INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

ESCUELA NACIONAL DE DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

S

SE

“ INDUCCIÓN DE MIELOMA EN

RATONES BALB/c “

TESIS

QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA

OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

PRESENTA:

QBP. BERENICE SÁNCHEZ GONZÁLEZ

DIRECTOR DE TESIS:

DR. LUIS ANTONIO JIMENÉZ ZAMUDIO

México, D.F. Diciembre, 2010

El presente trabajo se realizo en el Laboratorio de Inmunología Clínica del Departamento de

Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas bajo la dirección del Dr. Luis

Antonio Jiménez Zamudio.

Se contó con el apoyo de becas: Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) clave

227288 y de Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) del Instituto

Politécnico Nacional con clave de proyecto 20100406

DEDICATORIA

Porque: Toda carne es como hierba, y toda la gloria del hombre como flor de la hierba.

La hierba se seca, y la flor se cae; Mas la palabra del Señor permanece para siempre.

1ª Pedro 1:24-25

Dedicada a mis padres, hermanos y amigos.

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a mi Director de Tesis, el Dr. Luis Jiménez quien constituye la base de este

proyecto. Gracias a la Dra. Elba Reyes por todo el apoyo que me brindo. Gracias a los

Químicos Elena y Gustavo del hospital 20 de Noviembre, a la Dra. Lilia Domínguez y al Dr.

Víctor Hernández, por el apoyo en el proceso experimental. Gracias a la Dra. Ethel quien es

coordinadora del programa de Maestría y a la Dra. Laura Montiel por haber sido parte de mi

comité tutorial.

Gracias a mis niños de licenciatura, Ivon, Alejandro y Pedro, quienes me han ayudado mucho,

a Jessica, quien también forma parte de este proyecto. Gracias al Sr. Luis del Bioterio, por su

gran ayuda en el mantenimiento de los ratones. Gracias a Yolanda, por su apoyo en el

laboratorio de Inmunología molecular. Gracias a Araceli, por todo el apoyo administrativo que

siempre nos brinda a todos.

Gracias Maricela, por el tiempo y ayuda que me brindaste. Gracias amiga Erika, porque sin ti

no sé como lo hubiera logrado. Gracias amigo Emilio, por apoyarme en este trabajo. Gracias

amigas Alma y Dany, por su apoyo en el equipo, Gracias amiga y compañera de viaje Bere, por

apoyarme con las muestras. Amiga Alicia R, gracias por tu gran amistad. Gracias amigo

Mauricio por tu gran amistad y todos los ánimos. Gracias Marcelo, Margarita, Ángeles, Wendy,

Cesar, Ricardo, Minerva, Alicia, Adriana por su amistad.

Gracias a todos ustedes, por ser mis amigos y formar parte de esta etapa en mi vida.

Gracias amiga Erika y Juan por el apoyo incondicional que me brindaron desde el momento en

que los conocí. Gracias Química Silvia, por su apoyo en el laboratorio de Inmunología del

hospital 20 de noviembre.

Gracias a mis Padres y hermanos por su gran amor, dirección y apoyo, porque sin todo esto,

mis locuras no serian posibles.

Gracias Dios mío por ser el dueño de mi vida, porque tú eres mi fuerza y razón de existencia.

Gracias porque soy feliz al sentir que estás conmigo en donde quiera que voy. Gracias por

permitirme concluir esta etapa en mi vida, sin ti simplemente no hubiera sido posible.

i

ÍNDICE GENERAL Paginas

ÍNDICE GENERAL ............................................................................................................................... i

ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................ iii

ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................................... iii

ABREVIATURAS ............................................................................................................................... iv

RESUMEN ........................................................................................................................................... vi

ABSTRACT ........................................................................................................................................ vii

I INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1

1.0 Generalidades del Mieloma Múltiple ........................................................................................... 1

1.1. Antecedentes del Mieloma Múltiple .................................................................................... 1

1.2. Epidemiología, etiología y patogénesis ................................................................................ 2

1.3. Microambiente de la médula ósea ........................................................................................ 3

1.4. Oncogenes y genes supresores ............................................................................................. 4

1.5. Características del Mieloma Múltiple .................................................................................. 5

1.6. Evaluación diagnostica del Mieloma ................................................................................... 6

1.6.1. Electroforesis de Proteínas ....................................................................................... 6

1.6.2. El ensayo de cadena ligera libre de inmunoglobulina sérica (FCL) ......................... 6

1.6.3. Estudios en Médula ósea .......................................................................................... 7

1.7. Tratamiento para el control del Mieloma ............................................................................. 7

2.0. Respuesta inmunológica ............................................................................................................. 8

2.1. Linfocitos Th1 y Th2 ............................................................................................................ 8

2.2. Linfocitos Th17 ................................................................................................................... 8

2.3. Linfocitos T reguladores .................................................................................................... 10

3.0. El Modelo de Plasmocitoma en ratón BALB/c ........................................................................ 12

3.1. Importancia del modelo de plasmocitoma .......................................................................... 12

3.2. Estandarización del modelo del Plasmocitoma Murino ..................................................... 13

3.3. Plasmacitogénesis ............................................................................................................... 13

3.4. Características de diagnóstico ............................................................................................ 17

3.5. Agente inhibidor del MPC ................................................................................................. 17

ii

4.0. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 18

5.0. HIPOTESIS .............................................................................................................................. 19

6.0. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................... 20

6.1. OBJETIVOS PARTICULARES ........................................................................................ 20

II MATERIAL Y MÉTODOS ......................................................................................................... 21

III RESULTADOS ............................................................................................................................. 28

IV DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 42

V CONCLUSIÓN ............................................................................................................................. 46

VI EXPECTATIVAS PARA TRABAJOS FUTUROS ................................................................... 47

VII BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 48

iii

ÍNDICE DE FIGURAS Paginas

Figura 1. Esquema de Inducción de mieloma en ratones de las cepas BALB y C57BL ................... 22

Figura 2. Imagen del glomérulo renal de ratones BALB/c ............................................................... 28

Figura 3. Imagen de la zona perivascular en riñón de ratón BALB/c ............................................... 29

Figura 4. Imagen del corte histológico de bazo de ratones BALB/c ................................................. 29

Figura 5. Cortes histológicos de intestino delgado de ratón BALB/c ............................................... 30

Figura 6. Análisis densitométrico del suero humano como control .................................................. 33

Figura 7. Análisis densitométrico del suero de ratón BALB/c ................................................... 33

Figura 8. Análisis densitométrico del suero de ratón C57BL .................................................... 34

Figura 9. Niveles de la fracción Gamma globulinas ................................................................... 35

Figura 10. Niveles de la fracción Beta globulinas ....................................................................... 36

Figura 11. Niveles de la fracción Alfa-2 globulinas ..................................................................... 37

Figura 12. Niveles detectables y no detectables de IL-6 en líquido peritoneal de ratones

BALB/c y C57BL .............................................................................................................................. 39

Figura 13. Niveles detectables y no detectables de IL-10 en líquido peritoneal ratones

BALB/c y C57BL .............................................................................................................................. 39

Figura 14. Niveles detectables de TGF-β en ratones BALB/c y C57BL .................................. 40

Figura 15. Comparación de los niveles de IL-6, IL-10 y TGF-β entre BALB/c y C57BL

inducidos ........................................................................................................................................... 40

Figura 16. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre los testigos e

inducidos de BALB/c ....................................................................................................................... 41

Figura 17. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre los testigos e

inducidos de C57BL ........................................................................................................................ 41

Figura 18. Propuesta de interacciones que ocurren en la cavidad peritoneal del ratón

BALB/c y C57BL .............................................................................................................................. 45

ÍNDICE DE FIGURAS

Tabla 1. Proteínas totales de los ratones BALB/c y C57BL ...................................................... 31

iv

ABREVIATURAS

Ab Anticuerpos

Avidin-HRP Avidina-Peroxidasa de rábano

AcMo Anticuerpo monoclonal

BJ Proteínas de Bence Jones

BFA Brefeldina A

CP Célula Plasmática

DCs Células Dendríticas

GTRI Factor de necrosis tumoral inducido por esteroides

H-E Hematoxilina-Eosina

HFG Factor de crecimiento de hepatocitos

IGF-1 Factor-1 de crecimiento tipo insulina

IL Interleucina

LPS Lipopolisacarido

MGUS Gammapatía monoclonal de significado incierto

MIP-1alfa Proteína inflamatoria de macrófagos 1alfa

MM Mieloma Múltiple

MO Médula ósea

MP Melfalán con Prednisona

MPC Plasmocitoma Murino

OAF Factores activadores de osteoclastos

PMA Forbol 12-Miristato 13-Acetato

PGE2 Prostaglandina E2

PT Proteínas Totales

PTHrP Péptido asociado con la paratohormona

TGF- β Factor de crecimiento de transformación beta

TMB Tretrametilbenzidina

v

TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa

VAD Vincristina, Adriamicina y Dexametasona

VCAM Moléculas de adhesión celular vascular

VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular

vi

RESUMEN

Introducción. El mieloma múltiple (MM) es un cáncer de células plasmáticas que afecta a

hombres y mujeres con una edad promedio de 65 años. La anemia, infecciones, lesiones

óseas, hiperviscosidad y daño renal, son las manifestaciones clínicas más características.

A pesar de que hoy en día existen varios medicamentos innovadores para el tratamiento

del MM, aún es una enfermedad incurable, razón por la cual, es necesario seguir

realizando investigación. Justificación. El modelo murino es útil para el estudio de las

interacciones inmunológicas que se desencadenan en la cavidad peritoneal del ratón

susceptible BALB/c, puesto que no se conocen aún. Así se espera que el estudio más

detallado de este modelo permita aplicar dicho conocimiento en la comprensión del

mieloma humano. Objetivo. Determinar la posible correlación entre las citocinas presentes

en la cavidad peritoneal y la susceptibilidad del ratón BALB/c a desarrollar mieloma.

Material y métodos. Se estudiaron 13 ratones de la cepa BALB/c y 16 ratones de la cepa

C57BL. La inducción de MM, se realizó mediante inyección intraperitoneal de 3 dosis de

0.5 mL de aceite mineral, a los 2,4 y 6 meses de edad. A los 8 meses de iniciado el

tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron el riñón, el bazo y el intestino

delgado; se obtuvo suero a partir de punción cardiaca y se realizaron lavados de la cavidad

peritoneal con medio de cultivo RPMI. De los órganos obtenidos únicamente de la cepa

BALB/c, se realizaron cortes histológicos y se tiñeron por la técnica de H-E. Se analizaron

los niveles de la fracción gamma globulina, beta globulina y alfa-2 globulina mediante la

electroforesis de proteínas en el suero de cada ratón. El líquido peritoneal, se centrifugó

para obtener los sobrenadantes de cada ratón y se determinó la concentración de las

citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β mediante un solo ensayo, por duplicado, por el método de

ELISA. Resultados. En los cortes histológicos de ratones BALB/c inducidos, se observó

una infiltración de tipo linfoide en todos los órganos estudiados. En BALB/c inducido,

únicamente el nivel de gamma globulina se observó incrementado, mientras que en C57BL

inducido, se observaron incrementados tanto el nivel de gamma globulina como los niveles

de beta globulina y alfa-2 globulina. Con respecto a la determinación de la concentración

(pg/mL) de las citocinas estudiadas, en BALB/c se observó una concentración alta de TGF-

β en inducidos y testigos, una disminución de la concentración de IL-10 cuando el ratón fue

inducido y un incremento de la concentración de la IL-6 cuando el ratón fue inducido. En

C57BL, también se observó una concentración alta de TGF-β en inducidos y testigos, sin

embargo la concentración de las citocinas IL-10 e IL-6 se incrementó cuando el ratón fue

inducido. Conclusiones. Las alteraciones histológicas encontradas en la cavidad

peritoneal y en los órganos analizados del ratón BALB/c inducido con aceite mineral, así

como la presencia de citocinas inflamatorias, son indicadores de un proceso inflamatorio

crónico evidente.

vii

ABSTRACT

Introduction. The multiple myeloma (MM) is a cancer of plasmatic cells which affect both

men and women who are 65 years old as an average. Anemia, infections, bone lesions,

hyperviscosity and renal damage are the most typical clinic manifestations. In spite of the

fact that nowadays there are several innovative medicaments for the treatment of MM, it’s

still an incurable disease, which makes necessary to go on doing research. Justification.

