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UNIVERS IDAD

UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA

ANÁLISIS DE GENOTIPOS Y DE LOS TIEMPOS DE DUPLICACIÓN DE

CEPAS DE Staphylococcus aureus RESISTENTE A METICILINA

AISLADAS DE INFECCIONES NOSOCOMIALES Y ADQUIRIDAS EN LA

COMUNIDAD

Tesis para obtener el grado de

Doctor en Ciencias Médicas

Presenta

M. en C. Gerardo Martínez Aguilar

Asesores

D. en C. Xóchitl A. R. Trujillo Trujillo

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Colima

D. en C. Celia M. Alpuche Aranda

Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaría de Salud

D. en C. Miguel Huerta Viera

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Colima

2

Colima, Col. Marzo del 2010

AGRADECIMIENTOS Y DEDICATORIAS

Al CONACyT por la beca otorgada para la realización del Doctorado: No. de registro 82192.

Este proyecto fue realizado con recursos otorgados por Fondos Sectoriales/Conacyt al

proyecto “EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE S. aureus RESISTENTE A METICILINA

ADQUIRIDO EN HOSPITALES Y EN LA COMUNIDAD” con el número de registro

SALUD-2003-C01-091, The Fogarty International Center of the National Institutes of Health

Grant D43 TW01036 y del Fondo de Fomento a la Investigación FOFOI 2005/1/I/046.

A todas las enfermeras, médicos, y químicos de los hospitales participantes ya que con su

apoyo y compromiso fue posible el desarrollo de este proyecto.

3

INDICE

Resumen 1

Abstract 2

Glosario 3

Antecedentes 5

Planteamiento del problema 12

Pregunta de Investigación 13

Hipotesis general 13

Objetivo general 13

Objetivos específicos 14

Material y Métodos 14

Tipo de Estudio 14

Periodo de Estudio 14

Clasificación de las infecciones de acuerdo a su origen 15

Tamaño de la muestra 15

Colaboración con otras Instituciones 15

Hospitales participantes 16

Variables del Estudio 16

Definición operacional de las variables 16

Identificación inicial de S. aureus y de la resistencia a meticilina 17

Conservación y envío de las cepas de S. aureus. 17

Susceptibilidad a antimicrobianos 17

Extracción de DNA 18

Electroforesis de campos pulsados 18

Tipificación de SSCmec por PCR con iniciadores múltiples 18

Detección de genes que codifican para Panton-valentine-leucocidin 19

4

Tipificación de secuencias de locus múltiples 20

Asignación, interpretación y comparación de las secuencias de locus múltiples 21

Tiempos de duplicación de cepas nosocomilaes y comunitarias de S aureus 21

Análisis estadístico 22

Aspectos éticos 23

Recursos financieros 23

Instituciones y personal participante 24

Resultados 25

Discusión 33

Conclusiones 37

Perspectivas 38

Bibliografía 39

Anexo 1 45

Anexo 2

Anexo 3

48

49

Tablas y Figuras

Tabla 1 19

Tabla 2 20

Tabla 3 25

Tabla 4 26

Tabla 5 31

Tabla 6

Tabla 7

31

32

Figura 1 22

Figura 2 28

Figura 3 30

5

RESUMEN

Antecedentes. Se ha postulado que las cepas comunitarias de Staphylococcus aureus

resistente a meticilina (SARM) tienen tiempos de duplicación menores que las nosocomiales.

Objetivo. Comparar los tiempos de duplicación de cepas comunitarias de SARM-AC y de

cepas nosocomiales de SARM-AH de acuerdo a sus genotipos.

Metodología. Estudio transversal comparativo efectuado con cepas nosocomiales y

comunitarias de SARM aisladas de algunos hospitales mexicanos durante los años 2005 y

2006. Se realizó la caracterización molecular de las cepas mediante: electroforesis de campos

pulsados, tipificación del tipo de casete cromosómico de resistencia a meticilina (SCCmec) por

reacción en cadena de la polimerasa con iniciadores múltiples y tipificación de secuencias de

locus múltiples. Se compararon los tiempos de duplicación de cepas susceptibles y resistentes

a meticilina, de acuerdo al tipo de SCCmec y de sus secuencias tipo.

Resultados. se analizaron un total de 426 cepas de S. aureus, 351 (82.4%) de origen

nosocomial y 75 (17.6%) de origen comunitario. Se encontraron 83 cepas resistentes a

meticilina de origen nosocomial y 3 de origen comunitario. No se encontraron diferencias

significativas en los tiempos de duplicación de acuerdo a la susceptibilidad o resistencia a

meticilina y al el tipo de SCCmec (p = 0.187) ni de acuerdo a sus secuencias tipo (p = 0.765).

Se documentaron las clonas circulando en los hospitales participantes así como la presencia de

SARM-AC. La secuenciación de genes caseros mostró la presencia de una clona no descrita

previamente.

Conclusiones. Los tiempos de duplicación de cepas nosocomiales y comunitarias no están

determinados por el tipo de SCCmec o los tipos clonales. Se documentó la presencia de

SARM-AC en México y la existencia de una clona nosocomial no reportada previamente.

6

ABSTRACT

Background. It has been hypothesized that community acquired methicilin-resistant S. aureus

(MRSA) have generation times shorter than nosocomial strains

Objective. To compare generation times in CA-MRSA and in HA-MRSA strains according to

its genotype.

Methods. A cross sectional comparative study was performed with hospital and community

acquired strains isolated from Mexican hospitals during 2005 and 2006. Molecular

characterization was performed by pulsed field gel electrophoresis. Multiplex PCR typing for

SCCmec types and multilocus sequence typing for clonal types. Generation times were

compared among resistant and susceptible S. aureus strains and according to their SSCmec

type and sequence type.

Results. Four hundred and twenty six S. aureus strains were analyzed; 351 (82.4%) from

Mexican hospitals and 75 (17.5%) community acquired. Eighty six were methicillin-resistant,

83 nosocomial and 3 community acquired. We did not found significant differences in the

generation times of the strains according to their susceptibility or resistance to methicillin,

SCCmec type (p = 0.187) and sequence type (p = 0.765). The nosocomial clones circulating in

hospital were documented and also the presence of CA-MRSA. Housekeeping genes

sequencing showed a clone not reported previously.

Conclusions. Generation times of nosocomial and community acquired strains were not

determined by the SCCmec type or clonal type. We documented the emergence of CA-MRSA

in Mexico and the presence of a nosocomial clone not previously reported.

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GLOSARIO

Staphylococcus aureus susceptible a meticilina (SASM). S. aureus susceptible a todos los

antibióticos β lactámicos

Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM). S. aureus resistente a todos los

antibióticos β lactámicos

Staphylococcus aureu resistente a meticilina de adquisición comunitaria (SARM-AC). S.

aureus resistente a todos los antibióticos β lactámicos aislado de pacientes sin historia de

hospitalización en el año previo

Staphylococcus aureu resistente a meticilina de adquisición hospitalaria (SARM-AH). S.

aureus resistente a todos los antibióticos β lactámicos aislado de pacientes con al menos 48

horas de hospitalización.

Casete cromosómico de resistencia a meticilina (SCCmec) Elemento genético móvil de 21 a

67 kb que se inserta en el genoma de SASM, contiene el gen mecA y sus reguladores.

Gen mecA. Gen que confiere resistencia a todos los antibióticos β lactámicos ya que codifica

para la producción de proteína alterada denominada “proteína fijadora de penicilina”

(PBP2A).

Arginine Catabolic Mobile Elment (ACME). Elemento genético móvil presente en el

SCCmec que interviene en el metabolismo de la arginina (ACME por las siglas en inglés de

Arginine Catabolic Mobile Elment) y que puede desempeñar algún papel en la virulencia de

SARM-AC.

Gen Panton-Valentine-Leucocidin (PVL). Gen que codifica para una leucocidina que tiene la

capacidad d e lisar leucocitos. Inicialmente se le atribuyo un papel patógeno en las cepas de

SARM-AC, sin embargo, este papel aun no esta claro y se le considera más como un

marcador genético de estas cepas.

Cepas de referencia ATCC. Cepas de “The American Type Culture Collection” de las cuales

se conocen todas sus características fenotípicas y que se utilizan como controles de calidad

para la identificación y pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos.

8

Kirby-Bauer. Método cualitativo para realizar pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos

mediante método de difusión de disco

Electroforesis de Campos Pulsados (ECP). Separación de fragmentos del DNA bacteriano

genómico mediante su digestión en bloques de parafina y electroforesis con campos

electromagnéticos emitidos en diversas condiciones de voltaje y tiempo a temperatura

constante.

Secuenciación de locus múltiples (MLST). Secuenciación de siete genes caseros altamente

conservados en S. aureus. Las secuencias de los alelos de estos genes permiten su clasificación

dentro de clonas circulando a nivel mundial e incluidas en una base de datos internacional.

Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI). Normas actualizadas para la realización de

pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos.

Tiempos de duplicación. Tiempo en minutos en el que las cepas se duplican al reproducirse

por conjugación y que se determina mediante curvas de crecimiento en medios de cultivo

adecuados.

