustrato específico S-AAPF-pNa .................................. 25 2.2.17. Ensayo de actividad en medio líquido con sustrato específico TNBSA ........................................... 25

3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2727

3.1. Expresión de la proteasa T4 ....................................................................................27 3.2. Búsqueda de la secuencia 5’ del gen t7 mediante el método Genome Walking.........30 3.2.1. Diseño de partidores para la obtención de la secuencia 5’ del gen t7 ............................................... 30 3.2.2. Digestión de DNA genómico de la cepa p9/2-10 ............................................................................... 31 3.2.3. Construcción del oligo-adaptador y de la genoteca-adaptador .......................................................... 32 3.2.4. Amplificación del extremo 5’ del gen que codifica para la proteasa T7 .......................................... 33 3.3. Análisis de la secuencia aminoacídica de la proteasa T7 .........................................37 3.4. Construcción de plasmidios recombinantes con el gen t7 ........................................38 3.4.1. Diseño de partidores para el clonamiento del gen t7 en los vectores de expresión.......................... 40 3.4.2. Clonamiento del gen t7 en los plasmidios pET22b(+), pMALc2E y pMALp2E............................. 41 3.4.3. Clonamiento de plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3) y TB1. .................... 45 3.5. Pruebas de actividad proteasa extracelular ..............................................................46 3.6. Producción de la proteasa recombinante T7 en E. coli.............................................47

4.4. CONCLUSIONESCONCLUSIONES .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 5050

5.5. BIBLIOGRAFÍABIBLIOGRAFÍA .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 5151

6.6. ANEXOSANEXOS .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5555

A. Electroforesis de DNA en geles de agarosa ........................................................................................................ 55 B. Purificación de DNA a partir de geles de agarosa .............................................................................................. 55 C. Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy ........................................................................................ 55 D. Transformación de células electrocompetentes .................................................................................................. 56 E. Minipreparación de DNA plasmidial................................................................................................................... 56 F. Amplificación de DNA mediante PCR con Elongasa® ..................................................................................... 56 G. PCR de Colonias ................................................................................................................................................... 57 H. Agar Luria Bertani (100mL) ................................................................................................................................ 57 I. Medio Luria Bertani (100mL) ............................................................................................................................... 57 J. TB (1000 ml) ...................................................................................................................................................... 57 K. Kphosphate (1000 ml) .......................................................................................................................................... 58 L. IPTG 0,1 M ...................................................................................................................................................... 58 M. XGal 50 mg/mL ................................................................................................................................................... 58 N. Carbenicilina 100 mg/mL..................................................................................................................................... 58 O. Tampón Binding 10X (1000 ml).......................................................................................................................... 59 P. Tampón de lavado 1X (250 ml)............................................................................................................................ 59

Q. Tampón de elución 1X (100 ml).......................................................................................................................... 59

INDICE DE TABLAS

Tabla 1: Reactivos utilizados durante el trabajo de tesis.................................................................................14

Tabla 2. Enzimas de restricción utilizadas durante el trabajo de tesis............................................................14

Tabla 3: Partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia 5’ del gen t7. ......................................31

Tabla 4: Partidores utilizados para el clonamiento del gen codificante para proteasa. .................................41

INDICE DE FIGURAS

Figura 1: Mecanismo general de acción de las serina proteasas.......................................................................6

Figura 2: Región de clonamiento del vector de expresión pET22b(+)...........................................................18

Figura 3: Mapa de restricción del vector de expresión pMAL. ......................................................................19

Figura 4: Esquema con las regiones funcionales de T4 y T7 ..........................................................................27

Figura 5: Análisis electroforético de la expresión de la proteasa T4 en.........................................................28

Figura 6: Partidores para la amplificación de la secuencia 5’ del gen t7. ......................................................30

Figura 7: Digestión de DNA genómico de la cepa p9/2-10. ...........................................................................32

Figura 8: Adapt-total..........................................................................................................................................32

Figura 9: Diagrama de técnica de “genome walking” empleada para la obtención de la secuencia 5’ del

gen t7...................................................................................................................................................................34

Figura 10: Análisis electroforético de los productos de PCR para la obtención del extremo 5’ de t7

utilizando la técnica de genome walking. .........................................................................................................35

Figura 11: Secuencia aminoacídica de la proteasa T7.....................................................................................38

Figura 12: Vectores de clonamiento y expresión.............................................................................................39

Figura 13: Introducción de sitios de restricción en los extremos del gen t7. .................................................42

Figura 14: PCR de colonias...............................................................................................................................43

Figura 15: Electroforesis de digestiones de DNA plasmidial con distintas concentraciones de DNA y

linearización de vectores de expresión. ............................................................................................................44

Figura 16: Digestión de plasmidios recombinantes. ........................................................................................45

Figura 17: Identificación de clones activos en los sobrenadantes mediante zimograma. .............................48

Figura 18: Ensayo de actividad proteolítica in situ para la proteasa T7.........................................................49

LISTA DE ABREVIATURAS 1Kpb Marcador de peso molecular 1Kbp Amp Ampicilina DNA Ácido desoxirribonucleico dNTPs Deoxiribonucleótidos trifosfato DO Densidad óptica E. coli Escherichia coli EDTA Etilendiaminotetraacetato ácido g Fuerza de gravedad gr Gramo gen t7 Gen codificante para la proteína tipo subtilisina T7 h Hora IPTG Isopropil tio-β-D-galactósido

kDa Kilodalton LB Medio Luria-Bertani M Molar MBP Proteína de unión a Maltosa min Minutos mL Mililitros mM Milimolar ORF Marco de lectura abierto PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida. pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa pH Potencial hidrógeno Proteasa T7 Proteína tipo subtilisina T7 rpm Revoluciones por minuto s Segundos SDS Dodecil sulfato de sodio TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina Tris Tris-(hidroximetil)-aminoetano U Unidad enzimática µF Microfaradios

UV Radiación ultravioleta V Voltio X-GAL 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

1

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Antecedentes generales

Las principales áreas industriales que tradicionalmente han utilizado enzimas en sus

procesos o productos finales son: las empresas de alimentos (alimentos para animales, producción de cervezas, procesamiento de carnes, panadería, quesos, etc.), empresas textiles, empresas de cuero y de detergentes [1].

En general, las nuevas industrias han incorporado el uso de enzimas dentro de sus procesos

de producción, puesto que éstas les permiten obtener una mayor eficiencia en el proceso debido a la reducción del consumo de agua, de la emisión de compuestos tóxicos y al ahorro de energía. Esto implica una disminución de costos y del impacto ambiental [2, 3], además de un aumento en la rentabilidad. Las enzimas también se utilizan como componentes de nuevos productos. Por esta misma razón, el mercado para la venta de enzimas con aplicaciones industriales y el desarrollo e investigación de nuevas enzimas, ha crecido enormemente en los últimos años.

Una importante aplicación corresponde al uso de enzimas en detergentes, las cuales

remueven selectivamente manchas de la ropa de diversos orígenes, reemplazando a los compuestos sintéticos. Sin embargo las enzimas mesófilas utilizadas tienen temperatura óptima de catálisis de alrededor de los 60 °C, implicando que esta aplicación requiere de altas temperaturas de lavado para lograr una limpieza óptima [4].

Entre las enzimas manejadas, se encuentran las proteasas, que catalizan la degradación de

compuestos de origen proteico, tales como sangre, huevo, cacao o leche. Un tipo de proteasas importante en este ámbito son las subtilisinas, que pertenecen a la familia de las serina proteasas.

Teniendo una vasta variedad de nichos y posibles nuevos biocatalizadores, para poder

resolver las necesidades específicas del proceso industrial o aplicación, se debe definir el lugar de la naturaleza donde buscar las nuevas enzimas. Obviamente, el nicho específico está determinado por las condiciones definidas por la aplicación industrial. Para el caso de las proteasas activas a baja temperatura con aplicación en detergentes, un buen nicho de búsqueda son los microorganismos encontrados en mares de la Antártica, donde además las condiciones ambientales obligarían a obtener proteasas eficientes a baja temperatura tolerantes a las altas concentraciones salinas [5].

2

Con el objetivo de optimizar el proceso de lavado, se ha invertido en proyectos de

investigación en ingeniería genética, para el desarrollo de nuevos detergentes que permitan el lavado eficiente a bajas temperaturas, con el consecuente ahorro energético que esto implica.

Para purificar y estudiar proteínas, se requiere aislar células u organismos productores.

Estos pueden ser extraídos directamente desde su hábitat o cosechados a partir de cultivos artificiales generados por el hombre, para luego ser procesados y transformados en un producto comercial. Actualmente se está estudiando el comportamiento, función y actividad de proteínas extraídas de microorganismos extremófilos, para posibles usos en productos que resulten ser más eficientes.

Hoy en día, la expresión recombinante representa un paso esencial en la producción de

enzimas industriales. Mediante este método es posible producir enzimas de microorganismos de forma eficiente en bioreactores, de manera que el espectro de posibles biocatalizadores para la utilización en la industria se amplía gracias a la tecnología de DNA recombinante.

1.2. Antecedentes bibliográficos

1.2.1. La vida en ambientes extremos

A pesar de que existen numerosas enzimas capaces de catalizar diferentes reacciones, pocas

se adecuan a las condiciones presentes en la industria. Es por esto que los microorganismos que viven en condiciones extremas (extremófilos) han despertado gran interés como posibles fuentes de nuevas enzimas que funcionen bajo las condiciones requeridas.

En especial, se tiene interés por los organismos extremófilos psicrófilos. Estos habitan los

ambientes más fríos de la Tierra, que incluyen las regiones polares, altas montañas, glaciares, profundidades oceánicas, superficies de sistemas subterráneos (cuevas), atmósfera alta, electrodomésticos refrigerados y superficies de animales y plantas que viven en ambientes fríos, donde las temperaturas nunca exceden los 5°C [6,7].

1.2.2. Enzimas activas a bajas temperaturas

La temperatura es uno de los factores medio ambientales más importantes para la vida, ya

que ésta influencia directamente los procesos celulares.

3

Vivir a temperaturas cercanas a los 0 ºC requiere de múltiples adaptaciones cruciales, que

incluyen arreglos bioquímicos a nivel molecular (síntesis de moléculas especiales), subcelular (regulación de canales iónicos) y de la fisiología completa del organismo (vías metabólicas). Entre las adaptaciones se encuentra la necesidad de preservar la estabilidad y la permeabilidad de la membrana y de mantener las actividades enzimáticas a niveles apropiados. Debido a esto, los organismos psicrófilos han desarrollado mecanismos adaptativos para llevar a cabo sus funciones metabólicas a bajas temperaturas incorporando características únicas en sus proteínas y membranas [7,8].

Las enzimas adaptadas a bajas temperaturas se caracterizan por tener una alta actividad

específica a bajas temperaturas y, como consecuencia, una rápida inactivación a temperaturas moderadamente altas [9]. Las bajas temperaturas inhiben fuertemente la velocidad de las reacciones químicas, cualquier disminución en la temperatura inducirá una reducción exponencial en la velocidad de la reacción. A pesar de esto, los organismos psicrófilos son capaces de mantener una apropiada velocidad de sus reacciones bioquímicas debido a flexibilidad estructural de sus enzimas.

El aumento en la flexibilidad estructural probablemente facilitaría los cambios conformacionales, resultando en una disminución de la energía requerida para la catálisis a bajas temperaturas, proveyendo así una mayor eficiencia enzimática [6,8]. Una consecuencia esperada del aumento de la flexibilidad es la reducción en la estabilidad térmica [10].

1.2.3. Aplicaciones biotecnológicas de enzimas activas a bajas temperaturas

La capacidad de las enzimas psicrófilas para catalizar reacciones a bajas o moderadas

temperaturas, ofrece un gran potencial para ciertas aplicaciones industriales y biotecnológicas [6,8]. Uno de los principales intereses en estas enzimas consiste en su uso como parte la composición de detergentes. Esto debido a que se hace innecesaria la aplicación de energía calórica para lograr niveles de actividad suficientes para efectuar el proceso de lavado eficientemente, lo que trae como consecuencia beneficios económicos debido al ahorro energético.

Algunos ejemplos de estos beneficios biotecnológicos se dan en la industria alimenticia,

donde el uso de enzimas adaptadas a bajas temperaturas permitiría la obtención de productos a temperaturas donde el crecimiento microbiano es mínimo y su uso entregaría mejores alternativas en la fermentación, manufactura de quesos, panaderías y ablandamiento de carnes. Por otro lado, los organismos adaptados al frío tienen un gran potencial en la aplicación de procesos de biorremediación, como por ejemplo, en el compostaje y la biodegradación de aceites o xenobióticos [9,10].

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1.2.4. Enzimas Proteolíticas; proteasas

Los microorganismos tienen una amplia gama de proteasas, tanto intra como extracelulares.

Las intracelulares participan en diversos procesos celulares y metabólicos, como por ejemplo: esporulación, diferenciación, recambio de proteínas, maduración de enzimas y hormonas. Las proteasas extracelulares son importantes para la hidrólisis de proteínas en el medio externo, de esta manera las células pueden absorber y utilizar los productos de las hidrólisis como nutrientes.

En relación a los sustratos proteolíticos, las proteasas se clasifican en dos tipos:

endopeptidasas, que hidrolizan enlaces peptídicos a lo largo de la toda la cadena y exopeptidasas, las que tienen preferencia por los extremos amino- (aminopeptidasas) o carboxilo- (carboxipeptidasas).

