“Influencia de la composición lipídica de modelos de ...
149
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso Facultad de Ciencias Instituto de Química Tesis doctoral “Influencia de la composición lipídica de modelos de membrana en la incorporación de péptidos penetrantes de células” Viviana Elisabeth Silva Salse Profesor guía: Dr. Luis Felipe Aguilar Profesor co-guía: Dr. Carlos Patricio Sotomayor 2018
Transcript of “Influencia de la composición lipídica de modelos de ...
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso Facultad de Ciencias Instituto de Química
Tesis doctoral
“Influencia de la composición lipídica de
modelos de membrana en la incorporación de péptidos penetrantes de células”
Viviana Elisabeth Silva Salse
Profesor guía: Dr. Luis Felipe Aguilar Profesor co-guía: Dr. Carlos Patricio Sotomayor
2018
1
Tesis financiada por Proyecto FONDECYT 1140800
2
Agradecimientos
A los incondicionales, mis padres, a ellos les gradezco lo que soy……….los amo. A mis
hermanos, mis sobrinos que siguen siendo mis luces y mis amigas que son parte de mi
familia.
Al laboratorio de fotofísica y espectroscopía molecular, pasé grandes alegrías y
frustaciones, seguí conociendo amigos que me acompañaran por muchos años más.
Mis profesores, Carlos Patricio Sotomayor a quien admiro profundamente y me siento
honrada de haber aprendido directamente de él muchos de los conocimientos que tengo
ahora. Luis Felipe Aguilar, profesor y amigo, tuvo la paciencia de enseñarme desde las
bases de la biofísica, lo admiro profundamente. Eternamente agradecida de ambos.
Al profesor David Jameson a quien por años admiré sin poder conocerlo y finalmente
durante el proceso de desarrollo de mi tesis pude viajar para poder aprender con él, esa
es una de las experiencias más enriquecedoras que he vivido.
Agradezco a CONICYT por su apoyo financiero durante el desarrollo de mi doctorado a
través de la beca de doctorado nacional 21120644 y al proyecto FONDECYT 1140800.
Al amor de mi vida, mi compañero, mi esposo, mi amigo, mi todo, estuviste todo este
largo proceso a mi lado, siempre apoyándome, siempre con una palabra de ánimo, sin
ti esto no hubiese sido posible…te amo con todo mi corazón.
A mi princesa, el verte diariamente me dio la fuerza para concluir esta etapa, eres mi
fuerza y la razón por la que quiero ser cada día mejor, por ti, por nosotras…te amo con
locura.
A Dios……
Un beso al cielo, siempre conmigo, siempre juntas.
3
Contenido
Agradecimientos ................................................................................................. 2
Índice de figuras ................................................................................................ 5
Índice de tablas .................................................................................................. 7
Abreviaciones ..................................................................................................... 8
1. Resumen ................................................................................................ 10
2. Introducción ........................................................................................... 12
2.1 Péptidos penetrantes de células ............................................................. 12
2.2 Vesículas lipídicas como modelo de membrana ......................................... 18
2.3 Termodinámica de la interacción péptido-lípido ........................................ 21
2.4 Fundamentos metodológicos .................................................................. 26
2.4.1 Dicroismo circular ........................................................................... 26
2.4.2 Polarización generalizada de Laurdan ................................................ 28
2.4.4 Tiempos de vida ............................................................................. 35
2.2 Descripción del problema ...................................................................... 40
3. Hipótesis y Objetivos ............................................................................... 41
3.1 Hipótesis ............................................................................................. 41
3.2 Objetivos ............................................................................................ 41
3.2.1 Objetivo General ............................................................................ 41
3.2.2 Objetivos Específicos ...................................................................... 41
4. Metodología ............................................................................................ 42
4.1 Síntesis y caracterización de CPPs .......................................................... 42
4.1.1 Síntesis de Péptidos ........................................................................ 42
4.1.2 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ................................. 43
4.1.4 Dicroismo Circular .......................................................................... 43
4.2 Preparación de LUVs ............................................................................. 44
4.3 Polarización generalizada Laurdan .......................................................... 45
4.4 Anisotropía de DPH ............................................................................... 45
4.5 Tiempos de vida de DPH ........................................................................ 45
4.6 Tiempos de vida de Laurdan .................................................................. 46
4.7 Porcentaje de inserción ......................................................................... 46
5. Resultados y discusiones .......................................................................... 47
5.1. Síntesis y caracterización de CPPs ............................................................. 47
4
5.2. Dicroismo circular de péptidos en membranas ....................................... 49
5.3 Propiedades fisicoquímicas de la membrana con y sin péptido. ................... 62
5.3.1. Polarización generalizada de Laurdan ................................................... 62
5.3. 2. Anisotropía de DPH ........................................................................... 69
5.3.3. Tiempos de vida de Laurdan y DPH ............................................... 76
5.3.3.1. DPH ........................................................................................ 76
5.3.3.2. Laurdan .................................................................................. 82
5.3.4. Porcentaje de inserción .............................................................. 100
6. Conclusiones ......................................................................................... 125
7. Referencias ........................................................................................... 127
ANEXO 1 ....................................................................................................... 139
ANEXO 2 ....................................................................................................... 144
5
Índice de figuras
Figura 1: Resumen de los mecanismos de incorporación propuestos para los CPPs. .. 15 Figura 2: Esquema representativo de las vesículas unilamerales grandes ................. 19 Figura 3: Esquema representativo dicroísmo circular ............................................. 26 Figura 4: Modelo espectro dicroismo circular ........................................................ 27 Figura 5: Estructura molécula de Laurdan (6-Dodecanoil-N,N-dimetil-2-naftilamina) . 28 Figura 6: Diagrama explicativo relajación dipolar de Laurdan ................................. 29 Figura 7: Espectro de emisión de Laurdan ........................................................... 30 Figura 8: DPH .................................................................................................. 31 Figura 9: Conceptos de polarización .................................................................... 32 Figura 10: Representación de un momento dipolar de transición ............................ 33 Figura 11: Ilustración del corrimiento de fase y la medida de modulación relativa ..... 36 Figura 12: Ilustración esquemática de los conceptos básicos de fasores .................. 38 Figura 13: Dicroismo circular de los péptidos sintetizados en buffer. ....................... 48 Figura 14: Dicroismo circular péptido R6H4 .......................................................... 50 Figura 15: Dicroismo circular péptido TAT ............................................................ 51 Figura 16: Dicroismo circular péptido penetratina ................................................. 52 Figura 17: Dicroismo circular péptido ARF 1-22 .................................................... 53 Figura 18: Dicroismo circular péptido FGF ........................................................... 54 Figura 19: Dicroismo circular péptido pKCi ........................................................... 55 Figura 20: Dicroismo circular péptido R9 ............................................................. 56 Figura 21: Dicroismo circular péptido pVEC .......................................................... 57 Figura 22: Dicroismo circular péptido Bac7. ......................................................... 58 Figura 23: Dicroismo circular péptido melitina ...................................................... 59 Figura 24: Gráfica resumen resultados DC ........................................................... 61 Figura 25: Polarización generalizada de Laurdan (1) ............................................. 64 Figura 26: Polarización generalizada de Laurdan (2) ............................................. 65 Figura 27: Polarización generalizada de Laurdan (3) ............................................. 66 Figura 28: Polarización generalizada de Laurdan (4) ............................................. 67 Figura 29: Anisotropia de DPH (1) ...................................................................... 71 Figura 30: Anisotropia de DPH (2) ...................................................................... 74 Figura 31: Tiempo e vida de DPH (1) .................................................................. 78 Figura 32: Tiempo de vida de DPH (2) ................................................................. 81 Figura 33: Gráficas de fasores de tiempos de vida de Laurdan del péptido ARF 1-22 . 83 Figura 34: Gráficas de fasores péptido ARF (1-22) ................................................ 85 Figura 35: Gráficas de fasores péptido melitina. ................................................... 86 Figura 36: Gráficas de fasores péptido Bac7 ......................................................... 88 Figura 37: Gráficas de fasores péptido pVEC. ....................................................... 89 Figura 38: gráfica de fasores péptido pKCi ........................................................... 91 Figura 39: Gráficas de fasores péptido R6H4 ........................................................ 92 Figura 40: Gráficas de fasores péptido R9 ............................................................ 94 Figura 41: Gráficas de fasores péptido TAT ......................................................... 95 Figura 42: Gráficas de fasores péptido penetratina ............................................... 97 Figura 43: Gráficas de fasores péptido FGF .......................................................... 98
6
Figura 44: Gráficas del porcentaje de péptido R6H4 en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 101 Figura 45: Gráficas del porcentaje de péptido penetratina en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 102 Figura 46: Gráficas del porcentaje péptido ARF (1-22) en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 103 Figura 47: Gráficas del porcentaje de péptido FGF en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 104 Figura 48: Gráficas del porcentaje de péptido PKCi en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 105 Figura 49: Gráficas del porcentaje de péptido pVEC en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 106 Figura 50: Gráficas del porcentaje de péptido pVEC en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 107 Figura 51: Gráficas del porcentaje de péptido Bac7 en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 108 Figura 52: Gráficas del porcentaje de péptido TAT en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 109 Figura 53: Gráficas del porcentaje de péptido melitina en los diferentes modelos de membrana ..................................................................................................... 110 Figura 54: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido R6H4 ............................................................................................................ 112 Figura 55: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido R9 ................................................................................................................ 114 Figura 56: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido TAT ............................................................................................................... 115 Figura 57: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido penetratina. ................................................................................................... 117 Figura 58: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido Bac7 ............................................................................................................. 118 Figura 59: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido pVEC. ............................................................................................................ 119 Figura 60: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido ARF (1-22). ................................................................................................... 121 Figura 61: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido FGF ............................................................................................................... 122 Figura 62: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido Melitina. ........................................................................................................ 123 Figura 63: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido pKCi.............................................................................................................. 124
7
Índice de tablas
Tabla 1. Tabla resumen péptidos sintetizados ....................................................... 47 Tabla 2: Tabla resumen porcentaje helicoidal de los péptidos sintetizados en los diferentes medios ............................................................................................. 49
8
Abreviaciones
CHO: colesterol
CPPs: péptidos penetrantes de células
DC: dicroísmo circular
DCM: diclorometano
DIEA: N,N-diisopropiletilamina
DMF: dimetilformamida
DMPC: 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina
DMPG: 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosforilglicerol
DOPC: 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
DPH: difenilhexatrieno
DPPC: 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
DPPE: 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetalonamina
DPPS: 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoserina
FmoC: 9-fluorenilmetoxicarbonilo
FRET: transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
GAG: glicosoaminoglicanos
GPMVs: vesículas gigantes de membrana plásmatica
GUVs: vesículas unilamelares gigantes
HOBT: 1-hidroxibenzotriazol
IPA: isopropanol
Laurdan: 6-Dodecanoil-2-Dimetilaminonaftaleno
Ld: líquido desordenado
L0: líquido ordenado
LUVs: vesículas unilamelares grandes
PC: fosfatidilcolina
PE: fosfatidiletalonamina
9
PG: fosfatidilglicerol
PS: fosfatidilserina
SUVs: vesículas unilamelares pequeñas
TBTU: O-benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato
TFA: ácido trifluoroacético
TFE: trifluoroetanol
TIS: triisopropilsilano
Trp: triptófano
10
1. Resumen
Los péptidos penetrantes de células pueden ser utilizados en diversas aplicaciones
terapéuticas. Éstos son ampliamente empleados para promover el ingreso al interior de
la célula de moléculas conjugadas (ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos,
proteínas, fármacos, liposomas, etc.). Por lo tanto, son usados para mejorar la baja
biodisponibilidad de moléculas terapéuticas. Los fármacos conjugados con péptidos
penetrantes cuando se administran in vivo han mostrado resultados prometedores con
alta eficacia. Muchos compuestos conjugados con péptidos penetrantes están bajo
ensayos clínicos.
En la actualidad se conocen una serie de péptidos penetrantes de células de alta
eficiencia, de los cuales se han propuesto variados mecanismos de incorporación a la
célula. Algunos de estos mecanismos son la formación de micela inversa, la formación
de poro (listón de barril y toroidal) y el modelo “como alfombra”. Estos mecanismos aún
no han sido elucidados en su totalidad. Una de las variables poco estudiadas y no
descritas sobre el mecanismo de incorporación de estos péptidos es la dependencia con
la composición lipídica y/o con las propiedades fisicoquímicas de la membrana.
El principal problema del uso de los péptidos penetrantes de células conjugados a
fármacos es la poca selectividad a la célula blanco, debido a esto es necesario estudiar
si estos péptidos ingresan de forma diferencial a células que presentan ciertas
modificaciones lipídicas como, por ejemplo, un cambio en la concentración de colesterol
presente en las células.
Para esto se estudió el efecto de colesterol en la incorporación de los péptidos
penetrantes de células y en las propiedades fisicoquímicas de la membrana. Las
propiedades fisicoquímicas de los modelos de membrana se estudiaron a través de los
ensayos de anisotropía de DPH, polarización generalizada de Laurdan y sus respectivas
medidas de tiempo de vida.
Los péptidos penetrantes de células utilizados son R6H4, TAT, Penetratina, ARF 1-22,
FGF, pKCi, R9, pVEC, Bac7 y melitina; cuyos mecanismos de incorporación directa a la
membrana están tratados en la literatura.
Los resultados nos sugieren que los péptidos catiónicos R6H4, R9 y TAT ingresan
rápidamente en los modelos de membrana estudiados, por lo que prácticamente no se
observan cambios en los diferentes parámetros estudiados con las metodología
11
utilizadas (excepto en membranas con alto contenido de colesterol). El péptido catiónico
penetratina presenta una dualidad en los resultados donde la concentración de este es
crítica para la penetración en las vesículas. Los péptidos anfipáticos Bac7, pVEC y ARF1-
22 muestran un alto ingreso en vesículas sin colesterol, pero en vesículas con altas
concentraciones de este, el ingreso de los péptidos disminuye. Finalmente el péptido
hidrofóbico FGF evidencia un reducido ingreso. Por lo tanto, la incorporación de estos
péptidos a los modelos de membrana estudiados no sólo depende de la concentración
de colesterol, sino que también de la concentración del péptido presente.
12
2. Introducción
2.1 Péptidos penetrantes de células
Es indudable el gran interés científico que presenta el transporte de moléculas a través
de la membrana plasmática. Moléculas que puedan atravesar fácilmente la membrana
celular son útiles para la investigación en biología y medicina, además de ser
convenientes para su utilización en el campo de la farmacología. En investigación son
utilizadas las moléculas permeables como bio-sensores de pH o para la determinación
de la concentración de iones, marcadores fluorescentes, sustratos enzimáticos
marcados, inhibidores de proteínas, etc. Por otro lado, en farmacología es importante
el transporte de drogas a través de la membrana celular. Dado el alto nivel de interés
en la incorporación de moléculas al citoplasma, es muy importante el desarrollo de
estrategias de entrega citosólica para diferentes moléculas. En este sentido, liposomas
(Priyanka et al, 2011), nanopartículas (Wang, 2012) y otros tipos de nanocarriers
farmacéuticos han sido utilizados para incrementar la estabilidad de drogas y modular
su farmacocinética y biodistribución, pero la captación de estas moléculas grandes
sigue siendo un reto por su estructura tridimensional, ocupación espacial y naturaleza
hidrofóbica/hidrofílica.
El descubrimiento de pequeños péptidos con carga neta positiva por la presencia de
aminoácidos como arginina y lisina que tienen la capacidad de atravesar la membrana
plasmática a bajas concentraciones sin perturbarla, han dado solución al problema,
pudiendo transportar moléculas terapéuticas que son incluso 200 veces más grandes
que el tamaño actual de restricción de biodisponibilidad. Estos péptidos catiónicos son
conocidos como “cell-penetrating peptide” (CPPs) y el primer hallazgo de estos se
remonta a la proteína TAT, un factor de transactivación desde el virus de
inmunodeficiencia humano 1 (VIH-1), siendo el primer polipéptido que entró a las células
cuando fue agregado de manera exógena a un medio de cultivo (Frankel et al, 1988;
Green et al, 1988), años más tarde fue descubierto el péptido anfipático penetratina
(pAnt) de 16 aminoácidos derivado del homeodominio de Drosophila Antennapedia
(Derossi et al, 1994).
En una primera instancia, estos CPPs se clasificaron según sean no anfipáticos (naCPPs)
o anfipáticos, estos últimos a su vez tienen subclasificación secundarios (saCPPs) o
primarios (paCPPs) (Madani et al, 2011).
13
Los paCPPs como Transportan (Pooga et al, 1998; Dunkin et al, 2011) y TP10 (Soomets
et al, 2000) contienen típicamente más de 20 aminoácidos. Ellos tienen secuencialmente
residuos hidrofóbicos e hidrofílicos a lo largo de su estructura primaria (Ziegler, 2008).
Además de la vía de la endocitosis, el mecanismo propuesto para este grupo de CPPs es
la transducción directa a la membrana. Los estudios de modelo sugieren que la
transducción directa ocurre vía formación de poro, perturbaciones “like-carpet” o
formación de micela reversa en la membrana.
Los saCPPs como penetratina, pVEC (Elmquist et al, 2001; Akdag et al, 2013) y M918
(El-Andaloussi et al, 2007) frecuentemente contienen un número pequeño de
aminoácidos comparados con los paCPPs. Sus propiedades anfipáticas se muestran
cuando ellas forman estructura alfa hélice u hojas beta al interactuar con los fosfolípidos
de membrana.
Los péptidos naCPPs son cortos con un alto contenido de aminoácidos catiónicos
(arginina) como R9 (Futaki et al, 2001) y TAT (Mishraa et al, 2011). Ellos se unen a los
lípidos aniónicos de la membrana lipídica.
En los últimos años debido a la gran cantidad de péptidos penetrantes encontrados (más
de 100 reportados y patentados), se dividieron en 3 subgrupos definidos por sus
propiedades fisicoquímicas: catiónicos, anfipáticos e hidrofóbicos (Wang et al, 2014)
Los péptidos catiónicos tienen una alta carga neta positiva y pocos residuos
aminoacídicos, estudios sugieren que se necesitan al menos 8 cargas positivas para una
entrada eficiente de estos péptidos (El-Sayed et al, 2009). Los péptidos catiónicos
pueden inducir un amplio rango de efectos secundarios, incluyendo efectos sobre la
integridad de la membrana y viabilidad celular. Entre ellos se encuentran R9, TAT, R6H4
y penetratina.