9

ANTECEDENTES

Las bacterias han existido por más de 3 billones de años y son ejemplo de las formas más

antiguas de vida en la tierra. El gran potencial de evolución de estos microorganismos se

evidencia en la presencia de innumerables especies que difieren en muchas de sus propiedades

tales como: capacidad metabólica, composición de la superficie celular, nichos ecológicos y

afinidad por ciertos hospederos. 1 Desde la perspectiva Darwiniana cada organismo viviente es

el resultado de las fuerzas que controlan la evolución y que incluyen: plasticidad del genoma,

expresión de fenotipos y la presión selectiva ejercida por el medio ambiente. 2 La capacidad

de adaptarse y cambiar como respuesta a estas fuerzas constituye la base de la evolución

genética de toda forma viviente. En células eucariotas la reproducción sexual da lugar a gran

variabilidad genética. En organismos procariotas, sin la posibilidad de intercambiar material

genético de esta forma, factores tales como frecuencia de mutaciones puntuales, altos niveles

de recombinación, silenciamiento de genes y la trasferencia de material genético entre

diferentes especies y géneros determinan su evolución. Este último proceso conocido como

trasferencia horizontal de genes constituye la piedra angular de la evolución bacteriana y

conduce a cambios dramáticos en la composición de los genomas microbianos en periodos

relativamente cortos de tiempo. 3

El Staphylococcus aureus es una bacteria comensal de la mucosa nasal y de la piel de los seres

humanos. Coloniza en algún momento a aproximadamente un 30% de la población, sin

embargo es también uno de los patógenos más importantes como causa de infecciones

adquiridas en la comunidad o en el ambiente hospitalario, estas pueden ser infecciones

superficiales de la piel o infecciones generalizadas y graves tales como neumonías,

bacteriemias, endocarditis y/o choque tóxico que ponen en riesgo la vida del paciente. 4, 5

El repertorio genético de este microorganismo es amplio lo que le permite adaptarse

rápidamente a cualquier medio ambiente hostil como se evidencia por aislados clínicos de S.

aureus que muestran resistencia a virtualmente todos los antibióticos usados en la práctica

clínica para su tratamiento. 6,7,8 El ejemplo más notable de este fenómeno en los hospitales es

10

la presencia de S. aureus resistente a la meticilina (SARM), su prevalencia se aproxima al

80% en muchos centros hospitalarios de los Estados Unidos de América (EUA). 6 La

prevalencia real en México es desconocida, algunos reportes señalan que es cercana al 50%, 9

aunque en instituciones de tercer nivel de atención se han notificado hasta un 100% de

resistencia a meticilina.10 Con frecuencia las cepas nosocomiales presentan resistencia a

múltiples antibióticos además de la meticilina.11

Estas consideraciones epidemiológicas reflejan fielmente como los genes bacterianos pueden

ser transmitidos entre diferentes organismos vía conjugación, trasducción y transformación

natural. Los primeros dos procesos requieren acarreadores específicos tales como fagos y

plásmidos. La mayoría del ácido desoxiribunucleíco (ADN) trasferido por estos mecanismos

es parte del material genético localizado fuera del ADN cromosómico de la bacteria, también

conocido como material genético flexible. En este material genético también existen

transposones, integrones, islotes (< 10 kilobases (kb) e islas genéticas (> 10 kb). 12

Pese a la velocidad con la cual SARM se ha diseminado dentro de los hospitales, estas cepas

multiresistentes han sido incapaces de diseminarse a la comunidad ya que se postula que el

conservar múltiples genes de resistencia disminuye su capacidad biológica para multiplicarse

y competir con la flora comensal normal. Sin embargo, en los últimos años han aparecido y

rápidamente se han diseminado en la comunidad cepas activas y altamente virulentas de

SARM. El S. aureus resistente a la meticilina de adquisición comunitaria (SARM-AC) es

claro ejemplo de este fenómeno y fue reportado por vez primera en Australia en 1993 13 y más

tarde en otros países incluyendo el norte del Continente Americano.14-16

A diferencia de las cepas de SARM de adquisición hospitalaria (SARM-AH) que

generalmente son multirresistentes, las cepas aisladas de pacientes con infección de

adquisición comunitaria sueles ser susceptibles a múltiples antibióticos tales como:

aminoglucósidos, clindamicina, tetraciclina, rifampicina, trimetoprim/sulfametoxasol, y con

relativa frecuencia son resistentes a eritromicina. 17 Además, los individuos afectados no

tienen los factores de riesgo asociados con SARM-AH y a diferencia de las cepas

nosocomiales de SARM que raramente presentan alta virulencia, las cepas de SARM-AC

11

causan infecciones serias y a menudo fatales en pacientes inmunocompetentes. 18,19 Así

mismo, la velocidad con que se propaga esta bien adaptada clase de SARM es preocupante.

Por ejemplo, en una comunidad rural de Nativos Americanos las cepas de SARM-AC son

ahora más prevalentes que las completamente susceptibles 20 y en algunos lugares, como

Houston, Tx, se ha reportado que hasta el 73% de las infecciones por S. aureus de adquisición

comunitaria, en niños, son ocasionadas por cepas resistentes a meticilina. 21 Estos hallazgos

nos plantean la posibilidad de que esta nueva clase de SARM pueda llegar a sustituir a S.

aureus susceptible a meticilina (SASM) como la flora normal que coloniza al ser humano.

El estudio de los mecanismos moleculares de resistencia a meticilina en S. aureus, ha

mostrado que esta resistencia resulta de la integración sitio-específica de un elemento

genético de 21 a 67 kb dentro del genoma de SASM y que ha sido denominado casete

cromosómico del estafilococo (SCCmec). El SCCmec es un elemento genético móvil que

contiene el gen mecA que codifica para una proteína alterada denominada “proteína fijadora

de penicilina” (PBP2A) y sus reguladores. Esta proteína tiene actividad de transpeptidasa y es

necesaria para la síntesis del peptidoglicano de la pared celular de S. aureus. A pesar de su

nombre, esta proteína muestra disminución en la afinidad por los antibióticos β-lactámicos y

permite la síntesis de peptidoglicano en presencia de los mismos. La resistencia a meticilina

conferida por el gen mecA resulta en resistencia cruzada a todos los β-lactámicos y, por lo

tanto, inhabilita el uso de penicilinas y cefalosporinas como opción de tratamiento. 22 Además

de portar al gen mecA, el SSCmec sirve como un sitio para la integración para otros

determinantes de resistencia tales como transposones y plásmidos. En cepas de SARM

hospitalarias se han identificado cuatro tipos de SCCmec (I, II, III y IV) mientras que, las

cepas de SARM-AC poseen el tipo IV SCCmec con algunas variantes y que difiere del de

cepas nosocomiales. 8,23 El tamaño de los SCCmec I, II y III varía entre 34 y 67 kb y poseen

genes de resistencia a otros antibióticos, mientras que el tipo IV es más corto 21 a 25 kb y no

tiene otros genes de resistencia además del mecA. El tipo de SCCmec está determinado por la

clase de mec (A o B) y el tipo de complejo de genes de recombinasas llamado CCC de los

tipos 1, 2 y 3 24 por lo tanto, el genotipo de cada clona de MRSA está determinado por el tipo

de SSCmec y el tipo de cromosoma que lo recibe, este último determinado mediante la

12

secuenciación de locus múltiples (MLST) de siete genes caseros altamente conservados en S.

aureus. 25

Por su estructura molecular y función el SCCmec puede ser considerado como una isla

genómica, inicialmente descritas como islas de patogenicidad, y que en años recientes ha sido

objeto de gran atención. Inicialmente se encontraron en el genoma de cepas patógenas de E.

coli y posteriormente también se encontraron en otras bacterias y fueron asociadas con

patogenicidad. 26 La secuenciación de genomas bacterianos completos mostró que estos

elementos están presentes en muchas especies bacterianas y no son exclusivos de mecanismos

de patogenicidad y se han denominado islas genómicas. 27 Estas islas son parte del material

genético flexible de las bacterias y tiene un tamaño entre 10 y 100 kb, con frecuencia incluyen

secuencias incorporadas por fagos o plásmidos, genes de transferencia y/o integrasas y otros

elementos de inserción de secuencias. Estos bloques de material están con frecuencia

insertados en genes que codifican para ARNt y pueden ser inestables. 28,29 Además de los

elementos de movilidad estas islas acarrean grupos de genes con funciones diversas. Al igual

que otros elemento del ADN extracromosómico la mayoría de estas islas difieren el ADN

cromosomal con respecto a su contenido de G+C y a la distribución y utilización de codones.