La clasificación de las proteasas se hace en base a los aminoácidos presentes en el sitio

activo, el cual determina el mecanismo químico de la reacción enzimática [11]. Estas clases son: a) Serina proteasas (Asp, Ser, His): El grupo más representativo de estas proteasas

microbianas son las subtilisinas. Esta clase se caracteriza por tener una serina como el aminoácido principal en el sitio catalítico.

b) Cisteina proteasas (Cys, His, Asp): Se caracteriza por tener un residuo de cisteina como el principal componente del sitio activo.

c) Aspartato proteasas (Asp, Asp): Estas presentan una estructura bilobular, con el sitio catalítico ubicado entre los dos lóbulos, cada uno de los cuales contribuye con un residuo de aspartato como aminoácido principal en la catálisis.

d) Metaloproteasas (Zn, Glu, Try): Esta clase difiere mucho entre sí en su secuencia y estructura, pero en general contienen un átomo de zinc, cobalto o níquel catalíticamente activo.

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1.2.4.1. Serina proteasas

Las serina proteasas son consideradas importantes debido a su actividad y estabilidad a pH

alcalino, condiciones comúnmente halladas en la industria. El mecanismo de acción de estas enzimas está muy bien caracterizado. Tienen un residuo de serina en el sitio activo, encargado del ataque nucleofílico sobre el sustrato. Además, tienen dos residuos adicionales esenciales para su actividad, aspartato e histidina. La triada catalítica forma el sitio activo.

La reacción comienza con la polarización del grupo imidazol de la histidina, por acción del

grupo carboxilo del aspartato (Figura 1) [12]. De esta forma, la histidina actúa como base y atrae al protón del grupo OH de la serina. En ese momento el oxígeno de la serina actúa como un nucleófilo para atacar el grupo carbonilo del enlace peptídico que será cortado. Se disocia el doble enlace del grupo carbonilo al arrastrar los electrones hacia el oxígeno de la serina, para formar el intermediario tetraédrico (Figura 1, cuadro 1.1). Con este cambio, el enlace peptídico se rompe mediante la transferencia de los electrones hacia el protón del grupo amino de la histidina, el cual actúa como un ácido, finalizando el paso de acetilación (formación del intermediario acil-enzima) (Figura 1, cuadro 1.2). El siguiente paso es nuevamente catalizado por la acción base de la histidina, la que atrae un protón desde el agua para que este actúe como un nucleófilo que ataca el enlace éster que forma la acil-enzima (Figura 1, cuadro1.3). El último paso involucra la recuperación del hidrógeno de la serina desde la histidina y el rompimiento del enlace éster (Figura 1, cuadro 1.4). La función del ácido aspártico es polarizar la histidina para que ésta actúe como base o ácido que ayuda en los procesos de acetilación y desacetilación, mientras la serina se une covalentemente al péptido sustrato para que la reacción ocurra.

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Figura 1: Mecanismo general de acción de las serina proteasas.

En el esquema se indican los pasos involucrados en la catálisis enzimática de las serina proteasas: (1.1) unión del sustrato; (1.2) formación del intermediario tetraédrico; (1.3) formación de intermediario covalente y (1.4) liberación del producto final y regeneración del catalizador.

1.2.5. Aplicaciones industriales de las proteasas

Las proteasas abarcan hasta el 40 % de las ventas totales de enzimas en el mercado,

distribuyéndose en diferentes sectores industriales; como por ejemplo en detergentes, procesamiento de alimentos, farmacéutico, cueros, diagnósticos, tratamiento de desechos y recuperación de plata. Las más apetecidas en el mercado de enzimas son las proteasas alcalinas para aplicación en detergentes. Estas son estables y activas a pH dentro de los rangos alcalinos, condición necesaria para la aplicación en detergentes.

Intermediario Tetraédrico Complejo de Michaelis

Intermediario Tetraédrico

Sustrato polipeptídico

Ataque Nucleofílico

Acil-enzima

Ataque Nucliofilico H2O

1 2

3 4

1.1

1.4 1.3

1.2

7

El éxito de las enzimas en detergentes llevó al desarrollo de distintas proteasas con otras

aplicaciones técnicas más específicas: limpieza de sistemas de membranas, limpieza de elementos quirúrgicos, limpiadores ópticos, limpiadores de lentes de contacto, control de pestes, desgomado de seda, deslignificación selectiva de cáñamo, etc. [13]. Todas obtuvieron éxito comercial.

1.2.5.1. Industria de alimentos

En la industria de alimentos se utilizan distintos tipos de proteasas, como la quimosina en la

elaboración de quesos [1]. Esta es una proteasa aspártica que se extrae del cuajo de bovinos, conocida comercialmente con el nombre de renina. En el caso de la elaboración de carnes en conserva se requiere de proteasas neutras o alcalinas que remuevan la carne adherida a los huesos. En el ablandamiento de carnes es utilizada la papaína, cisteina proteasa proveniente de la papaya [14]. También se utilizan proteasas para incrementar la solubilización y mejorar del sabor y olor de ciertos alimentos.

1.2.5.2. Industria del cuero

El reemplazo de métodos convencionales para el procesamiento de cueros, por tratamientos

bioquímicos, ha permitido mejorar el control del proceso del cuero. Por ejemplo, se alcanza una mayor velocidad en el tratamiento, así como menores niveles de contaminación ambiental, y una reducción de los desechos. El proceso de depilación de los cueros fue mejorado gracias al uso de proteasas alcalinas con actividad elastolítica y keratinolíticas, debido a que permiten la exposición de las raíces de los pelos con la consecuente facilidad de desprendimiento. Otros procesos como el de ablandamiento del cuero también fueron mejorados mediante la utilización de proteasas en condiciones alcalinas, que degradan las proteínas interfibrilares presentes en éste.

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1.2.5.3. Usos médicos

Las proteasas han sido utilizadas principalmente en la remoción de tejido necrótico

producido por quemaduras, ulceraciones y heridas. Se ha comprobado que enzimas proteolíticas provocan una licuefacción selectiva de células y tejido muerto, así como disolución de costras de sangre facilitando el drenaje y acelerando la granulación y re-epitelización de la herida, con una disminución en el tiempo de cicatrización [15].

Para la desinflamación de tejidos se recurre a tripsinas, que disuelven coágulos de sangre y

precipitados de proteínas extracelulares [16]. Estas también son usadas en el procesamiento de proteínas bio-farmacéuticas, como en la producción de insulina a partir de pro insulina, descrita por Klemer W. et al (1971).

1.2.5.4. Industria del detergente

La tendencia del mercado y la necesidad de los consumidores han tenido gran influencia en

el desarrollo de nuevas enzimas para detergentes. Además de proteasas, estos poseen lipasas, que ayudan en la hidrólisis de lípidos en la interfase lípido agua; amilasas, que aceleran la degradación de los residuos de almidón en alimentos como papa y chocolate, y celulasas, que facilitan la remoción de suciedad y restauran la suavidad y color de las fibras de algodón [17].

Las proteasas han sido por largo tiempo tema de mucho interés para la industria de los

detergentes, debido a la habilidad de estas para remover manchas proteicas de forma mucho más eficiente que los compuestos convencionalmente utilizados.

Se ha puesto mucho énfasis en la utilización de nuevas enzimas que mejoren los

rendimientos del lavado y que sean compatibles con los otros componentes del detergente. El éxito comercial de las subtilisinas como aditivos en detergentes, se debe principalmente

a su alta estabilidad y baja especificidad de sustrato, además de ser secretada extracelularmente en grandes cantidades por las especies de Bacillus, lo que facilita en gran medida su obtención y purificación [18].

El incrementado uso de fibras sintéticas que no toleran el lavado a altas temperaturas ha llevado al uso frecuente del lavado a bajas temperaturas. Esto ha obligado a los manufactureros de detergente a buscar nuevas enzimas que tengan mejor desempeño a bajas temperaturas. En 1998, Novo Nordisk desarrolló para el mercado japonés, una proteasa para detergentes llamada Kannasa, que tiene una buena eficiencia incluso a 15° C.

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1.2.6. Producción de proteínas recombinantes

Entre los sistemas biológicos heterólogos para la producción de proteínas recombinantes

más utilizados se encuentran: bacterias (como E. coli y B. subtilis), levaduras (como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris), y células eucariontes (cultivos animales, células de insectos en cultivo y plantas).

La elección de un sistema de expresión para un alto nivel de producción de proteínas

recombinantes depende de muchos factores. Éstos incluyen características del crecimiento de la célula, niveles de expresión, la localización final de la proteína expresada, modificaciones post-traduccionales, y la actividad biológica de la proteína de interés [19].

E. coli ofrece los medios para la producción rápida y económica de proteínas

recombinantes. Estas ventajas permiten que E. coli siga siendo un organismo valioso para el alto nivel de producción de las proteínas recombinantes [20,21].

Las bacterias producen proteínas recombinantes por medio de plasmidios. Entre las

propiedades de los plasmidios se incluyen (1) su pequeño tamaño, que hace que este DNA sea fácil de aislar y de manipular; (2) que son DNA circular, lo que hace que el DNA sea más estable durante su aislamiento químico; (3) su origen de replicación independiente, de manera que la replicación del plasmidio en la célula transcurre independientemente del control directo del cromosoma; (4) su múltiple número de copias, de manera que en la célula pueden estar presentes en numerosas copias, aumentando los niveles de expresión de la proteína de interés; (5) la presencia de marcadores seleccionables, tales como genes de resistencia a antibióticos, haciendo posible la detección y selección de los clones que contienen plasmidios [22].

El nivel de expresión del gen que codifica la proteína de interés depende, en parte, del

promotor que éste posea río arriba. Para aumentar la eficiencia transcripcional, los plasmidios cuentan con promotores con las siguientes características: (1) fuerte, es decir, con una alta afinidad por la RNA polimerasa, lo que implica un inicio frecuente de la transcripción; (2) que permita generar niveles intermedios de expresión y (3) regulado, es decir, que el investigador pueda controlar cuándo el gen es expresado utilizando inductores y/o co-represores. El promotor debe ser regulado ya que la sobreexpresión de una proteína impone un estrés metabólico a las células, bajando la velocidad de crecimiento. Algunas proteínas recombinantes pueden ser “tóxicas” para las bacterias, por lo que se requiere separar la fase de crecimiento de las células huéspedes de la fase de expresión del gen heterólogo [23].

10

1.2.6.1. Expresión recombinante de proteínas criofílicas

Las formas recombinantes de varias enzimas bacterianas adaptadas al frío han sido

exitosamente expresadas en microorganismos [24–27]. Por ejemplo, la enzima uracil-DNA glicosilasa del bacalao atlántico adaptada al frío fue recientemente expresada de forma activa en E. coli [28]. Más aún, la forma precursora de la tripsina I recombinante del bacalao atlántico, fue expresada en un sistema de expresión E. coli His-Patch ThioFusion y puriWed [29].

Todos los cDNAs de tripsinas del grupo III han sido aislados de especies de peces que

pasan parte de su vida en ambientes muy fríos, a 0 °C o a temperaturas más bajas. Hoy, ninguno de los polipéptidos de tripsinas del grupo III ha sido aislado desde sus fuentes nativas. Por lo tanto su caracterización ha sido principalmente basada en el análisis de las sucesiones de cDNA que codifican las enzimas, así como en el análisis bioquímico de la tripsina Y recombinante producida en P. pastoris [30].

También se han logrado expresar subtilisinas criofílicas recombinantes, aunque hay pocos

reportes en la literatura. Un ejemplo es la expresión de una subtilisina criofílica de la antártica en Bacillus [31], otra expresión exitosa se realizó con una serina proteasa tipo subtilisina en E. coli [26]. Es por esto que la producción de una subtilisina criofílica recombinante representa un gran desafío.

11

1.3. Descripción del proyecto y justificación

Este proyecto encuentra justificación en la necesidad de dar una solución al problema del

gasto evitable de energía para lavar ropa, de manera que las enzimas psicrofílicas puedan ser utilizadas como “materia prima” para eliminar manchas. Esto presenta un importante interés comercial en la actualidad, por lo que la producción de una proteasa recombinante activa, corresponde al primer y fundamental paso que permita avanzar hacia la generación de una herramienta tecnológica con el objetivo solucionar esta inquietud.

La búsqueda y desarrollo de nuevas enzimas para una aplicación industrial se basa en tres

parámetros principales [32]: 1) La eficiencia que tiene la enzima en su aplicación 2) Producción segura y económica de la proteína 3) Patentabilidad de la proteína o aplicación Este trabajo está enfocando en parte del primer punto, es decir, en la expresión de enzimas

descubiertas desde la naturaleza. Luego de la selección de enzimas (mediante ensayos de actividad compatibles con las

aplicaciones requeridas), siguen las etapas de clonamiento, expresión, purificación y caracterización de las enzimas para que los mejores candidatos sean probados a escalas mayores.

Recientemente, en el CIByB (Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología) se han

aislado microorganismos psicrófilos (bacterias) de la antártica y se ha determinado que las proteínas que secretan tienen una alta actividad a bajas temperaturas. Particularmente se aislaron proteínas del tipo subtilisina desde distintas cepas de Polarisbacter sp. de origen marino antártico. Entre éstas proteínas se encuentran las denominadas T4 y T7.

Se espera que alguna de estas proteasas de origen antártico favorezca el desarrollo de

detergentes con las propiedades descritas anteriormente. Para esto, es necesario expresar estas enzimas de manera recombinante, con el objeto de facilitar su posterior producción a mayor escala.