The murine model is useful for the study of the immunologic interactions that are triggered

in peritoneal cavity of susceptible BALB/c mouse, since it’s still unknown. Thus it is

expected that more detailed study of this model allows to apply this knowledge in the

understanding of human myeloma. Objective. To determine the possible correlation

between the cytokines present in the peritoneal cavity and the susceptibility of BALB/c

develop myeloma. Material and Methods. We studied 13 mice of the BALB/c strain and 16

mice of the C57BL strain. Induction of MM was done by means of 3 0.5 mL doses of

mineral oil intraperitoneal injection at 2, 4, and 6 months of age. At 8 months, mice were

sacrified and organs as kidney, spleen and small intestine were obtained, serum samples

were collected by cardiac puncture, and washes were performed with a RPMI culture

medium. Of the organs, that were obtained only on BALB/c strain, histological sections

were made and stained by H-E technique. We analyzed the levels of gamma globulin

fraction, beta globulin and alpha-2 globulin by electrophoresis of proteins in the serum of

each mouse. The peritoneal liquid was centrifuged to get the supernatants and the IL-6, IL-

10 and TGF-β cytokines concentrations were determined by a single assay in duplicate by

the ELISA test. Results. In histological sections of induced BALB/c mice, we observed an

infiltration of lymphoid type in all organs studied. In induced BALB/c, only the level of

gamma globulin was found increased, whereas in C57BL induced, the level of gamma

globulin and levels of beta globulin and alpha-2 globulin were observed increased. With

respect to the determination of the concentration (pg/mL) of cytokines studied, in BALB/c,

we observed a high concentration of TGF-β in induced and witnesses, a decreased

concentration of IL-10 when the mouse was induced and increased concentration of IL-6

when the mouse was induced. In C57BL, there was also a high concentration of TGF-β in

induced and witnesses, but the concentration of cytokines IL-10 and IL-6 was increased

when the mouse was induced. Conclusions. The histological alterations found in the

peritoneal cavity and analyzed organs of BALB/c mice with mineral oil, and the presence of

inflammatory cytokines, are indicators of a chronic inflammatory process evident.

1

I INTRODUCCIÓN

1.0. Generalidades del Mieloma Múltiple

El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad caracterizada por proliferación clonal de células

plasmáticas y presencia de una proteína monoclonal (proteína M) en suero y/u orina.

Constituye aproximadamente 10% de todas las neoplasias hematológicas y se caracteriza por

destrucción ósea, anemia, hipercalcemia e insuficiencia renal (Conte, 2006; Labardini-Méndez y

Díaz-Vargas, 2009).

1.1. Antecedentes del Mieloma Múltiple

La evidencia más antigua de la existencia del mieloma son los estudios realizados en las

momias egipcias. En 1489, Otto Kahler estudió un caso y publicó una revisión que se dio a

conocer como la enfermedad de Kahler (citado por Díaz-Maquero, 2006). El Dr. Samuel Sully

asignó el nombre de “mollitis ossium” y es el primero en describir la enfermedad en la literatura

moderna; el reporte médico publicado 1845, describe el primer caso de Thomas Alexander Mc

Bean de 44 años, mientras que el segundo caso corresponde a Sarah Newburg de 39 años

(citado por Díaz-Maquero, 2006). Las proteínas de Bence Jones (BJ) fueron así llamadas por el

Dr. Henry Bence Jones en 1847, quien estudio especímenes de orina proporcionados por los

Doctores Macintyre y Watson (citado por Díaz-Maquero, 2006). El Dr. John Dalrymple, informó sus

hallazgos detectados en los huesos humanos y realizó dibujos de las células encontradas en

éstos (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1873, Rutizky, describió otro paciente y utilizó por

primera vez el termino Mieloma Múltiple para resaltar las variadas lesiones óseas que estaban

presentes (citado por Díaz-Maquero, 2006). El término de célula plasmática fue utilizado por el

patólogo alemán Wilhem von Wakdeyer-Hartz (1836-1921), aunque en 1890, Ramón y Cajal

las describe con precisión (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1894, fue publicado el primer caso

en EU por los Doctores Herrick y Hekto (citado por Díaz-Maquero, 2006). Hasta 1900, James

Homer Wright (1869-1928), publica sus descubrimientos relacionados con plasmocitos, que son

células malignas que se encuentran en médula ósea (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1927

Arinkin, destacó la importancia del aspirado de médula ósea en el diagnóstico de mieloma

múltiple (citado por Díaz-Maquero, 2006). Perlzweig y cols. en 1928, reportan hiperglobulinemia

en un paciente. En ese mismo año Geschikter y Copelan, reportaron 13 casos y revisaron 412

que se habían publicado hasta entonces. Para 1938 Rusenthal y Vogel confirman dicha

aseveración (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1933 Wintrobe y Buil, reconocieron la presencia

de crioglobulinemia, sin embargo fue hasta 1947 que se introdujo este término por Lerner y

Watson (citado por Díaz-Maquero, 2006). En 1939 Longsworh y cols., emplearon la electroforesis

2

en el estudio del mieloma demostrando la presencia de un pico monoclonal. Kunkel demostró

que las proteínas monoclonales son producidas por los plasmocitos malignos (citado por Díaz-

Maquero, 2006). La terapia del mieloma se inició en 1958, cuando Blokhin y cols., reportaron

resultados exitosos con la mostaza I-fenilalanina, llamada en ese entonces sarcolisina (citado

por Díaz-Maquero, 2006). En 1962, ya con el nombre de melfalán, Blokhin y cols., reportaron que

inducía remisiones en un tercio de pacientes con mieloma (citado por Díaz-Maquero, 2006). En

1999, el Myeloma Trialists’ Colaborative Group demostró que solo la combinación del

Melfalán/Prednisona era eficaz (citado por Díaz-Maquero, 2006).

1.2. Epidemiología, etiología y patogénesis

El mieloma múltiple (MM) es la gammapatía monoclonal más importante (Borbolla-Escoboza y

Salazar, 2006). Representa cerca del 1% de todas las neoplasias y el 10% de los tumores

hematológicos y se presenta sobre todo en pacientes mayores de 65 años de edad. Se estima

que la frecuencia de la enfermedad es de entre tres y cuatro casos por cada cien mil personas

por año. Parece que existe una mayor incidencia de mieloma entre varones de raza negra; esta

llega a ser de nueve por cada cien mil personas por año. La incidencia en pacientes femeninos

de esta misma raza se calcula en seis por cada cien mil personas por año (Borbolla-Escoboza y

Salazar, 2006; Bujan, 2006). En el año 2002, las leucemias, los linfomas y el mieloma múltiple se

ubicaron dentro de las primeras veinte causas de mortalidad por neoplasias malignas a nivel

mundial, representando el 3.6% del total de las defunciones registradas. La distribución de la

mortalidad por edad fue muy similar a la observada en la incidencia, es decir, la tendencia de la

mortalidad por estas entidades nosológicas fue ascendente de acuerdo con la edad,

alcanzando su nivel máximo en el grupo de 65 años y más. La mortalidad por leucemia linfoide

y mieloide en México, para el 2002, fue del 4.6% respecto del total de defunciones registradas,

ubicándose el MM dentro de las primeras quince causas de mortalidad por neoplasias malignas

(Tirado-Gómez y Mohar, 2007). En MM existen varias etapas, la primera es la “indolente”,

conocida como gammapatía monoclonal de significado incierto (Monoclonal gammapathy of

unknown significance, MGUS), que es asintomática. La segunda etapa es evidente por el

aumento progresivo de la proteína monoclonal o aparición y daño a ciertos órganos. En la

etapa agresiva o terminal, las células del mieloma se vuelven independientes del estroma de la

médula ósea, y hay un aumento en la velocidad de proliferación (Borbolla-Escoboza y Salazar,

2006).

3

1.3. Microambiente de la médula ósea

Por otra parte, el microambiente medular desempeña un papel importante en la patogénesis del

MM, de ahí que la destrucción ósea se presenta en la mayoría de los pacientes con MM. Una

vez que las células del MM se adhieren al estroma medular mediante moléculas de adhesión

celular vascular (VCAM-1), las células estromales, inician la producción de citocinas como las

interleucinas IL-6, IL-1, IL-11, factor de necrosis tumoral, y la proteína inflamatoria de

macrófagos 1alfa (MIP-1alfa). A su vez, las células del MM secretan otras citocinas: el factor de

crecimiento de hepatocitos (HFG) y el péptido asociado con la paratohormona (PTHrP). Todas

estas sustancias en conjunto son llamados “factores activadores de osteoclastos” (OAF, por

sus siglas en inglés). Los OAF inducen la formación de osteoclastos de forma indirecta,

mediante estimulación de las células estromales de la médula ósea, para que se expresen

niveles elevados del ligando RANK en su superficie. Este ligando se une a su receptor en las

células precursoras de los osteoclastos e inducen su maduración y diferenciación (Borbolla-

Escoboza y Salazar, 2006; Babatunde, 2007).

La secreción paracrina y autocrina de citocinas, tales como IL-6, TNFα, IL1-β y factor de

crecimiento endotelial vascular (VEGF), son igualmente importantes en la regulación de la

biología del MM (Piazza y cols., 2007). La IL-6, es esencial en la proliferación de células

plasmablásticas normales y en la diferenciación terminal del plasmoblasto a célula plasmática.

En MM, la IL-6 es el principal factor de supervivencia celular y no induce diferenciación terminal

(Borbolla-Escoboza y Salazar, 2006). El TNFα es producido por células plasmáticas del MM, y su

actividad se debe a la sobrerregulación de moléculas de adhesión en células del MM y células

estromales de la médula ósea. El TNFα, presente abundantemente en el microambiente de la

médula ósea, activa al NF-ƘB resultando en secreción de IL-6, sobrerregulación de señales

antiapoptóticas (Bcl-XL) y expresión de moléculas de adhesión (ICAM-1 y VCAM-1) (Cavallo y

cols., 2006). El VEGF, que es producido por las células del MM y del estroma de la médula

ósea, estimula la angiogénesis, la proliferación de las células plasmáticas del MM y la

secreción de citocinas en médula ósea. El IGF-I producido en el microambiente de la médula

ósea estimula la proliferación de células plasmáticas del MM, la resistencia a fármacos e induce

migración de las células plasmáticas del MM. Otras citocinas involucradas en el crecimiento,

supervivencia y migración en MM son SCF1α, TGF-β, y la IL1β, las cuales pueden influir en el

crecimiento de las células plasmáticas del MM y en el microambiente de la médula ósea (Piazza

y cols., 2007).

Los datos obtenidos por citometría de flujo y análisis por hibridización fluorescente in situ

(FISH), indican la presencia de anormalidades citogenéticas en al menos 90% de los pacientes

4

con MM. Las translocaciones del cromosoma 14q32 que involucran la cadena pesada de las

inmunoglobulinas son un hallazgo reciente, importante en la patogenia del mieloma. La

hipodiploidía y deleción del cromosoma 13 mostró que ambas anormalidades están asociadas

de forma independiente con el mal pronóstico de la enfermedad (Borbolla-Escoboza y Salazar,

2006). Se recomienda la combinación de CD38 y CD138, como criterio eficiente para definir e

identificar de forma precisa la población de CP mediante citometría de flujo (Mateo y cols., 2006).

1.4. Oncogenes y genes supresores

La desregulación de oncogenes y genes supresores que controlan la proliferación celular,

supervivencia y apoptosis, contribuyen a la patogénesis del MM. Los genes supresores

tumorales, CDKN2A y CDKN2B se localizan en cromosoma 9p21, y codifican para los

inhibidores dependientes de ciclína-cinasa, p16 y p15 respectivamente. Tanto p15 como p16

están hipermetilados en MM, y por ello, desactivados. También los niveles de p21 y p27 se

encuentran incrementados en pacientes con MM, quizá por activación constitutiva de la vía

STAT-3. Ellos protegen a las células mielomatosas de la apoptosis induciendo paro del ciclo

celular y permitiendo la reparación subsecuente del DNA. La mutación del oncogén ras en MM

es de 40 % y es probable que dichas mutaciones provoquen independencia de las células de

mieloma de citocinas externas como IL-6 e IGF, y sea este uno de los primeros mecanismos

que adquieren las células para convertirse en estroma-independiente (Bezieau y cols., 2001). La

proteína c-myc participa en regulación de la transcripción génica de células normales y

neoplásicas. Desempeña un papel en el control de la proliferación, diferenciación y apoptosis.