Los péptidos anfipáticos contienen regiones polares y apolares. Según esta definición,
penetratina también se encontraría en este subgrupo. Algunos anfipáticos serían pVEC
(derivada de proteína murina cadherina vascular endotelial), ARF (1-22) (derivada de la
proteína supresora de tumores p14ARF) y Bac7 (bactenecina 7).
Los péptidos que contienen sólo residuos apolares son considerados hidrofóbicos, entre
ellos se encuentra FGF.
14
El mecanismo de incorporación de estos péptidos a la célula aún no está del todo claro,
aun así, se puede pensar en un mecanismo directo vía independiente de energía, por un
lado, donde la interacción de cargas entre los péptidos y los componentes de la
membrana es fundamental (Figura 1.A), dentro de estos se encontraría la micela
reversa, la formación de poro (listón de barril y toroidal) y el modelo “como alfombra”.
Por otro lado, la endocitosis es otro mecanismo propuesto para el transporte de estos
péptidos a través de la membrana (Trabulo et al, 2010). Aun así, la translocación directa
sigue siendo la ruta más importante y esto se evidencia en el trabajo de Alves I.D.
(2011) donde el péptido estudiado fue penetratina y los resultados muestran que la
acumulación y la alta afinidad de unión del péptido a la superficie celular no refleja la
eficacia de internalización de estos y, a su vez, el péptido penetratina utiliza la vía de
translocación a bajas concentraciones (micromolar) y la vía de endocitosis se activa a
altas concentraciones puesto que requiere la acumulación del péptido sobre
glicosoaminoglicanos (GAG).
El modelo de micela reversa descrito inicialmente por Derossi et al. (1994) intentó
explicar los resultados obtenidos con el péptido pAnt, donde la interacción de los péptidos
que penetran la célula con las membranas biológicas llevan a una perturbación de la
bicapa lipídica (Figura 1. C1), resultando en la formación de estructuras hexagonales
reversas (micela reversa). El péptido es atrapado en el medio hidrofílico presente en el
núcleo de la micela (Figura 1. C2) hasta su interacción con los componentes de la
membrana que llevan a la formación de un proceso inverso, resultando en la
desestabilización de la micela reversa y consecuente liberación del péptido al medio
intracelular (Figura 1. C3).
De acuerdo a los modelos involucrados en la formación del “listón de barril” y poro
toroidal, la translocación de péptidos y sus conjugados a través de la membrana biológica
resultarían en la formación de un poro transitorio, producido tras la inserción del péptido
en la membrana y la oligomerización de los péptidos en una estructura con forma de
anillo. En el caso de los poros “listón de barril” los péptidos pueden asumir una estructura
anfipática hélice alfa cuando se insertan en la membrana, donde la cara hidrofóbica de
las hélices anfipáticas pueden interactuar con las cadenas alifáticas de los fosfolípidos
de la bicapa y la cara hidrofílica puede formar el interior del poro (Figura 1.D) (Pouny et
al., 1992; Shai, 1999; Matsuzaki et al., 1999 y Lundberg et al., 2003). El modelo
involucrado en la formación del poro toroidal es similar, excepto que en este modelo el
15
péptido insertado en la membrana interactúa exclusivamente con los grupos polares de
los fosfolípidos de membrana, induciendo un significante reordenamiento de la bicapa
lipídica (Figura 1.E) (Lundberg et al., 2003 y Yang et al., 2001).
De acuerdo al modelo “como alfombra”, la translocación en la membrana de los péptidos
permeantes y sus conjugados pueden ocurrir como consecuencia de una
desestabilización temporal de la membrana celular (Figura 1. B1), inducida por una larga
asociación de los péptidos a esta superficie (Figura 1. B2) y una consecuente
reorganización fosfolipídica (Pouny et al., 1992; Shai, 1999; Matsuzaki et al., 1999 y
Lundberg et al., 2003).
A: Interacción de cargas positivas de los péptidos con las cargas negativas de los componentes de la membrana. B: Modelo “como alfombra”. C: Modelo de micela reversa. D: Modelo listón de barril. E: Modelo toroidal.
Figura 1: Resumen de los mecanismos de incorporación propuestos para los CPPs.
16
El mecanismo de ingreso de CPPs en células está en debate (Vives et al, 2008). A pesar
de las similitudes entre los CPPs, el mecanismo de entrada puede variar
considerablemente. La presencia de diferentes factores que afectan la entrada celular y
el mecanismo de translocación celular están sujeta a observaciones contradictorias
debido a condiciones experimentales que difieren en aspectos importantes como lo son
la concentración de CPPs, tipo celular, temperatura y tiempo de incubación (Deshayes
et al, 2004a; Jones et al, 2012; Madani et al, 2011; Mueller J. et al, 2008 y Nakase et
al, 2009). Dentro de todos los factores, el principal es la concentración de CPPs que
pueden gatillar diferentes rutas de ingreso (Deshayes et al, 2004a). Se cree que la
endocitosis es el mecanismo más común de entrada a las células cuando se tiene baja
concentración de péptido penetrante, sin embargo, en los péptidos penetrantes
hidrofóbicos se cree que a altas concentraciones es más probable la penetración directa.
El método de ingreso de muchos CPPs catiónicos depende de la concentración de éstos
(Nakase et al, 2009 y Padari et al, 2010). Los péptidos marcados con diferentes
fluoróforos pueden también influenciar el mecanismo de entrada y la distribución celular
(Lundberg et al, 2007). Los mecanismos de ingreso de CPPs han sido objeto de
numerosos estudios y es inevitable que trabajos en el futuro puedan esclarecer las
variables que afectan los modos de internalización (Wang et al, 2014)
Los CPPs han demostrado mediar el transporte de un gran número de proteínas como
β-galactosidasa (Schwarze et al, 1999), eGFP (Caron et al, 2001), BcL-xL (Cao et al,
2002), catalasa humana (Jin et al, 2001), glutamato deshidrogenada humana (Yoon et
al, 2002), Cu,Zn-superóxido dismutasa (Eum et al,2005) y HSP70 (Wheeler et al, 2003),
entre otras. También se han utilizado para funcionalizar liposomas (Torchilin et al, 2001)
y nanomateriales (Goda et al, 2010; Pan et al, 2012), incrementando la entrada de las
moléculas cargo encapsuladas.
La captación de CPP en las células vivas es generalmente observada a bajas
concentraciones del orden micromolar o incluso nanomolar. Cuando las
concentraciones de los CPP incrementan, la distribución subcelular y la toxicidad
pueden cambiar. Esto sugiere que la concentración de los CPP es de principal
importancia en las consideraciones subsecuentes sobre la potencial ruta de ingreso y
para su toxicidad. Algunos paCPPs son líticos/tóxicos ya en el intervalo del orden
micromolar (Jones et al., 2005; Deshayes et al., 2006b), mientras que los saCPPs y los
naCPPs son menos tóxicos (Gros et al., 2006, Jones et al., 2005, Lindgren et al., 2004)
y llevan a una inestabilidad únicamente a altas concentraciones (Kramer et al., 2003)
17
o en presencia de un potencial transmembrana aplicado (Henriques et al., 2004;
Ziegler, 2008).
El uso de CPPs como transportadores de drogas ha sido ampliamente explorado en varios
tratamientos de enfermedades, incluidas las neuronales, asma, isquemia, diabetes y
cáncer (Ezzat et al, 2010; Dietz et al, 2004; Snyder et al, 2005 y Gros et al, 2006). Hay
más de 300 publicaciones de estudios relacionados con el uso de CPPs como
transportadores de drogas (Heitz F. et al, 2009). La principal aplicación es en
investigaciones sobre cáncer.
Se ha demostrado que los CPPs facilitan la administración intracelular de fármacos contra
el cáncer. Sin embargo, debido a la poca selectividad celular de los CPPs, es esencial el
desarrollo de suministros de fármacos que incluyan características de reconocimiento
del tumor junto a los CPPs para permitir el tráfico intracelular y la administración de
agentes terapéuticos específicos al sitio como, por ejemplo, el uso de péptidos de
localización de tumores (Dissanayake S. et al, 2017).
En el trabajo de Dubikovskaya et al (2008) conjugaron el péptido penetrante R8 a taxol
(droga anticancerígena), los estudios realizados en células resultaron favorables
teniendo mucho más efecto la droga conjugada que la droga libre, pero el investigador
observó in vivo una alta concentración de la droga cercana al sitio de inyección debido
a la adherencia de CPPs-droga al tejido adyacente, por lo que concluyó que no sería
favorable la administración sistémica de éste, sino su uso directamente sobre el tumor.
En otro estudio in vivo, Schwarze et al (1999) ya había reportado que la proteína de
fusión β-galactosidasa unida a TAT se encontraba en varios órganos del cuerpo, incluido
el cerebro. Por lo tanto, el principal problema del uso de CPPs es la especificidad, lo que
demanda especial consideración al momento de la elección del péptido para el transporte
de drogas ya que no presentarían selectividad en tejidos (Shin et al, 2014).
18
2.2 Vesículas lipídicas como modelo de membrana
Los modelos de membrana son sistemas simplificados en los cuales la mayoría de los
parámetros físico-químicos pueden ser controlados.
Las membranas biológicas están compuestas de lípidos (glicerofosfolípidos,
esfingolípidos, glicolípidos, colesterol) asociados con proteínas funcionales que actúan
como receptores, canales iónicos, bombas, etc. (Yeagle, 2011). Debido a la complejidad
de la composición de la membrana y su arquitectura, los modelos de membrana fueron
introducidos en los años 60 (Stoeckenius et al, 1969).
Los liposomas son vesículas esféricas delimitadas por una bicapa de fosfolípidos que se
separan en 2 compartimentos acuosos. Esta configuración ofrece la posibilidad de cargar
compuestos hidrofílicos en el compartimento interno acuoso mientras que los
compuestos hidrofóbicos podrían ser insertados en la bicapa lipídica. Las vesículas
pueden estar delimitadas por una bicapa (vesícula unilamelar) o por múltiples bicapas
(vesículas multilamelares). Estas vesículas pueden ser pequeñas (20-50 nm), grandes
(50-100 nm) o gigantes (10-100 µm) y son llamadas SUVs, LUVs y GUVs
respectivamente cuando son vesículas unilamelares (Roiter et al, 2009). Estos modelos
son considerados como los modelos de membrana más simples para investigar efectos
tóxicos xenobióticos (sustancias que son ajenas al sistema biológico) en las membranas
biológicas (Rascol et al, 2016).
Los estudios mecanísticos más comunes realizados para péptidos catiónicos
antimicrobianos implican estudios utilizando membranas lipídicas aisladas reconstituidas
a partir de lípidos puros o mezclas de lípidos (Matsuzaki et al, 1995). Tales experimentos
suelen basarse en que los péptidos catiónicos interactúan con las membranas y a
menudo se usan como pruebas irrefutables de que tales péptidos destruyen células
actuando sobre la membrana citoplasmática bacteriana. Sin embargo, esto es un uso
incorrecto de tales estudios, ya que los modelos de membrana usualmente fallan en
simular las características biológicas tales como la heterogeneidad de lípidos, la
presencia de proteínas de membrana, las características relevantes (oligosacáridos,
osmolaridad, pH), potencial de membrana y gradientes de pH. Además, es muy difícil
establecer que las concentraciones utilizadas en los estudios de modelos de membrana
son biológicamente relevantes. Sin embargo, estos estudios con modelos de membrana
son útiles para ayudar a dilucidar los mecanismos de interacción péptido-membrana
(Hancock et al, 2002).
19
En el presente trabajo se utilizarán como modelo de membranas, vesículas unilamelares
grandes (LUVs) compuestas de: DMPC debido a que la fosfatidilcolina es el lípido más
abundante en células y la cola al ser saturada evitará su rápida oxidación, el lípido DMPG
el cual otorgará carga negativa a la vesícula lo que es esencial para la interacción de los
péptidos penetrantes y finalmente se utilizará colesterol que será nuestra variable a
estudiar. Las concentraciones de colesterol que se utilizaron en este proyecto
corresponden a las concentraciones en las cuales se observaron máximos o mínimos en
diferentes parámetros fisicoquímicos de membrana o máximos en la actividad de
proteínas asociadas a membranas celulares (Sotomayor C. et al., 2000 y Aguilar L. et
al., 2012). Estas concentraciones críticas pueden ser calculadas teóricamente con la
teoría de la superred (Chong P. et al., 2009). En este trabajo se utilizaron tres
concentraciones de colesterol predichas por la teoría de la superred como
concentraciones críticas (Figura 2).
Figura 2: Esquema representativo de las vesículas unilamerales grandes
La figura de color rojo representa la molécula de colesterol. A: LUV´s DMPC/DMPG, B: LUV´s DMPC:DMPG:CHO 15%, C: LUV´s DMPC:DMPG:CHO 20% y D: LUV´s DMPC:DMPG:CHO 33,3%.
20
El colesterol es uno de los más importantes reguladores de la organización lipídica. Los
mamíferos tienen un mecanismo sofisticado y complejo para mantener los niveles de
colesterol celular de membrana en un rango limitado (Goldstein et al, 2001).
Muchas membranas biológicas tienen una falta de homogeneidad lateral (microdominio)
que pueden ser usados para ayudar a atraer moléculas señal (tanto lípidos como
proteínas de membrana) o para mantenerla bajo ciertas condiciones (Simons et al.,
2004; Mukherjee et al., 2004; Holowka et al., 2005).
Las membranas altamente ordenadas pueden generalmente proveer una mejor barrera
de permeabilidad que las membranas más desordenadas debido a que las moléculas
polares pueden más fácilmente intercalarse en los lípidos desordenados. Sin embargo,
los lípidos altamente ordenados (fase gel) evitan una rápida difusión de proteínas de
membrana lo que es dificultoso para la unión de vesículas y túbulos. En efecto, los lípidos
en fase gel no se observan en membranas de células de mamífero, los cuales exhiben
más propiedades de la fase líquido dinámica. En membranas biológicas, hay algunas
mezclas de fase líquido desordenado (Ld) y líquido ordenado (Lo) con la abundancia Ld
o Lo dependiendo de la composición lipídica (Maxfield et al., 2005).
21
2.3 Termodinámica de la interacción péptido-lípido
La termodinámica de la interacción péptido-membrana es un campo bastante amplio.
Este depende de la naturaleza química de los lípidos, péptidos y carbohidratos
involucrados, como también de la naturaleza mecanística de los procesos involucrados.
Se aplican diferentes reglas para las inserciones transmembrana de los péptidos que
para la incorporación de ellos. Las fuerzas electroestáticas (repulsión y atracción
coulombicas e interacción dipolar), formación de puentes de hidrógeno e interacciones
hidrofóbicas juegan roles igualmente importantes. Dependiendo de la composición de la
membrana, grupos de lípidos específicos pueden agregarse teniendo propiedades físicas
claramente distintas de los otros dominios de membrana (Seelig, 2004).
La interacción del péptido con la membrana lipídica puede ser dividida en 3 pasos
termodinámicos. En un primer paso, la unión es iniciada por atracción electroestática de
péptidos catiónicos a la membrana aniónica. Dependiendo de la carga del péptido y el
tamaño del potencial de superficie de la membrana, la atracción electroestática
(repulsión) aumentará (disminuirá) significativamente la concentración del péptido cerca
de la superficie de la membrana en comparación con la concentración libre en solución.
Por supuesto, la atracción electroestática no es un pre-requisito para la unión. Esta
también puede ocurrir con péptidos no cargados y membranas neutras. Bajo estas
condiciones la concentración de péptido cercano a la superficie de membrana será
idéntica a la de la solución (Seelig, 2004).
El próximo paso es la transición del péptido en el plano de unión. La ubicación exacta de
esta capa es difícil de definir y depende del equilibrio hidrofóbico/hidrofílico de los grupos
moleculares y las fuerzas implicadas. La unión significa que los péptidos están en
contacto directo con la membrana compuesta de lípidos, todos accesibles para la unión.
La unión en una reacción química convencional denota la formación de un complejo
específico entre 2 o más especies que interactúan con una estequiometria bien definida.
En los equilibrios de membrana, el término unión se usa más libremente y se refiere a
fenómenos físicos tales como partición y adsorción. La formación de complejos entre
péptidos y lípidos no se encuentran con frecuencia (Seelig, 2004).
El tercer paso en el proceso de unión es un cambio de conformación del péptido unido.
En muchas instancias los péptidos tienen conformación “random coil” en solución, pero
adoptan una conformación de hélice alfa cuando se asocian a lípidos de membrana
(Seelig, 2004).
22
En estudios posteriores (Ziegler, 2008), nuevamente se refieren a la necesaria presencia
de lípidos cargados para la unión de los péptidos. Estos indican que la fracción de lípidos
aniónicos es decisivo para la afinidad a la membrana de la mayoría de los CPPs. La
fracción de lípidos aniónicos es pequeña en células eucariontes (cercana al 10%)
comparada con las células bacterianas (sobre 50%). Los lípidos no se distribuyen
simétricamente a través de las 2 bicapas en células sanas. Los lípidos aniónicos son
localizados mayormente en el lado citosólico de la membrana plasmática. Su aparición
en el lado externo se considera como un marcador de muerte celular o apoptosis
(Koopman et al, 1994 y Martin et al, 1995).
Siguiendo la primera clasificación propuesta de los CPPs, se pueden analizar la unión y
penetración de los 3 subgrupos. Los PaCPPs se unen con una fuerte afinidad tanto a
membranas neutras como aniónicas (Deshayes et al, 2004a; Deshayes et al, 2004b;
Maget-Dana, 1999; Magzoub et al, 2001; Van Mau et al, 1999 y Vie et al, 2000) lo que
sugiere que su interacción a la membrana está dominada por interacciones hidrofóbicas.