El trabajo que se presenta a continuación se enmarca dentro de la secuenciación del gen de

una subtilisina criofílica, para luego ser clonado en vectores de expresión y transformados en un organismo adaptado para la expresión de grandes cantidades de proteína recombinante, y poder así tener una gran cantidad de enzima pura. Con esta enzima purificada se puede evaluar su desempeño en la aplicación.

12

Las técnicas a utilizar con dicho fin serán: la reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

para encontrar la secuencia del gen completo, también para posibilitar su inserción en los dos vectores de expresión a utilizar; el clonamiento en cepas de E. coli y la inducción de la expresión mediante IPTG, según protocolos para cada vector de expresión a utilizar.

1.4. Objetivos

1.4.1. Objetivo General

El objetivo general del Trabajo de Memoria de Título es: producir una enzima tipo

subtilisina criofílica recombinante, en forma activa en Escherichia coli, a partir de un gen de una bacteria de origen marino antártico.

1.4.2. Objetivos específicos

• Aislar el gen completo de una proteasa mediante un método de “genome walking”. • Analizar la secuencia aminoacídica realizando estudios comparativos con otras proteasas. • Clonar y expresar de forma recombinante los genes codificantes para las proteasas T4 y

T7.

13

2. METODOLOGIA En este capítulo se presentan cada uno de los pasos seguidos con el fin de obtener una

subtilisina recombinante activa.

2.1. Materiales

2.1.1. Cepas bacterianas

E.coli cepa DH5α, genotipo: F- Φ80dlacΔM15 Δ(lacaya-argF) U169 recA1 endA1

hsdR178rk-,mk

+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1.

E. coli BL21(D3E), genotipo: F- ompT hsdSB (rB-mB

+) gal dcm (DE3). E. coli TB1, genotipo: F-araΔ(lac-proAB)[Φ80dlacΔ(lacZ)M15] rpsL(StrR) thi hsdR.

2.1.2. Reactivos

Los reactivos utilizados durante el trabajo de tesis y el laboratorio proveedor se detallan en

la Tabla 1.

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Tabla 1: Reactivos utilizados durante el trabajo de tesis.

Reactivos Laboratorio

Enzimas de restricción NdeI, PvuII, XhoI, y XbaI. Taq DNA polimerasa, pGEM-T Easy.

Promega (WI-USA)

T4 DNA ligasa, Elongasa®, estándar de tamaño molecular 1 Kb, dNTPs, cepa E. coli DH5α.

Invitrogen (CA-USA)

X-GAL, IPTG. Sigma (MO-USA)

El estándar de tamaño molecular preteñido de proteínas, enzimas de restricción NcoI, KpnI.

Fermentas

Triptona, extracto de levadura, medio LB, agar. Disco (DT- USA)

pMAL-c/p2E, cepa E. coli TB1. New England Biolabs (MA-USA)

pET22b(+), cepa E. coli BL21(D3E). Novagen, Madison (WI-USA)

Los sistemas de purificación de productos de PCR, de DNA plasmidial y de extracción de DNA desde geles de agarosa. Resina Ni-NTA.

Qiagen

Tris, SDS, Glicerol. Winkler

Cloruro de sodio. J.T Backer

Agarosa. Fermelo

El resto de las sales, ácidos, bases, bromuro de etidio y solventes de grado analítico o de biología molecular.

Merk

2.1.3. Enzimas de restricción

La mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en esta tesis producen cortes de tipo

cohesivos, excepto PvuII y EcoRV que producen cortes romos (Tabla 2).

Tabla 2. Enzimas de restricción utilizadas durante el trabajo de tesis.

Enzima

Sitio de reconocimiento (5’→ 3’)

NcoI CCATGG

XhoI CTCGAG

KpnI GGTACC

XbaI TCTAGA

EcoRV GATATC

PvuII CAGCTG

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2.2. Métodos

2.2.1. Búsqueda de la secuencia 5’ del gen t7 mediante la técnica de Genome Walking

La técnica denominada “genome walking” consiste en la amplificación de secuencias

desconocidas de DNA genómico, adyacentes a secuencias ya conocidas [33]. Esta técnica consta de 5 etapas:

• Diseño de partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia río arriba del gen de proteasa.

• Digestión del DNA genómico con la enzima de restricción deseada y luego elongación de los fragmentos producidos, mediante el uso de la Taq DNA polimerasa que agrega una adenina a los extremos 3’ de cada fragmento.

• Construcción de un oligo-adaptador de doble hebra que contiene una timidina no apareada en un extremo 3’.

• Ligación del oligo-adaptador con los fragmentos de DNA generando así una genoteca-adaptador.

• Amplificación del gen completo. Estos pasos se detallan en la Figura 9 en Resultados.

2.2.1.1. Diseño de partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia 5’ del gen t7

Se dispone de la secuencia del extremo 3’ del gen codificante para la proteasa T7 (gen t7).

Por otra parte, se realizó un alineamiento múltiple con las secuencias de subtilisinas conocidas, revelándose la existencia de una región conservada en la fracción central de los homólogos. Con el fin de encontrar la secuencia del extremo 5’ del gen en cuestión, se utilizó la técnica de genome walking estandarizada en el laboratorio del CIByB. Para esto se diseñaron partidores y adaptadores específicos a partir del fragmento central conservado (Tabla 3 en Resultados).

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2.2.1.2. Digestión del DNA genómico y elongación

Se digirió el DNA genómico de la cepa p9/2-10 aislada en el laboratorio (que contiene el

gen t7), con las enzimas de restricción PvuII y EcoRV y los tampones recomendados por el proveedor. La reacción se efectuó en un volumen final de 20 µL que contenía 1 µg de DNA

previamente purificado, 2 µL de tampón 10X y 1,5 µL de enzima. El resto del volumen se

completó con agua Milli-Q estéril. La mezcla se incubó a 37 °C por 3 h. Para extender los extremos 3’ de los fragmentos de DNA y agregar una adenina

desapareada, fueron incubados 500 ng del DNA previamente digerido y purificado con 5 unidades de Taq DNA polimerasa, 1 µL de 10 mM dNTPs y 5 µL de tampón Taq 10X en un

volumen total de 50 µL. Se incubó a 70 °C por 45 min.

2.2.1.3. Construcción del oligo-adaptador

Se construyó un oligo-adaptador de doble hebra que contiene 6 sitios de restricción,

hibridizando los oligonucleótidos AdaptS y AdaptA no fosforilados. El oligo-adaptador se denominó Adapt-total y posee una timidina no apareada en uno de sus extremos 3’ (Figura 8 en Resultados).

La hibridización o alineamiento de los dos partidores se realizó calentando 3 minutos a 95

ºC una solución 10 µM de cada oligonucleótido, seguido de un enfriamiento lento hasta alcanzar

la temperatura ambiente.

2.2.1.4. Construcción de la genoteca-adaptador

Para la construcción de la genoteca-adaptador, que corresponde al DNA digerido unido al

oligo-adaptador en sus extremos, se hizo una mezcla de ligación. Se tomaron 7 µL de la mezcla

de fracciones de DNA polimerizado con una adenina no apareada en el extremo 3` y se mezclaron con 15 pmoles del adaptador Adapt-total, para realizar la reacción de ligación con una unidad de T4 DNA ligasa (Invitrogen (CA-USA)) y 2 µL del tampón de ligación 5X en un

volumen de 10 µL de reacción. Esta reacción se incubó a 16 ºC por 16 h.

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2.2.1.5. Amplificación del extremo 5’ del gen t7

La reacción de amplificación fue realizada en un volumen de 50 µL en presencia de tampón

elongasa 1X (Invitrogen (CA-USA)), donde la concentración final de los reactivos fue: 1.9 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs y 0.5 µM del primer partidor específico T7A1 diseñado a partir de la secuencia conocida del gen blanco (Tabla 3). Luego se agregó 5 µL de la genoteca-adaptador diluida 10 veces y 1 µL de Elongasa.

El programa de PCR utilizado fue el siguiente: 1 min a 94 °C, 20 ciclos (32 s a 94 °C y 5

min a 68 °C), finalmente 7 min a 70 °C. Las reacciones fueron llevadas a cabo en el termociclador Eppendorf MasterCycler Gradient.

Los productos de PCR fueron diluidos 10 veces para ser utilizados como templado en la

segunda ronda de PCR, que busca amplificar el extremo 5’ del gen de proteasa T7. En este PCR, se utilizó como partidor sentido AdapS2, que fue diseñado a partir de la secuencia del oligo-adaptador Adapt-total, y como partidor antisentido T7A2 (diseñado a partir de la secuencia conocida del gen blanco, río abajo de T7A1).

La segunda reacción de amplificación fue hecha en un volumen total de 50 µL de tampón

elongasa 1X, donde la concentración final de los reactivos fue: 1.9 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.5 µM del segundo partidor específico T7A2, 0.2 µM del partidor específico para el oligo-adaptador AdaptF2, 3 µL del producto de PCR diluido de la primera ronda y 1 µL de Elongasa. Las condiciones de los ciclos térmicos del PCR fueron: 1 ciclo por 1 min a 94 °C, 35 ciclos (32 s a 94 °C y 5 min a 68 °C), finalmente 7 min a 70 °C.

El fragmento amplificado fue sometido a electroforesis en un gel de agarosa 0,8% (Anexo

A), y posteriormente purificado desde éste (Anexo B), para ser ligado al vector de clonamiento pGEM-T Easy (Anexo C). Con la construcción se transformó E. coli DH5α (Anexo D). Luego se

realizó una minipreparación de los transformados (Anexo E) para secuenciar el producto de ligación.

2.2.1.6. Secuenciación y análisis del extremos 5’ del gen t7

El DNA plasmidial se mandó a secuenciar a Macrogen S.A. (Corea). La secuencia se

analizó comparándola con otras secuencias mediante los algoritmos BLASTn, BLASTp y BLASTx (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/), que comparan la secuencia nucleotídica, aminoacídica y la secuencia nucleotídica traducida en todos sus marcos de lectura respectivamente [12].

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2.2.2. Diseño de partidores para el clonamiento del gen t7 en los vectores de expresión

Para poder insertar el gen de la proteasa T7 en los vectores de expresión pET22b(+),

pMALc2E y pMALp2E se realizó PCR sobre el DNA genómico, utilizando partidores que agregan sitios de restricción para determinadas enzimas. Estos mismos sitios de restricción se encuentran en el sitio de clonamiento múltiple (MCS) de los plasmidios.

Se diseñaron partidores para realizar cuatro construcciones de vectores recombinantes, dos

de ellas con el gen en el vector de expresión pET22b(+) con distintos sitios de restricción, una con el vector pMALc2E (la proteína queda en el citoplasma) y otra con el vector pMALp2E, que tiene señal de exportación a periplasma. Estas dos últimas construcciones solo difieren en el vector, el inserto con sitios de restricción utilizado es el mismo.

Para insertar el gen en el vector pET22b(+) se consideraron las siguientes dos opciones:

1. Una construcción que incluye los sitios de restricción NcoI y XhoI en el gen t7. Para esto se diseñaron los partidores pETNcoIS y pETXhoIA respectivamente ( Figura 2).

2. Una construcción que incluye los sitios de restricción NcoI y XhoI en el gen t7. Para esto

se diseñaron los partidores pETNcoIS y pETSHXhoIA respectivamente. El partidor pETSHXhoIA contiene un sitio de término de la transcripción antes de la secuencia de corte para XhoI.

Figura 2: Región de clonamiento del vector de expresión pET22b(+).

Mapa de clonamiento del vector de expresión pET22b(+). Para la opción 1 y 2 se utilizaron los sitios de corte NcoI y XhoI para dejar el gen unido al péptido de exportación del vector.

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Para clonar en los sistemas de expresión pMALc2E y pMALp2E, se diseñaron los

partidores pMALT7S y pMALT7A con sitios de restricción para KpnI y XbaI, respectivamente. Estos sitios de restricción proporcionaron los extremos requeridos para clonar el gen finalmente en los vectores antes mencionados (Figura 3).

Figura 3: Mapa de restricción del vector de expresión pMAL.

Se utilizaron las enzimas de restricción KpnI y XbaI para insertar el gen t7 en los vectores de expresión pMALc2E y pMALp2E.

2.2.3. Amplificación de DNA mediante PCR

Los partidores se usaron a una concentración de 10 pmol/µL y se realizaron

amplificaciones del DNA genómico mediante PCR, utilizando Elongasa® (Elongase Enzyme)

(ver Anexo F) en lugar de Taq DNA polimerasa ya que la Elongasa® es capaz de amplificar fragmentos de mayor tamaño que la Taq, además de cometer menos errores durante la amplificación. Agrega una base de adenina al extremo 3`, permitiendo la posterior ligación al vector de clonamiento pGEM-T.

De esta manera el gen quedó con los extremos requeridos (con sitios de corte para enzimas

de restricción) para ser clonados finalmente en los vectores de expresión.

2.2.4. Purificación de fragmentos amplificados de DNA desde geles de agarosa

Los productos de PCR fueron cargados en un gel de agarosa 0,8% y sometidos a

electroforesis para separar los fragmentos deseados. Con el fin de purificar estos fragmentos de DNA, se cortó la banda desde el gel y se purificó con el sistema QIAEX II Gel Extraction, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

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2.2.5. Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy

Para obtener un mayor número de copias del vector con el inserto, y para facilitar

estéricamente el corte por parte de las enzimas de restricción, se utilizó el sistema pGEM-T

Easy, como vector de clonamiento. La mezcla de reacción se realizó en un volumen final de 10 µL y contenía 5 µL de tampón

de ligación 2X, 50 ng de vector pGEM-T Easy, 3,5 µL de fragmentos de DNA purificado y 1

unidad de enzima T4-DNA ligasa. Se dejó ligando por 16 h a 37 ºC. Los distintos vectores se denominaron pGEM-T7NcoI, pGEM-T7NcoISH y pGEM-T7KpnI.