La ventaja evolutiva de las islas genómicas sobre fragmentos pequeños de material genético

(islotes) es que un mayor número de genes pueden ser trasferidos e incorporados en bloque

dentro de un genoma receptor. Esta transferencia puede condicionar cambios dramáticos en el

comportamiento del organismo dando como resultado final un cambio evolutivo mayor que le

confiere ventajas importantes. 30,31

El análisis de las secuencias de las islas genómicas mostró que además de acarrear genes que

codifican proteínas con propiedades de trasferencia, recombinación, restricción y

modificación, la mayoría de los grupos de genes localizados en estos elementos genéticos

codifican funciones que son útiles para la sobrevida y transmisión de los microorganismos,

por lo tanto, confieren una ventaja selectiva dentro de una población a los organismos que las

poseen. Por ejemplo: elementos que codifican el ingreso de sucrosa en Salmonella senftenberg

son necesarios para la adaptación metabólica de estas bacterias a sus hospederos. 32 Otras islas

genómicas codifican para sistemas de incorporación de hierro las cuales incrementan la

13

capacidad de la bacteria para crecer y diseminarse en el suelo o dentro de un hospedero como

en el caso de las enterobacterias y Pseudomonas spp. 33 Las islas genómicas también pueden

acarrear genes que codifican factores que confieren resistencia a antimicrobianos. Por

ejemplo, la región mec-A de estafilococo favorece la sobrevida de sus portadores tanto en el

suelo donde existen microorganismos productores de antibióticos como en los hospitales con

una fuerte presión selectiva de de los mismos. 34 Recientemente se ha descrito que el SCCmec

también acarrea un elemento móvil que interviene en el metabolismo de la arginina (ACME

por las siglas en inglés de Arginine Catabolic Mobile Elment) y se postula que la selección

para resistencia y patogenicidad puede estar interrelacionada. 35 El Incremento de la fortaleza

fisiológica o “fitness” de la bacteria determinan cambios evolutivos importantes, en este

contexto el “fitness” se considera como un grupo de propiedades que favorecen la sobrevida,

diseminación y/o transmisión de un organismo dentro de un nicho ecológico específico. 36 Las

leyes Darwinianas son válidas (“sobrevida del más fuerte”) para la evolución de eucariotas y

procariotas. 37 Por lo tanto el poseer una isla genómica puede proporcionar una ventaja

selectiva bajo condiciones específicas del medioambiente (estrés, exposición a substancias

antibacterianas) debido a que incrementa la transmisión, sobrevida y colonización dentro de

un nicho. Por lo tanto desde un punto de vista funcional las islas genómicas que incrementan

la fortaleza del microorganismo que la recibe deberán ser denominados islas de fortaleza o

“fitness islands” 38 ya que le confieren a la bacteria nuevas propiedades que incrementan la

capacidad de adaptación a sus hospederos. A este respecto se ha documentado que la presencia

de ACME en el SCCmec además de contribuir a la patogenicidad incrementa el crecimiento y

sobrevida de las cepas que lo poseen. 35

Mediante la caracterización molecular (tipificación del SCCmec por reacción en cadena de la

polimerasa [PCR] y secuenciación de genes caseros por MLST) de colecciones internacionales

de SARM ha sido posible determinar que la resistencia a meticilina emergió en los hospitales

en cinco linajes clonales diferentes y que la mayoría de la cepas contemporáneas de SARM

que ocasionan infecciones intrahospitalarias son causadas por un número limitado de clonas

epidémicas. 39 A diferencia del número reducido de clonas de SARM circulando en los

hospitales de diversos continentes, 8 estudios de epidemiología molecular indican que SARM-

AC tiene linajes clonales muy diversos y sugieren que el tipo IV de SSCmec puede

diseminarse fácilmente entre clonas de S. aureus. 40

14

La presión ejercida por el medio ambiente natural o clínico condiciona que las bacterias se

seleccionen mediante mutaciones o pérdida de genes de resistencia. 41 La capacidad de una

bacteria para sobrevivir y crecer en condiciones adversas son un reflejo de su fortaleza física,

por lo tanto la medición de velocidad de crecimiento en cultivo ofrece un buen modelo para

evaluar su capacidad fisiológica y deducir los tiempos de generación o duplicación. El

desarrollo de resistencia a los antibióticos, ya sea por la adquisición de elementos de

resistencia o por mutaciones, impone un costo biológico a la bacteria que se expresa en una

disminución de su velocidad de crecimiento. 42

Es un estudio sobre la fortaleza física y el crecimiento competitivo de cepas nosocomiales de

SARM sensibles y resistentes a gentamcina, aisladas de 24 hospitales franceses, se encontró

que las cepas de SARM sensibles a gentamicina tuvieron tiempos de generación más cortos

que las cepas resistentes. Los experimentos sobre crecimiento competitivo mostraron que las

cepas de SARM sensibles a gentamicina sobrepasaron el crecimiento de las cepas resistentes a

este antibiótico. Estos resultados ayudaron a explicar de manera racional la emergencia y

predominio de cepas SARM sensibles a gentamcina en estos hospitales, así como el reemplazo

gradual de las cepas de SARM resistentes a gentamicina. 43

Por otro lado, el estudio de los fenotipos de resistencia de SARM-AC sugiere que, a diferencia

de las cepas nosocomiales las cuales son seleccionadas por la exposición a antibióticos β-

lactámicos potentes, las cepas comunitarias no fueron seleccionadas por la presión selectiva

ejercida por los antibióticos, lo que podría explicar su rápida diseminación en la comunidad.

Okuma y cols compararon los tiempos de duplicación entre cepas comunitarias (SCCmec IV)

y un número pequeño de cepas nosocomiales (SCCmec tipo I, II y III) y encontraron que los

tiempos de duplicación fueron menores para las cepas comunitarias, postulando que la alta

tasa de crecimiento de SARM-AC puede ser un prerrequisito para competir exitosamente con

otras cepas y colonizar las mucosas del ser humano en ausencia de la presión selectiva de los

antibióticos. 24 En este sentido, la presencia de resistencia a meticilina en S. aureus no implica

un costo biológico a expensas de la sobrevida, puesto que esta resistencia le proporciona a la

15

bacteria una ventaja de sobrevida selectiva solamente si se encuentra en presencia de

meticilina. 44

16

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La resistencia bacteriana es un problema grave y creciente con implicaciones importantes para

la salud pública. Staphylococcus aureus es un patógeno común en el ser humano que

desarrolla rápidamente resistencia a los antibióticos utilizados para su tratamiento como en el

caso de la meticilina. El SARM durante mucho tiempo estuvo limitado a las instituciones de

salud, por lo que la emergencia de resistencia a meticilina en S. aureus aislado de infecciones

adquiridas en la comunidad ha causado gran preocupación entre la comunidad médica, si

además se considera la emergencia de resistencia de S. aureus a otros antibióticos como la

vancomicina se magnifican las repercusiones de la resistencia a meticilina en el tratamiento

empírico con β-lactámicos, utilizado rutinariamente en infecciones de la comunidad en las

cuales S. aureus juega un rol importante. Por otra parte, las características moleculares del

elemento cromosómico que acarrea el gen de resistencia a meticilina sugieren que este se

comporta como una isla de patogenicidad y de fortaleza y además puede ser transferido

fácilmente a diferentes cepas de S. aureus y en conjunto son su velocidad de duplicación

pueden explicar su rápida diseminación en la comunidad. Por lo tanto, además del estudio

genotípico de esta clase de SARM, el estudio de sus características fenotípicas tales como la

capacidad de crecimiento podría facilitar la comprensión de los mecanismos involucrados en

su rápida diseminación y proporcionar estrategias para su control.

17

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Existen diferencias en los tiempos de duplicación entre las cepas SARM-AC y las cepas de

SARM-AH de acuerdo a sus genotipos?

HIPÓTESIS GENERAL

Los tiempos de duplicación entre las cepas de SARM-AC y las cepas de SARM-AH son

diferentes de acuerdo a sus genotipos.

OBJETIVO GENERAL

Comparar los tiempos de duplicación de cepas de SARM-AC y de cepas de SARM-AH de

acuerdo a sus genotipos.

18

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Aislar S. aureus resistente a meticilina (SARM) de infecciones comunitarias y

nosocomiales, de acuerdo a las recomendaciones de la Academia Americana de

Microbiología.

- Determinar su perfil de susceptibilidad a antimicrobianos de acuerdo a los

lineamientos del CLSI (National Committee for Clinical Laboratory Standards)

- Determinar la huella digital genómica de SARM aislado de infecciones comunitarias y

nosocomiales mediante electroforesis de campos pulsados. (ECP)

- Determinar el genotipo de SARM aislado de infecciones de adquisición nosocomial y

comunitaria, mediante la tipificación de secuencias de locus múltiples (MLST) y

mediante la tipificación del SCCmec por PCR.

- Determinar y comparar los tiempos de duplicación de cepas seleccionadas de SARM

aislado de infecciones de nosocomiales y comunitarias de acuerdo a sus genotipos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Tipo de Estudio.

Estudio transversal comparativo, para evaluar los tiempos de duplicación de cepas de SARM

aisladas de infecciones adquiridas en la comunidad y en hospitales de acuerdo a sus genotipos.

Periodo de Estudio

Se analizaron todos los aislados clínicos de S. aureus de origen nosocomial y comunitario,

obtenidos entre Enero 2005 y Junio de 2006 en los siguientes hospitales: Hospital Infantil de

México Federico Gómez, México, DF, Hospital Pediátrico de Sinaloa, Culiacán, Sinaloa.,

Hospital de Pediatría del Centro Médico de Occidente, IMSS Guadalajara, Jal., Hospital

19

General Ignacio Morones Prieto, San Luis Potosí, San Luís Potosí, Hospital General de

Durango (SSA) y Hospital General Regional No. 1 del IMSS, Durango, Durango. Todas las

cepas aisladas se enviaron al laboratorio de microbiología de la Unidad de Investigación

Biomédica del Instituto Mexicano de Seguro Social en la ciudad de Durango donde se

confirmaron los patrones de resistencia y realizaron las pruebas para la caracterización

molecular de las cepas mediante las siguientes técnicas: electroforesis de campos pulsados,

tipificación del SSCmec por reacción en cadena de la polimerasa con iniciadores múltiples

(PCR multiplex) y tipificación de secuencias de locus múltiples (MLST)

Clasificación de las infecciones de acuerdo a su origen (nosocomial o comunitario).

La clasificación del origen nosocomial o comunitario de las infecciones se realizó de acuerdo

a los criterios de la Norma Oficial Mexicana para el Control y Prevención de Infecciones

Nosocomiales. 45 Brevemente, se consideraron de origen nosocomial a las infecciones

adquiridas después de 72 horas del ingreso del paciente al hospital y que no se encontraban en

periodo de incubación al momento del ingreso. Se consideraron de origen comunitario a las

infecciones diagnosticadas en pacientes que no tenían antecedente de contacto con

instituciones de salud durante los 12 meses previos al episodio.