La presencia de lípidos aniónicos en la membrana no afectaría la afinidad a ésta. Tras la
unión a la membrana, reducen la tensión superficial (Deshayes et al, 2004a), que es
también indicativo de su inserción en la membrana. Algunos de ellos experimentan
cambios en la estructura secundaria al unirse a la membrana (Deshayes et al, 2004a),
lo cual no se observa para todos los PaCPPs (Magzoub et al, 2004). Por lo general,
penetran más profundamente en el núcleo hidrofóbico que otros CPPs (Deshayes S. et
al, 2004a), pero no abarcan la bicapa en un poro de la misma manera. En cambio,
muestran una tendencia a autoasociarse en la región de los grupos cabezas de los
fosfolípidos (Van Mau et al, 1999 y Plenat et al, 2004), lo cual podría ser relevante para
una posible translocación directa. La presencia de un potencial transmembrana
promueve su inserción en la membrana produciendo la formación de poro (Deshayes et
al, 2006a).
Los SaCPPs tienen una baja afinidad por membranas neutras (Magzoub et al, 2004 y
Ghibaudi et al, 2005). Su afinidad por membrana aumenta en varios órdenes de
magnitud cuando aumenta el contenido de lípido aniónicos. Este considerable aumento
en la afinidad no es causado únicamente por las interacciones electroestáticas, sino
también por cambios en su estructura secundaria. Cuando se unen a la membrana
adoptan una estructura helicoidal o de hojas beta que separa los residuos cargados y no
cargados en una estructura anfipática (Futaki et al, 2001; Lamaziere et al, 2007; Dathe
et al, 1996; Blazyk et al, 2001 y Oehlke et al, 1997). La formación de hélice contribuye
23
a una ganancia adicional de energía libre para su unión a la membrana (Wieprecht et al,
2002).
Los NaCPPs no se unen a membranas lipídicas (Magzoub et al, 2004) a menos que
contengan una alta fracción de lípidos aniónicos monovalentes. En analogía a SaCPPs,
una translocación directa no se observa a bajas concentraciones (orden del micromolar)
(Kramer et al, 2003; Rosenbluh et al, 2005; Ziegler et al, 2003; Lamaziere et al, 2007;
Thoren et al, 2005 y Tiriveedhi et al, 2007).
El mecanismo de captación celular de los CPPs no se ha elucidado por completo. Existe
consenso en que el primer contacto entre los péptidos y la superficie celular se produce
a través de interacciones electroestáticas. No obstante, se ha postulado que la
internalización de los CPPs podría limitarse a ciertos tipos de células y puede depender
de los constituyentes específicos de las células o de la composición lipídica (Guidotti et
al, 2017).
En la investigación de Ciobanasu et al (2010) se trabajó con modelos de membrana cuya
composición lipídica era DPPC/CHO, DOPC/CHO, DOPC/DPPS/CHO y DOPC/DPPE/CHO.
Los lípidos PC y PS tienen una forma cilíndrica con curvatura intrínseca cero, pero PE
tiene forma de cono lo que produce una curvatura negativa en membranas (Schmidt et
al, 1995). Ellos reportan que el péptido TAT no sólo es capaz de penetrar directamente
en tales membranas de una manera pasiva, sino que también forma poros físicos. El
péptido TAT primero se acumula en la membrana debido a interacciones electroestáticas
y luego, a una cierta concentración, se forman los poros que permiten el paso de
péptidos y moléculas pequeñas. El tiempo de vida de los poros es extremadamente corto
porque no eran observables por el seguimiento de una sola molécula. Estos resultados
para el péptido TAT son corroborados por experimentos y simulaciones computarizadas
llevadas a cabo por Herce at al (2007) y Herce et al (2009) para R9 y TAT. Estos
investigadores mostraron un flujo de iones a través de la membrana y por lo tanto la
presencia de poros cuando se encuentran los péptidos presentes. Otro resultado
reportado es que el péptido TAT se acumula en membranas altamente aniónicas y se
internalizan muy rápidamente. En algunos casos el péptido TAT provocó la
desestabilización de la membrana que condujo a una ruptura de la vesícula, un efecto
que podría ser asociado más bien a un mecanismo de lisis parecido al que ocurre en el
modelo “como alfombra”, además se observó una rápida translocación a través de
membranas que contienen lípidos que inducen una curvatura negativa, indicando que la
24
translocación de TAT es claramente dependiente de la carga y composición de la
membrana.
Las simulaciones computacionales realizadas por Hua et al (2016) indican que el péptido
TAT se une fuertemente a los lípidos aniónicos, lo cual se evidencia con una energía libre
negativa. Esta unión favorable de péptidos a sistemas lipídicos aniónicos se debe
principalmente a las fuertes interacciones electroestáticas entre el péptido catiónico TAT
y la alta densidad de cargas negativas en la interface agua-cabezas lipídicas. Se observa
además que la concentración molar de colesterol no afecta la energía libre mínima en la
interface tanto en las bicapas lipídicas neutras como en las aniónicas, lo que implica que
el enriquecimiento de colesterol en la membrana no afecta la asociación de los CPPs.
Esto se puede entender por el hecho de que las moléculas de colesterol están localizadas
principalmente dentro de la membrana cerca del núcleo hidrofóbico y casi no tienen
efecto sobre la densidad de carga superficial, también se puede explicar porque el
colesterol es neutro y porque los componentes electroestáticos de la interacción péptido-
membrana dominan sobre otras fuerzas de interacción como las de repulsión y fuerzas
débiles como las de puente de hidrógeno. A pesar de que las propiedades de la interface
no se ven afectadas por la cantidad de colesterol en los sistemas, la energía libre total
de translocación aumenta a medida que se incorpora una mayor concentración de
colesterol en las membranas. La adición de colesterol aumenta el orden de las colas
lipídicas induciendo mayor rigidez en las membranas del modelo en estudio, al igual que
la inducción observada experimentalmente de la fase líquido ordenado de las
membranas que aumenta la rigidez elástica. Esta rigidez aumentada trabaja contra la
translocación del péptido, reduciendo la deformabilidad de la membrana/bicapa para
formar poros en el centro de la bicapa. En este mismo artículo se cambió
sistemáticamente el porcentaje molar de lípidos aniónicos en presencia y ausencia de
colesterol; la adición de lípidos aniónicos a la bicapa neutra conduce a la aparición y
mejora de un estado estable en la interface. Esto se entiende por las fuertes
interacciones electroestáticas entre el péptido cargado de forma opuesta y los lípidos.
En la investigación de Herbig et al (2005) se trabajó con un péptido derivado de
calcitonina (hCT) con algunas modificaciones y se comparó con pVEC y penetratina. En
vesículas de POPC y POPG (80:20) se observó una penetración profunda de los péptidos
que puede explicarse por la carga neta positiva baja y la hidrofobicidad relativa de los
péptidos derivados de hCT que causan el anclaje en el núcleo hidrofóbico de la
membrana. En los estudios de polarización de DPH, se observaron efectos de
25
polarización distintos de pVEC y penentratina en las LUVs de POPG, pero no se observó
efecto significativo para ninguno de los péptidos derivados de hCT. Curiosamente en
vesículas de POPC/POPG (80:20), donde los estudios de fluorescencia de Trp mostraron
inserción hacia el núcleo hidrofóbico, no se pudo detectar ningún cambio en la
polarización; esto demuestra que la inserción profunda de los péptidos no es suficiente
para provocar cambios en la microviscosidad de la bicapa y, por lo tanto, la polarización.
Finalmente, un estudio de Sharmin et al. (2016), indica la formación de un pre-poro
transiente hidrofílico en la membrana de GUV´s de DOPG/DOPC y DLPG/DTPC cuando
interactúan con el péptido R9. Este pre-poro sería dependiente de la línea de tensión
provocada entre los lípidos que componen las vesículas, por lo tanto, una menor línea
de tensión (DLPG/DTPC) provoca pre-poros más estables los que hace que la formación
y tamaño de estos sean más grandes que los formados en mezclas con líneas de tensión
mayor (DOPG/DOPC). En un estudio anterior de Karatekin et al. (2003) indican que la
línea de tensión de DOPG/DOPC/CHO es más grande que en la mezcla de DOPG/DOPC
debido al efecto del colesterol, por lo tanto, colesterol desestabiliza el pre-poro por lo
que el tamaño y formación de este sería más pequeño (Islam et al, 2018).
26
2.4 Fundamentos metodológicos
2.4.1 Dicroismo circular
El dicroísmo circular (DC) es un excelente método para evaluar rápidamente la
estructura secundaria, plegado y propiedades de unión de péptidos y proteínas. DC se
define como la absorción desigual de luz polarizada circularmente hacia la derecha e
izquierda. Un haz de luz tiene campos eléctricos y magnéticos dependientes del tiempo
asociados con él. Si la luz es polarizada, al pasar a través de prismas o filtros adecuados,
su campo eléctrico oscilará sinusoidalmente en un solo plano. Cuando se ve de frente,
la onda sinusoidal se puede visualizar como la resultante de 2 vectores de igual longitud,
que forman círculos, uno que gira en el sentido de las agujas del reloj y el otro que gira
en sentido contrario al reloj. Las dos ondas circularmente polarizadas tienen existencia
física. Las ondas están desfasadas 90° entre sí y pueden separarse usando una variedad
de prismas o dispositivos electrónicos que utilizan el efecto Pockel (Velluz et al, 1965).
Cuando las moléculas asimétricas interactúan con la luz, pueden absorber la luz
circularmente polarizada a la derecha y a la izquierda en diferentes grados y también
tener diferentes índices de refracción para las 2 ondas. El resultado es que el plano de
la onda luminosa gira y la sumatoria de los vectores de la energía a la derecha e izquierda
da como resultado un vector que forma una elipse y se dice que la luz está polarizada
elípticamente (Beychok, 1966) (Figura 3).
La luz polarizada circularmente hacia la derecha e izquierda interactúan con la molécula cambiando su refracción, la sumatoria de estos vectores da por resultado un vector en forma de elipse.
Figura 3: Esquema representativo dicroísmo circular
27
DC es un excelente método para determinar la estructura secundaria de péptidos y
proteínas. Cuando los cromóforos de las amidas del esqueleto peptídico están alineados,
sus transiciones ópticas se desplazan o se dividen en múltiples transiciones (Sreerama
et al, 2004). El resultado es que diferentes elementos estructurales tienen espectros DC
característicos. Por ejemplo, las α-hélices tienen 2 bandas negativas a 222 nm y 208 nm
junto a una banda positiva a 193 nm (Holzwarth et al, 1965), en cambio las hojas beta
tienen una banda negativa a 218 nm junto a una banda positiva a 195 nm (Greenfield
et al, 1969 y Greenfield, 2006) (Figura 4).
A todos los péptidos estudiados se les realizó DC para conocer su estructura secundaria,
en buffer, en TFE al 30% (trifluoroetanol) y en presencia de vesículas. El TFE se
caracteriza por estabilizar la estructura secundaria en α-hélice de péptidos que poseen
una propensión a formar este tipo de estructura (Sonnichsen et al, 1992). Para
determinar el %helicoidal, se utilizaron los parámetros de la teoría de transición
helicoidal (Scholtz et al, 1991).
Modelo espectro dicroismo circular conformación (1) alfa, (2) beta y (3) random coil (Polyanichko et al., 2011).
Figura 4: Modelo espectro dicroismo circular
28
2.4.2 Polarización generalizada de Laurdan
El motivo naftaleno fluorescente de la molécula de Laurdan (Figura 5) posee un momento
dipolar debido a la separación parcial de cargas entre los residuos 2-dimetilamino y 6-
carbonil. Este momento dipolar aumenta durante la excitación y puede causar la
reorientación de los dipolos de solvente alrededor, es decir el fluoróforo excitado ya no
está en un estado de equilibrio y las moléculas de agua se reorientan alrededor del dipolo
de estado excitado para disminuir la energía del sistema (Sanchez et al, 2007).
Figura 5: Estructura molécula de Laurdan (6-Dodecanoil-N,N-dimetil-2-naftilamina)
Una aplicación del corrimiento espectral de Laurdan es en el estudio de bicapas lipídicas.
La cadena hidrofóbica del ácido graso laúrico permite la solubilización de la sonda en la
bicapa fosfolipídica, localizando el motivo fluorescente hacia el medio acuoso. Cuando
los lípidos están en fase gel, el máximo de emisión de Laurdan está centrado a los 440
nm y cuando los lípidos están en fase líquido cristalino el máximo de emisión se centra
a los 490 nm. Este cambio espectral es el resultado de la relajación dipolar de Laurdan
en el medio lipídico. El origen de esta relajación dipolar se ha atribuido a la presencia de
moléculas de agua en la bicapa a nivel del esqueleto de glicerol, donde se encuentra el
motivo naftaleno de Laurdan (Parasassi et al, 1998). La cantidad de agua presente y la
dinámica molecular de estas, es una función de estado de fase fosfolipídica, donde la
reorientación del agua a lo largo del dipolo del estado excitado de la sonda ocurre
solamente en la fase líquido-cristalino (Sanchez et al, 2007) (Figura 6).
29
Figura 6: Diagrama explicativo relajación dipolar de Laurdan
El corrimiento del máximo de emisión de Laurdan puede ser cuantificado a través de la
polarización generalizada (PG) que se define como: PG = (I440 - I490) /(I440 + I490) donde
I440 e I490 son intensidades de fluorescencia a 440 nm (máximo emisión fase gel) y 490
nm (máximo emisión fase líquido cristalino), respectivamente (Parasassi et al, 1995)
(Figura 7).
Laurdan, cuando absorbe radiación electromagnética, pasa de un estado basal (S0) a un estado excitado (S1) y las moléculas de agua alrededor de Laurdan cambian su orientación. Si la cantidad de agua es muy poca, el reordenamiento es rápido, produciendo un decaimiento al estado basal sin mayor pérdida de energía. Si la cantidad de agua es alta, ocurre un reordenamiento de los dipolos de las moléculas de agua alrededor de Laurdan (relajación de solvente) con pérdida de energía lo que se evidencia en los espectros como un corrimiento a longitudes de onda más altas (490 nm).
30
Figura 7: Espectro de emisión de Laurdan
Espectro de emisión de Laurdan solubilizado en DPPC a 50 °C (rojo) y a 35 °C (azul) usando luz de excitación a 340 nm (Sánchez S. et al, 2012).
31
2.4.3 Anisotropía de DPH
En 1976, Andrich et al, mostraron que la molécula de DPH está orientada con su eje de
simetría al mismo plano de la membrana (fosfolípidos), al menos en la fase gel de las
bicapas lipídicas. Los momentos de transición de absorción y emisión son esencialmente
(pero no completamente) colineales, uno con el otro y con el eje de simetría. Esto hace
que DPH sea una excelente sonda para estudios de orden en las bicapas lipídicas ya que
incluso pequeños desplazamientos del eje de simetría dan como resultado una
despolarización de la emisión de fluorescencia que es fácilmente detectada y medida
(Figura 8).
Figura 8: DPH
Actualmente, los estudios indican que la orientación de DPH es paralela al eje de las
cadenas alifáticas de los lípidos (estrechamente restringida dentro de las bicapas
lipídicas) tal como se indicaba en 1976, pero también se encuentra en el centro de la
bicapa paralela a la superficie, tal como se demuestra mediante estudios de anisotropía
de fluorescencia resuelta en el tiempo y medidas de polarización de fluorescencia. DPH
no muestra preferencia de partición entre los fosfolípidos coexistentes en fase gel y
fluida. La intercalación de DPH y sus derivados en membranas se acompaña de un fuerte
(A) Estructura de la molécula de 1,6-Difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH). (B) Ubicación de la molécula de DPH en la membrana.
32
aumento de su fluorescencia la que es prácticamente insignificante en agua debido a su
baja solubilidad y el apagamiento de su emisión (Repáková et al, 2005).
Esta sonda DPH, se utilizó para la medición de anisotropía. La luz puede ser considerada
como oscilaciones de un campo electromagnético, caracterizada por sus componentes
eléctricas y magnéticas, perpendiculares a la dirección de propagación de la luz. Sólo
consideraremos la componente eléctrica. En la luz natural, el vector de campo eléctrico
puede tomar cualquier dirección de oscilación siempre que sea perpendicular a la
dirección de propagación (Figura 9A). Los polarizadores son lentes ópticamente activos
que pueden aislar una dirección del vector eléctrico (Figura 9B).
Considerando un sistema de coordenadas XYZ con una solución fluorescente ubicada en
el origen (Figura 10), en donde XZ es el plano de la página. En este sistema, la luz de
excitación viaja en la dirección X. Si insertamos un polarizador en el haz, podremos aislar
una dirección única del vector eléctrico y obtener luz polarizada paralela al eje Z, que
corresponde al eje de laboratorio vertical. Esta luz de excitación será absorbida por el
fluoróforo en el origen y se originará una fluorescencia que típicamente se observará a
90° respecto de la dirección de excitación, es decir a lo largo del eje Y. Se considerará
inicialmente que esta emisión puede tener cualquier dirección de polarización. La
dirección real del vector eléctrico de la emisión puede ser determinada observando la
emisión a través de un polarizador que pueda ser orientado alternativamente en
direcciones paralelas o perpendiculares relativas al eje Z o el eje de laboratorio vertical
(Jameson, 2014). Luego la polarización es definida como la función de las intensidades
paralelas (III) y perpendiculares (I
⊥):
A
B
A: Luz natural o no polarizada antes de pasar por un
polarizador. B: Luz natural o no polarizada después de
pasar por un polarizador (Jameson, 2014).
Figura 9: Conceptos de polarización
33
Si la emisión está completamente polarizada en la dirección paralela, es decir, el vector
eléctrico de la luz de excitación se mantiene completamente, entonces:
Figura 10: Representación de un momento dipolar de transición
El dipolo en la solución representa un dipolo orientado en relación con la dirección de polarización de la excitación (Jameson D., 2014).
Si la luz emitida está totalmente polarizada en la dirección perpendicular, entonces:
34
En condiciones perfectas los límites de la polarización serían: +1 a -1.
Otro término empleado frecuentemente en el contexto de la emisión polarizada es la
anisotropía (usualmente se le designa como A ó r), y que se define como:
Por analogía con la polarización, los límites de la anisotropía también en condiciones
ideales serían +1 a -0,5.
Los límites teóricos en solución no se cumplen debido al proceso de fotoselección siendo
los límites para polarización de -0,33 a +0,5 y para anisotropía -0,25 a +0,4 (Jameson
et al, 2010).