2.2.6. Transformación de células electrocompetentes DH5α

Los productos de ligación pGEM-T7NcoI, pGEM-T7NcoISH y pGEM-T7KpnI fueron

transformados en células electrocompetentes E.coli DH5α. Las células electroporadas se

sembraron en placas LB agar (ver Anexo H) con carbenicilina [0,1 mg/mL], X-GAL [80ng/mL] e IPTG [0.5mM], luego se dejaron incubando a 37 ºC toda la noche en un agitador orbital (MaxQ4000, Equilab).

Posteriormente se utilizó Taq DNA polimerasa para realizar un PCR de colonias (ver

Anexo G). De acuerdo a los resultados, se seleccionó una colonia positiva (con inserto), correspondiente a la de mayor concentración de producto de PCR. Esta se inoculó en 4mL de medio LB estéril (ver Anexo I) con carbenicilina [0,1 mg/mL] y se dejó creciendo durante toda la noche a 37 ºC. Luego se extrajo el DNA plasmidial, mediante una minipreparación.

2.2.7. Digestión de DNA plasmidial y linearización de los vectores de expresión

Los plasmidios pGEM-T7NcoI y pGEM-T7NcoISH fueron digeridos con las enzimas NcoI

y XhoI. El plasmidio pGEM-T7KpnI fue digerido con los pares de enzimas KpnI y XbaI. Con la finalidad de ligar cada fragmento con su respectivo vector de expresión, estos fueron

digeridos con las mismas enzimas de restricción, es decir, pET22b(+) con los pares de enzimas NcoI y XhoI, pMALc2E y pMALp2E con KpnI y XbaI.

21

Las reacciones finales de digestión contenían 2 µL de tampón 5X recomendado por New

England Biolabs para digestiones dobles, 1 µL de cada enzima y 100 ng de vector pGEM T-Easy

con inserto. Para el caso de la linearización, se utilizaron 500 ng de los vectores de expresión. Las mezclas se llevaron al volumen final de 20 µL con agua Milli-Q estéril. Las digestiones se

dejaron reaccionando durante 16 h a 37 ºC y el resultado se analizó mediante un gel de agarosa 0,8%.

Se cortaron las bandas correspondientes al inserto en el caso de pGEM-T, y las de los

vectores linearizados. Se purificaron con el Kit de purificación de DNA QIAEX II Gel Extraction según instrucciones del fabricante.

2.2.8. Ligación de los insertos en los vectores de expresión

Las reacciones de ligación se realizaron en un volumen final de 10 µL en una mezcla que

contenía 100 ng de vector digerido, 300 ng de inserto digerido con las mismas enzimas de restricción, tampón T4 DNA ligasa 5X (Tris/HCl 250 mM pH 7,6, MgCl2 50 mM, ATP 5 mM, DTT 5 mM, polietilénglicol-8000 25% p/v) y 1 µL de T4 DNA ligasa [2.500U/mL]. La mezcla

de reacción se dejó a 16 ºC por 16 h. Los plasmidios producto de las reacciones de ligación se denominaron pET-NcoI, pET-

NcoISH, pMALc T7 y pMALc T7.

2.2.9. Clonamiento de los constructos en células DH5α

Con el fin de obtener un mayor número de copias, los vectores pET-NcoI, pET-NcoISH,

pMALc T7 y pMALc T7 fueron clonados en células electrocompetentes DH5α, para lo cual

fueron transformadas por electroporación 20µL de células de E.coli DH5α con 1µL de plasmidio

[0,2µg/mL], y posteriormente sembradas en placas LB agar y carbenicilina [0,1mg/mL]. Se

dejaron incubando toda la noche a 37 ºC. Las placas se sacaron de la incubadora y se guardaron a 4 ºC para que las colonias no

siguieran creciendo (comienzan a aparecer colonias satélites). Luego se realizó un PCR de colonias usando los partidores correspondientes a cada inserto, seguido de una electroforesis de DNA en gel de agarosa 0,8% para verificar la presencia de estos.

22

Se identificaron las colonias con el inserto del tamaño esperado, se eligió una en cada caso

y se dejaron creciendo a 37 ºC toda la noche en 4 mL medio LB y carbenicilina [0,1 mg/mL] a 200 rpm. Luego se extrajo el DNA plasmidial mediante una minipreparación, con el método QIAprep® Spin Miniprep Kit using a Microcentrifuge.

2.2.10. Clonamiento de los plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3) y TB1

Se transformaron células competentes E.coli BL21(DE3) y TB1 adquiridas en MoBiTec,

con los vectores pET-NcoI y pET-NcoISH en las primeras y pMALc T7 y pMALc T7 en las segundas.

Se eligió una colonia y se dejó creciendo a 37 ºC toda la noche en 4 mL medio LB y

carbenicilina a una concentración de 0,1 mg/mL. A 900 µL de cada cultivo se agregó 100 µL de glicerol 80%. Los tubos se guardaron a -80

ºC. Con el cultivo sobrante se hizo una minipreparación para obtener DNA plasmidial, con el método QIAprep® Spin Miniprep Kit using a Microcentrifuge.

Para verificar la presencia y correcta ligación de los insertos en los plasmidios, se realizó

una digestión de éstos con las respectivas enzimas de restricción como se indica en la sección 2.2.7.

2.2.11. Pruebas de actividad proteasa extracelular

Del PCR de colonias realizado luego de la clonación de los vectores de expresión en E. coli

DH5α, se eligieron 3 de cada constructo, se sembraron en placas de Skim Milk (SM) Agar con

IPTG y luego se incubaron durante la noche a 37 ºC. Para hacer las placas se mezcló: 1 gr de leche descremada en polvo, 0,1 gr de extracto de levadura y 1,5 gr de agar. La mezcla se llevó a 100mL con H2O (HPLC), se autoclavó, se dejó enfriar y se agregó IPTG a una concentración 0,5 mM.

23

2.2.12. Expresión recombinante de la proteasa T7 en E. coli

El gen codificante para proteasa, se expresó en células E. coli BL21(DE3)

electrocompetentes previamente transformadas con los vectores recombinantes pET-NcoI y pET-NcoISH. Para inducir la expresión del gen en pET22b(+), se procedió según lo recomendado por el “manual del sistema pET”. Así, se inocularon 4 mL de medio LB más carbenicilina con una colonia de células BL21(DE3), lo mismo para otra colonia “control” con plasmidio sin inserto. Los inóculos se dejaron creciendo a 37 ºC con agitación de 200 rpm por 16 h. Al día siguiente se midió la densidad óptica a 600 nm (DO600) y se determinó el volumen necesario para inocular 250 mL de medio LB estéril más carbenicilina con el cultivo de noche para una DO600 inicial de 0,05 nm. El cultivo se creció con agitación a 37 ºC hasta alcanzar una DO600 de 0,6 en aproximadamente 2 h. Se tomó una muestra de 1 mL, se centrifugó (centrífuga Eppendorf 5403 de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y el precipitado se resuspendió en 10 µL de tampón

SDS-PAGE 5X para luego guardarlo a -20 ºC (muestra1: células sin inducir). El resto del cultivo de células se enfrió en hielo durante 5 min y se centrifugó en una botella esterilizada por autoclave a 5.000 g

v durante 5 min (centrífuga Sorvall® RC-28S y rotor GS-3 Sorvall®, DuPont,

CT, USA). El precipitado se resuspendió en 250 mL de medio TB estéril (Anexo J) más carbenicilina, se pasó a un matraz estéril y la inducción se hizo agregando IPTG para una concentración final de 0,5 mM. Se continuó la incubación a 20 ºC con agitación de 200 rpm. Pasadas 4 h se tomó una muestra de 500 µL, se centrifugó y el precipitado se resuspendió en 200

µL de tampón SDS-PAGE 5X para después guardarlo a -20 ºC (muestra 2: células inducidas). El

resto se utilizó para la purificación de la proteína recombinante.

2.2.13. Purificación de la proteína recombinante T7

Las células se recolectaron mediante centrifugación a 5.000 x g

v por 5 min a 4 ºC, en una

botella de centrífuga previamente pesada (centrífuga Sorvall® RC-28S y rotor GS-3 Sorvall®, DuPont, CT, USA). Al sobrenadante se le midió la actividad proteolítica (sección 2.2.15) y se guardó a -20 ºC hasta la purificación por columna. El precipitado se resuspendió en 8 mL/0,1gr peso húmedo de células, de una solución Tris/HCl 30 mM, sucrosa 20% p/v (pH 8). Se agregó EDTA para una concentración final de 1 mM. Se agitó utilizando una barra magnética durante 10 min a temperatura ambiente, para luego centrifugar a 10.000 x g

v y 4 ºC durante 10 min

(centrífuga Sorvall® RC-28S y rotor F-28/50 Sorvall®, DuPont, CT, USA). El precipitado se resuspendió en 25 mL de una solución fría de MgSO4 5 mM y se agitó con agitador magnético en baño de hielo. Luego de 10 min se centrifugó a 10.000 x g

v y 4 ºC durante 10 min.

24

Del sobrenadante, que corresponde a la fracción periplasmática, se tomó una muestra de 10

µL y se agregó tampón SDS-PAGE 5X para luego guardarlo a -20 ºC (muestra 3: fracción

periplasmática sin purificar). Al resto se le midió la actividad proteolítica y se guardó a -20 ºC, para posteriormente purificarlo por una columna con resina de níquel agarosa (Ni-NTA His·Bind, Novagen).

Por otro lado, el sedimento que contiene tanto la fracción citoplasmática soluble como la

insoluble, se resuspendió en 25 ml de tampón Binding 1X (Anexo O) para luego sonicar la mezcla (Sonicador Microson, Equilab) en hielo a alta potencia con 5 pulsos de 30 s, dos veces con un intervalo de 5 minutos. Posteriormente se centrifugó a 10.000 x g

v durante 15 min a 4 ºC.

El sobrenadante, que corresponde a la fracción soluble, se purificó por una columna con resina de níquel agarosa. El precipitado, que corresponde a la fracción insoluble se guardó a -20 ºC.

Todas las fracciones se purificaron por una columna con resina de níquel. La resina

utilizada tiene alta afinidad por un segmento de polihistidina presente en la proteína de fusión. A las fracciones a purificar se agregaron 250 µL de resina de agarosa Ni-NTA previamente

ambientada con tampón Binding 1X. Además, a las fracciones sobrenadante y periplasmática se agregó tampón Binding 10X para una concentración final de 1X y se agitó durante 1 h en hielo.

Se cargaron lentamente las fracciones en columnas pD10 con filtros previamente

ambientadas con tampón Binding 1X (Anexo O) con el fin de cargar la proteína unida a la resina. Se lavó con 5 volúmenes de columna (10 mL) con tampón de lavado Binding Imidazol 20 mM (Anexo P), luego se eluyeron y colectaron 4 fracciones con 500 µL de tampón de elución Binding

250 mM imidazol (Anexo Q).

2.2.14. Electroforesis de proteínas SDS-PAGE

Las separaciones electroforéticas en condiciones denaturantes se realizaron en una cámara

vertical MiniProtean II. Las muestras se prepararon en proporción 4:1 con tampón de carga 5X (Tris/HCl 60 mM, glicerol 25% v/v, SDS 2% p/v, 2- mercaptoetanol 14,4 mM y azul de bromofenol 0,1% p/v pH 6,8), se denaturaron por ebullición durante 5 min y posteriormente se cargaron en geles de bis-acrilamida 12,5 % de acuerdo a los procedimientos estándares. La electroforesis se realizó bajo voltaje constante de 200 V, utilizando tampón de corrida Tris-glicina-SDS (Tris 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0,1% p/v).

Para visualizar las proteínas en el gel de acrilamida, este se incubó durante 1 hora en una

solución de tinción Coomasie (45 % metanol, 10 % ácido acético, 45% agua destilada y 1 gr de

25

azul de Coomasie) y luego se destiñó con una solución de destinción (45 % metanol, 10 % ácido acético, 45 % agua destilada) durante 15 min.

2.2.15. Zimograma de proteasas

Para determinar la actividad enzimática in situ (en gel), primero se corrió un gel en

condiciones denaturantes para luego renaturarlo in situ. Para esto se preparó un gel de poliacrilamida 12,5 % de acuerdo a los procedimientos estándares, adicionando gelatina al 0,1 %. Las muestras se mezclaron en una proporción 1:1 con el tampón de muestra 2X (Tris/HCl 125 mM, glicerol 20 %, SDS 4 %, azul de bromofenol 0,005 %, pH 6.8) y se cargaron en el gel. La corrida del gel se realizó igual que la electroforesis de proteínas normal, excepto porque la cámara de electroforesis se introdujo en un contenedor con hielo. Luego de corrido el gel, este se incubó con Tritón X-100 1% (agente renaturante) por 15 min en agitación, posteriormente se dejó incubando toda la noche a 4 °C en un tampón adecuado para la actividad proteolítica de las proteasas (Tris/HCl 50mM, NaCl 0.2 M, CaCl2 5mM, pH 8.0). Finalmente para visualizar las bandas de digestión de gelatina en el gel, se realizó una tinción y destinción igual a la realizada para el SDS-PAGE.