Tamaño de la muestra

Se incluyeron todas los aislamientos de S. aureus obtenidos durante el periodo de estudio 46

de pacientes en los que se estableció el diagnóstico de infección nosocomial o comunitaria de

los hospitales participantes.

Colaboración con otras instituciones

Se estableció colaboración con la Universidad Nacional Autónoma de México a través del

Laboratorio de Infectología, Microbiología e Inmunología Clínica de la Unidad de Medicina

Experimental de la Facultad de Medicina. Este laboratorio proporcionó asesoría técnica para la

estandarización de los tiempos de duplicación. También se estableció colaboración con el

20

Laboratorio de Enfermedades Infecciosas del Texas Children´s Hospital/Baylor College of

Medicine en Houston, Texas que proporcionó las cepas de SARM-AC y cepas de referencia

internacional y controles positivos para los protocolos de PCR.

Hospitales participantes

Los hospitales participantes se seleccionaron si contaban con especialistas en infectología,

comité para la prevención y control de infecciones nosocomiales y laboratorio de

microbiología con control de calidad.

Variables de estudio

Variable Independiente. Genotipo de las cepas de S. aureus resistente a meticilina

Variable Dependiente. Tiempos de duplicación de las cepas

Definición operacional de las variables

-S. aureus. Bacteria Gram positiva aislada de infecciones nosocomiales y de la comunidad

identificada de acuerdo a los pruebas y lineamientos recomendados por la Asociación

Americana de Microbiología. 47

-Resistencia a Meticilina. Diámetro del halo de inhibición ≤ de 21 mm que indica la

resistencia a este antibiótico y que se determina mediante la difusión en agar de un disco

conteniendo 30 µg de cefoxitina y se confirma mediante la detección del gen mecA por PCR.48

-Genotipos de las cepas de S. aureus. Diferencias genéticas entre cepas de S. aureus que se

identifican por: tipificación por PCR del tipo de SSCmec, 49 determinación de la huella digital

genómica mediante digestión inicial con la enzima Sma I y electroforesis de campos pulsados 50 y secuenciación de alelos de 7 genes caseros (MLST). 25

-Tiempos de Duplicación: Tiempo en minutos en el que las cepas se duplican al reproducirse

por conjugación y que se determina mediante curvas de crecimiento en medios de cultivo

adecuados. 51, 52

21

Identificación inicial de S. aureus y de resistencia a meticilina

Los laboratorios de microbiología de los hospitales participantes utilizaron manuales de

procedimientos estándar, control de calidad y cepas de referencia ATCC para garantizar la

correcta identificación de S. aureus y la realización de pruebas de susceptibilidad a

antimicrobianos. En todos los sitios la identificación se realizó de acuerdo a los lineamientos

recomendados por la Asociación Americana de Microbiología. 47 La búsqueda de resistencia a

meticilina se realizó por difusión en disco utilizando discos conteniendo 30 µg de cefoxitina.48

Conservación y envío de las cepas de S. aureus

Todas las cepas de S. aureus que se aislaron de episodios de infecciones nosocomiales y

comunitarias fueron conservadas en cada uno de los laboratorios de microbiología de los

hospitales participantes. De cada cultivo se realizó una resiembra y se mantuvo en crecimiento

durante toda la noche. Al día siguiente la caja completa se transfirió a tubos eppendorff de 2

mL conteniendo l mL de sangre de caballo y se conservó en congelación a –70° C. Cada mes

se enviaron a la Unidad de Investigación Biomédica en la ciudad de Durango, donde se re-

identificaron de acuerdo a los lineamientos estándar y se realizó una re-siembra para

nuevamente colectarse en sangre de caballo y mantenerse a –70° C hasta la realización de los

diferentes procedimientos de biología molecular, pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos

y tiempos de duplicación.

Susceptibilidad a antimicrobianos

En el laboratorio de la Unidad de Investigación Biomédica se realizó la determinación de

susceptibilidad a antibióticos por el método de difusión de disco (Kirby-Bauer) de acuerdo a

los lineamientos del CLSI vigentes. 48 Se incluyeron los siguientes antibióticos: vancomicina,

teicoplanina, clindamicina, trimetoprim/sulfametoxazol, eritromicina, gentamicina,

rifampicina y penicilina. Los resultados se evaluaron después de un periodo de incubación de

24 h a 35° C de acuerdo a los puntos de corte recomendados.

22

Extracción de DNA

Para la extracción del DNA cromosómico de las bacterias se realizó el siguiente

procedimiento: se tomaron dos colonias de un cultivo de 18 a 24 horas de edad, se colocaron

en caldo soya tripticasa y se crecieron en agitación constante a 35° C durante dos horas. Se

realizó un lavado de la bacteria y la extracción se completó con el sistema UltraCleanTM

Microbial DNA Kit (MO Bio Laboratories, Inc. Solana Beach, CA). La concentración

obtenida con esta técnica es de ~200 ng/µl y se corroboró corriendo una muestra en un gel de

agarosa con un marcador de peso molecular. El DNA se conservó en congelación a –20° C.

Electroforesis de Campos Pulsados

El crecimiento, la digestión y electroforesis de las cepas obtenidas se realizó de acuerdo al

procedimiento recomendado por McDougal 50 y descrito detalladamente en el anexo 1.

Tipificación de SCCmec por PCR con iniciadores múltiples

La tipificación del elemento cromosómico que acarrea el gen de resistencia a meticilina se

efectuó mediante PCR de tipo múltiplex que está basada en el uso de iniciadores múltiples

para detectar las secuencias de los diferentes tipos de SSCmec. En esta técnica se seleccionan

ocho locus (A-H) con base en secuencias previamente descritas, en la tabla 1 se muestran los

locus con sus respectivos cebadores, secuencias de oligonucleótidos, tamaño esperado del

producto, y tipo de SCCmec. 49 El protocolo para PCR múltiple se realizó con mezclas totales

de 50 µl las cuales contenían: 1X de amortiguador de PCR, Master mix (Promega) que

contenían 400 µM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfatados, 400 nM de los

cebadores CIF2 F2, CIF2 R2, MECI P2, MECI P3, RIF5 F10, RIF5 R13, puB110 RI y pT181

R1; 800nM de los cebadores DCS F2, DCS R2, MECA P4, MECA P7, y IS431 P4; 200 nM de

los cebadores KDP F1, KDP R1, RIF4 F3 y RIF4 R9; 3mM de MgCl2 y aproximadamente 200

ng de ADN. Los parámetros para el termociclador fueron los siguientes: pre-desnaturalización

a 94°C por 5 min; 30 ciclos a 94°C por 30 s, 55°C por 30 s y 72°C por 30 seg.; post-extensión

a 72°C por 7 min, y se mantuvieron a 4°C después del último ciclo. Los productos de PCR se

resolvieron en geles de agarosa al 2 % con amortiguador 0.5 X de Tris-borate-EDTA con un

23

voltaje de 100 V. Se tiñeron con bromuro de etidio para su visualización en un transiluminador

con luz ultravioleta.

Detección de genes que codifican para Panton-Valentine-Leucocidin (PVL)

Aunque inicialmente se le atribuyó a PVL un papel importante en la patogenia de las

infecciones secundarias a SARM-AC en la actualidad este rol no es claro, sin embargo todas

las cepas que portan el SCCmec tipo IV poseen además el gen de PVL y se le considera

como un marcador genético de estas cepas. Su presencia en SARM-AH es poco frecuente.

Para su identificación se utilizaron los iniciadores previamente descritos por Lina y cols. 53 El

protocolo para la detección de este gen fue el siguiente: amortiguador de PCR buffer 1X, 200

µM de cada uno de los deoxinucleótidos trifosfatados, 50 nM de cada uno de los iniciadores,

MgCl2 1.5 mM, 0.25 de Taq polimersa y 5 ng de ADN. Los parámetros del termociclador

fueron 94°C, 30 s; 55°C, 30 s; 72°C, 30 s y mantenimiento a 4°C.

Tabla 1. Locus, secuencias de oligonucleótidos, tamaño esperado y tipo de SCCmec en la

tipificación por PCR de tipo multiplex.