La desregulación del gen c-myc es frecuente en canceres humanos y murinos; se encuentra en

más del 70% de todos los canceres incluyendo el de mama, ovario, próstata, colon, hígado, y

cáncer gástrico; neuroblastoma; mieloma y linfoma de Burkitt (Guffei y cols., 2007). Las

translocaciones más comunes asociadas con este gen son t (8; 14), t (2; 8) y t (8,22). Debido a

que en modelos de plasmocitoma murino se han encontrado con frecuencia translocaciones

que involucran a c-myc, se pensaba que ocurriría lo mismo en MM. Sin embargo, se ha

observado que esto no es así. Hoy se cree que esas alteraciones son sucesos secundarios que

ocurren en etapas tardías de la enfermedad (Santana-Dávila y Fonseca, 2006). El proto-oncogén

BCL-2 previene la apoptosis; se ha publicado que MCL-1, más que BCL-2 o BCL-X es esencial

en la supervivencia de las células de mieloma (Puthier y cols., 1999). Las mutaciones del gen o la

proteína Rb contribuyen a la transformación celular en muchos tipos de neoplasias. El gen

supresor tumoral del retinoblastoma (Rb) se localiza en el cromosoma 13q14. Algunos estudios

sugieren que la deleción de Rb es frecuente en mieloma. La incidencia total de mutaciones en

p53 es menor a 10% en pacientes con MM y se asocian con etapas terminales de la

enfermedad. La proteína CD95 (antígeno Fas) es una proteína transmembrana que induce

apoptosis cuando está unida al ligando Fas. Las células de mieloma sobrerregulan el ligando

5

Fas y conducen a apoptosis de eritroblastos, lo que sería una explicación factible, aunque con

seguridad incompleta para la anemia observada en mieloma (Borbolla-Escoboza y Salazar, 2006).

1.5. Características clínicas del Mieloma Múltiple

Cada proteína M consiste de dos polipéptidos de cadena pesada de la misma clase (γ IgG, α

IgA, µ IgM, δ IgD, ε IgE) y dos polipéptidos de cadenas ligeras (kappa o lambda) del mismo

tipo. En la electroforesis esta proteína M se detecta como un pico monoclonal (kyle, 2006). En

cerca del 60% de los pacientes con MM se puede detectar IgG monoclonal (>3.5 g/dl); 20%

tiene IgA monoclonal (>2 g/dl); y 20% sólo cadenas ligeras de inmunoglobulinas monoclonales.

Una pequeña proporción de pacientes tiene MM no secretor, en el que las células plasmáticas

neoplásicas no secretan cantidades significativas de inmunoglobulinas monoclonales. Son

raros los casos de MM de tipo IgD, IgE o IgM o biclonal. Sin embargo, un estudio realizado en

la clínica Mayo en 2004, la clase IgM es incluso mayor que la clase IgA. En general los

pacientes con MM tienen proteinuria de Bence Jones debido a la excreción por orina de

cadenas ligeras en cantidades mayores de 1 g en 24 horas (Bujan, 2006). La proteína de Bence-

Jones se forma por dímeros de cadenas ligeras, sea kappa o lambda, procedentes de

inmunoglobulinas. Esta proteína fue reconocida por Henry Bence-Jones en 1847, debido a sus

propiedades inusuales de solubilidad: precipita al calentar a 40-60oC pero se solubiliza

nuevamente cuando se calienta hasta la ebullición. El peso molecular de la proteína es bajo, de

modo que se filtra fácilmente por los glomérulos (Sister, 1987).

La presentación clínica es variada y, en ocasiones, el diagnóstico de MM sintomático se retrasa

varios meses. Los datos clínicos y de laboratorio son: síntomas óseos por fracturas vertebrales

debidas a lesiones óseas; insuficiencia renal que aparece cuando la capacidad de reabsorción

tubular se agota, lo que produce una nefritis intersticial; anemia, de manera característica

normocítica normocrómica, debido a un amento de las CP tumorales dentro de la MO;

hipercalcemia provocada por la destrucción del hueso; infecciones bacterianas recurrentes, por

deficiencia inmunitaria normal; hiperviscosidad que se debe al contenido de proteínas

monoclonales. El MM puede afectar sitios extramedulares, como hígado, ganglio, bazo,

riñones, tejidos cutáneos y subcutáneos, meninges y parénquima cerebral, lo cual genera

morfología inmunoblástica, cifras elevadas de deshidrogenasa láctica (DHL) y de β2-

microglobulina (β2-m) (Labardini-Méndez y Díaz-Vargas, 2009).

6

1.6 Evaluación diagnostica del Mieloma

El sello distintivo del MM sigue siendo la detección de la proteína M en sangre u orina (proteína

de Bence Jones).

1.6.1. Electroforesis de proteínas

La electroforesis de proteínas en suero define las siguientes bandas: banda de prealbúmina;

banda difusa, por delante de la albúmina, poco visible y constituida por la prealbúmina y la

proteína fijadora del retinol, la banda de la albúmina; representa el 50%, es la proteína más

abundante del plasma, la banda de α1-globina; está formada por α1-antitripsina, α1-

glucoproteína, transcortina, α1-lipoproteína, y α-fetoproteína, siendo las dos primeras las que

representan el mayor porcentaje de la misma; la banda de α2-globulina; está integrada por α2-

macroglobulina, haptoglobina y ceruloplasmina, la banda de las β-globulinas; las proteínas más

importantes son transferrina, hemopexina, β-lipoproteína y c3 nativo y la banda de γ-globulina;

formada por las tres principales inmunoglobulinas IgG, IgA y IgM; en ausencia de una

gammapatía monoclonal, su estimación electroforética solamente aportará información sobre la

concentración sérica, sobre todo de la IgG. Su elevación puede ser policlonal, donde las

inmunoglobulinas se elevan dando lugar a una curva simétrica, o bien moclonal, donde aparece

un pico correspondiente a la síntesis de una sola cadena de inmunoglobulinas. La elevación

policlonal de IgA da lugar a lo que se llama puente βγ-globulina (Cidoncha-Gallego y cols., 2001).

La proteína M (una cadena pesada + una cadena ligera) usualmente se observa en el trazo

densitométrico como una banda densa y discreta en el gel de agarosa, como un pico estrecho y

alto en las regiones gamma, beta o alfa-2 de las globulinas. Por el contrario, un exceso de

inmunoglobulinas policlonales (una o más clases de cadena pesada y ambas cadenas ligeras

(kappa y lambda) producen una banda ancha o pico de base ancha limitado a la región

gamma (Kyle y cols., 1981). En MM la electroforesis de proteína revela una banda localizada en

el 80% de los pacientes. El 20% restante de los pacientes presentara otra

hipogammaglobulinemia o un patrón normal (Caers y cols., 2008).

1.6.2. El ensayo de cadena ligera libre de inmunoglobulina sérica (FCL).

Este ensayo mide los niveles de los dos tipos de cadenas ligeras kappa y lambda secretadas

por las células plasmáticas. Una relación anormal de FCL Kappa-lambda indica un exceso de

un tipo de cadena ligera y tiene que ser interpretado como un desorden clonal (Caers y cols.,

2008).

7

1.6.3. Estudios en Médula ósea.

Estudios de médula ósea, sangre, orina y radiografías son necesarios para diagnosticar el

estado, seguimiento de la enfermedad y determinar el pronóstico. El diagnóstico finalmente es

confirmado por demostración de células plasmáticas malignas en el examen citológico de la

médula ósea o tejido blando con plasmocitoma, con clonalidad generalmente establecida por

inmunohistoquímica o citometría de flujo. Además de demostrar la presencia de células de MM,

en la biopsia de la médula ósea se evalúa su organización arquitectónica, índice de

proliferación, patrón de crecimiento y tipo celular, o la posible presencia de depósitos amiloides;

todos con valor pronostico (Caers y cols., 2008). La médula ósea (MO) es la fuente usual de

obtención de la muestra en MM, ya que es donde habitualmente se localizan las células

plasmáticas (CP) malignas. Para establecer el diagnóstico de MM, se debe realizar un aspirado

de médula ósea (AMO) en el que se requiere 10% de células plasmáticas anormales, aunque

puede ser más bajo, por lo que hay que hacer una búsqueda cuidadosa porque la infiltración en

MO no es homogénea, aunque tienen que mostrar la característica morfológica de CP

alteradas. En las células plasmáticas (CP) de MM, pueden llegar a observarse inclusiones

como esférulas citoplásmicas hialinas (cuerpos de Russell) y cuerpos de inclusión

intranucleares. Las células de Mott y aquéllas con forma de mórula parecen agregados de

cuerpos de Russell (Labardini-Méndez y Díaz-Vargas y Díaz, 2009).

1.7 Tratamiento para el control del Mieloma.

Entre 1958 y 1962 se inicia la era del tratamiento efectivo para MM, y el melfalán fue el primer

agente utilizado con éxito. Sin embargo, los resultados se mejoraron cuando se empezó a

utilizar la combinación de melfalán con prednisona (MP). La combinación de vincristina,

adriamicina y dexametasona (VAD) tiene mejores resultados. Sin embargo, este tratamiento es

costoso y puede presentarse neuropatía por vincristina y cardiotoxicidad. La combinación de

talidomida con dexametasona se puede considerar hoy como una terapia útil y de primera

elección para pacientes que serán sometidos a un trasplante autólogo de células

hematopoyéticas. Hoy en día existen otros medicamentos innovadores como el bortezomib,

lenalidomida, anticuerpos monoclonales anti Bcl-2, y otros (Gómez-Almaguer, 2006). Sin

embargo, el MM sigue siendo una enfermedad incurable con una mediana de supervivencia de

aproximadamente 33 meses. El mayor problema en MM es la resistencia a la terapia larga de

quimioradiación junto con la enfermedad ósea, las cuales son fuentes de gran morbilidad

(Piazza y cols., 2007).

8

2.0. Respuesta inmunológica en el mieloma

Una respuesta antitumoral adecuada depende de la correcta detección de células tumorales y

de la capacidad para provocar una respuesta efectiva del sistema inmune del individuo. En los

pacientes con MM ninguna de estas dos condiciones se cumple, debido a que existen

alteraciones fenotípicas y funcionales en linfocitos B, linfocitos T, macrófagos, células NK y

células dendríticas (Vela-Ojeda, 2006).

2.1. Linfocitos Th1 y Th2

Las clonas de células Th pueden dividirse en dos tipos principales con distintos fenotipos de

secreción de citocinas. Esto tiene sentido biológico, ya que las células Th1 que producen

citocinas como IFNγ serían especialmente eficaces contra infecciones intracelulares producidas

por virus y microorganismos que crecen en macrófagos, mientras que las células Th2 son muy

buenas colaboradoras de las células B, y parecieran estar adaptadas para la defensa contra los

parásitos que son vulnerables a IgE inducida por IL-4, eosinofilia inducida por IL-5 y

proliferación de mastocitos estimulada por las IL-3 y 4. Las células presentadoras de antígeno,

y en particular las células dendríticas, parecen ser fundamentales para impulsar la

diferenciación hacia un fenotipo Th1 o Th2. La IL-12 es particularmente importante para la

producción de células Th1, y la IL-4 para la producción de células Th2. La invasión de las

células fagocíticas por patógenos intracelulares induce la secreción de IL-12, que a su vez

estimula la producción de IFNγ. Estas dos citocinas impulsan de forma selectiva la

diferenciación del desarrollo de Th1 e inhiben las respuestas Th2. La cantidad de IL-4 en

relación con las de IL-12 e IFNγ tienen importancia fundamental para determinar la

diferenciación de las células Th0 en Th1 o Th2 (Roitt, 2001).

2.2. Linfocitos Th17

Hace pocos años se detectó una nueva célula, Th17 CD4+, esencialmente caracterizada por la

producción de IL-17 (Romagnani, 2008). La IL-17 (también conocida como IL-17A) fue

identificada en 1995 como una citocina producida por células T de memoria activadas

CD45RO+. La IL-17F presenta una secuencia de aminoácidos homologa a la IL-17A, por lo que

se considera que ambas interleucinas están estrechamente ligadas. La IL-17 (A y F) induce la

producción de un amplio rango de citocinas y quimiocinas proinflamatorias incluyendo la IL-6,

9

factores estimulantes de colonias, quimiocinas, 2-defensina-β y metaloproteasas (Voo y cols,

2009). Por lo tanto, ambas citocinas son muy importantes para la producción, activación y

migración de los neutrófilos. Las células Th17 están presentes en ratones y humanos, pero sus

características fenotípicas y funcionales, así como los mecanismos responsables para su

desarrollo en las dos especies parecen ser diferentes (Romagnani, 2008). Así las Th17 en ratón

promueven la autoinmunidad y en humano están implicadas en la patogénesis de las

enfermedades inflamatorias (Zhou y cols., 2008). En humanos los niveles de IL-17 se han

asociado con enfermedades inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide, esclerosis, uveítis,

asma y lupus eritematoso sistémico. En ratones, la IL-17 contribuye al desarrollo de encefalitis

autoinmune, artritis y colitis (Voo y cols., 2009). La diferenciación de las células Th17 es

inducida por la combinación de IL-6 y TGF-β y se incrementa por inducción de IL-21, la cual

actúa de manera autocrina (Voo y cols., 2009). Algunos reportes indican que la IL-23 parece ser

requerida para amplificar o estabilizar el fenotipo de las células Th17. La IL-1β y el TNF,

también se encontraron amplificando la respuesta de Th17 inducida por TGF-β e IL-6. Algunos

investigadores, encontraron que la IL-6 y el TGF-β sobrerregulan la expresión del RORγt, pero

no inducen diferenciación de Th17 en humanos. Contrariamente, la IL-23 promueve la

generación de células Th17 en humanos, y también es un inductor de otras citocinas

proinflamatorias (Romagnani, 2008). La IL-23 se produce por la activación de células dendríticas

(Zhou y cols., 2008). Algunos investigadores, encontraron que la IL-1 β o IL-23 son suficientes

para inducir el desarrollo de células productoras de IL-17. La función principal de las citocinas

producidas por las células Th17 es la de ser quimioatrayantes para diferentes tipos celulares a

través de la inducción de otras citocinas y quimiocinas. Las células Th17 también producen IL-

22 e IL-26, pero la función de esta última no se conoce claramente, por otro lado la IL-22, es

miembro de la familia IL-10 que se encontró está fuertemente sobre regulado en desordenes

inflamatorios crónicos (Romagnani, 2008). La IL-22 puede producir psoriasis y acantosis. La

diferenciación de las células Th17 se induce por combinación de IL-6 y TGF-β y se aumenta

por inducción de IL-21, la cual actúa de manera autocrina. La señalización inducida por dichas

citocinas resulta en fosforilación de STAT3 y expresión del receptor huérfano ROR γt, factor de

transcripción que se requiere para la expresión de IL-17 (Voo y cols, 2009).