2.2.16. Ensayo de actividad en medio líquido con sustrato específico S-AAPF-pNa

La actividad de enzimas tipo subtilisinas se puede determinar mediante el método de

Erlanger [34]. Este método consiste en la medida de la degradación de succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida (Succ-AAPF-pNa) en 50 MM Tris HCl pH 8.0 y 2 MM CaCl2 por 20 min a 20ºC. La hidrólisis de este sustrato por parte de las proteasas provoca la liberación de p-nitroanilina, generando un color amarillo en la solución. Esta actividad es registrada midiendo la absorbancia a 412nm.

2.2.17. Ensayo de actividad en medio líquido con sustrato específico TNBSA

Este ensayo se comercializa por Pierce (QuantiCleave Protease Assay Kit II) y se efectúa

en microplacas. Se preparó un blanco por cada muestra. Cada uno contenía buffer y muestra, pero no substrato. Se disolvió 10mg de caseína succinilada en 5ml buffer fosfato de potasio pH 8.0. y se dejó por 5 min a temperatura ambiental. Luego de agitar suavemente se agregó 100µL de la solución a pocillos de microplacas en triplicado. A dos distintos pocillos se agregó 100µL de buffer para preparar el blanco. Posteriormente se agregó 50µL de cada muestra en paralelo a los pocillos con solución de caseína succinilada y a los blancos, y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente. Después se agregó 50µL TNBSA a cada pocillo y se incubaron por 20 minutos a temperatura ambiente, luego se midió la absorbancia en un lector de placas a 450nm.

26

Por cada muestra, se calculó la diferencia de absorción a 450 nm (∆A450) y restó el promedio de ∆450 de los blancos a la absorbancia promedio de las muestras.

27

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Expresión de la proteasa T4

Para expresar las proteasas recombinantes fue necesario definir el sistema de expresión a

utilizar. Una alternativa fue el sistema pET de Novagen, específicamente el vector pET22b(+). Este es un sistema de expresión para E. coli inducido por IPTG, que expresa la proteína fusionada a un péptido señal de exportación a periplasma (opcional) y a una cola de histidina en el extremo C-terminal (opcional) para facilitar su posterior purificación.

La ventaja principal de este sistema radica en el fácil manejo de la cepa bacteriana,

reflejado principalmente en el rápido crecimiento y la facilidad de lisis y de transformación. Más aún, tiene la capacidad de expresar la proteína recombinante en grandes cantidades.

El constructo del vector pET22b(+) con el gen codificante para la enzima tipo subtilisina

intracelular T4 (Figura 4), se encuentra clonado en células E. coli BL21(DE3). La expresión de la proteína se indujo a 20 ºC durante 20 h y luego ésta se purificó como se indica en las secciones 2.2.12 y 2.2.13 respectivamente. Las fracciones obtenidas se analizaron en geles de poliacrilamida, donde se observó la sobreexpresión de una proteína del tamaño esperado de aproximadamente 87 kDa (Figura 5).

P. señal Prosec. T7 PPC

T4

D H S

D H S

P. señal Prosec. T7 PPC

T4

D H S

D H S

Figura 4: Esquema con las regiones funcionales de T4 y T7

T4: Proteína tipo subtilisina intracelular mostrando la tríada catalítica en amarillo D: Aspartato, H: Histidina y S: Serina. T7: Proteína tipo subtilisina, en rojo: péptido señal, en verde: Pro-secuencia, en amarillo: tríada catalítica, en morado: dominio pre-peptidasa C-terminal (PPC).

28

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

118 kDa

85 kDa

47 kDa

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

118 kDa

85 kDa

47 kDa

Figura 5: Análisis electroforético de la expresión de la proteasa T4 en

BL21 (DE3)/pET22b(+).

1 y 2: sobrenadante de cultivo purificado por columna de afinidad a níquel; control (BL21(DE3)/pET22b(+)) y muestra respectivamente; 3 y 4: fracciones periplasmáticas purificadas por columna de afinidad a níquel; control y muestra respectivamente; 5 y 6: fracciones citoplasmáticas solubles purificadas por columna de afinidad a níquel; control y muestra respectivamente; 7 y 8: extracto crudo antes de la inducción con IPTG; control y muestra respectivamente; 9 y 10: extracto crudo luego de 20 horas de inducción con IPTG; control y muestra respectivamente. PM: Marcador de masa molecular.

La proteína se detectó en una mayor concentración en la fracción citoplasmática soluble,

que corresponde al remanente obtenido después de sonicar y centrifugar la fracción citoplasmática soluble e insoluble, debiéndose incubar con resina Ni-NTA para su posterior purificación. Además se observa una alta expresión de proteína recombinante en el extracto crudo inducido, correspondiente al tamaño esperado de banda, confirmándose con la ausencia de ésta en los carriles correspondientes al control y a la muestra antes de inducir.

Para saber si la proteasa obtenida de las fracciones sobrenadante, periplasmática y

citoplamática solubilizada tenían actividad proteolítica, se realizaron ensayos de actividad in situ en geles de poliacrilamida mediante zimogramas como se indica en la sección 2.2.15. No se detectó actividad en ninguna de las fracciones.

29

Los zimogramas son métodos sensibles para detectar actividad proteolítica en los geles. La

ausencia de actividad puede deberse a que no todas las proteasas pueden soportar la denaturación con SDS y la posterior renaturación manteniendo la actividad proteolítica. Es posible que el tiempo de incubación con Tritón X-100 luego de corrido el gel (sección 2.2.15), o la concentración de éste en la solución de renaturación, no hayan sido suficientes para retirar el SDS, impidiendo la renaturación de la proteína.

Considerando que la proteasa a producir pertenece a la superfamilia de las enzimas

comerciales que se utilizan en los detergentes actualmente, se realizó además un ensayo de actividad proteolítica en medio líquido como se indica en la sección 2.2.16, no detectándose actividad en ninguna de las fracciones celulares. Es posible que la proteína criofílica reconozca sustratos específicos en su sitio activo, siendo la gelatina y Succ-AAPF-pNa no catalizadas por esta.

También se realizó un ensayo de actividad proteolítica con caseína succinilada, que es una

caseína tratada con anhídrido succínico para bloquear los grupos amínicos primarios. Estos se generan durante la proteólisis y reaccionan de manera cuantitativa con TNBSA, generando un complejo amarillo (2.2.17). No se observó actividad en ninguna de las fracciones celulares.

Por otro lado, el sistema de expresión BL21(D3E)/pET22b(+) presenta como desventaja

una gran y rápida inducción de proteína recombinante, lo que se puede traducir en un mal plegamiento de las proteínas y en la formación de cuerpos de inclusión. Para evitar estos inconvenientes se puede reducir la temperatura de inducción hasta encontrar la óptima y/o disminuir la cantidad de inductor para permitir una expresión más lenta, dando tiempo al buen plegamiento y procesamiento de las proteínas recombinantes. El tiempo de inducción también es un factor a considerar; dejando fijos los otros parámetros se puede estimar un tiempo adecuado para la correcta expresión de las proteínas. Otra desventaja de este sistema consiste en lo laborioso que resulta procesar las células del cultivo para recuperar las proteínas activas, en el caso de que no sean secretadas al sobrenadante. Según el protocolo de purificación de proteínas 2.2.13, el orden creciente de trabajo de recuperación sería: sobrenadante, fracción peripasmática, fracción citoplasmática soluble y fracción citoplasmática insoluble. Esto sería un inconveniente a nivel industrial, no así a escala de laboratorio. Es por este motivo que la fracción citoplasmática insoluble no se analizó.

30

La enzima T4 es una subtilisina intracelular que carece de señal de exportación [12], lo que complica su purificación considerando que, por lo general, las enzimas que se utilizan en los procesos industriales son extracelulares ya que poseen gran capacidad de hidrólisis de todo tipo de proteínas en el medio. Con estos antecedentes se decidió continuar con la expresión del gen codificante para la proteasa T7, la cual se encontraba parcialmente secuenciada. Para identificar si una proteasa es de secreción extracelular es necesario conocer la secuencia del gen completo para identificar el péptido señal de exportación.

3.2. Búsqueda de la secuencia 5’ del gen t7 mediante el método Genome Walking

El método de genome walking consiste en la identificación sistemática de regiones

desconocidas adyacentes a una secuencia de DNA conocida [35,36]. Si bien estas regiones también se pueden obtener mediante la búsqueda en una librería genómica con una sonda de DNA conocida, este procedimiento requiere mucho mas tiempo [36].

A partir de la secuencia previamente determinada del extremo 3’ del gen codificante para la

proteína tipo subtilisina T7, se diseñaron partidores específicos con el fin de obtener el resto de la secuencia del gen t7 (extremo 5`). Para esto se utilizó la técnica de “genome walking” estandarizada en el CIByB [33].

3.2.1. Diseño de partidores para la obtención de la secuencia 5’ del gen t7

Se diseñaron dos partidores específicos para obtener la secuencia río arriba del gen t7, con

sitios de alineamiento sucesivos. En la Figura 6 se esquematiza una fracción de la secuencia del gen previamente determinada, y los partidores T7A1 y T7A2. Las secuencias y Tm de los partidores se detallan en la Tabla 3.

Figura 6: Partidores para la amplificación de la secuencia 5’ del gen t7.

Las secuencias en azul corresponden a los partidores T7A1 y T7A2 para la amplificación del extremo 5’ del gen.

31

Tabla 3: Partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia 5’ del gen t7.

Nombre Secuencia (5’→ 3’) Tm (°C) *

T7A1 TGATAGAACGCCTTCAGAGTCGTTTGC 69

T7A2 CGGCCCACTGATGCTACGTTTACTACAC 70

AdaptA AGCTAGTACTAGTCGACGCGTGGCCTAG 64

AdaptS CTAGGCCACGCGTCGACTAGTACTAGCTT 69

AdapS2 CACGCGTCGACTAGTACTAGCTT 65

* Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C), donde A, T, G y C son los números de nucleótidos en el partidor, respectivamente.

Todos los oligonucleótidos, partidores y adaptadores utilizados en este trabajo, se

mandaron a sintetizar a Fermelo y Macrogen. El diseño de los partidores específicos fue hecho de tal manera, que las secuencias de sus

productos de amplificación se solapen con la del fragmento conocido, con el fin de facilitar la obtención de la secuencia completa de este gen.

3.2.2. Digestión de DNA genómico de la cepa p9/2-10

La cepa p9/2-10 corresponde a la cepa aislada a partir de la cual se extrajo el fragmento de

gen codificante para la proteasa T7. Se probaron 4 enzimas de restricción para digerir el DNA genómico, seleccionando la

digestión que generó fragmentos de mediano tamaño de manera de tener una mayor probabilidad de incluir íntegramente el gen. En la Figura 7 se muestran las dos mejores digestiones.

32

Figura 7: Digestión de DNA genómico de la cepa p9/2-10.

Se muestran las digestiones con las enzimas de restricción EcoRV (carril 1) y PvuII (carril 2). La mejor digestión se obtuvo con la enzima PvuII. Esta genera fragmentos con extremos romos.

Se seleccionó la digestión con PvuII debido a que fue la mejor enzima en digerir

(manifestado por el “chorreo” a lo largo del carril). El DNA digerido se purificó y se continuó con el procedimiento. Las demás enzimas produjeron fragmentos de tamaños grandes correspondientes probablemente a DNA genómico digerido parcialmente.

Los fragmentos digeridos con PvuII fueron sometidos a una adenilación de los extremos 3’,

utilizando Taq DNA polimerasa y dNTPs, con el fin de agregar una adenina no acoplada en los extremos 3’ (gracias a su actividad adenina transferasa independiente de templado).

3.2.3. Construcción del oligo-adaptador y de la genoteca-adaptador

El oligo-adaptador Adapt-total (Figura 8) se construyó mediante la hibridización de los

oligonucleótidos no fosforilados AdaptS y AdaptA, resultando en una doble hebra de nucleótidos que contiene en uno de sus extremos 3’ una timidina extra desapareada (ver sección 2.2.1.3.).

Figura 8: Adapt-total.

Adap-total es el resultado de la hibridización de los oligonucleótidos no fosforilados AdaptS (sentido) y AdaptA (antisentido).

33

Posteriormente los fragmentos de DNA genómico obtenidos con la adenina desapareada en

el extremo 3’ fueron ligados al oligo-adaptador Adapt-total formando la genoteca-adapador (ver sección 2.2.1.4.).

3.2.4. Amplificación del extremo 5’ del gen que codifica para la proteasa T7

La genoteca-adaptador fue utilizada como templado en una sucesión de dos reacciones de

PCR. La primera fue llevada a cabo usando sólo el partidor específico T7A1, generando la amplificación de una sola hebra del DNA, es decir, una amplificación lineal ya que solo se incrementó el número de copias de la hebra complementaria del gen. Esta amplificación se realizó para concentrar el fragmento de DNA de interés, que servirá de templado para la segunda reacción de PCR (Figura 9).

34

Figura 9: Diagrama de técnica de “genome walking” empleada para la obtención de la secuencia 5’ del gen t7.

Este esquema muestra la amplificación del extremo 5’ del gen desde un fragmento de secuencia conocida, usando genome walking con los dos partidores sucesivos que amplifican río arriba. Luego de digerir el DNA genómico con PvuII, este se extendió con Taq DNA polimerasa aprovechando su capacidad de dejar una adenina en el extremo 3’. Luego se ligó el adaptador Adapt-total que contiene una timidina desapareada. Mediante un PCR se realizó un enriquecimiento del extremo 5’ del gen, utilizando T7A1 diseñado para dicho fin. Finalmente se realiza un segundo PCR con T7A2 diseñado a partir del fragmento de proteasa que se encuentra río abajo de T7A1 y AdapS2 que se une a una región en Adapt-total.