Locus Primer Secuencia de oligonucleótidos Tamaño esperado (pb)

Tipo de SCCmec

A CIF2 F2 CIF2 R2

TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG ATTTACCACAAGGACTACCAGC

495 I

B KDP FI KDP RI

AATCATCTGCCATTGGTGATGC CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG

284 II

C MECI P2 MECI P3

ATCAAGACTTGCATTCAGGC GCGGTTTCAATTCACTTGTC

209 II, III

D DCS F2 DCS RI

CATCCTATGATAGCTTGGTC CTAAATCATAGCCATGACCG

342 I, II, IV

E RIF4 F3 RIF4 R9

GTGATTGTTCGAGATATGTGG CGCTTTATCTGTATCTATCGC

243 III

F RIF5 F10 RIF5 R13

TTCTTAAGTACACGCTGAATCG GTCACAGTAATTCCATCAATGC

414 III

G IS431 P4 pUB110 RI

CAGGTCTCTTCAGATCTACG GAGCCATAAACACCAATAGCC

381 IA

H IS431 P4 pT181 RI

CAGGTTCTCTTCAGATCTACG GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC

303 IIIA

mecA MECA P4 MECA P7

TCCAGATTACAACTTCACCAGG CCACTTCATATCTTGTAACG

162 Control Interno

Oliveira DC, de Lencastre H. (2002)

24

Tipificación de secuencias de locus múltiples (MLST)

En este procedimiento se determinaron las secuencias de fragmentos internos de siete genes

altamente conservados de ∼ 500 pb (house-keeping genes). Este procedimiento ha sido

validado para S. aureus y es una herramienta que permite determinar, de acuerdo a secuencias

disponibles en el sitio www.mlst.net, si la cepa de S. aureus evaluada pertenece a clonas ya

conocidas o si se trata de clonas nuevas. Para cada gen las diferentes secuencias se designan

como alelos distintos y cada aislamiento es definido por los alelos de cada uno de los siete

locus determinando su perfil alélico o secuencia tipo (ST). Los genes con sus

correspondientes cebadores y secuencias que se utilizaron para la tipificación de S. aureus,

se muestran en la tabla 2. 25

TABLA 2. Genes que se utilizan para la tipificación de S. aureus por MLST iniciadores y

sus secuencias.

Gene Primer Secuencia (5’-3’) ArcC arcC-Up

arcC-Dn TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC AGGTATCTGCTTCAATCAGCG

AroE aroE-Up aroE-Dn

ATCGGAAATCCTATTTCACATTC GGTGTTGTATTAATAACGATATC

GlpF glpF-Up glpF-Dn

CTAGGAACTGCAATCTTAATCC TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC

Gmk Gmk-Up Gmk-Dn

ATCGTTTTATCGGGACCATC TCATTAACTACAACGTAATCGTA

Pta pta-Up Pta-Dn

GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA

Tpi tpi-Up tpi-Dn

TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA TTTGCACCTTCTAACAATGTTAC

YqiL yqiL-Up yqiL-Dn

CAGCATACAGGACACCTATTGGC CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC

Enright MC et al (2000)

El volumen total de la mezcla para PCR fue de 50 µl y contenía 0.5 µl (0.5 µg) de ADN

cromosómico, 0.5 µg de cada primer, 1 U de Taq polimerasa, 5 µl de amortiguador 10X, y 0.2

nM de deoxinucleótidos trifosfatados. El programa del termociclador para la PCR fue:

desnaturalización inicial a 95°C por 5 min, 30 ciclos de alineación a 55°C l min, una extensión

a 72° l min, desnaturalización a 95°C 1 min y una etapa final de extensión a 72°C por 5 min.

25

Los productos de PCR fueron purificados con el sistema QIAquick PRC purification kit

(Quiagen, Foster city CA). Las secuencias se determinaron con los cebadores utilizados en la

amplificación inicial. (Seqwrite en Houston, Tx)

Asignación, interpretación y comparación de las secuencias de locus múltiples (MLST).

De acuerdo a las secuencias obtenidas de cada uno de los 7 locus. Los alelos se numeraron

consecutivamente. El perfil alélico obtenido se comparó con el perfil de cepas nosocomiales y

comunitarias de diversas regiones geográficas disponible en línea (www.mlst.net). Las

secuencias se consideraron como alelos distintos cuando se encontró diferencia en al menos un

nucelótido.

Tiempos de duplicación de cepas nosocomiales y comunitarias.

La capacidad de sobrevivir, multiplicarse, competir con otros microorganismos y, finalmente,

colonizar las mucosas, refleja que una bacteria tiene un buen estado fisiológico.

Los tiempos de duplicación fueron estimados mediante la inoculación de una colonia de un

cultivo de toda la noche en 25 mL de caldo soya tripticasa mantenido en agitación y

temperatura constante hasta la obtención de las muestras para cada uno de los tiempos

requeridos para el cálculo de los tiempos de duplicación o generación. El número de colonias

se estimó mediante la siembra de alicuotas de diluciones seriadas de las muestras obtenidas en

tiempos determinados. La fórmula para cálculo de tiempos de generación y el sustento de la

misma se muestran en la Figura 1.

En este proyecto se determinaron los tiempos promedio de duplicación de las cepas de

acuerdo al tipo de SCCmec y a su ST.

26

Figura 1. Procedimiento y y método usado para el cálculo de los tiempos de duplicación.

Gerhardt P, (2002) Kenneth T. (2005)

Análisis Estadístico

Se utilizó estadística descriptiva para la presentación de resultados en tablas y gráficas y

estadística paramétrica para contrastar los tiempos de duplicación entre los diferentes tipos

clonales. Para la comparación entre dos tipos de clonas se utilizó t- de Student y para la

contrastación de los tiempos de duplicación entre más de dos tipos clonales se utilizó análisis

de varianza no paramétrico (Kruskal- Wallis). Se utilizó el programa SPPS para Windows

versión 10.0 (1999). La similitud entre las cepas de SARM fueron calculadas usando el

coeficiente de Dice, se construyó un dendrograma de la relación entre cepas. La fuerza del

dendrograma fue estimado por el coeficiente de correlación cofenético (CCCr) usando la

prueba no paramétrica de Mantel. Se utilizó el programa NTSYSpc 2.02 (1998).

Tiempo de generación o duplicación: Intervalo de tiempo requerido por las células o población bacteriana para duplicarse. Ecuación que expresa el crecimiento por división binaria b = B x 2n Se despeja n logb = logB + nlog2 n = logb - logB = 3.3logb/B .301 G = t/n = t/3.3logb/B = 120 _ 3.3 log b/B

00.20.40.6

0.81

1.21.4

BASAL 90 180

270

360

460

MW2

n1

n2

n3

1c

2c

3c

Debido a que el crecimiento bacteriano ocurre por división binaria, el incremento en una población bacteriana es considera una progresión geométrica G (tiempo de duplicación) = t (tiempo en minutos u horas) / número de generaciones B = número de bacterias al inicio del intervalo de tiempo b = número de bacterias al final del intervalo de tiempo n = número de generaciones (número de veces que la población bacteriana se divide durante el intervalo de tiempo)

27

ASPECTOS ÉTICOS

Se considera como un estudio sin riesgo, según el Artículo 17, Incisos I, II y III y Artículo 65

del Reglamento de la Ley General en Salud en Materia de Investigación para la salud. Durante

todo el estudio la información es manejada en forma confidencial y no se mencionan nombre

ni datos de los pacientes en forma individual en la presentación de resultados en congresos o

publicaciones

.

El estudio se evaluó y fue aprobado por la Comisión Nacional de Investigación Científica del

Instituto Mexicano del Seguro Social (número de registro 2004-161-003) y por lo Comités de

Ética de cada Hospital Participante (Anexo 2).

RECURSOS FINANCIEROS

Este proyecto se efectuó con fondos del financiamiento de Fondos Sectoriales CONACYT

otorgado al proyecto “EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE S. aureus RESISTENTE A

METICILINA ADQUIRIDO EN HOSPITALES Y EN LA COMUNIDAD” con el número de

registro SALUD-2003-C01-091, de The Fogarty Internacional Center of the National

Institutes of Health Grant D43 TW01036 y del Fondo de Fomento a la Investigación FOFOI

2005/1/I/046 (Anexo 3)

28

INSTITUCIONES Y PERSONAL PARTICIPANTE

HOSPITAL GENERAL REGIONAL NO 1 IMSS. DURANGO Unidad de Investigación Médica en Epidemiología Clínica Dr. Gerardo Martínez Aguilar Comité de Infecciones Nosocomiales Enf. Carmen Anaya Arriaga BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE Texas Children’s Hospital/Infectious Diseases Laboratory Kristina Hulten Ph.D. Edward O Mason, Jr., Ph.D. UNIDAD DE MEDICINA EXPERIMENTAL DE LA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Laboratorio de Infectología Microbiología e Inmunología Clínica Dra. Celia. M. Alpuche Aranda LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PÚBLICA DE SINALOA. SS Dr. Eduardo Llausas Magaña HOSPITAL DEL NIÑO DE SINALOA Comité de Infecciones nosocomiales Dr. Ángel León Rito HOSPITAL GENERAL DE DURANGO. SS Laboratorio de Microbiología Dr. Juan Carlos Tinoco F Comité de Infecciones Nosocomiales Enf. María Cruz Pérez Prado HOSPITAL CENTRAL “IGNACIO MORONES PRIETO” Facultad de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de San Luis Potosí Dr. Daniel Noyola MC Fidel Martínez HOSPITAL INFANTIL DE MEXICO “FEDERICO GOMEZ” DC Norma Velázquez Guadarrama Laboratorio de Bacteriología UNIVERSIDAD DE COLIMA. FACULTAD DE MEDICINA Dr. Oscar Newton Sánchez Dr. Fabián Rojas Larios

29

RESULTADOS

Durante el periodo de estudio se analizaron un total de 426 cepas de S. aureus, 351 (82.4%) de

origen nosocomial y 75 (17.6%) comunitarias. La distribución por centro de acuerdo a la

susceptibilidad a la meticilina y a su origen nosocomial o comunitario se muestran en la tabla

3, donde se muestra respecto a la resistencia a meticilina que el 23.6% (83/351) de origen

nosocomial y 58.6% (44/75) de origen comunitario fueron resistentes a este antibiótico. Es

evidente las amplias variaciones en las proporciones de resistencia a meticilina en las cepas

nosocomiales desde 1.2% en Durango hasta 83% en San Luís Potosí. Solo se encontraron 3

cepas de SARM de origen comunitario.