Ahora se sabe que en respuesta a algunos patógenos o sus componentes, las células

dendríticas que son responsables de presentar antígenos a las células T, también secretan

interleucina IL-6 y TGF- β para la diferenciación de las células Th17. Algunos experimentos

muestran que las células dendríticas que fagocitan células apoptóticas infectadas o células B

apoptóticas, secretan TGF- β, IL-6, IL-23, las cuales inducen diferenciación de las células Th17

encargadas de promover la inflamación. Mientras que las células dendríticas que fagocitan

10

células apoptóticas no infectadas producen TGF- β e IL-10, promoviendo la diferenciación de

células T reg. Debido a esto se propone que la resolución de la inflamación seguida de

fagocitosis de células apoptóticas se acompaña de supresión activa de las citocinas que

estimulan la inflamación (Stockinger, 2009).

2.3. Linfocitos T reguladores

Las células T reguladoras se caracterizan por su capacidad para controlar la reactividad

inmune contra antígenos propios de las células T que han escapado de la apoptosis como

resultado de la alta afinidad por péptidos propios (Douglas y cols., 2008). Además, varias

funciones se han sugerido; prevención de enfermedades autoinmunes por estabilización y

mantenimiento de la tolerancia inmunológica a lo propio, supresión de alergia y asma,

Inducción de la tolerancia materna al feto, regulación de la clase efectora de la respuesta

inmune, supresión de la activación de células T desencadenada por estimulo débil, control de

retroalimentación de la magnitud de la respuesta inmune por células Th efectoras y protección

de bacterias comensales por eliminación del sistema inmune (Corthay, 2009). Al menos tres

grupos distintos de células Treg se han definido; células Treg Foxp3 positivas, células Th3

Foxp3 negativo y células Treg tipo 1 (Tr1). Las células Tr1 producen principalmente IL-10 y por

lo tanto, suprimen varias respuestas inflamatorias (Yanagawa y cols., 2008). Las células Treg

pueden derivar del timo (naturales) aunque también pueden desarrollarse de células CD4+ en

la periferia (Treg inducidas o adaptativas). Las células T reg derivadas del timo requieren

mecanismos de contacto célula a célula para ejercer su función y son esencialmente

independientes de citocinas, mientras que las células Treg inducidas por antígenos median su

función inmune por liberación de citocinas, especialmente el factor de crecimiento

transformante-β y la Interleucina IL-10 (Douglas y cols., 2008). Las células Tr1 se generan en la

periferia a partir de células CD4+CD25- naïve tras la estimulación antigénica en condiciones de

coestimulación limitante. Entre los factores inductores mejor establecidos están la IL-10 y las

células dendríticas inmaduras. Mientras que las células Treg CD4+CD25+ actúan a través del

contacto celular, las Tr1 lo hacen a través de citocinas supresoras como IL-10 y TGF-β. Por

otro lado, las células Tr1 parecen no expresar FOXP3. Además, mientras que las células Treg

migran a los ganglios linfáticos (por ello expresan niveles elevados de CD62L), las células Tr1

migran hacia sitios de inflamación. Las células Tr1 suprimen la respuesta de células T naïve y

de memoria, así como la expresión de moléculas coestimuladoras y la secreción de citocinas

proinflamatorias de las células presentadoras de antígeno (San Segundo y cols., 2007).

11

Existe un segundo tipo de células TCD4+ reguladoras inducidas que se denominan Th3 y que

son superponibles a las Tr1 en muchas características, salvo que secretan TGF-β. Tampoco

existen marcadores fenotípicos que las identifiquen (San Segundo y cols., 2007).

La IL-10 es una citocina inmunoreguladora potente que inhibe las respuestas innata y adquirida

indeseables. Esta puede ser producida por varios tipos celulares incluyendo las células B,

monocitos/macrófagos, células dendríticas (DCs), células Th2 y Treg. La IL-10 es responsable

de limitar y terminar la respuesta inflamatoria, la cual reduce el daño al tejido propio en el

proceso de erradicación patógena. Adicionalmente, la IL-10 juega un papel importante en la

tolerancia inmune y protección de la autoinmunidad. También inhibe la activación subsecuente

a la producción de citocinas y sobrerregulación de moléculas coestimuladoras. En contraste, se

ha reportado que el IFN-γ suprime la inducción de IL-10 mediada por receptores tipo Toll

(Yanagawa y cols., 2008).

El fenotipo de las células Treg es CD4+CD25+, y la sobreexpresión de FoxP3, el cual actúa

como un represor transcripcional y parece ser un marcador para su identificación (Douglas y

cols., 2008). Años después de su descripción inicial, se supo que CD25 no es un marcador

propio de estas células, pues también se expresa en células T activadas. Recientemente se

demostró que dos genes se expresan de manera predominante en estas células y que

pudieran ser específicos de ella: el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por

esteroides (GTRI) y el factor de transcripción Foxp3 (Vela-Ojeda, 2006). La transcripción del

factor NFAT, induce la expresión del FOXP3 por la unión a su promotor (Solomou y cols., 2007).

El antígeno asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), el Gen 3 de activación de los

linfocitos (LAG-3) también son marcadores ampliamente usados para la identificación de las T

reg (Corthay, 2009). Las células T reg incluyen a las llamadas células T reg Foxp3+ naturales

que son inducidas en el timo, las células T reg Foxp3+ adaptativas o las Foxp3- que son

inducidas en la periferia y producen TGF-Β y/o IL-10. Por otro lado, el Foxp3+ también se

encuentra induciendo la generación de las células T ROR γt+ productoras de IL-17 y de IL-10,

las cuales tienen funciones proinflamatorias y reguladoras respectivamente (Lochner y cols.,

2008).

El factor de crecimiento transformante-β es un factor de diferenciación crítico en el desarrollo

de las células Treg adaptativas, pero su acción es inhibida por la IL-6. Los cambios de células

Th17 a células Treg parece ser mutuamente exclusiva en los ratones, sin contar con datos

semejantes en humanos. Sin embargo, niveles altos de IL-6 juegan un papel importante en el

mieloma como factor necesario para crecimiento de las células plasmáticas y por lo tanto, en la

12

inhibición de células Treg en el mieloma. En humanos, el mantenimiento del número y función

de las células Treg se ha demostrado que depende de interacciones con células dendríticas

(DCs) y tiene una implicación importante para la inmunoterapia (Douglas y cols., 2008).

En la actualidad, hay desacuerdo significativo concerniente al número y función de las T reg en

mieloma (Douglas y cols., 2008). Hace poco, Prabhala y cols., publicaron que se encuentran

disminuidas en pacientes con MM. Estos investigadores reportaron cantidad significativamente

reducida de células FoxP3 en MGUS y mieloma, y esto fue confirmado por inmunohistoquímica

y Western blotting (Prabhala y cols., 2006). En contraste, Beyer et al encontró que las Treg se

incrementaron y asociaron con una fuerte función inhibitoria en MGUS tanto en mieloma tratado

como en no tratado. El incremento en los niveles de FoxP3 fue documentado por la expresión

de mRNA y citometría de flujo (Beyer y cols., 2006). La discrepancia en función y numero de Treg

en estos reportes puede deberse a diferencias en ensayos y técnicas de purificación (Douglas y

cols., 2008).

3.0 El Modelo de Plasmocitoma en ratón BALB/c

3.1. Importancia del modelo de plasmocitoma murino

Los plasmocitomas son inducidos en ratones BALB/c por inoculación intraperitoneal de un

agente químico específico. Tal agente, inicialmente provoca formación de un granuloma en la

superficie peritoneal y posteriormente desencadena el desarrollo de tumores que producen

inmunoglobulinas monoclonales (Armstrong y cols., 1978). Los estudios de plasmocitomas

realizados por Potter, aportaron una era de intensa investigación durante la cual algunas de las

preguntas más confusas en la inmunología fueron resueltas. La base estructural y genética de

la especificidad y diversidad de los anticuerpos se estableció por investigación de los

plasmocitomas murinos (MPC). Puesto que debido a que los plasmocitomas de BALB/c

producen el componente M en suero, estos tumores presentan una oportunidad única para

investigar la estructura y función de las inmunoglobulinas molecularmente homogéneas. Los

inmunoquímicos fueron inmediatamente atraídos por los plasmocitomas debido a que les

proporcionaron una fuente ilimitada de inmunoglobulina homogénea. Las proteínas

monoclonales producidas por la mayoría de los MPC fueron de clase IgA o IgG. Algunos

produjeron solamente cadenas ligeras Kappa o lambda, y raramente se produjeron IgM o IgD

(Lynch, 2005). Kohler y Milstein, desarrollaron un ingenioso sistema de hibridoma, en el cual las

células de MPC fueron fusionadas con células del bazo para inmortalizar clonas que producen

esencialmente cantidades ilimitadas de un anticuerpo único de especificidad definida (Kölher y

Milstein, 1975). Su trabajo tuvo un amplio impacto en las ciencias biológicas y la medicina

13

humana. Los plasmocitomas también fueron un elemento fundamental en la investigación de

Hozumi y Tonewaga, quienes fueron pioneros en aplicar tecnología recombinante en

inmunología (Hozumi y Tonewaga, 1976).

3.2. Estandarización del Plasmocitoma Murino

En 1962 Michael Potter y colaboradores sistemáticamente desarrollaron el método para

provocar y caracterizar mielomas en ratón. Los plasmocitomas pueden ser inducidos con alta

frecuencia en cepas de ratones susceptibles por administración intraperitoneal de plásticos o

aceites. En una serie de experimentos paralelos Potter utilizó el aceite de maíz, el pristano (2,

6, 10, 14 – tetrametilpentadecano); componente inductor principal del aceite mineral, el aceite

de silicón y el gel de silicón obtenido de implantes mamarios y los inyecto en ratones de las

cepas BALB/c, C57BL, C3H/Hej, DBA/2N y F1 (BALB/c x DBA/2). Posteriormente a la

inoculación, él encontró que el pristano, fue capaz de inducir el plasmocitoma y solo la cepa

BALB/c resultó ser susceptible a desarrollar mieloma, mientras que las otras cepas resultaron

ser resistentes. Las características del desarrollo de tumor en este modelo de ratón son las

siguientes: 1) Se requiere un genotipo susceptible, especialmente encontrado en los ratones

BALB/c, 2) La formación de las translocaciones cromosómicas t(12;15) y t(6;15) en células B

resulta en combinaciones con c-myc o pvt-1. 3) Inflamación crónica ocasionada por el aceite;

principalmente el aceite pristano, 4) Desarrollo del tumor después de que el agente irritante

persiste por un periodo muy largo en la cavidad peritoneal del ratón (Potter y cols., 1994).