35
2.4.4 Tiempos de vida
Cuando una molécula absorbe un fotón de energía apropiada, se produce una cadena de
eventos fotofísicos, como la conversión interna o la relajación vibracional (pérdida de
energía en ausencia de emisión de luz), la fluorescencia, el cruce entre sistemas (del
estado singlete al estado triplete) y la fosforescencia. Cada uno de los procesos ocurre
con cierta probabilidad, caracterizado por constantes de velocidad de decaimiento (k).
El tiempo de vida es un proceso de decaimiento de la fluorescencia de primer orden y
depende de la concentración de moléculas en estado excitado de la forma:
N(t)=N0e-kt
donde N(t) es el número de moléculas electrónicamente excitadas que decaen en el
tiempo, N0 es el número total de moléculas, k es la constante de velocidad de
decaimiento y t el tiempo. El tiempo de vida de los procesos varía significativamente de
decenas de fentosegundos para la conversión interna a nanosegundos para fluorescencia
y microsegundos o segundos para fosforescencia (McGown et al, 2000 y Berezin et al,
2010).
El tiempo de vida de fluorescencia no depende de las condiciones iniciales de la
perturbación, como la longitud de onda de la excitación, la duración de la exposición a
la luz, la excitación de un fotón o multifotón, el método de medición y tampoco es
afectado por el fotoblanqueo (Chen Y. et al, 2004). Además, el tiempo de vida de
fluorescencia es un parámetro, en gran medida, independiente de la intensidad de
fluorescencia y la concentración del fluoróforo. Dado que este proceso está asociado a
un estado energéticamente inestable, el tiempo de vida puede ser sensible a una gran
variedad de factores internos definidos por la estructura del fluoróforo y factores
externos que incluyen la temperatura, polaridad y la presencia de apagadores. Una
combinación de sensibilidad al entorno e independencia paramétrica hacen que el tiempo
de vida sea un método complementario a las mediciones de intensidad de fluorescencia
estacionarias (Berezin et al, 2010).
El tiempo de vida del estado excitado se mide utilizando el método del dominio del
tiempo y el método del dominio de la frecuencia. En este proyecto se utilizó el dominio
de la frecuencia o método armónico. En este método, se utiliza una fuente de luz
continua, como un láser o lámpara de arco-xenón, y la intensidad de esta fuente de luz
es modulada sinusoidalmente a altas frecuencias. En cualquier caso, la frecuencia de
excitación está descrita por:
36
𝐸𝐸(𝑡𝑡) = 𝐸𝐸0 [1 + 𝑀𝑀𝐸𝐸 sin𝜔𝜔𝑡𝑡]
Donde E(t) y E0 son las intensidades en el tiempo t y 0, ME es el factor de modulación,
que está relacionada con la relación de los componentes de CA (parte alternante) y DC
(parte media) de la señal, y ω que es la frecuencia de modulación angular. Debido a la
persistencia del estado excitado, los fluoróforos sometidos a tal excitación darán lugar a
una emisión modulada, que se desplaza en fase con relación a la luz existente (Figura
11).
Figura 11: Ilustración del corrimiento de fase y la medida de modulación relativa
La línea continua corresponde a la excitación y la línea punteada a la emisión (Ross J. et al, 2008)
La figura 11 muestra el corrimiento de fase (ɸ) entre la excitación, E(t), y la emisión,
F(t). También se muestran los niveles de AC y DC asociados con las formas de onda de
excitación y emisión. Se puede demostrar que:
𝐹𝐹(𝑡𝑡) = 𝐹𝐹0 [1 + 𝑀𝑀𝐹𝐹 sin(𝜔𝜔𝑡𝑡 + 𝜑𝜑)]
Esta relación indica que la medida del corrimiento de fase, ɸ, puede formar la base de
una medición del tiempo de vida, τ. En particular, como se demostró en 1933 por
Dushinsky F.:
tan𝜑𝜑 = 𝜔𝜔𝜔𝜔
La modulación de la excitación (ME) y la emisión (MF) son dados por:
37
𝑀𝑀 = �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐷𝐷𝐴𝐴�𝐸𝐸
y 𝑀𝑀 = �𝐴𝐴𝐴𝐴𝐷𝐷𝐴𝐴�𝐹𝐹
La modulación relativa, M, de la emisión es entonces:
𝑀𝑀 =�𝐴𝐴𝐴𝐴𝐷𝐷𝐴𝐴�𝐹𝐹
�𝐴𝐴𝐴𝐴𝐷𝐷𝐴𝐴�𝐸𝐸
El tiempo de vida, τ, puede también ser determinado desde M acuerdo a la relación:
𝑀𝑀 =1
�1 + (𝜔𝜔𝜔𝜔)2
Usando el corrimiento de fase y la modulación relativa se puede determinar el tiempo
de vida de fase y el de modulación. Si el decaimiento fluorescente es sólo una
exponencial, los tiempos de vida de fase y modulación serán iguales en todas las
frecuencias. Sin embargo, si el decaimiento fluorescente es multiexponencial los tiempos
de vida de fase y modulación son distintos (Jameson, 2014).
38
2.1.1 Gráficos de fasores
Jameson et al. (1984) describió un método de representación gráfica de datos de fase y
modulación que se puede observar en la figura 12.
En esta figura 12, el vector tiene una longitud igual a la modulación (M) y hace un ángulo
con el eje x igual al desplazamiento de fase (ɸ). De las siguientes ecuaciones que son la
relación entre ɸ y la amplitud cuadrada (M2) para una mezcla de componentes
sinusoidales:
tan𝜑𝜑 = �𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑀𝑀𝑓𝑓 sin𝜑𝜑𝑓𝑓 /�𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑀𝑀𝑓𝑓 cos𝜑𝜑𝑓𝑓
𝑀𝑀2 = (∑𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑀𝑀𝑓𝑓 sin𝜑𝜑𝑓𝑓)2+(∑𝑓𝑓𝑓𝑓 𝑀𝑀𝑓𝑓 cos𝜑𝜑𝑓𝑓)2
(A) Ilustración esquemática de los conceptos básicos de las gráficas de fasores. (B) Dos fluoróforos diferentes con tiempos de vida de τ1 y τ2, donde τ1> τ2, y sus mezclas hipotéticas. La línea discontinua representa el conjunto de mezclas. La línea continua ilustra el vector M con desplazamiento de fase ɸ, que corresponde a la mezcla, donde la relación de las contribuciones de fluorescencia entre ambos fluoróforos es 1: 1. Tener en cuenta que el aumento de la contribución de la fluorescencia del fluoróforo con tiempo de vida τ1 resulta en un mayor ángulo ɸ y una disminución de la modulación M y también mueve el punto de fasor más cerca a la de τ1 (Štefl M. et al, 2011).
Figura 12: Ilustración esquemática de los conceptos básicos de fasores
39
Donde fi es la fotocorriente fraccional del i-ésimo componente con modulación Mi y fase
ɸ i, derivan las coordenadas X e y usando las anotaciones de Weber G. (1981):
𝑥𝑥 = 𝐺𝐺 = 𝑀𝑀 cos𝜑𝜑
𝑦𝑦 = 𝑆𝑆 = 𝑀𝑀 sin𝜑𝜑
Para un decaimiento exponencial simple, este vector describe un semicírculo de radio ½
con un centro en (1/2, 0) debido a la relación:
𝑀𝑀 = cos𝜑𝜑
Por lo tanto, un fluoróforo caracterizado por un solo tiempo de vida siempre dará lugar
a un punto de fasor que cae en este semicírculo, normalmente denominado como el
círculo universal (Figura 12A). Los puntos de fasor para los fluoróforos que se
descomponen con múltiples tiempos de vida se limitan dentro del círculo universal.
En presencia de reacciones de estado excitado, como la relajación dipolar y FRET, los
puntos de datos en el gráfico de fasor pueden caer fuera del círculo universal (Redford
G.I. et al, 2005). Las alteraciones en las propiedades de emisión de un fluoróforo pueden
ocurrir en respuesta a la dinámica del solvente. En el estado fundamental, los fluoróforos
tienen a menudo un momento dipolar permanente, cuya fuerza y dirección dependen de
la estructura y aspectos electrónicos de la molécula. Inmediatamente después de la
absorción de un fotón, se produce una reorganización electrónica dentro de la molécula,
que a menudo resulta en un momento dipolar con diferente orientación y magnitud.
Como tal, las moléculas de disolvente alrededor del dipolo de fluoróforo excitado ya no
están en un estado de equilibrio y se reorientan alrededor del dipolo de estado excitado
para disminuir la energía del sistema. Si el tiempo de este reordenamiento de dipolo del
solvente es comparable o más corto que el tiempo de vida del estado excitado, entonces
la reorientación del disolvente resultará en un corrimiento al rojo de la emisión, es decir,
a un estado excitado de energía inferior (Štefl M. et al, 2011).
40
2.2 Descripción del problema
En base a los antecedentes descritos, tenemos por un lado que Dubikovskaya et al
(2008) concluyeron que no sería favorable la administración sistémica de una droga
anticancerígena conjugada con CPPs debido su poca selectividad. Este resultado está
apoyado por Schwarze et al (1999) que indicaron que el principal problema del uso de
CPPs es la especificidad, lo que demanda especial consideración al momento de la
elección para el transporte de drogas ya que no presentarían selectividad en tejidos.
Ambos resultados nos sugieren que no cualquier transportador logra la selectividad, por
lo que es importante dilucidar si es que estos efectivamente se pueden utilizar en
condiciones donde las células presentan algún tipo de variación. Por ejemplo, en el
artículo de Abramov et al (2011) encontraron que el colesterol contenido en la
membrana de neuronas del hipocampo es baja comparada con los astrocitos vecinos en
la enfermedad de Alzheimer.
Por otro lado tenemos los antecedentes de las simulaciones computacionales realizadas
por Hua et al (2016) que indican que el péptido TAT se une fuertemente a los lípidos
aniónicos y se observa además que la concentración molar de colesterol no afecta la
energía libre, lo que implica que el enriquecimiento de colesterol en la membrana no
afecta la asociación de los CPPs, pero a pesar de que las propiedades de la interface no
se ven afectadas por la cantidad de colesterol en los sistemas, la energía libre total de
translocación aumenta a medida que se incorpora una mayor concentración de colesterol
en las membranas, o sea la adición de colesterol aumenta la rigidez elástica evitando la
formación de poros en el centro de la bicapa. Este estudio solamente fue realizado con
el péptido TAT por lo que es muy importante la contrastación de estos resultados con
otros CPPs que tengan diferentes propiedades físico-químicas.
En base a todo lo expuesto surge la pregunta: ¿Dependerá la incorporación de los
péptidos penetrantes de células del contenido de colesterol en las membranas y/o de las
propiedades fisicoquímicas de la bicapa lipídica?
Para responder a este cuestionamiento es necesario exponer a estos péptidos carriers
a modelos de membrana donde se modificará el contenido de colesterol.
En el presente proyecto, se pretende resolver el problema de la influencia de las
propiedades fisicoquímicas en la penetración de péptidos a través de la membrana
plasmática. Este estudio aportará al conocimiento científico indicios sobre la interacción
de los péptidos penetrantes con los lípidos de membranas.
41
3. Hipótesis y Objetivos 3.1 Hipótesis
Los antecedentes aportados permiten fundamentar la siguiente hipótesis:
La incorporación de péptidos a vesículas es influenciada por la composición de la fase
lipídica y los péptidos afectan las propiedades fisicoquímicas de la membrana tales como
fluidez, orden de empaquetamiento e hidratación que modulan la interacción lípido-
péptido
3.2 Objetivos
3.2.1 Objetivo General
Determinar la dependencia de la incorporación de péptidos penetrantes de células
(CPPs) respecto de la composición lipídica en modelos de membrana.
3.2.2 Objetivos Específicos
1. Sintetizar y caracterizar los distintos péptidos a estudiar.
2. Caracterizar las propiedades fisicoquímicas de modelos de membrana propuestos
según la composición lipídica.
3. Estudiar la interacción lípido-péptido y su correlación con la composición lipídica
en modelos de membrana.
4. Cuantificar el grado de incorporación de los péptidos en los diferentes modelos
de membrana propuestos.
42
4. Metodología
4.1 Síntesis y caracterización de CPPs 4.1.1 Síntesis de Péptidos
Se pesaron 40 mg de resina sólida Rink-amida poliestireno-divinilbenceno (Kassem et
col., 2009) y se colocaron al interior de una bolsa de polipropileno, la cual se selló
totalmente (cada bolsa debidamente identificada con un número) (Houghten, 1985).
A su vez se prepararon los aminoácidos Fmoc pesando la cantidad calculada para tener
aproximadamente 10 excesos en solución (el volumen a preparar depende de los
aminoácidos necesarios para la síntesis del péptido) y el solvente a utilizar en este caso
es DMF.
El primer paso de la síntesis es la desprotección del grupo amino de la resina, para esto
se realizaron 2 lavados con una solución de piperidina al 20% y tritón X-100 al 1% en
DMF durante 10 minutos. Luego se realizaron 5 lavados con DMF durante 1 minuto, un
lavado con IPA durante 1 minuto, un lavado con azul de bromofenol (este es extra para
monitorear el acople) al 1% en DMF durante 2 minutos, dos lavados con DMF durante
un minuto y finalmente 2 lavados con DCM durante 1 minuto.
Una vez que la resina de las bolsas estuvo desprotegida, se agregó a la solución de
aminoácido correspondiente a la secuencia a sintetizar. Los aminoácidos estuvieron
preparados previamente como se indicó más arriba y después de añadidas las bolsas,
se les agregó activador TBTU-HOBT y DIEA (Aminoácido: Activador: DIEA; 10:10:20).
Al finalizar, se dejó en agitación constante durante un mínimo de 6 horas.
Este proceso consistente en desprotección y acople se realizó tantas veces como
aminoácidos presentes en el péptido a sintetizar.
Una vez sintetizado el péptido se realizó la separación de este desde la resina, para esto,
primero, se preparó la solución de clivaje para los péptidos que contienen en su
estructura primaria los aminoácidos metionina, cisteína y triptófano consistente de
92,5% de TFA, 2,5% de agua, 2,5% de B-mercaptoetanol y 2,5% de TIS (solución B),
y luego, se preparó la solución de clivaje para el resto de los péptidos preparada con
95% de TFA, 2,5% de agua y 2,5% de TIS (solución A).
Las bolsas a clivar se colocaron en tubos de 15 mL y se les agregó 1,5 mL de la solución
A o B según correspondía. Se dejaron agitando durante 2 horas. Una vez cumplido el
43
tiempo, se le agregó a la solución éter frío y se centrifugó (este proceso se repitió 5
veces para los de la solución A y 10 veces para la solución B, para retirar el B-
mercaptoetanol). El péptido precipitado se dejó secar. Finalmente se disolvió en agua,
se congeló y se liofilizó (Hood C.A. et col., 2008).
4.1.2 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Los análisis de pureza de los péptidos se realizaron por HPLC, en un cromatógrafo líquido
de alta resolución con detector UV-Vis, Jasco LC-2000 plus serie (Jasco Co., Ltd., Tokyo,
Japan). La caracterización de cada uno de los péptidos se realizó utilizando una columna
XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y con un gradiente de 0 - 70% de
acetonitrilo en 8 minutos y detección a 220 nm.
4.1.3 Espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida (LC-MS)
Se determinaron las masas de los diferentes péptidos sintetizados en un equipo
Shimadzu LCMS-2020 (Shimadzu Corp., Ltd., Kyoto, Japan) con detector de masas
utilizando un programa 0-100% de acetonitrilo durante 20 minutos MS PDA 250 mm.
Espectros obtenidos en el Laboratorio de la Dra. Fanny Guzmán, Núcleo de biotecnología
de Curauma.
4.1.4 Dicroismo Circular
Los espectros de dicroísmo circular de los péptidos sintetizados se realizaron usando
cubetas de cuarzo de 1 mm. Cada uno de los péptidos fue disuelto en agua buffer de
trabajo a una concentración de 1 mM y la estructura secundaria fue estabilizada con TFE
a una concentración final de 30% (v/v). Los espectros se obtuvieron a partir de tres
acumulaciones entre 195 y 260 nm con un paso de datos de 0,2 nm, un ancho de banda
de 1 nm y una sensibilidad estándar a 37 ºC. Los espectros DC de péptidos en presencia
de vesículas se realizaron a una relación 1:40 péptido-lípido. Los espectros de DC fueron
analizados utilizando la teoría de transición helicoidal según la fórmula:
Donde θH es la elipticidad molar a 222 nm que se obtendría si todo el péptido fuese una
alfa hélice (deg cm2 dmol-1), T es la temperatura en °C, n es el número de residuos en
la cadena, x es una constante (determinada en el artículo de Scholtz J.M et al, 1991)
que corresponde a 2,5 y el valor de 40000 se usa para una hélice infinita. El valor
obtenido corresponde al péptido suponiendo hélice alfa 100% y este valor se comparó
θH = -40000 x ( 1 - x / n ) + 100 x T
44
con los valores obtenidos experimentalmente a 222 nm para cada péptido en las distintas
condiciones.
4.2 Preparación de LUVs
Se preparó una solución stock de DMPC, DMPG y colesterol de forma independiente en
cloroformo (excepto DMPG que se disolvió en una mezcla metanol: cloroformo 1:3)
burbujeado previamente con N2, luego se adicionó la cantidad correspondiente de
fosfolípidos stock en tubos de vidrio para preparar las mezclas DMPC/DMPG 1:1,
DMPC/DMPG/CHO15%, DMPC/DMPG/CHO20% y DMPC/DMPG/CHO33,3%. Después se
evaporó el cloroformo usando corriente de N2 y se evaporó el cloroformo residual con
vacío toda la noche.
Se resuspendieron los fosfolípidos con buffer de trabajo (20 mM Tris, 100mM NaCl) a pH
7.4 para una posterior agitación y resuspensión a 60°C, luego se agitó y sonicó.
Finalmente, se realizaron 10 ciclos de congelado (con nitrógeno líquido) - descongelado
(60°C) – agitación con vortex y sonicación en baño de ultrasonido, para resuspender
todo el sólido.