35

La etapa de enriquecimiento del gen mejora la especificidad del segundo PCR y hace que el

método sea más independiente de la concentración de DNA, sobretodo en el caso de existir pocas copias íntegras del gen. Esta etapa aumenta el numero de copias del gen permitiendo diluir el templado para el siguiente PCR y de esa manera minimizar la cantidad de fragmentos de DNA no específicos.

Los productos de PCR obtenidos son de tamaños suficientemente grandes como para que

contengan al gen de interés. Esto se debe al uso de Elongasa, la cual es el resultado de una mezcla de Taq DNA polimerasa y DNA polimerasa termoestable de la especie Pyrococcus sp., esta última posee actividad proofreading lo cual permite la correcta copia de fragmentos largos de DNA sin la generación de errores, haciendo más estable estos amplificados. Por otro lado la Taq polimerasa agrega en el extremo 3’ una adenina desapareada, permitiendo una fácil ligación en los vectores de clonamiento.

La segunda reacción de PCR se realizó tomando el producto del primer PCR como

templado, generando un aumento exponencial de la hebra templado (Figura 9). La amplificación del extremo 5’ se realizó utilizando los partidores AdapS2 (que corresponde al partidor que alinea con el oligo-adaptador) y T7A2, adyacente río abajo a T7A1. Esto evita la amplificación de contaminantes (en el caso de que TA71 se haya alineado en otro fragmento de ADN que no contiene el gen). Se realizó un análisis electroforético de esta amplificación en un gel de agarosa (Figura 10).

1018

16362036

3054

PM PvuII

1018

16362036

3054

PM PvuII

1018

16362036

3054

PM PvuII

Figura 10: Análisis electroforético de los productos de PCR para la obtención del extremo 5’ de t7 utilizando la técnica de genome walking.

PM: marcador 1 kb de tamaño de oligonucleotidos. PvuII: El extremo 5’ de t7 utilizando la genoteca-adaptador generada a partir de la digestión del DNA de la cepa p9/2-10 con PvuII.

36

De acuerdo al análisis de alineamiento de la secuencia conocida del gen t7 con secuencias

completas de subtilisinas conocidas, se predijo una región faltante de aproximadamente 500 pb. Por este motivo y por el hecho de ser las bandas más nítidas, los fragmentos amplificados encerrados en círculo en la Figura 10 se purificaron desde el gel de agarosa y se ligaron al vector de clonamiento pGEM-T Easy. Luego se transformó la cepa DH5α de E. coli con el fin de

obtener un alto número de copias del vector con el inserto. Posterior a una minipreparación, el DNA se mandó a secuenciar exitosamente con los

partidores M13F-pUC (-40) y M13R-pUC (-40) que alinean en el vector de clonamiento pGEM-T Easy, en los sectores adyacentes al inserto. El fragmento con el extremo 5’ obtenido se solapa con el fragmento previamente secuenciado, lográndose reconstruir la secuencia completa del gen e identificar su región promotora. Se determinó que la secuencia corresponde a un fragmento de gen codificante para una proteasa tipo subtilisina (ver sección 2.2.1.6).

Esta técnica fue realizada sin dificultad y en un corto período de tiempo. Otra aplicación de

este nuevo método genome walking sería la de reconocer genes con multicopias en el genoma en los casos de aparecer más de una banda en el PCR.

En el caso de las digestiones no mostradas (punto 3.3.2), no se observaba ningún tipo de

amplificación. Es muy posible que se deba a que el corte de estas enzimas se encontraba demasiado alejado del sitio de alineamiento de los partidores específicos, siendo imposible para las polimerasas amplificar un fragmento de gran tamaño.

Gracias a la elongación y adenilación de los extremos 3’ de los fragmentos de DNA

genómico, no es necesario utilizar diferentes oligo-adaptadores para construir diferentes genoteca-adaptadores, sólo basta con construir un solo oligo-adaptador con una timidina (T) no apareada en uno de los extremos 3’ de éste, para utilizar varias enzimas de restricción a la vez. De este modo, si el uso de una enzima de restricción no es capaz de generar el extremo completo del gen, se puede utilizar cualquier otra enzima con el mismo oligo-adaptador y partidores específicos para el gen.

La ligación del oligo-adaptador a los fragmentos de DNA genómico deja una incisión en las

hebras de DNA entre el extremo 5’ del oligo-adaptador y el extremo 3’ de los fragmentos de DNA. La T4 DNA ligasa no es capaz de regenerar esta incisión, por lo que se generan fragmentos monohebra durante la denaturación. Debido a que el oligo-adptador tiene varios sitios de restricción colindantes, la probabilidad de encontrar esta secuencia en el genoma es muy baja. Por este motivo, el apareamiento inespecífico de los oligonucleótidos liberados en la fase de denaturación, no ocurrirá en la posterior fase de annealing.

37

La estrategia de ligación de un oligo-adaptador no fosforilado a los fragmentos de DNA

genómicos es para evitar la inespecificidad de ligación y amplificación de fragmentos de DNA contaminantes. Luego de la denaturación de las genoteca-adaptador durante la amplificación lineal, sólo el extremo 5’ de los fragmentos queda ligado a la hebra simple del oligo-adaptador, hebra que contenía una timidina desapareada originalmente. Solo los fragmentos que fueron amplificados durante el primer PCR serán utilizados como templado y se amplificarán específicamente en el segundo PCR ya que son los únicos fragmentos que tienen la secuencia complementaria al partidor que alinea oligo-adaptador.

3.3. Análisis de la secuencia aminoacídica de la proteasa T7

Con el fin de de asegurar que el fragmento amplificado y aislado corresponde al mismo gen

deseado, se diseñaron partidores específicos a partir de la secuencia obtenida (Tabla 4), que alinean con los extremos del gen y se amplificó nuevamente el gen completo.

La secuencia completa de DNA se reconstruyó a partir de las secuencias nucleotídicas

obtenidas con el programa Omiga. Se reconoció un marco de lectura abierto (ORF) de 2.124 pb que codifica para una proteína de 708 aminoácidos (Figura 11) [12]. La secuencia también se analizó con el programa PSORTb version 2.0.4 identificando la presencia de un péptido señal N-terminal de 27 aminoácidos para secreción extracelular. Además, mediante el análisis de la secuencia aminoacídica obtenida usando el algoritmo Blast P [37] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), se identificó una pro-secuencia que corresponde a los primeros 144 aminoácidos (sin contar el péptido señal de exportación extracelular). Esta pro-secuencia ayudaría al correcto plegamiento de la proteína, luego sería cortada para obtener la proteína madura con la consecuente activación de la enzima [38].

En la región C-terminal se encontraron dos dominios proteicos característicos de bacteria

denominados PPC (pre-peptidase C-terminal domain). Este tipo de dominios C-terminal es comúnmente encontrado en peptidasas de secreción y no se encuentra presente en la proteína madura [39].

38

Figura 11: Secuencia aminoacídica de la proteasa T7.

Secuencia aminoacídica de la proteasa T7. Los aminoácidos encerrados en cuadros azules corresponden a los que conforman la triada catalítica, el péptido destacado con rojo corresponde al péptido señal y el destacado con amarillo a la pro-secuencia. Las secuencias destacadas con verde corresponden a dominios PPC de proteínas bacterianas.

También se determinó que la proteasa T7 tiene un 85% de identidad con subtilisinas mesófilas, lo que resulta muy interesante para intentar expresarla de forma recombinante activa para utilizarla en posteriores aplicaciones industriales.

3.4. Construcción de plasmidios recombinantes con el gen t7

Para expresar el gen aislado en E. coli se utilizaron tres vectores de expresión diferentes:

pET22b(+), pMAL-c2E y pMAL-p2E. El sistema de expresión BL21(D3E)/pET22b(+) contiene una secuencia señal N-terminal

pelB para la localización periplasmática de la proteína. Además le confiere una cola de histidinas a las proteínas recombinantes en su extremo C-terminal (Figura 12A). De esta manera son fácilmente purificadas mediante cromatografías de afinidad por columna con resina de níquel agarosa (Ni-NTA His·Bind, Novagen). Las histidinas quelan iones metálicos como niquel (Ni2+), zinc (Zn2+) y cobre (Cu2+). Es posible que la fusión de esta cola pueda afectar la actividad de ciertas enzimas impidiendo su correcto plegamiento o ligación del sustrato al sitio catalítico [40-41]. En estos casos se evita la inclusión de una cola de poly-histidina en las construcciones con vectores recombinantes [26].

39

Conforme a los antecedentes señalados, para aumentar la probabilidad de expresar la

proteína en forma activa, además de diseñar partidores para incluir la cola de histidinas, se diseñaron partidores para excluir la cola de fusión en la construcción del vector recombinante pET22b(+). Otra estrategia para el mismo fin sería cortar la cola con enteroquinasa una vez expresada y purificada la proteína, pero resulta más complejo debido a que pudiera existir un sitio de corte para esta enzima dentro de la secuencia de la proteína de interés, además de alargar el proceso de obtención de la proteína activa. En el caso de no actividad con la cola incluida en la proteína se probaría este método.

Figura 12: Vectores de clonamiento y expresión.

(A) Vector pET-22b(+), (B) vector pMAL-c/p2E y (C) vector pGEM-T Easy. Ori pBR322: origen de replicación bacteriano derivado de pBR322; M13 ori: origen de replicación de DNA de hebra simple derivado del bacteriófago M13; F1 ori: origen de replicación de DNA de hebra simple derivado del bacteriófago F1. Ampr: gen de resistencia a ampicilina; T7: promotor para T7 polimerasa; LacI: gen que codifica el represor lac; Ptac: control del promotor híbrido tac; codón de inicio lacZ: región codificante para la β-galactosidasa interrumpida por el sitio de clonamiento; malE: secuencia codificante para la proteína MBP. Ap: secuencia codificante para bla contiene la región codificante de β-galactosidasa interrumpida por el sitio de clonamiento.

40

El sistema de expresión TB1/pMALc2E se basa en que el gen clonado se inserta en el sitio

múltiple de clonamiento río abajo del gen malE que codifica para la proteína de unión a maltosa (MBP), resultando en la expresión de una proteína fusionada a MBP. Esta interactuaría directamente con la proteína actuando como chaperona intramolecular [19]. Podría mejorar enormemente la solubilidad de la proteína, además de facilitar su purificación en una cromatografía de afinidad a maltosa [4].

Los vectores pMAL-c2E y pMAL-p2E también contienen una secuencia que codifica para el

péptido Asp-Asp-Asp-Asp-Lys reconocido por la proteasa enteroquinasa, localizada justo en el

extremo 5’ del sitio de clonamiento múltiple. Esto permite separar MBP de la proteína de interés

luego de su purificación. El vector pMAL-c2E tiene una deleción en la secuencia señal malE, lo que resulta en la expresión citoplasmática de la proteína de fusión (Figura 12B), mientras que el vector pMAL-p2E no cuenta con deleciones en dicha secuencia, expresando así la proteína de fusión se en el periplasma [4]. También se diseñaron partidores para insertar el gen t7 en estos vectores de expresión.

El vector de clonamiento pGEM-T Easy se caracteriza por poseer una timidina en el

extremo 3’ de cada una de las hebras en el sitio de inserción (Figura 12C), lo que permite la ligación de segmentos de DNA obtenidos por PCR que tienen una adenina en el extremo 3’ de cada hebra, debido a la acción de la Taq DNA polimerasa [4].

3.4.1. Diseño de partidores para el clonamiento del gen t7 en los vectores de expresión

Para poder insertar el gen t7 en los vectores de expresión, se realizó PCR sobre el DNA

genómico, utilizando como partidores oligonucleótidos que contienen sitios de restricción para enzimas, cuyos sitios de restricción también se encuentran en el sitio de clonamiento múltiple (MCS) de los plasmidios.

Los partidores tienen una cola con la secuencia correspondiente al sitio de corte de la

enzima de restricción que se quiere usar. Al partidor que va en el sentido del gen (el que va a formar parte de éste) se le denomina S (sentido) y al partidor que va a formar parte de la hebra complementaria a la que se encuentra el gen, se le llama A (antisentido).

41

Para insertar el gen en el vector pET22b(+) se diseñaron basándose en la secuencia encontrada, dos opciones de vectores recombinantes que incluyen el péptido señal para exportación a periplasma del vector (pelB). Estas se describen a continuación:

• Una construcción tenía el gen t7 fusionado a un fragmento que codifica una cola de

histidinas en el extremo carboxilo terminal. Para esto se diseñaron los partidores pETNcoIS y pETXhoIA con los sitios de restricción NcoI y XhoI respectivamente.

• Una construcción no fusionada a la cola de histidinas. Para esto se diseñaron los

partidores pETNcoIS y pETSHXhoIA con los sitios de restricción NcoI y XhoI respectivamente.

Para los sistemas de expresión pMALc2E (sin péptido de exportación) y pMALp2E (con

péptido de exportación a periplasma), se diseñaron los partidores pMALT7S y pMALT7A con sitios de restricción KpnI y XbaI, respectivamente. En este caso se decidió no incluir el péptido señal del gen, ya que pMAL otorga una secuencia codificante para la MBP río arriba de éste, no pudiendo desempeñar su función por lo que estaría de más.