3.3. Plasmacitogénesis

Este modelo es el más ampliamente utilizado y ha proporcionado la mayoría de datos de la

plasmocitogénesis hasta el momento. Este modelo da la oportunidad de estudiar el papel de la

desregulación del c-myc, los mecanismos que llevan a cambios citogenéticos que involucran

genes de Ig, el papel de los factores inflamatorios crónicos, de la interleucina IL-6, el factor-I de

crecimiento tipo insulina, prostaglandinas y las vías de señalización de transducción en el

proceso neoplásico. Aunque el crecimiento del MPC está restringido al microambiente

peritoneal, la inyección intraperitoneal de la suspensión de células del MPC puede reproducir

las características de diseminación de la enfermedad humana en los receptores (Gado y cols.,

2001). En la mayoría de los plasmocitomas murinos, la desregulación del transcrito myc es

activado por la translocación que yuxtapone el locus c-myc/Pvt-1 en el cromosoma 15 con un

loci de la inmunoglobulina (Ig) en el cromosoma 12 (IgH), 6 (IgƘ) o 16 (Igλ). El hallazgo de que

la expresión myc es desregulada en el plasmocitoma murino indica que es un evento crítico

obligatorio requerido para la transformación de linfocitos B a plasmocitoma murino. Se ha

sugerido que la generación de t (12;15) está restringida a las células precursoras en un estado

14

mayor de diferenciación, a células B inmaduras/maduras y también a células plasmáticas,

mientras que los tipos variantes, t(6;15) y t(15;16), ocurren en células en un estado más

temprano de diferenciación, tal como la célula B progenitora (pro-B) y células precursoras B

(pre-B) (Ohno y cols., 1999). Una característica que une a las células neoplásicas plasmáticas

del ratón y humano es el papel crítico de IL-6, como un factor de crecimiento, diferenciación y

de supervivencia (Kovalchuk y cols., 2001).

Interleucina-6

La interleucina (IL-6) es una citocina proinflamatoria que carece de un dominio

transmembranal, es secretada directamente como una proteína soluble. Es producida

tardíamente en la respuesta inflamatoria e importante en la fase de resolución temprana de la

respuesta innata y en la inducción de la inmunidad adquirida (Manderson y cols., 2007). Aunque

la IL-6 fue identificada como un factor producido por los linfocitos T, no sólo éstas células la

producen, sino también una amplia variedad de tipos celulares que incluyen macrófagos,

células endoteliales, gliales, queratinocitos o fibroblastos. La IL-6 es un polipéptido pequeño, de

homología con una familia de citocinas más amplia: IL-11, factor ciliar neutrófico (CNTF),

caridiotrofina-1 (CT-1), citocinas similar a la cardiotrofina (CLC), factor inhibidor de la leucemia

(LIF), neuropoyetina (NPN) y oncostatina M (OSM), recientemente ampliada por IL-27 e IL-31.

Todas ellas comparten la utilización de un receptor celular muy común, presente en casi todas

las células del organismo: gp130, capaz de transmitir señales intracelulares a través de la

fosforilación de proteínas asociadas a su dominio intracelular. Sin embargo, la IL-6 no es capaz

de unirse a gp130 en ausencia de un segundo receptor específico denominado IL-6R, de

expresión mucho más restringida a hepatocitos, neutrófilos, monocitos/macrófagos y algunos

linfocitos (Pablos-Álvarez). La unión de IL-6 a su receptor IL-6R/GP80 induce la fosforilación y

homodimerización de gp130 llevando a la activación de las tres principales cascadas de

señalización: la vía janus quinasa 2 / señal del transductor y activador de la transcripción 3

(JAK2/STAT3), la vía de la quinasa fosfatidilinositol-3 (PI-3K) y la vía de la proteína quinasa

activada por mitógeno/Ras. La vía STAT3 esta constitutivamente activada en las células

mononucleares en médula ósea de pacientes con mieloma múltiple y de la línea celular de

mieloma U266 dependiente de IL-6 (Cavallo y cols., 2006). El tipo de señal que transmite gp130

es de fosforilación de una proteína intracelular denominada jak (Jano cinasa 2) que a su vez

fosforila a STAT-3 (transductor de señal y activador de transcripción), un factor de transcripción

capaz de trasladarse al núcleo y activar la expresión de sus genes diana. Uno de ellos es el

gen del inhibidor SOCS (supresor de la señalización de citocinas) que actúa como un

mecanismo de retroalimentación negativa, interfiriendo con la fosforilación de STAT3, con lo

que se cierra esta cascada. Además de esta señal especifica de STAT3, la activación de gp

15

130 se conecta lateralmente con dos importantes cascadas intracelulares y las activa: la vía de

las MAPK (cinasas activadas por mitógenos) y la mediada por lípidos IP3k/AKt (fosfatidil inositol

cinasa), ambas de enorme relevancia en la inducción de factores proinflamatarios y de

supervivencia celular (Pablos-Álvarez).

La IL-6 es la citocina más importante con efectos a distancia u “hormonales”. Los tres focos a

distancia de mayor interés en la respuesta sistémica a la inflamación mediada por IL-6 son: el

sistema nervioso (respuesta febril), el hígado (aumento de reactantes de fase aguda) y la

médula ósea (respuesta hematológica), aunque no son los únicos (Pablos-Álvarez). La IL-6 es

uno de los principales factores de crecimiento para las células del mieloma y tiene un papel

importante en la supervivencia de las células plasmáticas malignas. La inducción de los MPC

es favorecida por la presencia de IL-6 y otros factores de crecimiento en el microambiente

granulomatoso. Lattanzio y cols., encontraron que la deficiencia de esta citocina en ratones

BALB/c, los protege contra el desarrollo del tumor que se induce con aceite pristano (Lattanzio y

cols, 1997). Es concebible que, durante el curso de la expansión de células plasmáticas

policlonales inducida por la IL-6, pueda ocurrir la translocación Ig/myc en una o pocas clonas

que finalmente generaran plasmocitomas monoclonales (Gado y cols., 2001).

En presencia de TGF-β, el destino de la célula T hacia proinflamatoria (Th17) o antiinflamatoria

(Treg) depende de que en el medio haya o no citocinas proinflamatorias, fundamentalmente IL-

6. La IL-6 no solo favorece la generación de células Th17, sino que bloquea la diferenciación

de células Treg, de efectos antiinflamatorios e inmunosupresores (Pablos-Álvarez, 2009;

Pasquinelli, 2008).

Prostaglandinas

Las prostaglandinas E2 (PGE2) han mostrado tener un número de efectos reguladores en la

actividad de células B. El principal efecto biológico es inhibir la proliferación y activación de

células B. Las prostaglandinas pueden ser detectadas en niveles altos en el granuloma de

aceite y es más probable que sean producidos por los macrófagos y fibroblastos. Puesto que la

PGE2 estimula la producción en macrófagos y otras células inflamatorias de IL-6, llega a ser

un factor relevante durante la génesis de MPC. Si se requieren niveles altos de IL-6 para el

desarrollo de MPC, entonces la inhibición de la síntesis de PGE2 puede jugar un papel

importante en el microambiente permisivo de la formación de MPC (Gado y cols., 2001).

16

El factor-1 de crecimiento tipo insulina

El factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) se ha encontrado que estimula la proliferación de

líneas celulares de mieloma humano. El IGF-1 también posee un efecto antiapoptótico en

células de mieloma (Gado y cols., 2001).

El factor de crecimiento transformante β

El factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) es un regulador general de las

actividades celulares con múltiples efectos biológicos. Actualmente se sabe que es sintetizado

por diferentes tipos celulares incluyendo linfocitos, macrófagos, fibroblastos, miocitos,

condrocitos, astrocitos, células epiteliales, células de riñón, células de placenta y plaquetas, así

como por algunas células tumorales. A esta citocina se le denominó como el TGF-β por su

función de inducir reversiblemente la transformación e inhibir la proliferación de fibroblastos

normales, pero actualmente ha sido posible aislarlo de fuentes como el glioblastoma humano y

de médula ósea bovina. Los miembros de la superfamilia de TGF-β son reguladores

multifuncionales de la proliferación y diferenciación de una amplia variedad de tipos celulares.

Existen varias isoformas de los TGF-β designadas como TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 y

TGF-β5. Adicionalmente, un heterodímero del TGF-β1.2, se ha identificado en plaquetas

porcinas. Las isoformas 1, 2 y 3 se encuentran codificadas en los cromosomas humanos

19q13, 1q41 y 14q24, mientras que las isoformas 4 y 5 se han identificado en aves y en

anfibios, respectivamente. El TGF-β1 y el TGF-β2 son sintetizados por muchos tipos celulares,

mientras que el TGF-β3 es expresado por células mesenquimales. Las isoformas TGF-β 1, 2 y

3 comparten una alta homología de secuencia de aminoácidos, tienen distintos patrones de

expresión y sus funciones son mediadas por los mismos receptores. Se han identificado cinco

diferentes tipos de receptores para TGF-β que incluyen a los receptores funcionales, como son

el tipo I (TβRI) y el tipo II (TβRII) y los receptores no funcionales que incluyen el tipo III (TβRIII),

el tipo IV (TβRIV) y el tipo V (TβRIV). El TGF- β1 es el miembro de la familia más ampliamente

estudiado y puede actuar como un mitógeno indirecto sobre células mesenquimales o como

estimulador de la síntesis de proteínas de matriz extracelular. Sin embargo, también es un

potente inhibidor de la proliferación de de células epiteliales, endoteliales, linfoides y mieloides

(Peralta-Zaragoza y cols., 2001). Sin embargo las células del PCT son refractarias al efecto de

inhibición y apoptosis porque carecen del receptor funcional para TGF-β (Gado y cols., 2001).

Por otro lado, Maeda y cols, demostraron en sus trabajos en modelos murinos con timomas

que el TGF- β1 estimula la producción de IL-10 por parte de macrófagos (Maeda y cols, 1995).

Estas evidencias apoyan que los tumores son capaces de producir el TGF-β1 y, en

17

consecuencia, inducir el desarrollo de mecanismo de escape de la vigilancia inmune (Peralta-

Zaragoza y cols., 2001).

3.4. Características de diagnóstico

El diagnostico de MPC es establecido siguiendo los resultados de 10 o más características del

las células plasmáticas tumorales en el líquido de ascitis. Las células de plasmocitoma pueden

ser identificadas por su gran tamaño, abundante citoplasma basófilo, un retículo endoplásmico

y aparato de Golgi bien desarrollado, junto con un núcleo no picnótico en forma de riñón con

una zona clara perinuclear (Gado y cols., 2001).

3.5. Agente inhibidor del MPC

Potter demostró que la Indometacina, un agente no esteroideo anti inflamatorio, inhibe

fuertemente el desarrollo de la formación de MPC en ratones BALB/c tratados con pristano

(Potter y cols., 1985). Se sabe que los blancos bioquímicos de este inhibidor son las enzimas

ciclo oxigenasas, COX-1 y COX-2.

18

1.0. JUSTIFICACIÓN

El modelo murino es útil para el estudio de las interacciones inmunológicas que se

desencadenan en la cavidad peritoneal del ratón susceptible BALB/c, puesto que no se

conocen aún. Así se espera que el estudio más detallado de este modelo permita aplicar dicho

conocimiento en la comprensión del mieloma humano.

19

5.0. HIPOTESIS

La concentración de citocinas presentes en la cavidad peritoneal del ratón BALB/c inducido

que promueven la diferenciación de las células Th17, es mayor respecto a la concentración de

citocinas que inducen a la diferenciación de las Treg.

20

6.0. OBJETIVO GENERAL

Determinar la posible correlación entre las citocinas presentes en la cavidad peritoneal y la

susceptibilidad del ratón BALB/c a desarrollar mieloma.

6.1. OBJETIVOS PARTICULARES

Realizar cortes histológicos del bazo, riñón, e intestino a los 8 meses post-inducción en

ratones BALB/c.

Identificar la banda monoclonal por medio de electroforesis de suero a los 8 meses

post-inducción en ratones BALB/c y C57BL.

Cuantificar las citocinas: IL-6, IL10 y TGF-β por el método de ELISA a los 8 meses post-

inducción en el líquido peritoneal de ratones de las cepas BALB/c y C57BL.

21

II MATERIAL Y MÉTODOS

Diagrama General de Trabajo

* *

*

*Se trabajaron ratones inducidos y sus respectivos testigos

INDUCCIÓN CON

ACEITE MINERAL

Electroforesis de

Proteínas séricas

Histología: riñón, bazo,

hígado e intestino

Cuantificación de

citocinas IL-6, IL-10 y

TGF-β por ELISA

OBTENCIÓN

DE SUERO

OBTENCIÓN

DE ÓRGANOS

OBTENCIÓN

DEL LÍQUIDO

PERITONEAL

BALB/c

y

C57BL

BALB/c

22

A) PROCEDIMIENTO DE INDUCCIÓN DEL RATÓN POR VÍA INTRAPERITONEAL.

Se utilizaron dos cepas de ratones: BALB/c y C57BL. Cada una de estas cepas, fue dividida en

dos grupos: los Inducidos y los testigos; n=10 para cada grupo. La administración de aceite se

realizo únicamente en los grupos denominados Inducidos por vía intraperitoneal. En total se

aplicaron 3 dosis de 0.5 mL de aceite mineral. La primera, segunda y tercera dosis se realizó a

los 2, 4 y 6 meses de edad respectivamente (Figura1).