Tabla 3. Cepas de S. aureus por susceptibilidad a meticilina y hospitales participantes.

HOSPITALES PARTICIPANTES

CEPAS de

Staphylococcus aureus

N = 426 (100%)

Nosocomiales

n = 351 (82.4%)

Comunitarias

n = 75 (17.6%)

SARM

n=83

SASM

n = 268

SARM

n = 44

SASM

n =31

Hospital de Pediatría del CMO IMSS

(Guadalajara, Jal)

10 19 0 0

Hospital Pediátrico de Sinaloa

(Culiacán Sin)

1 6 1 8

Hospital General de Durango

(Durango Dgo.)

1 79 0 20

Hospital General de Colima

(Colima,Col.)

2 98 0 0

Hospital Central “Ignacio Morones

Prieto” San Luis Potosi

53 66 1 3

30

Hospital Infantil de México

“Federico Gómez”

16 0 1 0

Texas Children’s Hospital

Houston, TX.

- - 41 0

Las cepas aisladas de Guadalajara fueron colectadas durante el año 2005 y las de San Luís

Potosí, Colima y México durante el 2006. Las cepas de Durango y Sinaloa fueron recolectadas

durante todo el periodo de estudio. Debido a que solo se obtuvieron 3 cepas de SARM de

origen comunitario en México se utilizaron 41 cepas donadas por el cepario del laboratorio de

enfermedades infecciosas del Texas Children´s Hospital de Houston, TX para determinar y

comparar los tiempos de duplicación. En la tabla 4 se muestran los porcentajes de

susceptibilidad de cepas nosocomiales y comunitarias a diferentes antimicrobianos. Como era

esperado se encontraron mayores porcentajes de resistencia en las cepas de origen nosocomial

que en las comunitarias, principalmente en antibióticos pertenecientes a los grupos de

macrólidos y quinolonas.

Tabla 4. Susceptibilidad a antibióticos de cepas nosocomiales y comunitarias de S.

aureus aisladas en los hospitales participantes. (N = 426)

Antibióticos Cepas Nosocomiales

n = 351 (82.4%)

Cepas de la comunidad

n = 75 (17.6%)

% S % NS* % S % NS

Ciprofloxacina 72 28 91 9

Clindamicina 78 22 96 4

Eritromicina 61 39 83 17

Gentamicina 94 6 99 1

Linezolid 100 0 100 0

Rifampicina 95 5 100 0

Vancomicina 100 0 100 0

T/S 89 11 100 0

31

Quinupristina 98 2 100 0

Cefoxitima 76 24 41 59

S = Sensibles NS = No sensibles

* = cepas con susceptibilidad intermedia y resistentes.

Por electroforesis de campos pulsados, se documentaron varias clonas circulando en los

hospitales participantes. Se construyó un dendrograma de la relación entre las cepas, la

similitud entre ellas se calculó por medio del coeficiente de Dice. (Figura 3). La fuerza del

dendrograma fue estimado por el coeficiente de correlación cofenético (CCCr) usando la

prueba no paramétrica de Mantel. De acuerdo al porcentaje de similitud entre las cepas

estudiadas el dendrograma permitió identificar 21 grupos diferentes con clonas predominantes

en algunos centros hospitalarios como las clonas de los grupos A, C, F, I. Las clonas del grupo

S fueron similares a la clona USA 300. El dendrograma reveló un 94% de similitud entre las

clonas F y G y un 93 % entre las clonas A, B y C.

32

Dice Coefficient0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

425-HIM 931-HIM 488-HIM 428-HIM 10-HIM 882-HIM 375-HIM 234-HIM 32-SLP 46-SLP 56-SLP 57-SLP 10-SLP 42-GDL 81-SLP 10-GDL 54-HIM 635-HIM 60-SLP 60-SLP 76-SLP 63-SLP 47-SLP 6-SLP 24-SLP 42-SLP 41-SLP 714-H 828-HIM 867-HIM 817-HIM 18-SLP 19-SLP 25-SLP 26-SLP 27-SLP 33-SLP 5-SLP 7-SLP 15-SLP 1-SLP 3-SLP 7-SLP 69-SLP 8-SLP 9-SLP 14-SLP 17-SLP 72-SLP 146-HG 28-SLP 58-SLP 61-SLP 44-SLP 78-SLP 31-SLP 59-SLP 48-SLP 121-SLP 23-SLP 67-SLP 66-SLP 68-SLP 50-GDL 37-GDL 21-GDL 22-GDL 5-GDL 52-GDL 188-COL 71-SLP 53-SLP 36-SLP 14-SLP 41-GDL 45-GDL 101-DF 163-HIM-IV 77-SLP 17-SIN USA300 186-COL 39-SLP 150-HIM

r = 0.927 p= 0.0004

Figura 2. Dendrograma de los porcentajes de similitud entre patrones de macrorrestriccion (Sma I) de DNA de cepas de S. aureus resistente a meticilina aislados en algunos hospitales de México.

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K L M

N O P

Q

R

S

T U

33

En todas las cepas de SARM se documentó la presencia del gen mecA, así mismo, por medio

de PCR con iniciadores múltiples se determinó el tipo de SCCmec presente en las cepas. En 82

(98.7%) de las 83 cepas de SARM de origen nosocomial se encontró el SCCmec Tipo II y en

la restante el tipo IV; en 43 (97.7%) de las 44 cepas de origen comunitario se encontró el tipo

IV de SSCmec y en la restante el tipo II. En las figura 2 se muestran cepas control con los

diferentes tipos de casete de resistencia y algunas cepas de los sitios participantes.

1746

1749

1748

1747

17-SLP

39-SLP

500

400

300

200

100

SCCmec

I

SCCmec

II

SCCmec

III

SCCmec

IV

SCCmec

II

1 2 3 4 5 6 7 1

MW Kb 500 400 300 200 100

A

B

Linea1 = MW; Lineas 2 a 5 Controles de SSC I-IV; Lineas 6 y 7 Cepas 17 y 39 de SLP

34

Cuando se compararon los promedios de los tiempos de duplicación de las cepas de S. aureus

de acuerdo a la presencia o no de casete cromosómico de resistencia y al tipo presente en las

mismas no se encontraron diferencias estadísticamente significativas. (p = 0.187). Así mismo

no se encontraron diferencias en los tiempos de duplicación de las cepas de acuerdo a su ST (p

= 0.765). Tablas 5 y 6

Línea 1= MW; Línea 2 Control de SCC II; Línea 6 control SSC III-A; Líneas 3,4,5 y 7 Cepas de Guadalajara con SCCmec II.

Figura 3. Tipificación del casete cromosómico de resistencia por PCR Multiplex en cepas de San Luis

Potosí (A) y de Guadalajara (B)

1 2 3 4 5 6 7 1

35

Tabla 5. Tiempos de duplicación en minutos en cepas de S. aureus susceptibles y resistentes a meticilina y de acuerdo al tipo de casete cromosómico de resistencia.

Cepas Susceptibles

sin casete

n = 30

Cepas Resistentes a Meticilina

n = 60

*p

SSCmec II

N = 30

SSCmec IV

n = 30

Mediana

(Rango)

44.4

(30.4-87.0)

43.2

(26.3—223.7)

52.1

(30.5-92.8)

0.187

*Análisis de Kruskal-Wallis

Tabla 6. Tiempos de duplicación en minutos en cepas de S. aureus de acuerdo a su

secuencia tipo determinada por MLST.

Secuencias Tipo

ST5 n = 5

ST8 n = 4

ST97 n = 1

ST1011 n = 4

*P

Mediana

(Rango)

45.6

(26.3-223.7)

51.6

(30.5-92.8)

47.9

49.3

(25.4-218)

0.765

*Análisis de Kruskal-Wallis

Por electroforesis de campos pulsados, se documentaron varias clonas circulando en los

hospitales participantes. Se construyó un dendrograma de la relación entre las cepas, la

similitud entre ellas se calculó por medio del coeficiente de Dice. (Figura 3). La fuerza del

dendrograma fue estimado por el coeficiente de correlación cofenético (CCCr) usando la

prueba no paramétrica de Mantel. De acuerdo al porcentaje de similitud entre las cepas

36

estudiadas el dendrograma permitió identificar 21 grupos diferentes con clonas predominantes

en algunos centros hospitalarios como las clonas de los grupos A, C, F, I. Las clonas del grupo

S fueron similares a la clona USA 300. El dendrograma reveló un 94% de similitud entre las

clonas F y G y un 93 % entre las clonas A, B y C.

La secuenciación de los 7 genes caseros de cepas seleccionadas permitió identificar las

siguientes secuencias tipo (ST) entre las cepas estudiadas: 5, 8, 97 1011. Las ST 5, 8 y 97 se

han reportado previamente en cepas de SARM identificadas en diferentes regiones del mundo.

La ST 5 se ha encontrado en las clonas USA 100 y USA 800 en hospitales de los Estados

Unidos de Norteamérica. La ST 8 se ha documentado en la clonas USA 300 las cuales poseen

SCCmec tipo IV a y son PVL positivas. La secuencia 1011 fue asignada como una nueva ST

ya que las cepas que la poseen presentan un polimorfismo en alelo arc. A este alelo se le

asignó el número 126 y por lo tanto se añadió a la base de datos de MLST como una nueva

cepa. En la tabla 7 se muestra los alelos de los 7 genes caseros y la ST correspondiente.

Tabla 7. Secuencia tipo identificadas en cepas seleccionadas de SARM de los hospitales participantes.