Se realizó la extrusión de la solución de fosfolípidos para formar las LUVs, para esto se
utilizó un equipo de extrusión asociado a una corriente de nitrógeno para producir el
paso de las vesículas multilamelares por diferencias de presión a través de un filtro de
membrana de poliéster Drain Disc, libre de aglutinante, espesor 100um y 25 mm de
diámetro y dos filtros de membrana de policarbonato, negro, liso, tamaño poro 0,4um y
diámetro 25mm (10 ciclos).
Para realizar las medidas de anisotropía se incubaron las LUVs (0,4mM) con DPH (0,5
µM, 1 hr) y para realizar las medidas de polarización generalizada se incubaron con
Laurdan (0,5 µM, 1 hr) a 37ºC (Gräslund A. et al., 2011).
45
4.3 Polarización generalizada Laurdan
Laurdan (6-lauroil-2-dimetilaminonaftaleno) es una sonda anfipática cuyo espectro de
emisión tiene alta sensibilidad a los estados físicos de la membrana, con el motivo
fluorescente dentro de una posición de poca profundidad en la bicapa. Laurdan
proporciona información acerca de la polaridad y/o dinámica molecular a nivel del
esqueleto de glicerol de los fosfolípidos. Se midió como fue descrito por Parasassi et al.
(1995). Brevemente, la polarización generalizada (GP) se define como GP = (I440 - I490)
/(I440 + I490) donde I440 y I490 son intensidades de fluorescencia a 440 nm (máximo
emisión fase gel) y 490 nm (máximo emisión fase líquido cristalino), respectivamente,
la excitación es a 360 nm. Los ensayos de GP fueron realizados en el espectrofluorímetro
ISS K2 (ISS Inc., Champaign, IL, EEUU). Los datos y los valores de GP, fueron adquiridos
y calculados por el software del equipo VinciTM versión 2.4 (ISS Inc., Champaign, IL,
EEUU).
4.4 Anisotropía de DPH
DPH (1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno) es ampliamente utilizado como una sonda para las
regiones hidrofóbicas de las bicapas de fosfolípidos. Las mediciones de anisotropía de
fluorescencia en estado estacionario de DPH fueron utilizados para investigar las
propiedades estructurales de los fosfolípidos, ya que proporciona una medida de la orden
de empaquetamiento de lípidos, debido a la difusión rotacional restringida del fluoróforo
en la membrana. La longitud de onda de excitación fue de 370 nm y se utilizaron los
filtros de SCHOTT longpass 399 y 420. Los ensayos de anisotropía de DPH fueron
realizados en el espectrofluorímetro ISS K2 (ISS Inc., Champaign, IL, EEUU). Los datos
y los valores de anisotropía de DPH, fueron adquiridos y calculados por el software del
equipo VinciTM versión 2.4 (ISS Inc., Champaign, IL, EEUU).
4.5 Tiempos de vida de DPH
Las medidas de tiempo de vida se van modificando a medida que cambia el entorno de
las sondas fluorescentes en la membrana. El parámetro de tiempo de vida de
fluorescencia depende de la constante dieléctrica del entorno, es decir, mientras más
aumenta la hidratación del entorno de las sondas menor será el tiempo de vida, lo que
nos permitirá complementar los resultados de anisotropía y polarización generalizada
para poder dilucidar el mecanismo de incorporación de los péptidos y comparar este
mecanismo cuando se vaya modificando la composición lipídica. Se utilizó un
espectrofotómetro ISS K2 con desplazamiento de fase y modulación en el intervalo de
46
frecuencia 1-250 Hz, la cual fue variando dependiendo de cada muestra. La fuente de
energía fue un láser-diodo de 375 nm, como referencia se utilizó DMPOPOP cuyo tiempo
de vida es 1,42 ns a 37°C y el intervalo de frecuencias 5-100 Hz. Los tiempos de vida
de fluorescencia de DPH fueron ajustados a un modelo de dos componentes: una
distribución Lorentziana, y una componente discreta que da cuenta de la luz dispersada
(menos del 1 %). Los datos, fueron adquiridos y analizados con el software del equipo
VinciTM versión 2.4 (ISS Inc., Champaign, IL, EEUU).
4.6 Tiempos de vida de Laurdan
Se utilizó un espectrofotómetro Chronos con desplazamiento de fase y modulación en el
intervalo de frecuencia 10-200 Hz, ubicado en el Laboratorio del Dr. David Jameson en
la Universidad de Hawaii. La referencia utilizada fue DMPOPOP en etanol cuyo tiempo de
vida es de 1,42 ns a 37°C. La excitación se midió con un láser de 375 nm y para la
emisión se utilizaron 2 filtros de manera indistinta para obtener los tiempos de vida de
la parte azul (filtro 440 bp) y la parte roja (filtro 490 longpass). Los datos, fueron
adquiridos y analizados con el software del equipo VinciTM versión 2.4 (ISS Inc.,
Champaign, IL, EEUU).
4.7 Porcentaje de inserción
Se agregaron las LUVs a un tubo de centrífuga junto con la concentración necesaria de
péptido a cada tubo (metodología utilizada para las 4 mezclas de lípidos y 2
concentraciones de péptidos). Luego se incubó por 5 minutos a 37°C. Se centrifugó a
30.000 rpm a 4 °C durante 1 hora. Se recuperó el sobrenadante (aquí se encuentra el
péptido que no ingreso a la vesícula). Se resuspendió el pellet en buffer de trabajo y
detergente tritón (0,05%). Se centrifugó nuevamente a 30.000 rpm a 4 °C durante 1
hora y se recuperó el sobrenadante (péptido que ingreso a la vesícula).
Las medidas en estado estacionario se realizaron en un espectrofotómetro ISS K2
utilizando como fuente de energía una lámpara de Xenón a 15 A° y longitud de excitación
560 nm. La emisión fue tomada de 575 nm a 680 nm cada 1 nm utilizando un ancho de
banda slit 1.0.
47
5. Resultados y discusiones
5.1. Síntesis y caracterización de CPPs
Como se explicó anteriormente, los péptidos se pueden clasificar en catiónicos,
anfipáticos e hidrofóbicos. Para el siguiente estudio, se utilizó una variedad de péptidos
que pertenecieran a los distintos subgrupos, estos son: R6H4, TAT, Penetratina y R9
péptidos catiónicos; ARF 1-22, pVEC y Bac7 péptidos anfipáticos; FGF péptido
hidrofóbico; pKCi como control negativo y melitina como control positivo (tabla 1).
La elección de los 10 péptidos de este estudio también se basó en la priorización de los
que poseen en su cadena una mayor cantidad de aminoácidos arginina (R) que lisina
(K), esto debido a estudios que revelaron que arginina contribuye más a la captación
celular que lisina (Wender et al, 2000 y Tünnemann et al, 2008). Lo anterior se atribuye
a la capacidad del grupo cabeza guanidina de la arginina para formar enlaces de
hidrógeno bidentados con los grupos carboxílicos, sulfatos y fosfatos cargados
negativamente en la membrana celular, lo que lleva a la internalización (Rothbard et al,
2004). En cambio, lisina no presenta el grupo cabeza de guanidina, por lo tanto, muestra
menor capacidad para penetrar en la membrana plasmática (Koren et al, 2012 y Guidotti
et al, 2017).
Nombre Secuencia P.M (g/mol) Clasificación
R6H4 RRRRRRHHHH 1503,8 Catiónico
TAT YGRKKRRQRRR 1560,0 Catiónico
Penetratina RQIKIWFQNRRMKWKK 2247,0 Catiónico
ARF 1-22 MVRRFLVTLRIRRACGPPRVRV 2652,6 Anfipático
FGF PIEVCMYREP 1236,6 Hidrofóbico
PKCi RFARKGALRQKNV 1544,0 Control negativo
R9 RRRRRRRRR 1423,8 Catiónico
pVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK 2210,0 Anfipático
Bac7 RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG 2938,9 Anfipático
Melitina GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 2847,9 Control positivo
Tabla 1. Tabla resumen péptidos sintetizados
Tabla resumen péptidos sintetizados indicando el nombre, secuencia aminoacídica, peso molecular y su clasificación como péptido penetrante. En la tabla se incluyen los 2 controles tanto el positivo como el negativo.
48
Se realizó un análisis HPLC para comprobar la pureza de los péptidos sintetizados (Anexo
1) y un análisis de masas para determinar el peso molecular y compararlo con el cálculo
teórico (Anexo 2), obteniendo para ambos casos resultados satisfactorios lo que
demuestra que los péptidos sintetizados corresponden a los propuestos.
Para determinar la estructura secundaria de los péptidos sintetizados se realizó un
análisis de dicroísmo circular en solución buffer (20 mM Tris, 100mM NaCl, pH 7,4) a
una concentración correspondiente a la relación 1:20 péptido: lípido (la concentración
de cada péptido depende de su masa molecular, los valores se encuentran dentro del
rango 80-190 µM) debido a que los espectros a concentraciones más bajas no se
pudieron obtener.
Los espectros (figura 13) y los análisis (tabla 2) muestran que la mayoría de los péptidos
presentan una estructura no determinada en buffer donde se observa un mínimo entre
195 y 210 nm, pero el máximo no alcanza los valores positivos.
Figura 13: Dicroismo circular de los péptidos sintetizados en buffer.
200 210 220 230 240 250 260
-6,0x105
-4,0x105
-2,0x105
0,0
2,0x105
4,0x105
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1)
Longitud de onda (nm)
TAT ARF (1-22) FGF pKCi Melitina Penetratina R6H4 R9 pVEC Bac7
Dicroismo circular de los péptidos sintetizados en buffer. Línea negra: TAT, línea roja: ARF (1-22), línea azul: FGF, línea verde claro: pKCi, línea magenta: Melitina, línea amarrilla: Penetratina, línea cyan: R6H4, línea naranja: R9, línea ploma: pVEC y línea verde oscuro: Bac7. Medida realizada por triplicado, pero solo se muestra el mejor resultado.
49
5.2. Dicroismo circular de péptidos en membranas
Para evidenciar cambios en la estructura secundaria de los péptidos al interactuar con
los modelos de membranas propuestos, se realizó dicroísmo circular. Para realizar un
análisis cuantitativo de los gráficos de dicroísmo circular se calculó el porcentaje (%)
helicoidal (tabla 2). Sólo se considerará el análisis de la estructura secundaria alfa hélice
puesto que los péptidos estudiados en su mayoría adoptan esta conformación en
diferentes entornos (Milletti, 2012).
Como se observó en la figura 13, los péptidos en buffer sin la presencia de membranas
muestran que la mayoría de los péptidos tienen una estructura random coil caracterizado
por un mínimo cercano a 198 nm y un máximo positivo a 217 nm. Cuando no se observa
un máximo a 217 nm, nos indica una mezcla de estructura secundaria, en este caso la
presencia de hélice alfa, esta conformación de los péptidos se condice con antecedentes
bibliográficos (Eiríksdóttir et al, 2010).
Analizando sólo la estructura helicoidal de los péptidos en buffer, TAT y R9 tienen un
porcentaje correspondiente a 0%, pKCi una estructura helicoidal poco definida de un
1,5%, el péptido pVEC presenta una estructura cercana al 12% al igual que R6H4. Por
otro lado, penetratina y FGF presentan un porcentaje cercano al 15%. El péptido ARF
(1-22) presenta un 20%, melitina un 26% y cercano al 40% Bac7 (el detalle de los
porcentajes se puede apreciar en la tabla 2).
Luego se analizaron los péptidos en una solución de TFE al 30% puesto que su potencial
efecto es mayor a esta concentración v/v (Culik et al., 2014). El TFE se caracteriza por
estabilizar la estructura secundaria de hélice en las regiones con cierta propensión a
formarlas (Sonnichsen F. et al, 1992). Finalmente, se midió la estructura secundaria de
los péptidos en los 4 modelos de membrana propuestos: DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO
15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%.
Tabla 2: Tabla resumen porcentaje helicoidal de los péptidos sintetizados en los diferentes medios
Buffer y TFE; y en los modelos de membrana DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO15%, DMPC/DMPG/CHO20% y DMPC/DMPG/CHO33,3%.
Medio/péptido ARF 1-22 PKCi pVEC Bac 7 Melitina R6H4 TAT penetratina R9 FGFbuffer 19,0 1,5 12,4 39,4 25,7 11,2 0,0 13,1 0,0 15,9TFE 93,2 21,6 74,4 66,9 100,0 50,9 6,7 47,1 4,0 26,1DMPC/DMPG 27,9 6,4 15,4 49,7 26,9 10,3 0,0 12,1 0,0 20,1DMPC/DMPG/CHO15% 37,7 16,4 19,3 46,0 38,0 27,4 0,0 25,4 8,3 34,0DMPC/DMPG/CHO20% 36,9 22,5 31,1 49,2 39,0 17,1 15,5 22,8 7,0 30,8DMPC/DMPG/CHO33,3% 37,4 24,8 33,9 54,5 44,2 31,7 15,1 2,5 13,1 38,8
% helicoidal
50
La figura 14 muestra los resultados obtenidos para la interacción del péptido R6H4 en
las diferentes condiciones. En TFE (línea roja) el péptido toma una estructura levemente
helicoidal en comparación con el péptido en buffer (de un 11% en buffer a casi un 51%
en TFE).
Al interactuar el péptido con vesículas sin colesterol (línea azul) se ve la misma
estructura random coil (un mínimo a 198 nm) que en buffer (cercana al 10% estructura
helicoidal). En vesículas con un 15% de colesterol (línea verde) el péptido adopta una
conformación levemente helicoidal cercano a un 27% (se observa un leve mínimo a 208
nm y a 222 nm característicos de una estructura helicoidal) lo que cambia en las
vesículas con 20% de colesterol (línea magenta) cuyo % helicoidal disminuye a un 17%
para luego volver a aumentar a un 31% al encontrarse el péptido en presencia de
vesículas con un 33,3% de colesterol (línea amarilla).
Figura 14: Dicroismo circular péptido R6H4
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC:DMPG:CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC:DMPG:CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
200 210 220 230 240 250 260
-17,5
-15,0
-12,5
-10,0
-7,5
-5,0
-2,5
0,0
2,5
5,0
7,5
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
longitud de onda (nm)
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
51
La figura 15 muestra la interacción del péptido TAT con los distintos modelos de
membrana. El péptido en TFE (línea roja) presenta una estructura random coil (se
observa el mínimo a 198 nm y el máximo a 217 nm), pero la línea magenta y amarilla
que corresponden a 20% y 33,3% de colesterol respectivamente, se observa una leve
tendencia a formar una estructura helicoidal (15%), presumiendo una preferencia en la
interacción con estas membranas que presentan un mayor porcentaje de colesterol.
Según el artículo de Eiríksdóttir et al. (2010), el péptido TAT tiene estructura random
coil en agua lo que se condice con los resultados obtenidos, pero esta estructura se
mantiene al interactuar con vesículas de DOPG, DOPC/DOPG y DOPC/SM/CHO.
Figura 15: Dicroismo circular péptido TAT
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
200 210 220 230 240 250 260-22,5-20,0-17,5-15,0
-12,5-10,0-7,5-5,0-2,50,0
2,55,07,5
10,0
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
52
Se observa en la figura 16 la interacción del péptido penetratina. Al aumentar la
concentración de colesterol (a un 15% y luego a un 20%) aumenta el porcentaje
helicoidal levemente (desde un 12% en vesículas sin colesterol a un 25%
aproximadamente). Este porcentaje disminuye a un 2,5% de estructura helicoidal en
presencia de vesículas con 33,3% de CHO (línea amarilla). Estos resultados sugieren
que el péptido interactúa con membranas que contienen bajo porcentaje de colesterol.
Comparando los resultados con los obtenidos por Eiríksdóttir et al. (2010) se reporta
que en agua este péptido tiene estructura random coil la cual no se modifica en las
vesículas de DOPC/DOPG, DOPC y DOPC/SM/CHO, pero en las vesículas de DOPG habría
una mezcla de hoja-β y random coil.
Figura 16: Dicroismo circular péptido penetratina
200 210 220 230 240 250 260-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
53
La figura 17 representa los resultados de la interacción del péptido ARF 1-22 con los
distintos modelos de membrana. El péptido presenta una estructura helicoidal
correspondiente a 27,9% en vesículas sin colesterol. Al aumentar la concentración de
colesterol, hay un leve aumento de la estructura helicoidal desde un 27,9% a un 37%,
el cual se mantiene al aumentar la concentración de colesterol. No se evidencian
diferencias significativas entre los modelos de membrana con distintos porcentajes de
colesterol.
Figura 17: Dicroismo circular péptido ARF 1-22
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
200 210 220 230 240 250 260-60,0
-52,5
-45,0
-37,5
-30,0
-22,5
-15,0
-7,5
0,0
7,5
15,0
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
54
Las medidas de dicroísmo circular del péptido FGF (Figura 18), el único péptido
penetrante hidrofóbico en este trabajo, dio como resultado la presencia de estructura
helicoidal correspondiente a un 20% en vesículas sin colesterol. El porcentaje helicoidal
aumenta sobre el 30% al interactuar con vesículas cuyo porcentaje de colesterol es de
un 15% y 20% llegando a un 38,8% helicoidal en vesículas cuyo porcentaje de colesterol
es 33,3%. Este comportamiento es muy similar al del péptido anfipático ARF (1-22).
200 210 220 230 240 250 260
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
Figura 18: Dicroismo circular péptido FGF
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
55
En la figura 19 se observan los dicroismos de la interacción del péptido pKCi utilizado
como control negativo ya que en bibliografía se indica que no penetra en membrana
(Swiecicki at al.; 2015). Si se observa la línea verde, la línea magenta y la línea amarilla,
el péptido al interactuar con las membranas que presentan colesterol, tiende a tomar
una leve conformación helicoidal (16,4%, 22,5% y 24,8% respectivamente). Este
resultado se condice con el reportado por Swiecicki J. at al. (2015) quienes evidencian
una acumulación de este péptido en la membrana, pero no una internalización de éste.