Esquema de Inducción de mieloma en ratones de las cepas BALB/c y C57BL

Figura 1. Esquema de Inducción de mieloma en ratones de las cepas BALB/c y C57BL. La primera inducción con aceite mineral se realizó a los 2 meses de edad, la segunda a los 4 meses de edad y la tercera a los 6 meses de edad. Se estudiaron dos grupos de ratones de la cepa BALB/c, uno inducido y el otro control. De la cepa C57BL también se estudió un grupo inducido y otro control.

23

B) OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS

i) Procedimiento para la obtención de suero de BALB/c y C57BL

Los ratones fueron anestesiados con éter etílico y sujetados en la tabla de disección, lo que

facilitó la obtención de sangre por punción cardiaca. Primero se localizó el corazón,

posteriormente se limpió con alcohol la zona elegida para la punción y se introdujo la aguja

(22 x 32 mm) en la cavidad cardiaca, el embolo de la jeringa se jaló suave y rápidamente

para la extracción de la sangre. La sangre depositada en tubos eppendorf se coaguló y se

centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos, transcurrido este tiempo el suero fue

recuperado y conservado a -70ºC hasta su uso.

ii) Procedimiento para la obtención del líquido peritoneal de BALB/c y C57BL

Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y colocados en la tabla de disección.

Se inició limpiando con alcohol la parte anterior del ratón y se procedió hacer una incisión

vertical en la parte inferior del abdomen separando la piel con tijeras de punta roma sin romper

las capas más profundas (el peritoneo). Una vez expuesto el peritoneo, se inyectaron los

primeros 5 mL de medio de cultivo de células (RPMI) dando un ligero masaje en el peritoneo.

En seguida se aspiró con la misma jeringa el líquido contenido en la cavidad peritoneal y se

recolecto en un tubo estéril con tapón de rosca de 15 mL. Posteriormente se realizó un

24

segundo lavado con otros 5 mL del medio RPMI siguiendo el mismo procedimiento. La cantidad

obtenida del líquido peritoneal de los dos lavados fue aproximadamente 8 mL, el cual fue

centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos, transcurrido este tiempo, los sobrenadantes

fueron conservados a -70ºC hasta su uso.

iii) Procedimiento para la obtención de órganos de BALB/c

La obtención de los órganos se realizó una vez que fueron obtenidos los lavados de la

cavidad peritoneal. Se separo la piel del cuerpo del ratón utilizando la parte roma de la tijera

y se cortó el peritoneo. Una vez que estuvieron expuestos los órganos: riñón, bazo e

intestino delgado, se realizó su extirpación quitando cuidadosamente el tejido conectivo que

los fijaba a la cavidad peritoneal. Los órganos fueron conservados en viales que contenían

formol al 10%.

25

C) REALIZACIÓN DEL MÉTODO HISTOLÓGICO

i) Inclusión en parafina

Antes de incluir en parafina los órganos que fueron conservados en formol al 10%, estos se

mantuvieron en diferentes soluciones, durante 1hr en cada solución. Primero estuvieron en

cuatro soluciones de etanol al 96%, después en dos soluciones de etanol absoluto y por

ultimo en tres soluciones de xilol. Posteriormente los órganos fueron mantenidos en dos

soluciones de parafina fundida entre 60 y 65ºC durante 1 hora en cada solución. Una vez

solidificada la parafina, el bloque fue moldeado y enfriado en el refrigerador durante media

hora.

ii) Corte en micrótomo

El bloque de parafina de 4-6 micras fue cortado con el micrótomo hasta obtener los cortes

de tejido deseados. Los cortes fueron sumergidos en baño de flotación a 37ºC,

posteriormente se montaron en portaobjetos y se mantuvieron en la estufa a 60ºC durante

30 minutos.

iii) Tinción con H-E

Los cortes se desparafinaron sumergiendo los portaobjetos en dos soluciones de xilol

durante 5 minutos en cada una. En seguida se realizaron tres baños de etanol absoluto,

después 3 baños en tres soluciones diferentes de etanol al 96% y finalmente baños con

agua corriente. Terminada la desparafinación, se realizó la tinción, los cortes se

sumergieron en hematoxilina de Harris durante 5 a 10 minutos y se lavaron con agua

corriente, la diferenciación se realizó con alcohol-ácido y en seguida se lavaron con agua

corriente, después los cortes se viraron en una solución saturada de carbonato de litio e

hidróxido de amonio y en seguida fueron lavados con agua corriente. Entonces, los cortes

se colocaron en baños de eosina y posteriormente en tres soluciones de etanol al 96%.

Después se realizaron 3 baños en una solución de etanol absoluto y 3 baños en dos

soluciones de xilol. Una vez que los cortes fueron lavados y secados se observaron en el

microscopio.

26

D) REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

i. Cuantificación de Proteínas Totales

La cuantificación de proteínas totales presentes en el suero de ratón, se realizó de forma

automatizada en el equipo ADVIA 1200. Este equipo utilizó el sistema ADVIA Chemistry, el cual

se basa en el método de Weichselbaum que utiliza el reactivo de biuret (sulfato cúprico en una

solución alcalina). El principio de este procedimiento es que los enlaces peptídicos de las

proteínas interaccionan con los iones de cobre y forman un complejo morado que se mide a

545nm como reacción de punto final (Weichselbaum, 1946). La reacción es la siguiente:

Proteína + CuSO4 Complejo cuproproteinato

ii. Corrimiento electroforético

El corrimiento electroforético se realizó de forma automatizada utilizando el equipo SPIFE 3000.

Este equipo utilizó el kit QuickGel Split Beta. Primero se colocaron 60 µl del suero de cada

ratón en una cámara que se introdujo en el equipo. También se colocó el aplicador de muestras

y cuidadosamente el gel en el interior del equipo. Una vez limpios los electrodos con agua

desionizada, la muestra fue aplicada durante 10 minutos a 21ºC y el corrimiento durante 8

minutos a 21ºC a 350V, transcurrido este tiempo el gel fue removido para eliminar la parte

sobrante, posteriormente el gel fue secado a 54ºC. Entonces, el gel fue colocado en el plato de

tinción con Acid Blue durante 4 minutos, automáticamente fue secado y desteñido con tres

lavados consecutivos de 1 minuto en la solución para desteñir Citric Acid Destain,

automáticamente fue secado y quedando listo para ser removido después de 5 minutos. Una

vez removido el gel, se realizó el escaneado en el QuickScan 2000 y se obtuvo el análisis

densitométrico (Alper, 1974).

OH⁻

27

E) REALIZACIÓN DE LA DETERMINACIÓN DE CITOCINAS POR EL MÉTODO DE ELISA

Para la determinación de citocinas: IL-6, IL-10 y TGF-β en los sobrenadantes de líquido

peritoneal de cada ratón, se realizó un solo ensayo por duplicado por el método de ELISA

utilizando un kit ELISA eBiosciences para cada citocina. Primero se realizó una curva de

calibración de cada citocina. Posteriormente se adicionaron 100µL de cada dilución de la curva

de calibración (únicamente para la curva de calibración de TGF-β se adicionaron 20 μl de HCl

1N e incubaron 10 minutos y finalmente 20 μl de NaOH 1N) y de cada una de las muestras en

la placa de 96 pozos específica de cada citocina. La placa se cubrió e incubó toda la noche a

4ºC. Al día siguiente, la placa se aspiró, se lavo 5 veces y se secó sacudiendo fuertemente en

la mesa de trabajo. Una vez seca, se adicionaron 100µL de conjugado específico, se cubrió e

incubó 1 hr a temperatura ambiente. Transcurrida la incubación, la placa se aspiró, se lavo 5

veces y se secó sacudiendo fuertemente en la mesa de trabajo. Después se adicionaron 100µL

de la enzima Avidin-HRP, se cubrió e incubo 30 minutos a temperatura ambiente. La placa se

aspiró, se lavo 7 veces y se secó sacudiendo fuertemente en la mesa de trabajo.

Posteriormente se adicionaron 100µL de sustrato TMB y se incubó por 15 minutos a

temperatura ambiente. Se adicionaron 100µL de solución de paro y finalmente se realizó la

lectura a 450nm en el lector de ELISA y a partir de la curva de calibración, se determinaron las

concentraciones (pg/mL) particulares de cada citocina presente en el líquido peritoneal de cada

ratón.

28

III RESULTADOS

1. RESULTADOS DEL ANÁLISIS HISTOLÓGICO

1.2. RIÑÓN

Los cortes histológicos del riñón teñidos con H-E, no mostraron alteración importante en la

estructura del glomérulo renal del ratón BALB/c con 8 meses post-inducción (I), con

respecto al ratón BALB/c testigo (T) (Figura 2). Sin embargo en la zona perivascular del

ratón inducido se puede observar una infiltración linfocitaria importante (Figura 3).

Figura 2. Imagen del glomérulo renal de ratones BALB/c. A) Imagen que

muestra glomérulo de ratón no inducido denominado testigo, 10x. B)

Imagen que muestra el glomérulo de ratón inducido con aceite mineral, 10X.

C) glomérulo de ratón testigo, 40x. D) glomérulo de ratón inducido, 40X.

Técnica de hematoxilina-eosina, 10 y 40x. g=glomérulo renal, tr=túbulos

renales, cp=capsula de Bowman

g

g

tr

g g

A) B)

C) D)

cp

29

1.3. BAZO

Los cortes histológicos correspondientes al bazo mostraron disminución de la pulpa roja con

incremento de pulpa blanca en los ratones tratados durante de 8 meses post-inducción con

aceite mineral respecto al grupo testigo (Figura 4).

Figura 3. Imagen de la zona perivascular en riñón de raton BALB/c. A) Imagen que

muestra un vaso sanguíneo libre de infiltrado celular en el ratón BALB testigo, 10X. B)

Imagen que muestra infiltrado celular de tipo linfoide en el vaso sanguíneo del ratón

inducido con aceite mineral, 10X. C) Misma imagen que B) a 40x. Técnica de

hematoxilina-eosina, 10 y 40x. vs=vaso sanguíneo, inf=infiltración celular tipo linfoide

vs

vs

inf

inf

A)

B)

.

C)

.

Figura 4. Imagen del corte histológico de bazo de ratones BALB/c. A) Se

muestra la proporción de pulpa roja y de pulpa blanca en un ratón testigo.

B) Imagen correspondiente a un ratón inducido con aceite mineral y se

muestra disminución de la pulpa roja con incremento de la pulpa blanca.

Técnica de hematoxilina-eosina, 10x. pr=pulpa roja, pb=pulpa blanca.

pr

pb

pr pb

A) B)

30

1.4. INTESTINO DELGADO

Los cortes histológicos correspondientes al intestino delgado de ratones BALB/c, muestran

morfología normal en la lámina propia, las placas de Peyer y la capa muscular en los

testigos sin tratamiento. También se muestran los cambios histológicos en los mismos sitios

caracterizados principalmente por una infiltración de tipo linfoide en ratones tratados con

aceite mineral. Además de esta infiltración linfoide también se observó la participación de

macrófagos espumosos en la capa serosa, que posiblemente se encuentran fagocitando

partículas de aceite y engrosamiento de la capa muscular (Figura 5).

Figura 5. Cortes histológicos de intestino delgado de ratones BALB/c. A) Imagen de una placa de Peyer

normal en un ratón testigo, 10X. B) Placa de Peyer infiltrada por gran cantidad de células linfoides, 10X. C)

Imagen de la lámina propia de un ratón testigo, 10X. D) Imagen de la lámina propia alterada por infiltración

linfoide en un ratón inducido, 10X. E) Capa muscular normal en un ratón testigo, 10X. F) Engrosamiento de la

capa muscular en ratón inducido 10X. G) Misma imagen que en F) a 40X, en donde se aprecian los

macrófagos espumosos. Técnica de hematoxilina-eosina, 10 y 40x. pp=placa de peyer , lp=lamina propia,

inf=infiltración de tipo linfoide, m=capa muscular, s=capa serosa, mθ=macrófago espumosos

A) B)

.

C)

.

D)

.

E) F) G)

.

pp

pp

inf

lp

lp

inf

m

m

s

mθ

31

2. RESULTADOS DEL ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO

a) Cuantificación de Proteínas Totales

La determinación de proteínas totales (PT) se realizó por método automatizado. En la tabla 1,

se muestran los valores obtenidos de proteínas totales de los ratones testigos e inducidos de

las cepas BALB/c y C57BL. De la cepa BALB/c se trabajó con 8 ratones inducidos y 5 ratones

testigos, mientras que de la cepa C57BL se trabajó con 5 ratones inducidos y 8 testigos.

Tabla 1. Proteínas totales de los ratones BALB/c y C57BL.