Las secuencias de los partidores utilizados para la inserción en ambos plasmidios se

muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Partidores utilizados para el clonamiento del gen codificante para proteasa.

Nombre Secuencia (5’→ 3’) Tm (ºC)

pETNcoIS CCATGGCAATCAGTTTCAAGTTCAGTGG 71

pETXhoIA CTCGAGCGGTTGGTATTGCCCG 72

pETSHXhoIA CTCGAGAGGACGGTTTCAGTAAATTTTTTG 69

pMALT7S GGTACCGCAATCAGTTTCAAGTTCAGTGG 68

pMALT7A TCTAGACGGTTGGTATTGCCCGCTA 68

Los sitios de restricción aparecen destacados con negrita.

3.4.2. Clonamiento del gen t7 en los plasmidios pET22b(+), pMALc2E y pMALp2E

El gen t7 se amplificó desde DNA genómico, con los partidores que incluyen sitios de

restricción adecuados para ser clonados en cada vector de expresión. Se utilizó la polimerasa Elongasa®. Esta además de poseer actividad proofreading, contiene Taq DNA polimerasa que agrega una base de adenina al extremo 3’, permitiendo la posterior ligación al vector de Clonamiento pGEM-T Easy.

42

Se amplificó por PCR el ORF completo del gen directamente desde el DNA genómico de la

cepa p9/2-10 con los partidores para las tres construcciones descritas anteriormente y se analizaron en un gel de agarosa (Figura 13).

1018

1636

2036

3054

PM 1 2 3

Figura 13: Introducción de sitios de restricción en los extremos del gen t7.

PM: marcador 1Kb (1) Amplificado con pETNcoIS y pETXhoIA; (2) Amplificado con pETNcoIS y pETSHXhoIA; (3) Amplificado con pMALT7S y pMALT7A.

Las bandas muestran un fragmento en el rango del tamaño esperado (2124 pb). Se ligaron los insertos purificados en pGEM-T Easy para después ser transformados

mediante electroporación en la cepa E. coli DH5α y posteriormente sembrados en LB agar.

Se encontraron colonias azules y colonias blancas. El plasmidio tiene un gen que codifica

para la β-galactosidasa, la cual degrada el sustrato X-gal contenido en la placa liberando un color

azul. El inserto interrumpe el gen de la B-galactosidasa, por lo que esta no se expresa y no degrada X-gal, en este caso las colonias son blancas. Por lo tanto las colonias de interés son las blancas ya que contienen los plasmidios con insertos. Por otro lado, todas las colonias ya sean blancas o azules tienen el plasmidio ya que sobrevivieron a la carbenicilina (tienen un gen de resistencia a este antibiótico). El uso de antibiótico es para asegurar la presencia de los plasmidios, ya que sin éste la célula tiende a expulsar los plasmidios foráneos.

Luego se realizó un PCR de colonias (para chequear la correcta orientación del inserto), se

seleccionó una colonia para cada caso y se dejaron incubando.

43

Los fragmentos amplificados mostraron un tamaño aproximado de 2000 pb. Sin duda estos

corresponden a la proteasaT7 (Figura 14).

Figura 14: PCR de colonias.

PM: marcador 1Kb (1,2,3 y 4): Colonias amplificadas con pETNcoIS y pETXhoIA. (5,6,7 y 8): DNA de colonias amplificado con pETNcoIS y pETSHXhoIA. (9, 10 y 11): DNA de colonias amplificado con pMALT7S y pMALT7A.

Todas las colonias resultaron ser positivas. Se eligió una de cada grupo y, luego de la

incubación, se realizaron minipreparaciones de DNA plasmidial, obteniéndose los siguientes vectores aislados:

pGEM-T7NcoI; pGEM-T Easy más el inserto con sitios de restricción NcoI y XhoI pGEM-T7NcoISH; pGEM-T Easy más el inserto con sitios de restricción NcoI y XhoI pGEM-T7KpnI; pGEM-T Easy más el inserto con sitios de restricción KpnI y XbaI Los vectores pGEM-T7NcoI, pGEM-T7NcoISH y pGEM-T7KpnI fueron digeridos con las

enzimas de restricción cuyos sitios de corte fueron incluidos previamente en los extremos del gen durante la amplificación. Cada vector se digirió usando tres diluciones de DNA (10, 5 y 1 µL), con los respectivos tampones y enzimas de restricción. Esto se realizó para tener un pool de opciones y así evitar posibles contaminaciones en el caso de arrastrar material genético no deseado al momento de cortar las bandas de insertos desde el gel de agarosa.

Las tres diluciones de pGEM-T7NcoI y de pGEM-T7NcoISH fueron digeridas con NcoI y

XhoI (Figura 15A). Las de pGEM-T7KpnI con KpnI y XbaI (Figura 15B). Para cada caso se observan dos bandas claras, cada una con el tamaño esperado; el plasmidio pGEM-T correspondiente a una banda de 3015 pb y el inserto a un tamaño de banda aproximado de 2140 pb (incluyendo los pb de los partidores). Además se aprecian bandas con intensidades proporcionales a las diluciones de DNA (como era de esperarse).

44

Con el fin de ligar cada fragmento a su respectivo vector de expresión, estos fueron

digeridos con las mismas enzimas de restricción, es decir, pMALc2E y pMALp2E con KpnI-XbaI (Figura 15B) y pET22b(+) con NcoI-XhoI (Figura 15C). Los vectores pMALc2E, pMALp2E y pET22b(+) también aparecen con un tamaño de banda esperado de 6646 y 5493 respectivamente (Figura 15).

PM 1 2 3 4 5 6 7 8

1018

1636

2036

3054

A

PM 1 2 3 4 5 6 7

1018

1636

2036

3054

7126

5090

B

PM 1 2

1018

1636

2036

3054

7126

5090

C

Figura 15: Electroforesis de digestiones de DNA plasmidial con distintas concentraciones de DNA y linearización de vectores de expresión.

A: PM: marcador 1Kb. (1 y 5): carriles vacíos. (2, 3 y 4): Digestión de pGEM-T7NcoI con NcoI y XhoI con 10, 5 y 1 µL de templado respectivamente. (6, 7 y 8): Digestión de pGEM-T7NcoISH con NcoI y XhoI con 10, 5 y 1 µL de templado respectivamente. B: (1,2 y 3): Digestión de pGEM-T7KpnI con KpnI y XbaI con 10, 5 y 1 µL de templado respectivamente. (4 y 6): carriles vacíos (5): pMALc2E digerido con KpnI y XbaI, (7): pMALp2E digerido con KpnI y XbaI. C: (1): carril vacío. (2): pET22b(+) digerido con NcoI y XhoI.

Los carriles vacíos cumplen el objetivo de evitar arrastrar material genético adyacente no

deseado al momento de cortar las bandas desde el gel. Se cortaron y purificaron desde los geles de agarosa las bandas correspondientes a los

vectores y a los insertos, a estos se les denominó T7NcoI, T7NcoISH y T7KpnI, respectivamente. A los vectores linearizados se les nombró: pET-NcoI, pMALc-KpnI y pMAL-KpnI. Posteriormente los insertos se ligaron a los vectores de expresión correspondientes (ver sección 2.2.8), es decir:

T7NcoI con pET-NcoI → pET-NcoI

T7NcoISH con pET-NcoI → pET-NcoISH

T7KpnI con pMALc-KpnI → pMALcT7

T7KpnI con pMALp-KpnI. → pMALpT7

45

De esta manera se obtuvieron 12 construcciones, las cuales se clonaron en E. coli DH5α.

Los vectores fueron purificados mediante minipreparaciones. Luego se corroboró la

presencia del inserto en cada construcción, mediante la digestión de cada plasmidio recombinante con las enzimas de restricción correspondientes y posterior análisis electroforético en un gel de agarosa. Para los vectores pET22b(+), pMALc2E y pMALp2E linearizados se obtuvieron bandas definidas del tamaño esperado de 5493 y 6646 respectivamente (aproximado), igualmente los insertos resultaron todos en el rango del tamaño esperado de 2124 pb (Figura 16).

PM 1 2 3 4 5 6 PM 7 8 9

1018

1636

2036

3054

71265090

PM 10 11 12

1018

1636

2036

3054

71265090

Figura 16: Digestión de plasmidios recombinantes.

PM: marcador 1Kb. (1, 2 y 3) Digestión del constructo pET-NcoI con las enzimas NcoI y XhoI para las diluciones de 10, 5 y 1 µL de DNA respectivamente. (4, 5 y 6): Digestión del constructo pET-NcoISH con las enzimas NcoI y XhoI para las diluciones de 10, 5 y 1 µL de DNA respectivamente. (7, 8 y 9): Digestión del constructo pMALcT7 con las enzimas KpnI y XbaI para las diluciones de 10, 5 y 1 µL de DNA respectivamente. (10, 11 y 12): Digestión del constructo pMALpT7 con las enzimas KpnI y XbaI para las diluciones de 10, 5 y 1 µL de DNA respectivamente.

3.4.3. Clonamiento de plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3) y TB1.

E. coli BL21(DE3) y TB1 poseen en su genoma el gen de la RNA polimerasa del fago T7

(T7 RNApol). Este gen posee en su zona operadora un sitio de unión para el represor lacI, que se expresa constitutivamente. En ausencia de IPTG, lacI reprime la transcripción de la T7 RNApol. Cuando hay IPTG este se une a lacI, induciendo un cambio conformacional que resulta en la disociación de este del operador. De esta manera, la T7 RNApol se expresa normalmente permitiendo la posterior transcripción del gen heterólogo que está bajo el control específico del promotor de T7.

46

El plasmidio también cuenta con un gen represor que se transcribe constantemente en

ausencia de IPTG. Esta redundancia en represores es para evitar la expresión basal, ya que se puede producir una sobrecarga metabólica, además de que la enzima es una proteasa que puede dañar a la célula imposibilitando su posterior recuperación.

Se utilizaron los vectores recombinantes productos de las minipreparaciones obtenidas en el

punto 3.4.2. para transformar células de E. coli. La cepa BL21(DE3) se transformó con los 6 vectores recombinantes obtenidos, 3 pET-NcoI y 3 pET-NcoISH ; la cepa TB1 con los 3 plasmidios pMALcT7 y los 3 pMALpT7. De esta manera se lograron 12 transformaciones.

Después de realizar un PCR de colonias, se dejaron creciendo 2 positivas de cada

construcción, es decir 24 en total. Esto para ampliar la gama de posibles clones activos, aún considerando que ambos provienen de la misma colonia inicial. Es posible que los insertos muten a medida que se transforman en células competentes, debido al mecanismo de defensa de la célula frente a material genético foráneo [42].

Una fracción de los inóculos (900 µL) se guardó a -80 ºC en glicerol 80% como stock, el

resto se sometieron a minipreparaciones y posteriores digestiones para reasegurar la presencia de los insertos. Las digestiones se cargaron en un gel de agarosa encontrándose los tamaños de banda esperados para los distintos vectores e insertos al igual que en las digestiones anteriores (no mostrado).

3.5. Pruebas de actividad proteasa extracelular

Con el fin de identificar las colonias con actividad proteolítica extracelular, se transfirieron

40 colonias (10 de cada constructo) desde las últimas placas de LB agar sembradas, a una placa con medio SM-agar como se indica en la sección 2.2.11. Luego de 16 h de incubación a 37 ºC y 48 h a 4 ºC, la placa se expuso a luz UV (350 nm) para ser fotografiada (no mostrada).

Las colonias secretoras de proteasas se distinguieron visualmente por la formación de un

halo decolorado alrededor de éstas. Estos halos se observaron alrededor de 7 de las colonias con el vector recombinante pET-T7NcoI, una de las cuales fue seleccionada para la posterior inducción. En el caso del constructo pET-T7NcoISH se observaron halos en 5 de las colonias.

47

Las colonias con pMALcT7 no mostraron halos, lo que era de esperarse debido a que la

proteína recombinante no es secretada con este vector. Estas sirvieron como control negativo para las colonias con pMALpT7, que exporta las proteínas al periplasma. Se observaron halos en todas las colonias. Los halos observados tenían un tamaño relativamente estándar, condición esperada ya que se trata de la misma cepa de la cual se extrajo el DNA genómico para amplificar la T7.

De acuerdo a esto los vectores recombinantes con una mayor probabilidad de expresar la

proteína en forma activa a priori serían pET-T7NcoISH y pET-T7NcoI. Se decidió expresar estos vectores utilizando el sistema de expresión E. coli BL21(DE3). Los vectores recombinantes pMALcT7 y pMALpT7 quedaron pendientes para ser expresados con el sistema de expresión E. coli TB1/pMAL-c2E. Esta elección se basó en la experiencia del manejo del primer sistema y antecedentes que muestran complicaciones al momento de intentar cortar la MBP en el segundo sistema, impidiendo obtener la proteína activa con su conformación original [4].

3.6. Producción de la proteasa recombinante T7 en E. coli

Con el fin de saber si la proteína recombinante tenía actividad proteolítica, se indujo la

expresión del la T7 con IPTG como se describe en Metodología (sección 2.2.12), durante 15 horas a 20 ºC, 5 ml de inóculo en medio de cultivo LB a modo de experimento piloto. La inducción se realizó con 3 clones recombinantes de E. coli BL21(DE3) transformados con pET-NcoI y con 3 clones transformados con pET-NcoISH.