Figura 19: Dicroismo circular péptido pKCi
200 210 220 230 240 250 260-27,5
-25,0
-22,5
-20,0
-17,5
-15,0
-12,5
-10,0
-7,5
-5,0
-2,5
0,0
2,5
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
56
El péptido R9, cuyos gráficos de dicroismos se observan en la figura 20, muestra una
estructura random coil al estar presente en vesículas sin colesterol presentando un 0%
de estructura helicoidal (línea azul). Al aumentar la concentración de colesterol en las
vesículas, el porcentaje helicoidal aumenta levemente, llegando a un máximo de 13,1%
en vesículas con 33,3% de colesterol (línea amarilla).
Según lo reportado por Eiríksdóttir et al. (2010) se evidencia una estructura random coil
para este péptido en agua y en los modelos de membrana de DOPC, DOPC/DOPG, DOPC
y DOPC/SM/CHO, lo que se condice con nuestros resultados.
Figura 20: Dicroismo circular péptido R9
200 210 220 230 240 250 260-25,0-22,5-20,0-17,5-15,0-12,5-10,0-7,5-5,0-2,50,02,55,07,5
10,0
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
57
El péptido anfipático pVEC (figura 21), muestra una estructura secundaria helicoidal alta
en TFE al 30% (74,4% correspondiente a la línea roja), la que no se evidencia claramente
al exponer el péptido a la presencia de vesículas, siendo más bien una estructura random
coil con una menor presencia helicoidal. Al incrementar la concentración de colesterol en
las vesículas, aumenta el porcentaje helicoidal, correspondiendo a un 15,4% en vesículas
sin colesterol (línea azul) y luego a un 19,3%, 31,1% y 33,9% al aumentar la
concentración de colesterol en las vesículas (línea verde, línea magenta y línea amarilla).
Este comportamiento del péptido es muy similar al péptido anfipático ARF (1-22).
Eiríksdóttir E. et al. (2010) evidenció que el péptido pVEC tiene estructura random coil
y esta estructura no se modifica en las vesículas de DOPC/DOPG, DOPC y DOPC/SM/CHO,
pero en las vesículas de DOPG habría una mezcla de hoja-β y random coil.
Figura 21: Dicroismo circular péptido pVEC
200 210 220 230 240 250 260-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC:DMPG:CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC:DMPG:CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
58
Bac7 al interactuar con las distintas condiciones (figura 22), presenta una estructura
helicoidal de casi un 50% en el modelo de membrana sin colesterol (línea azul) y al
aumentar la concentración de colesterol (línea verde, línea magenta y línea amarilla)
esa estructura disminuye levemente para luego mantenerse relativamente constante,
por lo tanto, de ocurrir interacción sería indistintamente en los 4 modelos de membrana
presentados sin ser influenciado por la presencia de colesterol.
Figura 22: Dicroismo circular péptido Bac7.
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG:CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC:DMPG:CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC:DMPG:CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
200 210 220 230 240 250 260-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
59
Melitina es el péptido utilizado como control positivo debido a que este penetra en la
membrana formando un poro. En la figura 23, se observan los resultados obtenidos para
este péptido. Se observa una estructura hélice del péptido correspondiente al 26,9% en
presencia de vesículas que no tienen colesterol (línea azul). Luego, en las líneas magenta
y amarilla, se ve un leve aumento de la estructura helicoidal del péptido (cercana al
38%), por lo que la presencia de colesterol mejoraría la interacción con la membrana.
En el artículo de Qiana et al. (2015) muestra que efectivamente melitina en agua
presenta un 10% de estructura helicoidal, la cual aumenta en las vesículas de POPC/CHO
en 18% y en las vesículas de POPE/POPG en un 43%.
200 210 220 230 240 250 260
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
buffer TFE 30% CHO 0% CHO 15% CHO 20% CHO 33,3%
longitud de onda (nm)
Elip
ticid
ad m
olar
(deg
cm
2 dm
ol-1) x
104
Figura 23: Dicroismo circular péptido melitina
Los espectros corresponden al péptido en distintos entornos. Línea negra: péptido libre en buffer; línea roja: péptido libre en TFE 30%; línea azul: péptido en LUV´s DMPC: DMPG (1:1); línea verde: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 15%; línea magenta: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 20% y línea amarilla: péptido en LUV´s DMPC: DMPG: CHO 33,3%. Medidas realizada por triplicado, se muestra el mejor resultado.
60
La figura 24 muestra un resumen de los resultados obtenidos en DC. En vesículas sin
colesterol el péptido que presenta mayor porcentaje helicoidal es Bac7 seguido por
ARF(1-22), melitina y FGF; los péptidos que presentan menor porcentaje helicoidal con
R9 y TAT. Al aumentar el porcentaje de colesterol en un 15%, 20% y 33,3% en vesículas
la tendencia es la misma que en vesículas sin colesterol. Si observamos los porcentajes
helicoidales de los péptidos, estos aumentan al aumentar el porcentaje de colesterol en
un 15% (excepto Bac7 que disminuye), el aumento es mayor para los péptidos R6H4,
FGF y penetratina. Al aumentar el porcentaje de colesterol en un 20%, la mayoría de los
péptidos disminuye su porcentaje helicoidal (excepto Bac7, pVEC y pKCi que aumentan
el porcentaje helicoidal) siendo mayor este efecto nuevamente en los péptidos R6H4,
FGF y penetratina. Finalmente al aumentar el colesterol en un 33,3% la mayoría de los
péptidos aumenta su porcentaje helicoidal (excepto penetratina y pKCi que disminuye
su porcentaje helicoidal), los péptidos con mayor efecto son R6H4 y FGF. Los péptidos
que aumentan su estructura secundaria al aumentar el porcentaje de colesterol en las
vesículas en un 15% y 33,3% se podría asociar a una mayor acumulación de estos en
la superficie de la membrana. Efecto contrario se observa en vesículas con un 20% de
colesterol donde la mayoría de los péptidos disminuyen el porcentaje helicoidal lo que
se puede interpretar como una disminución de la acumulación de estos en la membrana
ya sea por la incorporación de los péptidos al núcleo hidrofóbico de la membrana, un
ingreso a las vesículas o un aumento de estos libres en solución.
61
0% 15% 20% 33,3%0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Porc
enta
je h
elico
idal
Porcentaje de colesterol
ARF 1-22 PKCi pVEC Bac 7 Melitina R6H4 TAT Penetratina R9 FGF
Figura 24: Gráfica resumen resultados DC
Porcentaje helicoidal versus porcentaje de colesterol en los modelos de membrana DMPC/DMPG/CHO.
62
5.3 Propiedades fisicoquímicas de la membrana con y sin péptido.
5.3.1. Polarización generalizada de Laurdan
Para la medición de polarización generalizada de Laurdan se incubaron las vesículas en
presencia de la sonda. Laurdan se ubica dentro de la membrana con su motivo naftaleno
cercano a las cabezas polares de los fosfolípidos. Cuando el valor de PG aumenta indica
una menor hidratación y/o relajación de solvente y cuando este valor disminuye es el
efecto contrario (mayor hidratación y/o relajación de solvente).
En el trabajo de Harris F. et al. (2002) utilizaron como modelo de membrana vesículas
multilamelares de DPPC y reportaron un rango experimental de los valores de PG de
Laurdan de 0,7 a -0,14. Estos valores los utilizaremos como rango de referencia para
comparar nuestros resultados, aunque se esperan valores de PG más bajos debido a que
los modelos de membrana utilizados son más fluidos que los descritos en la bibliografia.
En la figura 25A se muestran los resultados de PG de Laurdan en presencia de los
péptidos con las vesículas de DMPC/DMPG. Los péptidos ARF (1-22) y TAT (línea roja y
línea negra respectivamente) aumentan significativamente el valor de PG al aumentar
la relación péptido: lípido. Por un lado, el péptido ARF (1-22) aumenta
proporcionalmente la PG respecto al control al aumentar la concentración de péptido, en
una primera instancia (relación 1:80 péptido: lípido) en un 48%, luego en la relación
péptido: lípido 1:40 aumenta en 100% y finalmente al valor de concentración más alto
de péptido aumenta en un 200%. Por otra parte, el péptido TAT tiene el mismo efecto
que el péptido ARF (1-22) pero en un porcentaje menor, se observa un aumento de PG
primero de un 36%, luego de un 74% y finalmente de un 155%.
Los péptidos melitina y Bac7, al igual que ARF (1-22) y TAT, aumentan el valor de PG al
aumentar la concentración de péptido, pero en un porcentaje. Melitina aumenta la PG
en un 23%, luego un 33% y finalmente un 64%, en cambio Bac7 aumenta el valor de
PG en un 15%, luego un 39% y finalmente un 47%.
Finalmente, los péptidos penetratina y pVEC (línea verde y línea magenta) a bajas
concentraciones de péptido tienen un aumento de PG bajo y relativamente constante
63
(17% penetratina y 10% pVEC). Al aumentar la concentración de péptido (1:20) se
observa un aumento en el valor de PG en un 76% para penetratina y 42% para pVEC.
Este aumento en el parámetro que se observa en la gráfica 25A indica una disminución
en la hidratación alrededor de Laurdan o una disminución en la dinámica molecular del
agua. Por lo tanto, los péptidos pueden estar desplazando las moléculas de agua por la
interacción de estos con la superficie de la membrana (acumulación).
Al observar la figura 25B, no se observa un cambio significativo en la PG de Laurdan por
los péptidos R9, R6H4, pKCi y FGF (los cambios son inferiores al 10% del valor de PG
obtenido en el punto control), más bien se mantiene constante.
64
Figura 25: Polarización generalizada de Laurdan (1)
Cuando se aumenta la concentración de colesterol (Figura. 26A y 27A), PG aumenta al
aumentar la relación péptido: lípido, pero en menor proporción que en vesículas sin la
presencia de colesterol. El que aumenta en mayor proporción es nuevamente ARF (1-
22) primero en un 13%, luego un 23% y finalmente un 39% en vesículas con un 15%
de colesterol (figura 26A), pero en vesículas con un 20% de colesterol (figura 27A) el
aumento de PG es casi la mitad que el observado en vesículas con 15%CHO. Este mismo
efecto tienen los otros péptidos, pero en una mucho menor proporción.
Los péptidos en la gráfica 26B y 27B siguen sin aumentar la PG al interactuar con
vesículas con mayor porcentaje de colesterol (15% y 20%), esta vez su cambio en el
valor de PG no supera el 2%.
Efecto de los péptidos al interactuar con las vesículas de DMPC/DMPG. Gráfica A: TAT (negro), ARF (1-22) (rojo), melitina (azul), penetratina (verde), pVEC (magenta) y Bac7 (amarillo). Gráfica B: FGF (negro), pKCi (rojo), R6H4 (azul) y R9 (verde). Resultado promedio de cuadruplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
65
Figura 26: Polarización generalizada de Laurdan (2)
Efecto de los péptidos al interactuar con las vesículas de DMPC/DMPG/CHO15%. Gráfica A: TAT (negro), ARF (1-22) (rojo), melitina (azul), penetratina (verde), pVEC (magenta) y Bac7 (amarillo). Gráfica B: FGF (negro), pKCi (rojo), R6H4 (azul) y R9 (verde). Resultado promedio de cuadruplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
66
Figura 27: Polarización generalizada de Laurdan (3)
Efecto de los péptidos al interactuar con las vesículas de DMPC/DMPG/CHO20%. Gráfica A: TAT (negro), ARF (1-22) (rojo), melitina (azul), penetratina (verde), pVEC (magenta) y Bac7 (amarillo). Gráfica B: FGF (negro), pKCi (rojo), R6H4 (azul) y R9 (verde). Resultado promedio de cuadruplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
67
Finalmente, los péptidos estudiados al estar en presencia de DMPC/DMPG/CHO 33,3%
(Figura 28) no se observa variación significativa en el valor de PG. En la figura 28A la
variación de la PG no supera el 6% y en la figura 28B no supera el 2%.
Figura 28: Polarización generalizada de Laurdan (4)
Efecto de los péptidos al interactuar con las vesículas de DMPC/DMPG/CHO33,3%. Gráfica A: TAT (negro), ARF (1-22) (rojo), melitina (azul), penetratina (verde), pVEC (magenta) y Bac7 (amarillo). Gráfica B: FGF (negro), pKCi (rojo), R6H4 (azul) y R9 (verde). Resultado promedio de cuadruplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
68
Los péptidos que presentan un mayor aumento de PG son ARF (1-22) y melitina. Al
aumentar el porcentaje de colesterol en las vesículas es menor el aumento de la PG de
Laurdan en presencia de estos péptidos (efecto que también presenta la mayoría de los
péptidos). En relación a la concentración de péptido se observa que al aumentar, se
produce un aumento de PG en casi un 100% y cuando la concentración de péptido es la
más alta, el aumento es de casi el doble. El efecto se mantiene al aumentar la
concentración de colesterol. Estos péptidos que presentan un mayor aumento en PG nos
indica que producen una disminución en la hidratación alrededor de Laurdan o
disminución en la relajación de solvente. Esto se explica por el desplazamiento de las
moléculas de agua producido por la unión péptido-membrana cercano al motivo
naftaleno de Laurdan.
69
5.3. 2. Anisotropía de DPH Para la medición de anisotropía se utilizará la sonda fluorescente DPH la cual se
distribuye en todo el núcleo hidrofóbico de la bicapa lipídica. Para obtener los valores de
anisotropía se utilizaron dos polarizadores que seleccionan la luz en paralelo y en
perpendicular tanto en excitación (luz polarizada que llega a la muestra) como en la
emisión. Cuando el movimiento de DPH es limitado (membrana más compacta) su
anisotropía es mayor, pero cuando aumenta su movimiento (desestabilización de la
membrana) el valor de anisotropía disminuye. Los valores de anisotropía de DPH en
vesículas se mueven en el rango 0,05 a 0,35 (Stott et al., 2008; Cheng et al., 2011;
Soto et al., 2013). Los resultados se pueden observar en las figuras 29 y 30.
En la figura 29 se puede observar que la mayoría de los péptidos no producen cambios
en la anisotropía de DPH manteniéndose constante al aumentar la concentración de
péptido y/o al aumentar la concentración de colesterol en las vesículas (con algunas
excepciones). Esto ocurre con los péptidos catiónicos R6H4, R9, TAT (exceptuando en
vesículas con 33,3% de colesterol a una relación péptido: lípido 1:40 donde se observa
un aumento de un 16% de la anisotropía lo que indica una disminución en la libertad de
movimiento de DPH), el péptido anfipático Bac7 (excepto en vesículas sin colesterol
donde se ve un aumento de anisotropía correspondiente a un 26% a baja relación
péptido: lípido 1:80), el péptido hidrofóbico FGF y el control negativo pKCi.
El que no se observen grandes cambios en la anisotropía de DPH puede indicar que la
penetración de estos péptidos es rápida y/o no producen una perturbación permanente
en la membrana evidenciada por la anisotropía de DPH.
70
71
Figura 29: Anisotropia de DPH (1)
Efecto de los péptidos TAT (negro), FGF (rojo), pKCi (azul), R6H4 (verde), R9 (magenta) y Bac7 (amarillo). Las 4 gráficas corresponden a las 4 mezclas de lípidos utilizadas A: DMPC/DMPG 1:1, B: DMPC/DMPG/CHO 15%, C: DMPC/DMPG/CHO 20% y D: DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Resultado promedio de cuadruplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
72
Por otro lado, hay péptidos que sí afectaron la anisotropía de DPH (ARF1-22, meltina,
penetratina y pVEC) produciendo un aumento en su valor al aumentar la concentración
de péptido (figura 30). Este incremento en la anisotropía, nos indica una limitación en
el movimiento de DPH, quizá por una penetración de estos péptidos en la membrana y
la permanencia de estos en dicha zona.
El péptido anfipático ARF (1-22) es el que mostró un mayor aumento en la anisotropía
de DPH al aumentar la relación péptido: lípido (aumentó inicialmente un 9%, luego un
18% y finalmente un 27% comparado con el valor control). Este comportamiento se
mantuvo en vesículas con un 15% y 20% de colesterol, pero sólo a concentraciones
altas se observa un aumento significativo (18% de aumento en vesículas 15%CHO y
13% en vesículas 20%CHO). En vesículas cuyo contenido de colesterol es del 33,3% no
se observó cambios significativos (los cambios no superan el 5% de variación).
El péptido catiónico penetratina también aumentó la anisotropía de DPH al aumentar la
concentración presente en vesículas sin colesterol (aumentó inicialmente un 9%, luego
un 18% y finalmente un 29% comparado con el valor control), pero en vesículas con la
presencia de colesterol su aumento no fue significativo (los cambios no superaron el
10% de variación).
El control positivo melitina, también evidencia un aumento en la anisotropía de DPH en
vesículas sin colesterol, pero sólo son significativos a concentraciones altas (relación
péptido: lípido 1:40 aumentó un 13% y en la relación 1:20 aumentó un 28%) y en
vesículas con un 15% de CHO sólo se observa un aumento de un 18% cuando la
concentración de péptido es la más alta (relación 1:20). En vesículas con contenido de
colesterol de un 20% y un 33,3% no se observan variaciones.
Finalmente, el último péptido que presenta modificaciones en la anisotropía de DPH es
el péptido anfipático pVEC el cual en vesículas sin colesterol se ve un aumento sólo a
una relación péptido: lípido 1:20 (aumento de un 15% del valor control). En todos los
modelos de membrana con colesterol el cambio en la anisotropía de DPH no es
significativa (no supera en 7% de variación).
73
74
Figura 30: Anisotropia de DPH (2)
Efecto de los péptidos ARF (1-22) (negro), melitina (rojo), penetratina (azul) y pVEC (verde). Las 4 gráficas corresponden a las 4 mezclas de lípidos utilizadas A: DMPC/DMPG 1:1, B: DMPC/DMPG/CHO 15%, C: DMPC/DMPG/CHO 20% y D: DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Resultado promedio de cuadruplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
75
Los péptidos que presentan un mayor cambio en anisotropía de DPH son ARF(1-22),
melitina, penetratina y pVEC (excepcionalmente Bac7 presenta un aumento en vesículas
sin colesterol a una relación péptido:lípido 1:80). Al aumentar el porcentaje de colesterol
en un 15% menor es el aumento de la anisotropía de DPH producida por estos péptidos
(pVEC ya no presenta cambios en este parámetro). En vesículas con un 20% de CHO
sólo es afectada la anisotropía de DPH por ARF(1-22) y pVEC. Finalmente en vesículas
con un 33,3% de colesterol no se presenta variación en la anisotropía de DPH (excepto
TAT a una relación péptido:lípido 1:40). Cabe destacar que en todos los casos donde se
observa una variación en el parámetro medido, el aumento es prácticamente el mismo
al aumentar la concentración de péptido presente (aumento directamente proporcional
con la concentración de péptido).