RATONES BALB/c RATONES C57BL

TESTIGOS INDUCIDOS TESTIGOS INDUCIDOS

Clave PT (g/dl). Clave PT (g/dl). Clave PT (g/dl). Clave PT (g/dl).

BT1 5.7 BI1 6.5 CT1 5.6 CI1 3.6

BT2 8.3 BI2 6.9 CT2 5.0 CI2 5.8

BT3 6.2 BI3 5.7 CT3 5.3 CI3 5.6

BT4 5.6 BI4 6.3 CT4 6.7 CI4 5.5

BT5 6.5 BI5 5.2 CT5 5.7 CI5 5.6

BI6 7.6 CT6 5.7

BI7 7.1 CT7 5.2

BI8 6.1 CT8 6.7

PT= Proteínas Totales, BT= Testigo de BALB/c, BI= Inducido de BALB/c, CT= Testigo de C57BL y CI= Inducido

de C57BL.

32

b) Corrimiento Electroforético

De la cepa BALB/c se trabajó con 8 ratones inducidos y 5 ratones testigos, mientras que de

la cepa C57BL se trabajó con 5 ratones inducidos y 8 testigos. Las lecturas densitométricas

muestran las fracciones correspondientes a albúmina, alfa globulinas 1 y 2, beta globulinas y

las gamma globulinas. En la figura 6, se muestra el proteinograma representativo del suero

humano utilizado como control. En la figura 7b, se muestra el proteinograma representativo

del suero de ratón BALB/c inducido, donde se observa un ligero incremento de la región de

gamma globulinas y un pico más estrecho en la región de beta globulinas, respecto al

proteinograma representativo del ratón BALB/c testigo en la figura 7a. En la figura 8b, se

muestra el proteinograma representativo del suero de ratón C57BL inducido, observándose

un ligero incremento en la región de gamma globulinas y un pico más estrecho en la región

alfa-2 y beta globulinas, respecto al C57BL testigo en la figura 8a. Las figuras 9, 10 y 11,

corresponden al análisis estadístico realizado por la prueba U de Mann Whitney, de los

porcentajes de las fracciones gamma, beta y alfa globulinas respectivamente, en suero de

ratón BALB/c y C57BL. En la figura 9a, se muestra la comparación de la fracción gamma

entre los ratones BALB/c testigos e inducidos, en donde se obtuvo una mediana de 9.7 y

10.9 % respectivamente, y una p=0.2144. En la figura 9b, se muestra la comparación de la

fracción gamma entre los ratones C57BL testigos e inducidos, en donde se obtuvo una

mediana de 8.7 y 9.9 % respectivamente, y una p=0.8192. En la figura 9c, se muestra la

comparación de la fracción gamma entre los ratones BALB/c y C57BL inducidos, en donde

se obtuvo una mediana de 10.9 y 9.9 % respectivamente, y una p=0.2353. En la figura 10a,

se muestra la comparación de la fracción beta entre los ratones BALB/c testigos e inducidos,

en donde se obtuvo una mediana de 25.9 y 24.3 % respectivamente, y una p=0.9385. En la

figura 10b, se muestra la comparación de la fracción beta entre los ratones C57BL testigos e

inducidos, en donde se obtuvo una mediana de 21.1 y 29.2 % respectivamente, y una

p=0.2206. En la figura 10c, se muestra la comparación de la fracción beta entre los ratones

BALB/c y C57BL inducidos, en donde se obtuvo una mediana de 24.3 y 29.2 %

respectivamente, y una p=0.5924. En la figura 11a, se muestra la comparación de la fracción

alfa-2 entre los ratones BALB/c testigos e inducidos, en donde se obtuvo una mediana de

8.3 y 7.3 % respectivamente, y una p=0.2079. En la figura 11b, se muestra la comparación

de la fracción alfa-2 entre los ratones C57BL testigos e inducidos, en donde se obtuvo una

mediana de 7.6 y 14.7 % respectivamente, y una p=0.0031. En la figura 11c, se muestra la

33

comparación de la fracción beta entre los ratones BALB/c y C57BL inducidos, en donde se

obtuvo una mediana de 7.3 y 8.3 % respectivamente, y una p=0.2079.

Figura 6. Análisis densitométrico del suero humano como

control. Resultado representativo del proteinograma de

suero humano con 5.7 g/dl de proteínas totales, en donde se

muestran las fracciones albumina, alfa, beta y gamma.

Figura 7. Análisis densitométrico del suero de ratón BALB/c. a) Resultado representativo del proteinograma de

suero de ratón BALB/c testigo con 6.5 g/dl de proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina,

alfa, beta y gamma. b) Resultado representativo del proteinograma de suero de ratón BALB/c inducido con 7.1 g/dl

de proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina, alfa, beta y gamma. En esta figura, se observa

un ligero incremento en la región de gama globulinas y un pico más estrecho en la región de beta globulinas,

respecto al ratón testigo.

34

Figura 8. Análisis densitométrico del suero de ratón C57BL. a) Resultado representativo del proteinograma de

suero de ratón C57BL testigo con 6.7 g/dl de proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina, alfa,

beta y gamma. b) Resultado representativo del proteinograma de suero de ratón C57BL inducido con 5.6 g/dl de

proteínas totales, en donde se muestran las fracciones albumina, alfa, beta y gamma. En esta figura, se observa un

ligero incremento en la región de gamma globulinas y un pico más estrecho en la región de beta y alfa-2 globulinas,

respecto al ratón testigo.

35

a) b)

Gamma globulinas en BALB/c Gamma globulinas en C57BL

c)

Gamma globulinas en Inducidos

Figura 9. Niveles de la fracción

Gamma globulinas. a) % de Gamma

globulinas en BALB/c testigos e

inducidos, p= 0.2144, b) % de Gamma

globulinas en C57BL testigos e

inducidos, p=0.8192, c) Comparación

del % de Gamma globulinas entre los

ratones BALB/c y C57BL inducidos, p=

0.2353. Análisis estadístico por U de

Mann Whitney que muestra las

medianas de los % obtenidos de la

fracción gamma.

36

a) b)

Beta globulinas en BALB/c Beta globulinas en C57BL

c)

Beta globulinas en Inducidos

Figura 10. Niveles de la fracción

Beta globulinas. a) % de Beta

globulinas en BALB/c testigos e

inducidos, p=0.9385, b) % de Beta

globulinas en C57BL testigos e

inducidos, p=0.2206, c) Comparación

del % de Beta globulinas entre

ratones BALB/c y C57BL inducidos, p=

0.5924. Análisis estadístico por U de

Mann Whitney que muestra las

medianas de los % obtenidos de la

fracción beta.

37

a) b)

Alfa-2 globulinas en BALB/c Alfa-2 globulinas en C57BL

c)

Alfa-2 globulinas en Inducidos

Figura 11. Niveles de la fracción Alfa-

2 globulinas. a) % de Alfa-2

globulinas en BALB/c testigos e

inducidos, p= 0.2079, b) % de Alfa-2

globulinas en C57BL testigos e

inducidos, p=0.003, c) Comparación

del % de Alfa-2 globulinas entre los

ratones BALB/c y C57BL inducidos,

p=0.2079. Análisis estadístico por U

de Mann Whitney que muestra las

medianas de los % obtenidos de la

fracción Alfa-2.

38

3. RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE CITOCINAS POR ELISA

La determinación de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β, se realizó en líquido peritoneal de 7 ratones

inducidos y 6 ratones testigos de la cepa BALB/c, y de 7 ratones inducidos y 9 testigos de la

cepa C57BL. Las concentraciones en pg/mL, fueron obtenidas mediante un solo ensayo por

duplicado por el método de ELISA. El análisis estadístico para comparar las concentraciones

obtenidas en los grupos testigos e inducidos de los ratones BALB/c y C57BL, se realizó por la

U de Mann Whitney. En la figura 12, se presentan los resultados de la concentración de IL-6 y

solo se muestran valores detectables en el grupo de los inducidos, en ambas cepas de ratón.

En la figura 12a, se comparan las concentraciones entre testigos e inducidos de BALB/c, en

donde se obtuvo una p=0.0010 y mediana de 7.1 pg/mL en el grupo inducido. En la figura 12b,

la cepa C57BL muestra una p=0.0286 y mediana de 12.9 pg/mL en los inducidos. En la figura

13, se muestran las concentraciones obtenidas de IL-10 en ambas cepas de ratón. En la figura

13a, se muestra la concentración de IL-10 en testigos e inducidos de BALB/c, y se obtuvo una

p=0.2542 y mediana de 24.3 pg/mL en el grupo testigo, mientras que en el grupo inducido no

hay niveles detectables. En la figura 13b, se muestra la concentración de IL-10 en testigos e

inducidos de C57BL, en donde se obtuvo una p=0.0653 y mediana de 2.0 y 48.7 pg/mL

respectivamente. En la figura 14, se muestra la comparación de la concentración de TGF-β

entre BALB/c y C57BL. En la figura 14a, se muestra la concentración de TGF-β en testigos e

inducidos de BALB/c, en donde se obtuvo una p=0.4452 y mediana de 982.6 y 842.4 pg/mL

respectivamente. En la figura 14b, se muestra la concentración de TGF-β en testigos e

inducidos de C57BL, y las medianas obtenidas fueron 701.3 y 676.3 pg/mL respectivamente y

se obtuvo una p=0.7104. En la figura 15, se representa la comparación de las citocinas

estudiadas entre BALB/c y C57BL, ambas cepas inducidas. En la figura 15a, se muestra la

concentración de IL-6 en BALB/c y C57BL, y se obtuvo una p=0.7012 y mediana de 7.1 y 12.9

pg/mL respectivamente. En la figura 15b, se muestra la concentración de IL-10 en BALB/c y

C57BL, y se obtuvo una p=0.0089 y mediana de 42.0 solo en C57BL. En la figura 15c, se

muestra la concentración TGF-β en BALB/c y C57BL, y se obtuvo una p=0.4954 y mediana de

638.8 y 676.3 pg/mL respectivamente. En la figura 16, se muestra la comparación de IL-6, IL-10

y TGF-β en ratones testigos e inducidos de BALB/c. La figura 16a, corresponde al grupo testigo

y presenta una p=0.0009. La figura 16b, corresponde al grupo inducido y presenta una

p=0.0006. En la figura 17, se muestra la comparación de IL-6, IL-10 y TGF-β en ratones

testigos e inducidos de C57BL. La figura 17a, corresponde al grupo testigo y presenta una

p<0.0001. La figura 17b, corresponde al grupo inducido y presenta una p=0.0009.

39

a) IL-6 en BALB/c b) IL-6 en C57BL

Figura 12. Niveles detectables y no detectables de IL-6 en líquido peritoneal de ratones BALB/c y C57BL. a) Análisis de

IL-6 en BALB/c testigos e inducidos, p= 0.0010, b) Análisis de IL-6 en C57BL testigos e inducidos, p= 0.0286. Se muestran

niveles detectables de IL-6 solo en ratones inducidos. Análisis estadístico por la U de Mann Whitney que muestra las

medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de la IL-6.

a) IL-10 en BALB/c b) IL-10 en C57BL

Figura 13. Niveles detectables y no detectables de IL-10 en líquido peritoneal de ratones BALB/c y C57BL. Análisis

de IL-10 en BALB/c testigos e inducidos, p= 0.2542, b) Análisis de IL-10 en C57BL testigos e inducidos, p= 0.0653. Se

muestran niveles detectables de IL-10 en ratones BALB/c testigos, un incremento de IL-10 en ratones inducidos

C57BL, y una disminución de IL-10 en ratones inducidos BALB/c. Análisis estadístico por la U de Mann Whitney que

muestra las medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de la IL-10.

40

a) TGF-β en BALB/c b) TGF-β en C57BL

Figura 14. Niveles detectables de TGF-β en líquido peritoneal de ratones BALB/c y C57BL. Análisis de TGF-β en

BALB/c testigos e inducidos, p= 0.4452, b) Análisis de TGF-β en C57BL testigos e inducidos, p= 0.7104. Los niveles de

TGF-β en los testigos de BALB/c fueron ligeramente mayores que en los otros grupos. Análisis estadístico por la U de

Mann Whitney que muestra las medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de TGF-β.

a) IL-6 en INDUCIDOS b) IL-10 en INDUCIDOS

b) TGF-β en INDUCIDOS

Figura 15. Comparación de los niveles de IL-6,

IL-10 y TGF-β entre BALB/c y C57BL inducidos.

a) Análisis de IL-6 en BALB/c y C57BL, p=0.7012,

b) Análisis de IL-10 en BALB/c y C57BL, p=0.0089,

c) Análisis de TGF-β en BALB/c y C57BL,

p=0.4954. No hay diferencias importantes en los

niveles de IL-6 y TGF-β, pero en el caso de IL-10,

se observa incremento en C57BL y disminución

en BALB/c. Análisis estadístico por la U de Mann

Whitney que muestra las medianas de las

concentraciones en pg/mL obtenidas de

citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β.