Cepas

ST

Alelos

Arc Aro Glp Gmk Pta Tpi Yqi

14 SIN 97 3 3 1 1 4 4 3

17SIN , 77 SLP,163 HIM,186 COL.

8 3 1 1 1 1 5 3

5G, 21G, 22G, 14SLP, 17 SLP,

5 1 4 1 4 12 1 10

23SLP, 66SLP, 78SLP,146 HG 1011 126 4 1 4 12 1 10

La ST 1011 no se había reportado previamente en otras regiones por lo que se añadió a la base

de datos de MLST como una nueva cepa.

37

DISCUSIÓN

En este estudio no se encontraron diferencias en los tiempos de duplicación de cepas de

SARM de acuerdo a: susceptibilidad a meticilina, tipo de SCCmec, ni a sus secuencias tipo.

La tipificación molecular de cepas de SARM permitió documentar la emergencia de SARM-

AC y las clonas circulando en algunos hospitales de México. La secuenciación de genes

caseros mostró la presencia de una clona no descrita previamente como causal de infecciones

nosocomiales en San Luis Potosí y Durango.

Uno de los factores que se han propuesto para explicar la rápida diseminación de SARM en la

comunidad es el que las cepas comunitarias tienen tiempos de duplicación menores a los de

cepas de adquisición nosocomial.24 Sin embargo, cuando comparamos los tiempos de

duplicación de cepas de S. aureus sensible y resistente a meticilina, de acuerdo al tipo de

SCCmec y a sus secuencias tipo no encontramos diferencias significativas entre los mismos,

generando la interrogante de: ¿A qué factores se pueden atribuir la divergencia entre nuestros

resultados y los reportados por Okuma y cols? 1) A diferencia de las cepas de origen

nosocomial que se agrupan en pocos linajes genéticos, las cepas de SARM-AC poseen

múltiples linajes 23 por lo que además de los diferentes tipos de SCCmec, diferencias en otras

partes del genoma bacteriano pueden condicionar diferencias en los tiempos de duplicación; 2)

Se observan variaciones importantes en los tiempos de duplicación en minutos, por lo tanto si

solo se compara una cepa o un número limitado de las mismas tal como se realizó en el

estudio de Okuma K, et al.24 las diferencias encontradas pueden ser atribuidas a estas

variaciones más que a diferencias reales entre las cepas. En nuestro estudio documentamos

estas amplias variaciones al interior de los grupos comparados, por lo tanto postulamos que

existen otros factores además de los casetes cromosómicos de resistencia y de las secuencias

tipo que determina los tiempos de duplicación de las cepas de S. aureus. El estudio de los

genomas completos de cepas representativas de determinadas clonas así como de factores

genéticos del hospedero permitirán mejorar el conocimiento sobre los mecanismos que

determinan la velocidad de duplicación de las cepas y su diseminación en ciertas

comunidades. 3) Recientemente, en modelos de conejo, se ha demostrado que la presencia de

38

ACME (Arginine Catabolic Mobile Elment) incrementa la fortaleza física de la clona USA

300 (clona de SARM-CA diseminada globalmente) y que la eliminación del SCCmec no

afecta la fortaleza de la cepa, postulándose que SARM-AC podría haber emergido y persistido

en la comunidad debido a que la presencia del SCCmec tipo IV no impone un costo a la

fortaleza de la bacteria al menos en modelos in vitro e in vivo y por el contrario la presencia de

los tipos I, II y III de SCCmec impone un costo a la fortaleza bacteriana disminuyendo los

tiempos de duplicación.54, 55 Sin embargo, al igual que en nuestro trabajo, los estudios que

han demostrado una menor tasa de crecimiento de las cepas que poseen SCCmec 1-III no han

evaluado el papel del elemento ACME por lo que no es posible definir si la menor tasa de

crecimiento se debe a la ausencia de mismo y/o a la presencia de otros elementos presentes en

estas islas genómicas.

Con respecto a la caracterización molecular de las cepas, ECP puede detectar modificaciones

genómicas que surgen de mutaciones en el sitio de reconocimiento de la enzima usada y de la

recombinación, deleción o inserción que afecta el tamaño del fragmento. 56 En nuestro estudio,

por ECP, se encontraron varias clonas circulantes, algunas de ellas en hospitales de diferentes

ciudades señalando la facilidad para su diseminación o reflejando movimientos de pacientes o

personal colonizado entre hospitales. El carácter transversal de este trabajo solo nos permite

plantear estas hipótesis, su confirmación requiere de estudios prospectivos en los que se

determinen si los pacientes y personal de salud se colonizan por estas cepas y cuales son las

dinámicas que se establecen entre ellas y la flora habitual.

En la actualidad las infecciones nosocomiales por SARM son un problema endémico y

epidémico para muchos hospitales de todo el mundo aunque su frecuencia varía entre los

diferentes países.57 La tipificación molecular de colecciones de cepas de SARM ha permitido

determinar que el número de clonas asociadas a infección nosocomial es limitado y que cinco

de ellas representan cerca del 70% de los aislamientos recuperados en hospitales. 8 La

prevalencia de SARM en hospitales mexicanos no está determinada aunque existen reportes

aislados de algunos centros hospitalarios de tercer nivel de atención. En el Hospital de

Pediatría del Centro Médico Nacional del IMSS documentó la presencia de una clona

(secuencia tipo ST30-SCCmec IV) predominante durante los años 1997-2000 y que fue

39

remplazada en los años siguientes por la clona New York -Japon (secuencia tipo ST5-SCCmec

II). 58 De igual manera en un hospital de tercer nivel de atención de Guadalajara, Jal., se

encontró una clona predominante de SARM entre los años 1999-2003 con características muy

similares a la clona New York/Japón descrita inicialmente en New York y Tokio y

actualmente ampliamente diseminada en EUA.59 En este estudio documentamos la presencia

de una clona predominante, con características semejantes a la clona New York /Japón o USA

100 (ST5-SSCmec II) en cinco de los hospitales participantes (Guadalajara, Durango, Colima,

San Luís Potosí y Ciudad de México) Por ECP la clona difiere de la New York /Japón en la

posición de las bandas pero cumple con los criterios de Tenover 56 para considerarse como la

misma clona, la secuencia tipo es 5, tiene SCCmec tipo II y es PVL negativo. Así mismo en

los hospitales de Guadalajara y San Luís Potosí se identificaron algunas cepas que por ECP

difieren de la clona predominante en la posición de bandas. La tipificación por MLST mostró

una secuencia tipo ST 1011 no previamente reportada en otros sitios (de acuerdo a la

clasificación del sitio oficial de MLST) y que difiere de la ST5 por la presencia de una

mutación en una base en el gen Arc y a la que se le asignó la ST 1011. Esta clona tiene el

SSCmec tipo II y a diferencia de la New York-Japón que posee el alelo Arc tipo 1 se le asignó

el número 126. Aparentemente es una clona derivada de la New York/Japón que se ha

adaptado a estos hospitales. Debido al diseño de este estudio no podemos determinar el

momento de su aparición, ni sabemos si es una clona con la capacidad de adaptación de las

clonas actualmente circulando en hospitales o si era remplazada por estas, por lo que es

necesario mantener un sistema de vigilancia epidemiológica y molecular continua

Como era de esperarse la mayoría de las cepas de SARM nosocomiales tuvieron el SCC mec-

II confirmando su origen nosocomial, sin embargo identificamos dos cepas de S. aureus

aisladas de pacientes con infección nosocomial pero que poseían el SCCmec tipo IV. Este

hallazgo puede tener dos explicaciones posibles: 1) Señalar la presencia de cepas de SARM-

AC causando infecciones nosocomiales, fenómeno que se ha descrito en sitios con alta

prevalencia de SARM-AC 60 o 2) Tratarse de cepas de origen nosocomial con SCCmec-IV las

cuales a diferencia de las de adquisición comunitaria son PVL negativo, poseen la ST 5 y se

han clasificado en EUA como USA 800 50 Estas dos cepas fueron PVL negativo, sin embargo

40

no fue posible realizar la secuenciación de los genes caseros para determinar el tipo clonal y

tener la certeza total de que se trata de la clona USA 800.

En los últimos años se ha descrito la presencia de SARM-AC en países de diversos

continentes.38 En algunas ciudades de los EUA se han reportado una alta frecuencia de

infecciones por SARM-AC causando, predominantemente infecciones de piel y tejidos

blandos pero también infecciones graves algunas veces fatales.19, 60 El estudio molecular de

estas cepas muestra, que a diferencia de las nosocomiales, poseen el SCCmec tipo IV, el gen

que codifica para PVL y por MLST son ST8 y que se han denominado USA 300 y USA 400

de acuerdo a la clasificación propuesta por Mc Dougal 50 y que se encuentran ampliamente

diseminadas en los EUA. En este estudio se encontraron 4 cepas idénticas por ECP a la USA

300. Estas se identificaron en los siguientes hospitales: Hospital Pediátrico de Sinaloa,

Hospital Infantil de México, y los hospitales generales de Colima y San Luis Potosí. La cepa

aislada en el hospital de Sinaloa se obtuvo de un niño con infección de piel y tejidos blandos,

esta cepa es PVL positiva y mediante tipificación por MLST se determinó que tiene la ST 8.

Estos datos confirman la aparición de SARM-AC y específicamente la clona USA 300 en

nuestro país. Aunque solo se trata de casos aislados, el potencial que posee esta clona para

diseminarse rápidamente señala la necesidad de establecer sistemas de vigilancia

epidemiológica continuos.