Este resultado es esperable debido a que melitina forma un poro en la membrana, por
lo que se DPH debería tener un movimiento más restringido (aumento de anisotropía) y
todos los péptidos que forman poro debiesen presentan algún cambio en este parámetro
o en el tiempo de vida de esta sonda fluorescente.
76
5.3.3. Tiempos de vida de Laurdan y DPH
El tiempo de vida de la fluorescencia es una medida del tiempo en que un fluoróforo
pasa en el estado excitado antes de regresar al estado fundamental al emitir un fotón;
es característico de cada sonda y sensible al cambio de entorno.
5.3.3.1. DPH Las mediciones de tiempo de vida de DPH nos indicarán el entorno de este en la
membrana, esto quiere decir que un aumento en la hidratación se reflejará en una
disminución en el tiempo de vida. El rango experimental del tiempo de vida de DPH va
desde 6,5 ns a 11 ns (Aguilar L. et al., 2012).
En primer lugar, analizaremos lo que ocurre en vesículas sin colesterol (figura 31A). El
péptido TAT (línea negra), el cual disminuye el tiempo de vida en un 6% a una relación
péptido: lípido 1:40 y luego un 10% a la mayor concentración de péptido (relación 1:20).
Luego penetratina (línea roja) y R6H4 (línea azul) disminuyen el tiempo de vida sólo a
una concentración 1:20 péptido: lípido en un 5% y 7% respectivamente. Finalmente, el
péptido R9 (línea verde) no evidencia una modificación en el tiempo de vida superior al
5%. Al aumentar la concentración de colesterol en un 15% (figura 31B) sólo se ve
afectado el tiempo de vida de DPH por penetratina a una alta concentración (relación
1:20) produciendo una disminución de este parámetro en un 7%. En vesículas con un
20% de colesterol (figura 31C) los cuatro péptidos disminuyen el tiempo de vida a la
mayor concentración de péptido en un 6% (excepto penetratina que disminuye el
parámetro en un 10%). Finalmente, los péptidos en presencia de vesículas con un
porcentaje de colesterol de un 33,3% (figura 31D) no producen ningún efecto en el
tiempo de vida de DPH (excepto penetratina a la concentración más alta que disminuye
el tiempo de vida en un 7%).
La disminución del tiempo de vida observada en algunos péptidos a ciertas
concentraciones nos indica un aumento de la hidratación alrededor de DPH debido
presumiblemente al ingreso de estos péptidos en la vesícula.
77
78
Figura 31: Tiempo e vida de DPH (1)
Efecto de los péptidos TAT (negro), penetratina (rojo), R6H4 (azul), y R9 (verde). Las 4 gráficas corresponden a las 4 mezclas de lípidos utilizadas A: DMPC/DMPG 1:1, B: DMPC/DMPG/CHO 15%, C: DMPC/DMPG/CHO 20% y D: DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
79
En la figura 32 se aprecian las gráficas del tiempo de vida de DPH de los péptidos ARF
(1-22), FGF, pKCi, Melitina, pVEC y Bac7 en los distintos modelos de membrana. Los
péptidos FGF y pKCi no evidenciaron cambios en el tiempo de vida de DPH en ningún
modelo de membrana.
Los péptidos ARF (1-22) (línea negra) y pVEC (línea magenta) a bajas concentraciones
(relación péptido: lípido 1:80) y en presencia de vesículas sin colesterol (figura 32A)
presentan un aumento del tiempo de vida de un 6%, en cambio los péptidos Bac7 y
Melitina presentan una disminución del tiempo de vida (aumento en la hidratación
alrededor de DPH) en un 5% (relación péptido :lípido 1:40) y 11% (relación péptido:
lípido 1:20) respectivamente. Al aumentar la concentración de colesterol en las vesículas
(15%) los péptidos no produjeron cambios en el tiempo de vida de DPH. En vesículas
con un 20% de colesterol y 33,3% de colesterol, sólo ARF (1-22) produjo una
disminución en el tiempo de vida a altas concentraciones de péptido siendo de 7% en
vesículas 20%CHO y 10% en vesículas 33,3%CHO.
80
81
Figura 32: Tiempo de vida de DPH (2)
Efecto de los péptidos ARF (1-22) (negro), FGF (rojo), pKCi (azul), melitina (verde), pVEC (magenta) y Bac7 (amarillo). Las 4 gráficas corresponden a las 4 mezclas de lípidos utilizadas A: DMPC/DMPG 1:1, B: DMPC/DMPG/CHO 15%, C: DMPC/DMPG/CHO 20% y D: DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
En la medición de tiempo de vida de DPH, los péptidos que presentan un mayor efecto en vesículas
sin colesterol son TAT, penetratina y R6H4 (como excepción melitina aumenta el tiempo de vida de
DPH a una relación péptido:lípido 1:40 y los péptidos ARF1-22 y pVEC aumentan el tiempo de vida
de DPH a una relación péptido:lípido 1:80). En vesículas con un 15% de CHO el único péptido que
produce una disminución del tiempo de vida es penetratina pero a la máxima concentración de
péptido. Al aumentar el colesterol a un 20% en los modelos de membrana, hay una disminución del
tiempo de vida sólo a la mayor concentración de péptido ARF(1-22), penentratina, TAT, R9 y R6H4.
Finalmente en vesículas con un 33,3% de colesterol, sólo los péptidos ARF(1-22) y penetratina
presentan una disminución del tiempo de vida de DPH (relación péptido;lípido 1:20). En estos
resultados la concentración de péptido es crucial para observar un cambio en el parámetro medido,
siendo la relación 1:20 la que muestra una variación mayor.
82
5.3.3.2. Laurdan Debido a los 2 fenómenos que ocurren asociados a Laurdan como lo es la relajación de
solvente y la hidratación es que para resolver este problema instrumental se realizó la
medida de ambos tiempos de vida separándolos a través del uso de filtros.
Se midió el tiempo de vida a 440 nm (canal azul) donde se observa la influencia de las
moléculas de agua. Cuando ocurre un incremento en el contenido de agua, esto causa
un apagamiento del tiempo de vida de Laurdan, moviendo el fasor a valores más cortos
de tiempo de vida (corrimiento a la derecha de la gráfica). La segunda medida se realizó
a 490 nm (canal rojo) que representa la relajación dipolar, lo que se traduce en un
corrimiento de la distribución de fasores fuera del círculo universal cuando este
parámetro aumenta.
En la figura 33 se muestra un ejemplo de las gráficas de fasores obtenidas representando
al péptido ARF 1-22 con las vesículas de DMPC/DMPG a diferentes concentraciones. Cada
punto en la gráfica representa los tiempos de vida a distintas frecuencias. Los análisis
se realizaron a una frecuencia constante para que los datos pudiesen ser comparados
(se eligió la frecuencia 55,39 Mhz donde se observan los puntos más resueltos).
83
Las gráficas de fasores a continuación representan los tiempos de vida de Laurdan
obtenidos para los canales azul y rojo a una frecuencia de 55,39 MHz con un aumento
para que se puedan distinguir mejor los resultados. El color negro representa la
interacción de los péptidos con las vesículas de DMPC/DMPG, el color rojo la interacción
con DMPC/DMPG/CHO 15%, el color verde el efecto con DMPC/DMPG/CHO 20% y el
color azul con DMPC/DMPG/CHO 20%.
En la figura 34A se observa el péptido ARF 1-22 en el canal azul. El péptido en la
presencia de las vesículas con 0% de CHO (figuras color negro) al aumentar su
concentración se ve un corrimiento de los puntos hacia la izquierda del gráfico, esto nos
indica que el tiempo de vida aumenta indicando una menor cantidad de agua alrededor
de Laurdan. Al aumentar la concentración de colesterol en las vesículas, se ve un
corrimiento de los puntos al aumentar la concentración de péptido pero en menor
proporción que en vesículas sin colesterol. Observando los zoom, vemos que en vesículas
con 15% de CHO hay un aumento del tiempo de vida, pero a concentraciones altas de
péptidos (relación péptido: lípido 1:40 y 1:20). En vesículas con un 20% de CHO se
observa primero una disminución del tiempo de vida a baja concentración de péptido,
Figura 33: Gráficas de fasores de tiempos de vida de Laurdan del péptido ARF 1-22
Gráficas de fasores de tiempos de vida de Laurdan del péptido ARF 1-22 en vesículas de DMPC/DMPG a diferentes concentraciones (negro sin péptido, rojo relación 1:80 péptido-lípido, azul relación 1:40 péptido-lípido y verde relación 1:20 relación péptido-lípido). La figura A corresponden a los tiempos de vida medidos con el canal azul (440 nm) y la figura B tiempos de vida medidos con el canal rojo (490 nm). Cada punto representa una frecuencia distinta.
84
luego se mantiene constante (en relación al control) y finalmente se observa un aumento
del tiempo de vida. Por último en vesículas con un 33,3% de CHO se observa un aumento
del tiempo de vida a una relación péptido: lípido 1:80 y luego a concentraciones más
altas se ve un aumento del tiempo de vida con respecto al control, pero menor que en
la relación 1:80.
Por otro lado, en el canal rojo (gráfica 34B), se observa que al aumentar la
concentración de péptido en las vesículas los puntos se mueven hacia el círculo universal,
indicando una disminución de la relajación dipolar (esto ocurre con todos los modelos de
membrana estudiados).
85
Figura 34: Gráficas de fasores péptido ARF (1-22)
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
Melitina en el canal azul (figura 35A) al interactuar con las vesículas a 0% y 15% de
colesterol aumentan los tiempos de vida al aumentar la concentración de péptido; en
una relación péptido: lípido 1:80 su aumento es leve, al aumentar la concentración de
péptido (relación 1:40) es mayor el incremento en el tiempo de vida y finalmente a la
máxima concentración de péptido hay aumento de tiempo de vida, pero menor. En
vesículas con 20% de CHO ocurre una disminución en el tiempo de vida y a la más alta
concentración de péptido la disminución del tiempo de vida es menor (comparada con el
control). Cuando el péptido interactúa con vesículas con 33,3% de CHO hay un
desplazamiento de los puntos a la derecha indicando una pequeña disminución del
tiempo de vida.
El péptido melitina (figura 35B) al igual que ARF 1-22, al aumentar la concentración
disminuye la relajación dipolar, efecto que ocurre con todos los modelos de membrana.
86
Figura 35: Gráficas de fasores péptido melitina.
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de
DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de
DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los
círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La
gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
87
En la gráfica 36A se observa el canal azul para Bac7, la polaridad se ve mayormente
afectada cuando el péptido aumenta la concentración en vesículas sin colesterol
aumentando el tiempo de vida. En vesículas con colesterol el efecto es menor, pero al
observar los zoom podemos evidenciar ciertos cambios. En vesículas con un 15% de
CHO aumenta el tiempo de vida al aumentar la concentración de péptido, pero a la más
alta concentración de Bac7 (relación 1:20) se observa una disminución del tiempo de
vida. Bac7 al estar en presencia de vesículas con un 20% de CHO disminuye el tiempo
de vida de Laurdan en la relación péptido: lípido 1:80 y 1:20, pero cuando la relación es
1:40 ocurre un aumento en el tiempo de vida. Por último, en vesículas cuyo porcentaje
de colesterol es 33,3%, se ve una disminución del tiempo de vida en presencia del
péptido.
En el canal rojo (Figura 36B), Bac7 al aumentar la concentración de este con los
diferentes modelos de membrana se observa una leve disminución de la relajación
dipolar.
88
Los resultados de polaridad de Laurdan afectada por el péptido pVEC (figura 37A) no se
logran distinguir con claridad sin el zoom (por lo tanto las diferencias de los tiempos de
vida no son tan grandes). En vesículas sin colesterol se observa una disminución del
tiempo de vida de Laurdan al aumentar la concentración de péptido (aumento de la
hidratación). Al observar las vesículas con 15% de CHO y 20% de CHO se ve el mismo
efecto, disminuye el tiempo de vida al aumentar la concentración de péptido, pero a una
relación péptido: lípido 1:20 aumenta el tiempo de vida (corrimiento hacia la derecha de
la gráfica de fasores). Finalmente, en vesículas con un 33,3% de CHO se observa un
aumento del tiempo de vida a baja concentración de péptido (relación 1:80), pero al
aumentar la concentración los puntos se mueven a la derecha de la gráfica (disminuye
el tiempo de vida).
El péptido pVEC en el canal rojo (Figura 37B), se ve que no afecta la relajación dipolar
debido a que los puntos más que ingresar al círculo universal lo rodean.
Figura 36: Gráficas de fasores péptido Bac7
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
89
Figura 37: Gráficas de fasores péptido pVEC.
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
90
El péptido control pKCi (Figura 38A) no afecta la polaridad de Laurdan mayormente en
vesículas, sin embrago al analizar los zoom se pueden observar variaciones en los
tiempos de vida. En vesículas con 0% y 15% de colesterol se observa un aumento en el
tiempo de vida de Laurdan al aumentar la concentración de péptido (excepto en vesículas
15%CHO a una relación péptido: lípido 1:80 donde se ve una leve disminución del tiempo
de vida de Laurdan). En vesículas con un 20% y 33,3% de colesterol se ve una
disminución del tiempo de vida de Laurdan que se refleja en un corrimiento de los puntos
hacia la derecha del gráfico, esto sólo ocurre a la más alta concentración de péptido
(también se ve este efecto en vesículas con un 33,3%CHO en una relación péptido: lípido
1:40).
La relajación dipolar no se ve afectada por este péptido (Figura 38B).
91
En el gráfico 39A vemos el efecto del péptido R6H4 en el canal azul, donde prácticamente
no se observa efecto en vesículas, pero al observar el zoom se pueden apreciar cambios
en los puntos. En vesículas sin colesterol, con 20%CHO y 33,3%CHO observamos un
corrimiento de los puntos a la derecha de la gráfica los que nos indicaría una disminución
del tiempo de vida producto de un aumento de la hidratación de agua alrededor de
Laurdan (excepto en vesículas con 33,3%CHO a una relación péptido: lípido 1:40 donde
se ve un aumento del tiempo de vida de Laurdan). En cambio, en vesículas con un
15%CHO vemos un aumento del tiempo de vida de Laurdan a altas concentraciones de
péptido (relación 1:40 y 1:20).
En el canal rojo (gráfica 39B) no se observan cambios en la relajación de solvente de
Laurdan en vesículas sin colesterol y con 15%CHO, pero en vesículas con 20% de
colesterol (observando el zoom) se ve una disminución en la relajación dipolar, mientras
que en vesículas cuyo contenido de colesterol es de 33,3% se observa que los puntos se
mueven fuera del círculo universal al aumentar la concentración de péptido, indicando
un aumento en la relajación dipolar.
Figura 38: gráfica de fasores péptido pKCi
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
92
Figura 39: Gráficas de fasores péptido R6H4
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de
DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de
DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los
círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La
gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
93
Los resultados del péptido R9 se pueden observar en la figura 40. En el canal azul (Figura
40A) no es posible observar variaciones, pero al observar el zoom si es posible. En
vesículas sin colesterol, 20%CHO y 33,3%CHO se observa una disminución del tiempo
de vida de Laurdan (corrimiento puntos hacia la derecha del gráfico), es decir, un
aumento de la hidratación alrededor de la molécula de Laurdan (excepto en vesículas
sin colesterol a una relación péptido: lípido 1:20 y en vesícula con 15% de colesterol a
una relación 1:40 donde no se observa cambio en el tiempo de vida de Laurdan). En
vesículas con un 20% de CHO se ve un aumento del tiempo de vida de Laurdan, pero
sólo a una relación péptido: lípido 1:40.
Al observar el canal rojo (Figura 40B) tampoco se ven grandes variaciones excepto en
vesículas con 20% de contenido de colesterol donde se ve un movimiento fuera del
circulo universal lo que informa un aumento en la relajación de solvente y a 33,3% de
colesterol donde se ve una disminución en la relajación dipolar al aumentar la
concentración de péptido.
94
Figura 40: Gráficas de fasores péptido R9
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
En la gráfica 41A se observa el canal azul para TAT donde prácticamente no hay variación
significativa en los tiempos de vida de Laurdan, al realizar un zoom es posible ver
variaciones, excepto en vesículas sin colesterol donde efectivamente no se observa
variación. En vesículas con colesterol (15%, 20% y 33,3%) hay una disminución en el
tiempo de vida de Laurdan debido a un aumento en la hidratación al aumentar la
concentración de péptido.
Al observar el canal rojo (Figura 41B) no se evidencian cambios en la relajación de
solvente.
95
Figura 41: Gráficas de fasores péptido TAT
Gráficas de fasores péptido TAT. Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos
rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas
de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido,
los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La
gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
96
El péptido penetratina en el canal azul (Figura 42A) muestra un efecto diferencial en las
diferentes vesículas con distinto contenido de colesterol. En vesículas sin colesterol y con
un 15% de colesterol se ve un aumento en el tiempo de vida al aumentar la relación
péptido: lípido. Este efecto cambia a 20%CHO y 33,3%CHO donde el tiempo de vida
disminuye al aumentar la concentración de péptido.
En el canal rojo (Figura 42B) se ve en todos los modelos de membrana propuestos un
acercamiento hacia el círculo universal al aumentar la concentración de péptido, esto
significa una disminución de la relajación dipolar.
97
Figura 42: Gráficas de fasores péptido penetratina
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
Finalmente, el péptido FGF (hidrofóbico) se puede observar en la figura 43, donde el
canal azul (Figura 43A) en vesículas sin colesterol, 20% de colesterol y 33,3% hay un
aumento en el tiempo de vida (aumento del tiempo de vida mayor en vesículas sin
colesterol y 20% colesterol a una relación péptido: lípido 1:40). El efecto contrario ocurre
al aumentar la concentración de péptido en vesículas con un 15% de colesterol donde el
tiempo de vida disminuye.