41

a) BALB/c TESTIGOS b) BALB/c INDUCIDOS

Figura 16. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre los testigos e inducidos de BALB/c. a)

Análisis de IL-6, IL-10 y TGF-β en testigos, p=0.0009, b) Análisis de IL-6, IL-10 y TGF-β en inducidos, p=0.0006. Se

observan niveles altos de TGF-β en testigos e inducidos, la IL-6 no es detectable en testigos pero se incrementa en

inducidos y la IL-10 se detectó en testigos pero fue indetectable en inducidos. Análisis estadístico por la U de Mann

Whitney que muestra las medianas de las concentraciones en pg/mL obtenidas de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β.

a) C57BL TESTIGOS b) C57BL INDUCIDOS

Figura 17. Comparación del perfil de los niveles de IL-6, IL-10, y TGF-β entre testigos e inducidos de C57BL. a) Análisis de

IL-6, IL-10 y TGF-β en testigos, p=<0.0001, b) Análisis de IL-6, IL-10 y TGF-β en inducidos, p=0.0009. Se observan niveles

altos de TGF-β en testigos e inducidos, y los niveles de IL-6 e IL-10 no fueron detectables en testigos, pero ambas

citocinas se incrementaron en inducidos. Análisis estadístico por la U de Mann Whitney que muestra las medianas de las

concentraciones en pg/mL obtenidas de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β.

42

IV. DISCUSIÓN

El análisis histológico de ratones BALB/c inducidos con aceite mineral, mostró la presencia de

infiltración celular tipo linfoide en todos los órganos que fueron estudiados. En la zona

perivascular en el corte de riñón. En el bazo, la infiltración tipo linfoide estuvo presente en la

pulpa blanca, ya que principalmente está conformada por linfocitos, no así la pulpa roja, que se

conforma por eritrocitos. Además, se sabe que la pulpa roja es más abundante que la pulpa

blanca, pero en el caso de los ratones inducidos se observó disminuida. En el intestino

delgado, la infiltración tipo linfoide provocó alteración en la estructura normal de las Placas de

Peyer, lamina propia, capa muscular y serosa. No sabemos si las células plasmáticas malignas

se encuentran participando en los agregados de células de tipo linfoide, ya que no se realizaron

tinciones especificas de inmunohistoquímica, sin embargo, la sola presencia de células

linfoides y macrófagos en los órganos antes mencionados, puso de manifiesto la existencia de

un proceso inflamatorio que se inició en la cavidad peritoneal, sitio donde se administró el

aceite, y que se fue extendiendo a otros órganos. Pero es necesario estudiar el resto de los

órganos para saber si el proceso inflamatorio se extiende en todo el organismo del ratón

inducido, además realizar estudios histológicos en el ratón C57BL para conocer si el proceso

inflamatorio crónico persiste solamente en el ratón BALB/c. El hallazgo de infiltración linfoide en

otros órganos además de la cavidad peritoneal, apoya el modelo de mieloma murino, el cual

intenta reproducir la enfermedad de mieloma humano en donde el daño se extiende a otros

órganos.

En la tabla 1, se mostró la determinación de proteínas totales que sirvió para realizar el análisis

densitométrico una vez realizada la electroforesis de proteínas en el suero de los ratones

BALB/c y C57BL. No se realizó comparación de las proteínas totales entre los cuatro grupos de

ratones, puesto que nuestro objetivo fue analizar las diferentes regiones del proteinograma

para monitorear los cambios, sobre todo, en las bandas de gamma, beta y alfa-2 globulinas.

Cabe mencionar que los resultados no fueron significativos, pero esto se debe a que algunos

individuos no se comportan de la misma forma. Por esta razón, se utilizaron medianas en lugar

de medias para tener una aproximación del valor más real. A pesar de que es necesario

incrementar el número de ratones utilizados para que nuestros resultados sean significativos,

las medianas presentan cambios que nos dan idea de la distribución de las proteínas en los

diferentes grupos de ratones estudiados. Nosotros esperábamos observar un gran pico

estrecho de tipo monoclonal en la región de las gamma globulinas, como en mieloma humano.

Esto no fue así del todo, ya que el análisis de BALB/c inducido no revela una banda

monoclonal de este tipo, sin embargo se observó un incremento, además el pico comenzó

hacerse más estrecho, indicio de que la banda es de tipo monoclonal. Por otro lado, en C57BL

43

también se encontró un ligero aumento en la región gamma, no obstante la banda se observó

más ancha, sugiriendo que fue de tipo policlonal. Otro dato que apoyaría esto, es que el

análisis estadístico en ratones inducidos, mostró que la fracción gamma es mayor en BALB/c

respecto a C57BL. Pero el análisis estadístico de fracciones beta y alfa aportaron otros

resultados. En BALB/c la imagen representativa del análisis densitométrico, no mostró un

incremento en la región beta. Aunque el pico se va haciendo más estrecho, el análisis

estadístico mostró una ligera disminución de esta fracción respecto a ratones testigo. En el

caso de C57BL inducido, el análisis representativo de la región beta, mostró un pico más

estrecho y también un incremento en el análisis estadístico. Cuando se comparó dicha región

en ambas cepas inducidas, la fracción beta fue mayor en C57BL. Con respecto al análisis

representativo de la fracción alfa-2, no se observaron cambios en el ratón BALB/c inducido,

pero el análisis estadístico mostró una disminución de la fracción alfa-2. En C57BL inducido, el

análisis representativo de esta fracción mostró un pico más estrecho y un incremento

significativo respecto al testigo en el análisis estadístico. Además, la fracción alfa-2 de C57BL

inducido, fue mayor respecto al ratón BALB/c inducido. Estos resultados, mostraron que las

bandas de beta y alfa-2 se observaron como picos estrechos y sólo se incrementaron en

C57BL. Kyle en 1981, reportó que la proteína M se puede situar en la región gamma, beta o

alfa-2 de las globulinas, formando un pico estrecho y alto, pero una banda ancha en la región

de las gammas, es producida por un exceso de inmunoglobulinas policlonales. El ratón C57BL

inducido muestra un pico estrecho en la región beta y alfa-2, pero una banda ancha en la

fracción gamma La posible explicación a este hecho, es que C57BL probablemente presentó

un incremento de la fracción gamma, beta y alfa, porque su sistema inmunológico también

estuvo combatiendo al agente extraño, incrementando la producción de anticuerpos

policlonales. El ratón BALB/c inducido, mostró un pico estrecho en la fracción gamma y un

porcentaje más alto de dicha fracción, respecto a C57BL. Estos resultados, solo sugieren que

podría existir banda monoclonal en BALB/c pero todavía no se puede concluir nada al respecto,

puesto que no se obtuvieron picos altos que evidencien la banda monoclonal característica del

MM. La posible explicación a esto, es que se utilizó un aceite mineral de marca comercial

utilizado para el cuidado de los bebes, y esto implica que tenga menor cantidad del

componente activo debido a la gran cantidad de sustancias que constituyen dicho aceite. Es

por ello, que se deberá inducir nuevamente el mieloma en ratones BALB/c con pristano, que es

el componente activo del aceite mineral. Con ello, se espera que la banda monoclonal pueda

ser identificada en ratones BALB/c y no así en ratones C57BL que son resistentes a desarrollar

mieloma.

44

La determinación de citocinas IL-6, IL-10 y TGF-β del líquido peritoneal de ratones BALB/c y

C57BL, se realizó por el método de ELISA. El análisis estadístico, mostró las medianas de las

concentraciones (pg/mL) para cada una de las citocinas analizadas en ambas cepas de ratón.

A pesar, de que en la mayoría de los casos se obtuvieron resultados no significativos debido al

comportamiento disperso de algunos individuos, las medianas representan cambios evidentes

entre los diferentes grupos. La concentración de IL-6 no fue detectada en los testigos de ambas

cepas, la explicación es que la cantidad de esta citocina está por debajo de la sensibilidad del

método empleado, ya que en el caso de los inducidos de ambas cepas de ratón, se observó un

incremento en la concentración de esta citocina. En el caso de IL-10, no se detecto su

concentración en ratones C57BL testigo, pero cuando fueron inducidos se observó que la

concentración de esta citocina se había incrementado. En la cepa BALB/c, la concentración de

IL-10 se detecto en los testigos, pero no fue detectada en ratones inducidos. El análisis de

TGF-β presentó una concentración >600 pg/mL respecto a IL-6 e IL-10, que presentaron

aproximadamente <15 pg/mL y < 50 pg/mL respectivamente. La concentración de esta citocina

fue alta en todos los grupos de ratones, y no se observaron diferencias importantes entre cada

grupo. Es necesario incrementar el número de ratones para que los resultados sean

significativos y realizar más ensayos por el método de ELISA, puesto que solo se realizó un

ensayo por duplicado. Sin embargo, la diferencia observada en las citocinas estudiadas, es

muy clara y nosotros podemos tener una idea de lo que podría estar ocurriendo en la cavidad

peritoneal de ratón BALB/c y C57BL. Por lo que la posible explicación, es que el incremento de

concentración de IL-6 cuando los ratones BALB/c y C57BL fueron inducidos, y la concentración

elevada de TGF-β, podría inducir diferenciación de los linfocitos T CD4 a linfocitos Th17 en

ambas cepas. Se sugiere precisamente la diferenciación de esta población celular, porque por

un lado se sabe que estas citocinas son necesarias para su diferenciación y por otro lado, que

las Th17 favorecen el desarrollo de respuestas inmunológicas exageradas que promueven el

desarrollo de enfermedades autoinmunes y procesos inflamatorios crónicos. También se sabe

que en el sistema inmunológico participan células encargadas de suprimir dichas respuestas,

logrando mantener un equilibrio en la respuesta inmunológica. Según lo reportado, las citocinas

que favorecen la diferenciación de linfocitos T CD4 a linfocitos Treg son la IL-10 y TGF-β. De

acuerdo con esto, solo la cepa inducida que presente estas citocinas, podrá contrarrestar el

efecto de las Th17, por lo que se sugiere que la en cepa C57BL podría estar induciendo la

diferenciación de las Treg, mientras que en la cepa BALB/c, además de no inducirse la

diferenciación, las Treg podrían estar siendo disminuidas, ya que la IL-10 está presente en

testigos, pero se observa su disminución cuando los ratones son inducidos. Por otro lado, la

posible persistencia de linfocitos Th17 no controlados, la presencia de IL-6 y la posible

presencia de la mutación del gen c-myc, pudieran ser los principales factores condicionantes de

45

la persistencia del proceso crónico inflamatorio que no puede ser controlado por células Treg y

además, ser responsables de la transformación y sobrevivencia de los linfocitos B a célula

malignas del mieloma.

Figura 18. Propuesta de las interacciones que ocurren en la cavidad peritoneal del ratón BALB/c y C57BL. a) En

el ratón BALB/c testigo, hay un número incrementado de linfocitos Treg puesto que la presencia de TGF-β e IL-

10 favorecen su diferenciación. b) En el ratón C57BL testigo, hay números similares de linfocitos Th17 y Treg

puesto que no se induce diferenciación. c) En el ratón BALB/c inducido, la presencia de TGF-β e IL-6 promueve la

diferenciación de linfocitos Th0 a Th17 y su incremento promueve la persistencia del proceso crónico

inflamatorio, en el cual se originan las células plasmáticas malignas que generan por sí mismas IL-6 para su

sobrevivencia. d) En el ratón C57BL inducido, el número de linfocitos Th17 y Treg es similar, puesto que se induce

diferenciación a Th17 por la presencia de IL-6 y TGF-β pero también a Treg por la presencia de IL-10 y TGF-β

a)

.

b)

c)

.

d)

46

V. CONCLUSION

Las alteraciones histológicas encontradas en la cavidad peritoneal y en los órganos analizados

del ratón BALB/c inducido con aceite mineral, así como la presencia de citocinas inflamatorias,

son indicadores de un proceso inflamatorio crónico evidente.

47

VII. EXPECTATIVAS PARA TRABAJOS FUTUROS

Deberá utilizarse un inductor más puro y prolongarse el tiempo de observación, para

lograr el desarrollo completo de mieloma en ratón BALB/c, y poner de manifiesto la

banda monoclonal característica de MM.

Realizar histología a otros órganos de ratones BALB/c y C57BL.

Realizar inmunohistoquímica para identificar el tipo de población celular presente en el

proceso inflamatorio.

Incrementar el número de ratones BALB/c y C57BL para el estudio.

Incrementar el número de ensayos para la determinación de citocinas por ELISA

Cuantificar las poblaciones de linfocitos Th17, Treg y células plasmáticas, en el líquido

de la cavidad peritoneal por citometría de flujo.

48

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