La emergencia de SARM-AC en diversos continentes y la alta prevalencia de infecciones en

las cuales esta bacteria desempeña un papel importante sugieren que estas cepas posen

características especiales que les permiten colonizar y causar infecciones superficiales y

graves en niños y adultos. Inicialmente la virulencia de estas cepas se atribuyó a la presencia

del gen PVL que codifica para una toxina con capacidad de lisar leucocitos y se asoció con

mayor mortalidad y con la presencia de complicaciones graves tales como neumonía

necrozante 61 e infecciones musculoesqueléticas. 18 Estudios en modelos animales con cepas de

SARM en los que se suprimió el gen PVL mostraron que conservaron su virulencia y se

propone un nuevo factor de virulencia de tipo peptídico denominado modulina soluble en

fenol (PSM por sus siglas en inglés). 62

41

CONCLUSIONES

1. No se encontraron diferencias en los tiempos de duplicación de cepas de SARM de acuerdo

al tipo de SCCmec ni de acuerdo a sus secuencias tipo. Tampoco entre cepas susceptibles y

resistentes a meticilina.

2. Los tiempos de duplicación de cepas nosocomiales y comunitarias no están determinados

por el tipo de SCCmec o los tipos clonales por lo que consideramos que existen otros factores

que determina los tiempos de duplicación de las cepas de S. aureus.

3. El análisis de los genotipos de cepas nosocomiales permitió documentar las clonas

circulando en algunos hospitales Mexicanos. La clona predominante es muy semejante a la

clona New York-Japón encontrada anteriormente en el Hospital de Pediatría del Centro

Médico Nacional Siglo XXI y en el Hospital Civil de Guadalajara por lo que es la clona

predominante en infecciones nosocomiales en pacientes mexicanos.

4. Documentamos la presencia de una clona causante de infección nosocomial no reportada

previamente y que muy probablemente es descendiente de la clona New York-Japón.

5. Documentamos la emergencia de SARM-AC en algunas ciudades y las cepas son similares

a la clona USA 300 ampliamente diseminada en EUA.

6. Documentamos mediante la tipificación molecular de cepas de SARM las clonas circulando

en algunos hospitales de México así como la presencia de SARM-AC. La secuenciación de

genes caseros mostró la presencia de una clona no descrita previamente causado infección

nosocomial en San Luis Potosí y Durango.

42

PERSPECTIVAS

En este estudio no se encontraron diferencias -in vitro- en los tiempos de duplicación de cepas

de S. aureus resistentes y susceptibles a meticilina ni tampoco en cepas de SARM de acuerdo

al tipo de SCCmec o a sus secuencias tipo. Sin embargo el comportamiento de las cepas puede

ser diferente en las condiciones habituales de colonización de piel y mucosas por lo que es

importante realizar estudios prospectivos, a mediano plazo, en pacientes y personal de salud

en los que se determine la interacción con la flora comensal y las dinámicas de colonización

y multiplicación de diferentes clonas de SARM.

La secuenciación de genes caseros mostro la presencia de una clona (ST1011) no descrita

previamente en la literatura causado infección nosocomial en San Luis Potosí y Durango. El

hallazgo de esta clona, aparentemente derivada de la New York-Japón, requiere que la

vigilancia epidemiológica establecida para este estudio se implemente de forma continua ya

que al igual que la New York-Japón esta clona puede tener características que favorezcan su

establecimiento y diseminación en hospitales mexicanos.

El diseño transversal de este estudio nos permitió identificar la aparición de una nueva clona

sin embargo no podemos determinar el momento de su aparición por lo que además de los

sistemas de vigilancia epidemiológica prospectivos implementados por los comités de

prevención y control de infecciones nosocomiales en los hospitales participantes es necesario

continuar con el estudio molecular de las cepas de SARM tener la capacidad de identificar la

aparición de clonas circulando en otros países y/o la emergencia de nuevas clonas. Esta

información será de gran utilidad para implementar las medidas adecuadas para limitar su

diseminación.

43

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49

ANEXO 1

PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSADOS

A.- PREPARACIÓN DE LOS BLOQUES

DÍA 1

1. Se pasa la bacteria a una placa de agar.

DÍA 2

2. Se coloca una colonia en 5 mL de caldo de Soya Tripticasa e incuba a 35o C toda la noche.

DÍA 3

3. Se agita el caldo de soya tripticasa con la colonia. Se toman 400 µl de la bacteria del caldo

a los tubos Eppendorf y se centrifuga a velocidad máxima por 1-2 minutos. El botón tiene

que ser aproximadamente de este tamaño ● → ●

4. Se resuspende el botón en 125 µl de buffer PIV y se mantiene los tubos en hielo durante el

procedimiento.

5. Se calienta a 50o C los tubos en baño caliente. Se descongela la lisostafina (1

mg/mL) en hielo.

6. Se derrite la agarosa al 1.6% (0.16 g en 10 mL de agua doble destilada) en el microondas y

se equilibra en el baño caliente.

7. Se transfieren los tubos bacterianos a los bloques calientes y se equilibran brevemente

menos de 5 min., a 50o C.

8. Se toma un tubo a la vez: se agrega 1 µl lisostafina y 125 µl de agarosa. Se mezcla con la

pipeta sin crear burbujas e inmediatamente se transfieren a los moldes de bloques. Se

hacen 2-3 bloques por aislado.

50

9. Los bloques de agarosa se dejan solidificar a temperatura ambiente.

10. Se etiquetan los tubos con los números de los aislados y se agregan 2 mL de Buffer EC de

lisis a cada tubo (Se agrega 2.5 µl de RNAsa (20mg/mL) y 2.5 µl lisostafina (1mg/mL) por

mL de solución de EC lisis antes de usar).

11. Se sacan cuidadosamente los bloques de los moldes a los tubos respectivos e incuban a

37oC toda la noche.

DÍA 4

12. Se decanta la solución EC-lisis de los tubos, previniendo que los bloques se escapen.

13. Se agrega 2 mL de buffer ESP a cada tubo. (Se agrega 2.5 µl de Proteinasa K (20 mg/mL

por mL de solución antes de usarse).

14. Se incuba a 50o C toda la noche.

DÍA 5

15. Se decanta la solución y se lavan los bloques de agarosa 5 veces por 30 minutos con TE,

agitando lentamente a temperatura ambiente.

16. Se guardan los bloques de agarosa en TE a 4o C no más de 3 meses, bien etiquetados con

fecha.

B. ELECTROFORESIS Y TINCIÓN

DÍA 1

1. Se remueve un bloque de agarosa por aislado a un tubo Eppendorf de 2 mL (desde el

fondo) y se lavan los bloques en 1 mL de 1x buffer enzima de restricción por 5 minutos.

2. Se decanta el buffer, se agrega 300 µl de 1x NEB 4, se agrega 1.5 µl de enzima Sma I

(25-30U) y se incuba a 25o C toda la noche.

DÍA 2

51

3. Se remueve la solución y colocar los bloques de agarosa en TE. Los bloques de agarosa

pueden ser guardados por una semana a 4oC.

4. Se elabora 2 litros frescos de buffer de TBE al 0.35x (70 mL de TBE al 10x y 1930 mL

de agua).

5. Se realiza el gel: 1g agarosa certificada para campos pulsados (BioRad Cat # 162-0137)

en 100 mL TBE al 0.4x. Se vierte el gel dentro de la canastilla ensamblada cuando ~

50oC. Se remueve el peine e inserta 1/3 del bloque de agarosa dentro de cada hueco. Se

usan los huecos de la orillas de la izquierda y derecha para los marcadores.

6. En el microondas se coloca agarosa al 1% de baja fusión y se enfría (20 mL: 0.2 g y 20

mL de buffer 0.35x TBE o agua destilada). Se cubren los hoyos con agarosa para sellar

se usan pipetas pequeñas de plástico desechables.

7. Se vierte 1800-2000 mL de buffer dentro de la cámara de electroforesis y se empieza la

circulación. Se remueven las burbujas.

8. Se empieza el sistema de enfriamiento. Esto toma cerca de 2-3 minutos para que el

enfriador realmente enfríe. Se inserta el gel dentro de la cámara de electroforesis, los

pozos cercanos a la parte de atrás de la cámara (opuesta donde tú la levantas).

9. Se programa la máquina. El último programa usado es siempre el que queda grabado.

Staphylococcus spp: Block 1: inicio cambiar el tiempo a 5 seg, final cambiar el tiempo

de 15 seg, correr el tiempo 10 horas; Block 2: inicial cambiar el tiempo 15 seg, final

cambiar el tiempo a 60 seg, correr el tiempo 13 horas; 6 V/ cm; ángulo de 120o.

Generalmente corre mejor entre 100 y 135 V.

10. Se tiñe el gel en TBE a 0.35x con 10 µl de bromuro de etidio (5 mg/mL), se agita a

temperatura ambiente.

11. Se lava el gel con agua doble destilada en agitación leve por 45 min a 1 hora.

12. Se coloca en un transiluminador con luz ultravioleta. Se captura la foto (exposición:

cámara colocada a 6.7 cm). Las imágenes se conservan en el disco duro de la

computadora conectada al sistema. Los patrones de restricción son interpretados de

acuerdo a las recomendaciones de Tenover y cols.

52

ANEXO 2.

CARTA DE APROBACIÓN DEL PROYECTO

53

ANEXO 3.

COMPROBANTE DE DESIGNACIÓN DE RECURSOS FINANCIEROS

54

55