Para saber si la proteína era secretada al medio extracelular, se le midió la actividad

proteolítica in situ a los sobrenadantes obtenidos luego de la inducción de los clones mediante zimogramas como se indica en la sección 2.2.15. Estos se realizaron en geles de acrilamida-bisacrilamida al 12,5 % y 2 % gelatina, a modo de sustrato para subtilisinas. Fue posible observar claramente para todos los clones bandas blancas, indicativo de actividad (Figura 17), del tamaño esperado de 72 kDa calculado previamente a partir de la secuencia nucleotídica con el programa Omiga.

48

Figura 17: Identificación de clones activos en los sobrenadantes mediante zimograma.

PM: Marcador de masa molecular. (1, 2 y 3): clones transformados con pET-NcoISH. (4, 5 y 6): clones transformados con pET-NcoI.

La expresión del gen t7 sin la unión a la cola de histidinas resultó viable y activa. Sin

embargo la cola de histidinas no fue un impedimento para obtener la proteasa T7 de forma activa. Dado que este péptido de fusión unido a la proteína tiene la ventaja de ser purificado fácilmente, se continuó realizando ensayos de expresión y posterior purificación con el constructo pET-T7NcoI.

A pesar de que se obtuvo actividad en el sobrenadante para todos los clones, no fue posible

asegurar que la proteína se estaba secretando al medio extracelular producto del sistema de expresión. Esto debido a que las células se encontraban lisadas al momento de medir la actividad, por lo tanto, las proteínas activas podrían haberse encontrado tanto en el sobrenadante como en la fracción periplasmática o citoplasmática antes de la recolección. Con el objetivo de dilucidar en qué fracción celular se encontraba realmente la proteína se realizó un nuevo ensayo. Se volvieron a inducir dos clones (5 y 6) y un control en 150 ml de cultivo por 12 h a 20 ºC. Las fracciones sobrenadante, periplasma y citoplasma de cada clon fueron purificadas con resina NI-NTA, obteniendo 4 eluciones de 500 µL (sección 2.2.13). Parte de las eluciones nº 2 se cargaron en zimogramas (sección 2.2.15). Ambas mostraron actividad proteolítica tanto en el sobrenadante como en el periplasma (no mostrado).

Para dilucidar el efecto de la temperatura en la inducción de la proteasa recombinante, se

repitió la expresión de los clones n°5 y nº6 junto con la posterior purificación y zimograma. En la fracción del sobrenadante no se detectó actividad. Esto pudo deberse a que estas fracciones se encontraban a -20 ºC, por lo que se analizaron las otras fracciones celulares mantenidas a 4 ºC. Con respecto a las fracciones periplasmáticas, estas muestran actividad sólo a 20 ºC (no se muestra), en cambio las citoplasmáticas muestran bandas de actividad tanto a 20 como a 30 ºC, siendo mayor la banda a 20 ºC (Figura 18).

49

Figura 18: Ensayo de actividad proteolítica in situ para la proteasa T7.

Todas las muestras corresponden a fracciones citoplasmáticas. PM: Marcador de masa molecular. (1 y 2): Controles (BL21(DE3)/pET22b(+)) a 20 y 30 °C respectivamente. (3 y 4): Clones transformados con pET-NcoI dilución 1 a 20 y 30 °C respectivamente. (5 y 6): Clones transformados con pET-NcoI dilución 5 a 20 y 30 °C respectivamente.

La diferencia en la intensidad de las bandas correspondientes a las fracciones

citoplasmáticas a 20 y 30 °C (Figura 18) observada para ambos clones (carriles 3-4, y 5-6, respectivamente), puede deberse a que a 30ºC: (1) se expresa menos cantidad de proteína durante la inducción; (2) el porcentaje de proteína activa bien plegada es menor; o (3) se produce la misma cantidad de enzima activa, pero se genera denaturación durante el proceso de inducción debido a la termolabilidad de la enzima.

A pesar de que existe una diferencia en la intensidad de las bandas, esta parece no ser

significativa, indicando que la producción no se ve mayormente afectada en estas condiciones de mayor temperatura. Es preciso realizar más ensayos variando las condiciones de temperatura para concluir una relación exacta entre este factor y la actividad enzimática.

Se realizó además un ensayo de actividad proteolítica en medio líquido como se indica en

la sección 2.2.16, detectándose una muy baja actividad en la fracción periplasmática y una mayor actividad en la fracción citoplasmática soluble.

50

4. CONCLUSIONES

• Se logró obtener la secuencia completa de un nuevo gen codificante para proteasa utilizando un método de genome walking. El análisis de la secuencia de la proteasa T7 aislada reveló la presencia de regiones correspondientes a: un péptido señal, una prosecuencia, dominios PPC (pre-peptidase C-terminal domain) de proteínas bacterianas y los aminoácidos que conforman la triada catalítica.

• El método de genome walking estandarizado en el laboratorio, mostró ser rápido y

eficiente. Esta técnica permitió obtener la secuencia río arriba del gen codificante para la proteasa T7 a partir de un fragmento de secuencia conocida.

• Fue posible clonar de manera correcta el gen t7 en los vectores de expresión

pET22b(+), pMALc y pMALp, con las distintas construcciones realizadas.

• Se obtuvo la proteasa recombinante T7 de forma activa con el sistema de expresión E. coli BL21(DE3)/pET22b(+) tanto con, como sin el péptido de poli-histidinas fusionado para su purificación, observándose bandas de actividad definidas correspondientes al tamaño esperado (72 kDa).

• Dependiendo de las condiciones de temperatura y tiempo de expresión, se obtuvo

actividad proteolítica en el sobrenadante, fracción periplasmática y citoplasmática. La mayor cantidad de enzima activa obtenida corresponde a la fracción citoplasmática.

• En un tiempo de inducción de cuatro horas de la proteasa T7, la cantidad de enzima

activa es mayor a 20 °C que a 30 °C, además de encontrarse activa en el periplasma sólo a 20 °C.

• Fue posible producir exitosamente una subtilisina criofílica recombinante en E. coli.

• La proteasa recombinante T4 se expresó de forma inactiva en la fracción

citoplasmática soluble.

51

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42. Comunicación personal. Salazar Oriana.

55

6. ANEXOS

A. Electroforesis de DNA en geles de agarosa

Las electroforesis de DNA se realizan en una cámara horizontal Horizon-58 (Gibco-BRL

Life Technologies, Inc., MA-USA). Las muestras se mezclan en proporción 5:1 con tampón de carga 6X (glicerol 30% p/v y azul de bromofenol 0,25% p/v) y luego se cargan en geles de agarosa 0,8% p/v. La agarosa se prepara en tampón TAE 1X: Tris-Acetato-EDTA (Tris 40 mM, acetato 20 mM y EDTA 1 mM) y bromuro de etidio 0,2 µg/mL. Se incluye estándar de peso

molecular de tamaño 1 Kpb. Las electroforesis se realizan bajo voltaje constante de 100 V (fuente de poder Model 500 de BRL Life Technologies, Inc., MD-USA). Se utiliza como tampón de corrida TAE 1X. Finalmente se observa el gel sobre un transiluminador UV y se fotografía.

B. Purificación de DNA a partir de geles de agarosa

Se corta la banda de DNA del gel, minimizando el exceso de agarosa. Después se deposita

en un tubo Eppendorf de 1,6 mL esterilizado por autoclave, para luego utilizar el sistema QIAEX II Gel Extraction, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Finalmente, el DNA se eluye en agua Milli-Q estéril a pH 8, previamente calentada a 50 ºC.

C. Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy

La mezcla de reacción se realiza en un volumen final de 10 µL y contiene tampón de

ligación 2X, 50 ng de vector pGEM-T Easy, 3,5 µL de DNA y 1 unidad de enzima T4-DNA

ligasa. Se deja ligando por 16 h a 4 ºC.

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D. Transformación de células electrocompetentes

Sobre 20 µL de células electrocompetentes E. coli DH5α, BL21(DE3) ó TB1, se agrega 1

µL de mezcla de ligación. La electroporación se realiza en un equipo Cell-Porator®

Electroporation System (Gibco-BRL Life Technologies, Inc., MD-USA) en las siguientes condiciones: 420 V, 330 µF, baja impedancia y una tasa de carga rápida. Las células

transformadas se mezclan en 1 mL de medio LB y se incuban a 37 ºC durante 1 h. Luego se centrifugan a 13.000 rpm (centrífuga Eppendorf 5403 de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) durante 1 min y se descartan 850 µL del sobrenadante. El precipitado se resuspende en el

sobrenadante remanente y se siembra sobre placas de LB agar estériles con carbenicilina 100 µg/mL para el caso de células transformadas con vectores de expresión, y además X-gal 50

µg/mL e IPTG 1 mM para el caso de células transformadas con pGEM-T Easy. Las placas de

transformación se incuban a 37 ºC durante 16 h. Para su mantención se conservan a 4 ºC.

E. Minipreparación de DNA plasmidial

El DNA plasmidial se extrae a partir de un inóculo en 4 mL de medio LB con carbenicilina

100 µg/mL, incubado por 16 h a 37 ºC a 200 rpm. El cultivo se centrifuga a 13.000 x gv

(centrífuga Eppendorf 5403 de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) por 1 min en un tubo Eppendorf de 1,6 mL (previamente esterilizado por autoclave) con 1 mL por vez. El proceso se repite hasta obtener un precipitado de bacterias. A continuación se utiliza el sistema QIAprep Spin Miniprep Kit. La extracción se realiza según las instrucciones del fabricante.

F. Amplificación de DNA mediante PCR con Elongasa®

El PCR consiste en 2 mezclas que hacen un volumen final de 50 µL. La mezcla 1 se

prepara de acuerdo a: ambos partidores en una concentración de 5 pM cada uno, 150 ng de templado, 0,2 mM de cada dNTP y se completa con agua Milli-Q estéril hasta 20 µL. La mezcla

2 consiste en: tampón A 5X y tampón B 5X para una concentración final de Tris-SO4 60 mM (pH 9,1), (NH4)2SO4 18 mM y MgSO4 1,9 mM, 1 µL de enzima Elongasa® y se completa con agua

Milli-Q estéril hasta 30 µL.

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La mezcla 1 se incuba por 30 segundos a 94 ºC en un termociclador (termociclador PTC-100 de MJ Research, Inc., MA-USA), luego se agrega la mezcla 2 y se continúa con el siguiente programa: 5 min a 94°C, 3 ciclos (30 s a 94 ºC, 30s a 48 ºC, 1 min 20 s a 68 ºC), 20 ciclos (30 s a 94 ºC, 30seg a 59 ºC, 1 min a 68 ºC), 5 min a 72 ºC.

G. PCR de Colonias

Se seleccionan 4 o 5 colonias y se transfirieren mediante una punta estéril desde la placa de

transformación a una placa numerada de LB agar con carbenicilina, luego la punta se inserta en un tubo Eppendorf con 30 µL de agua Milli-Q estéril. La suspensión se incuba a 100 ºC durante

15 min. Se toman 5 µL de DNA denaturado y se agregan sobre 15 µL de mezcla de PCR. La

presencia del inserto se confirma utilizando los partidores respectivos que amplificaron el fragmento clonado, para lo cual se utilizó el siguiente protocolo de PCR: 5 min a 94°C, 30 ciclos (30 s a 94°C, 30 s a temperatura relativa a las Tm de los partidores, 30 s a 72°C), 5 min a 72°C. Los productos de PCR de colonias se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa 0,8%.

H. Agar Luria Bertani (100mL)

• Luria Bertani 1,55 gr • NaCl 0,95 gr • Agar 1,5 gr • Llevar a 100 mL con H2O (HPLC) y autoclavar.

I. Medio Luria Bertani (100mL)

• Luria Bertani 1,55 gr • NaCl 0,95 gr • Llevar a 100 mL con H2O (HPLC) y autoclavar.

J. TB (1000 ml)

• Tryptona 12 gr • Extracto de levadura 24gr • Glicerol 04 ml • Llevar a 900 ml con H2O desionizada y esterilizar por autoclave. • Agregar 100 mL de fosfato de potasio estéril (Anexo K).

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K. Kphosphate (1000 ml)

• KH2PO4 23,1 gr • K2HPO4 125,4 gr • Llevar a 1000 ml con H2O desionizada y autoclavar.

L. IPTG 0,1 M

• Preparar una solución stock de IPTG 0,1 M en agua Milli-Q estéril. • Esterilizar por filtración con un tamaño de poro de 0,2 µm (Sartorius, Hannover-

Alemania). • Almacenar a 4 ºC.

M. XGal 50 mg/mL

• Preparar una solución stock de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-galactosidol (XGal) a una

concentración de 50 mg/mL en N,N’- dimetil-formamida. • Almacenar a -20 ºC.

N. Carbenicilina 100 mg/mL

• Preparar una solución stock de carbenicilina a una concentración de 100 mg/mL en agua

Milli-Q estéril. • Esterilizar por filtración con un tamaño de poro de 0,2 µm.

• Almacenar a -20 ºC.

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O. Tampón Binding 10X (1000 ml)

• Na2HPO4 82,95 gr • NaH2PO4 4,69 gr • NaCl 175,3 gr • Imidazol 6,808 gr • Ajustar a pH 8.0 • Para hacer Binding buffer 1X, diluir 100 ml de Binding buffer 10 X en 900 ml de H2O

desionizada.

P. Tampón de lavado 1X (250 ml)

• Tampón Binding 10 X 25 ml • Imidazol l0,17 gr • Agregar 225 ml de H2O desionizada. • Ajustar a pH 8.0

Q. Tampón de elución 1X (100 ml)

• Tampón Binding 10 X 10 ml • Imidazol 1,63 gr • Agregar 100 ml de H2O desionizada. • Ajustar a pH 8.0