Al observar el canal rojo (Figura 43B) se observa que prácticamente este péptido no
afecta la relajación dipolar de Laurdan.
98
Figura 43: Gráficas de fasores péptido FGF
Tiempos de vida de Laurdan a 55,39 MHz. Puntos negros: vesículas DMPC/DMPG, puntos rojos: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 15%, puntos verdes: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 20% y puntos azules: vesículas de DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las figuras cuadradas representan el tiempo de vida de Laurdan en las vesículas sin péptido, los círculos en una relación péptido-lípido 1:80, los triángulos en una relación 1:40 y los rombos en una relación 1:20. La gráfica A representa el canal azul y la gráfica B el canal rojo. Cada experimento tiene el zoom respectivo de ser necesario.
99
Si observamos el canal rojo y el canal azul, los péptido que presentaron un mayor efecto
en los distintos modelos de membrana (no fue necesario mirar el zoom para evidenciar
el efecto) fueron ARF (1-22), melitina y penetratina. Estos péptidos a su vez presentan
la mayor diferencia al aumentar la concentración de estos en las vesículas.
100
5.3.4. Porcentaje de inserción
Este experimento nos permitió medir el porcentaje de péptido marcado con rodamina
que ingresaba a las vesículas, el que quedaba fuera de las vesículas y el que quedaba
en las vesículas de DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y
DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Se utilizaron sólo dos relaciones péptido: lípido
correspondiente a las más altas debido que a bajas concentraciones (relación 1:80)
prácticamente no se evidenciaban grandes cambios.
El primer péptido a analizar es R6H4 (Figura 44). El porcentaje de péptido que ingresa
a la vesícula sin colesterol es cercano al 65% a una relación péptido: lípido 1:40, pero
cuando la concentración de péptido es mayor, el ingreso es cercano al 50%. Al aumentar
la concentración de colesterol en las vesículas disminuye su ingreso siendo cercano al
25% en ambas concentraciones de péptido. Analizando el porcentaje de péptido que no
ingresa es bastante parecido en ambas relaciones péptido: lípido fluctuando entre el 15
y 20% para todos los modelos de membrana estudiados. La cantidad de péptido que se
queda en la membrana es cercana a un 40% para la concentración más alta de péptido
y para la relación 1:40 corresponde a un 20% la cual se mantiene similar al aumentar
la concentración de colesterol en vesículas, pero cuando las vesículas contienen un 20%
de colesterol, aumenta aún más el porcentaje que se queda en membrana. Estos
resultados sugieren que el ingreso de este péptido a las vesículas está determinado por
la concentración de péptido (mayor concentración, menos ingreso) y a su vez un
aumento en la concentración de colesterol en las vesículas influye en el ingreso del
péptido a éstas, ocurriendo una mayor retención del péptido en la membrana al
aumentar la concentración de colesterol.
101
El segundo péptido catiónico a analizar es penetratina (gráfico 45). Al igual que el
péptido R6H4, la cantidad de péptido que no ingresa a las vesículas no está determinada
ni por la concentración de péptido ni por la cantidad de colesterol en las vesículas, este
parámetro permanece relativamente constante cercano al 5%. La distribución del
péptido entre la membrana y el interior de la vesícula está determinada por dos factores;
la primera es la concentración de péptido, en vesículas sin colesterol a menor
concentración de péptido (1:40) menor es el porcentaje que ingresa (cercano al 15%) y
mayor es el porcentaje que queda en membrana (cercano al 80%). El segundo factor es
la concentración de colesterol, ya que en vesículas con un 15% de colesterol, el
porcentaje de péptido que queda en membrana disminuye cerca del 30% para una
relación péptido: lípido 1:40, aumentando el porcentaje de péptido que ingresa a la
vesícula (65%), pero a una mayor concentración de péptido el porcentaje de éste que
queda en membrana es mayor (50%), ingresando una menor cantidad a las vesículas
(45%). Cuando aumenta la concentración de colesterol a un 20% disminuye el
porcentaje que ingresa a vesículas y aumenta lo que queda en membrana para
concentraciones bajas de péptido, pero ocurre el efecto contrario para relación alta de
Figura 44: Gráficas del porcentaje de péptido R6H4 en los diferentes modelos de membrana
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%.). Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
102
péptidos. Finalmente, en vesículas con 33,3% de colesterol el porcentaje de péptido que
ingresa es muy alto (90%) quedando muy poco en membrana, esto ocurre en una
relación péptido: lípido 1:40. A altas concentraciones de péptidos, el porcentaje de
péptido que queda retenido en membranas altas en colesterol es mayor ingresando un
porcentaje bajo.
Los resultados del péptido anfipático ARF (1-22) se pueden observar en la figura 46. En
vesículas sin colesterol, se observa una diferencia entre la distribución del péptido a
diferentes concentraciones. Cuando la relación péptido: lípido es 1:40 el porcentaje de
éste que no ingresa y el que ingresa es cercano al 40% (el 20% restante queda en
membrana); en cambio cuando la relación péptido: lípido es 1:20, el porcentaje que
ingresa es mayor (47% aproximadamente) y el que no ingresa es menor (25% app)
quedando una mayor cantidad de péptido en membrana. En vesículas con 15% de
colesterol no se observa diferencias en la distribución dependiendo de la concentración
de péptido, ésta más bien es igual, siendo muy cercanos los porcentajes de péptidos que
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
Figura 45: Gráficas del porcentaje de péptido penetratina en los diferentes modelos de membrana
103
ingresan a la vesícula y los que no ingresan (cercano al 40%). Al aumentar la
concentración de colesterol en las vesículas (20%) la cantidad de péptido que ingresa a
las vesículas es menor (cercano al 25%) aumentando la cantidad que queda en
membrana y manteniendo casi constante la cantidad de péptido que no ingresa.
Finalmente, a 33,3% de colesterol, la distribución entre péptido que ingresa, que no
ingresa y que se mantiene en la membrana es prácticamente la misma.
Figura 46: Gráficas del porcentaje péptido ARF (1-22) en los diferentes modelos de membrana
Los modelos de membrana son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
El péptido hidrofóbico FGF se puede observar en la gráfica 47, donde claramente se ve
que en su mayoría el péptido no ingresa a las vesículas en todos los modelos estudiados
(entre un 60 y un 70%), el porcentaje que ingresa es más bien bajo (entre un 20 y un
30%) y lo que queda en membrana es menor. Se ve una leve diferencia en los
porcentajes a diferentes concentraciones de péptido, a mayor concentración mayor es
el porcentaje que no ingresa a las vesículas.
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
104
El control negativo PKCi (gráfico 48) nos arroja un resultado no esperado, este péptido
en artículo mencionados anteriormente no ingresa en las vesículas, pero en los modelos
trabajados en este proyecto, se observa que sí ingresan alcanzando un 50% en vesículas
sin colesterol (no se observan grandes diferencias a distintas concentraciones de
péptidos). En vesículas con 15% de colesterol baja el porcentaje de péptido que ingresa
a las vesículas (35 a 40%). En el caso de alta concentración de péptido hay una menor
cantidad de péptido en membrana y una mayor cantidad de péptido que no ingresan, en
cambio a una baja concentración de péptido la cantidad de éste que queda en membrana
y afuera de la vesícula es muy parecida (35%). En vesícula con un 20% de colesterol la
cantidad de péptido que no ingresa para ambas concentraciones de péptidos es la misma
(30%). En vesículas con un 33,3% de colesterol, prácticamente no se ve diferencia a las
diferentes concentraciones de péptidos utilizadas y la distribución en los 3
compartimentos es prácticamente la misma.
Figura 47: Gráficas del porcentaje de péptido FGF en los diferentes modelos de membrana
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
105
Los resultados del péptido catiónico R9 se pueden observar en la figura 49 donde el
porcentaje de péptido que no ingresa a las vesículas es bastante bajo (menor al 10%)
en la mayoría de los modelos estudiados (en vesículas con un 33,3% de colesterol es un
poquito más alto, cercano al 15%). La distribución se observa entre el péptido que
ingresa en la membrana y el que queda en membrana. En vesículas sin colesterol el
porcentaje que queda en membrana es cercano al 60% para la mayor concentración de
péptido y cercano al 40% para la menor concentración de péptido. A medida que los
modelos de membrana aumentan la concentración de colesterol también aumenta la
cantidad de péptido en membrana llegando hasta un 80% (siendo muy parecidos los
porcentajes para ambas concentraciones de péptido); por otro lado el porcentaje de
péptido que ingresa es de un 53% para la relación péptido: lípido 1:40 y de un 40%
aproximadamente para la relación 1:20, disminuyendo este porcentaje a medida que
aumenta el porcentaje de colesterol en las vesículas.
Figura 48: Gráficas del porcentaje de péptido PKCi en los diferentes modelos de membrana
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
106
En la gráfica 50 se pueden observar los resultados para el péptido pVEC. Nuevamente
la distribución del péptido se da entre la cantidad que ingresa y la que permanece en la
membrana, la concentración de péptido fuera de la vesícula es muy baja y no supera el
15% en todas las condiciones estudiadas. No se observa una diferencia muy significativa
entre las distintas concentraciones de péptidos. En vesículas sin colesterol la distribución
del péptido es menor en membrana (40%) que lo que ingresa a ésta (50%), al aumentar
la concentración de colesterol en los modelos de membrana aumenta el porcentaje del
péptido en membrana (cercano al 60%) y disminuye lo que ingresa (promedio de un
25%).
Los modelos de membrana son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
Figura 49: Gráficas del porcentaje de péptido pVEC en los diferentes modelos de membrana
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
107
Figura 50: Gráficas del porcentaje de péptido pVEC en los diferentes modelos de membrana
El péptido anfipático Bac7, cuyos resultados se muestran en la figura 51, muestra un
comportamiento de distribución del péptido distinto a los otros péptidos anfipáticos. En
vesículas sin colesterol no hay una diferencia importante entre diferentes
concentraciones de péptido, el porcentaje de péptido que ingresa a las vesículas es
cercano al 55% y fluctuando entre el 15% y el 25% se encuentran los porcentajes de
péptidos que quedan en la membrana y que no ingresan. Al aumentar la concentración
de colesterol en los modelos a un 15% y 20% la distribución es prácticamente la misma
en los 3 compartimentos. En vesículas con un 33,3% de colesterol es mayor el porcentaje
de péptido que no ingresa (cercano al 50% a concentraciones altas de péptido) y menor
el que ingresa (cercano al 10% a concentraciones altas de péptido).
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porc
enta
je (%
)
% de colesterol en vesiculas
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
108
En la figura 52 se observan los resultados para el péptido catiónico TAT. La cantidad de
péptido que no ingresa a los distintos modelos de membrana fluctúa entre el 5%, no
dependiendo de la cantidad de colesterol ni de la concentración de péptido presente. A
menor concentración de péptido mayor es la cantidad de éste que ingresa a membrana
y por ende menor la cantidad de péptido que queda retenido en la membrana. Al
aumentar la concentración de colesterol en las vesículas disminuye la cantidad de
péptido que se encuentra en el interior de las vesículas, aumentando la que queda en
membrana hasta cuando el modelo presenta un 33,3% de colesterol donde todas las
cantidades (péptido que ingresa y queda retenido en membrana) son prácticamente las
mismas (alrededor del 50%).
Figura 51: Gráficas del porcentaje de péptido Bac7 en los diferentes modelos de membrana
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
% Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
109
Figura 52: Gráficas del porcentaje de péptido TAT en los diferentes modelos de membrana
Finalmente, en el control positivo melitina (figura 53) no se observan grandes diferencias
a diferentes concentraciones de péptidos (mayor concentración de péptido, solo un poco
más queda en membrana y un poco menos queda en el exterior de la vesícula). Al
aumentar la concentración de colesterol en las vesículas la cantidad de péptido que
ingresa es levemente menor (10% menos aproximadamente para 33,3% de colesterol)
quedando una mayor cantidad de péptido retenido en la membrana.
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 % Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%. Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
110
Si observamos los resultados obtenidos para la relación péptido:lípido 1:40 en vesículas
sin colesterol, la mayoría tiene un porcentaje de ingreso mayor al 50%, siendo los que
presentan mayor valor TAT y R6H4. Los péptidos que menos ingresan en estas
condiciones son penetratina (cercano a un 10%) y FGF (aproximadamente un 30%). Al
aumentar el porcentaje de colesterol en las vesículas en un 15%, el porcentaje de
ingreso es menor, aun así hay péptidos que mantienen su ingreso sobre el 50% (ARF 1-
22, melitina, TAT y penetratina). Cuando el porcentaje de colesterol en los modelos de
membrana es de un 20% sólo 3 péptidos tienen un porcentaje de ingreso sobre el 50%,
estos son TAT, melitina y R6H4. Finalmente en vesículas con un 33,3% de colesterol
nuevamente 3 péptidos mantienen su porcentaje de ingreso sobre un 50% y estos son
penetratina, melitina y TAT. Al aumentar la relación lípido:péptido a 1:20 el porcentaje
de ingreso siempre es menor. Penetratina es el único péptido que presenta un
comportamiento extremo a diferentes concentraciones, a mayor concentración más
ingresa en vesículas sin colesterol, pero al aumentar el porcentaje de colesterol en los
modelos de membrana, menos es su ingreso, en cambio a una relación péptido:lípido
Los modelos son DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3%.). Las líneas negras corresponden al porcentaje que ingresa a las vesículas, las líneas rojas al porcentaje de péptido que queda en la membrana y las líneas azules al porcentaje de péptido marcado que ni ingresa a las vesículas. Los símbolos cuadrados corresponden a una relación péptido: lípido 1:40 y los símbolos circulares a una relación 1:20. Resultado promedio de triplicado, las barras corresponden a la desviación estándar.
Figura 53: Gráficas del porcentaje de péptido melitina en los diferentes modelos de membrana
0 % 15 % 20 % 33,3 %0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 % Ingresa % en membrana % no ingresa % Ingresa % en membrana % no ingresa
% de colesterol en vesiculas
Porc
enta
je (%
)
111
1:40 menor es su ingreso en vesículas sin colesterol y mayor en vesículas con un alto
porcentaje de colesterol.
En general, los resultados nos dan un indicio de lo que podría estar ocurriendo entre los
péptidos y los modelos de membrana. Es importante explicar que los resultados
obtenidos son luego de una incubación de 5 min entre los péptidos y las vesículas (este
tiempo es suficiente para que todos los péptidos estudiados penetren) por lo que los
datos dejan en evidencia los efectos de la interacción péptido-membrana luego de su
ingreso. Para poder entender mejor los resultados se irá analizando lo que quedó fuera
de la vesícula (% péptido que no ingresa a membrana), lo que ocurrió a nivel de las
cabezas polares de los fosfolípidos (PG Laurdan, tiempo de vida de Laurdan y dicroísmo
circular), los efectos en el núcleo hidrofóbico de la membrana (anisotropía de DPH,
tiempo de vida de DPH, % péptido que se queda en la membrana) y lo que ingresó (%
péptido que ingresa).
El péptido catiónico R6H4 queda en bajo porcentaje sin ingresar a las vesículas, no sé
observan grandes diferencias entre las 2 diferentes concentraciones de péptidos
estudiadas, pero se observa un leve aumento de este porcentaje al aumentar el
porcentaje de colesterol en vesículas (desde un 10% en vesículas sin colesterol hasta un
20% en vesículas con un 33,3%CHO).
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: Los resultados de PG no nos indican nada (no
hubo variación de este parámetro), pero los tiempos de vida de Laurdan (variaciones
sólo observables con zoom a los resultados) nos indica una disminución de este
parámetro al aumentar la concentración de péptido en vesículas sin colesterol, con 20%
de CHO y 33,3%CHO (excepto en este último modelo que se observa aumento del
tiempo de vida a una relación péptido: lípido 1:40). Esta disminución general del tiempo
de vida indica un aumento en la hidratación alrededor de Laurdan quizá por la
permanencia de los péptidos en la superficie formando enlaces con el agua la que a su
vez se acerca a Laurdan. En modelos con 15% de CHO el efecto es el contrario
disminuyendo la cantidad de agua presente posiblemente por una acumulación del
péptido en la superficie (desplazando el agua).
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía no varía en ningún modelo de membrana estudiado,
pero se observa a altas concentraciones de colesterol (relación 1:20 péptido: lípido) en
vesículas sin colesterol y con 20% de colesterol una disminución del tiempo de vida de
112
DPH indicando un aumento de agua en dicha zona. El porcentaje de péptido que queda
en membrana va aumentando a medida que aumenta el porcentaje de colesterol en las
vesículas (el porcentaje de péptido que queda en membrana no necesariamente se
encuentra en el núcleo hidrofóbico, también pudiese estar en la superficie de esta
interactuando fuertemente con los componentes de la membrana).
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa a las vesículas es menor al
ir aumentando la concentración de colesterol en la membrana y al aumentar la
concentración de péptido el porcentaje de ingreso también es menor. Esto nos indica
que tanto la concentración de péptido como el porcentaje de colesterol son
fundamentales para el ingreso de este CPPs en vesículas siendo óptimo la relación 1:40
péptido: lípido y las vesículas sin colesterol (figura 54).
Figura 54: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido R6H4
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana:
DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas
de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
113
El siguiente péptido catiónico es R9, cuyo porcentaje sin ingresar a los modelos de
membrana es prácticamente el mismo en todas las condiciones (cercana al 10%).
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: Los resultados de PG al igual que R6H4 no
presentan variaciones, pero los tiempos de vida al observarlos con zoom (efecto muy
pequeño) presentan una disminución en vesículas sin colesterol, 15%CHO y 33,3%CHO
indicando un aumento en la hidratación alrededor de Laurdan (en vesículas 33,3%CHO
también se observa una disminución en la relajación dipolar). En vesículas con un 20%
de colesterol se observa un aumento en el tiempo de vida de Laurdan (disminución en
la hidratación) y un aumento en la relajación dipolar.
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía de DPH no se modifica con la presencia del péptido y
sólo se ve afectado el tiempo de vida de esta sonda disminuyendo en vesículas con
20%CHO a una alta concentración de péptido (1:20), este efecto indica un aumento en
la hidratación alrededor de DPH. El porcentaje de péptido que queda en membrana va
aumentando a medida que aumenta el porcentaje de colesterol en las vesículas.
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa a las vesículas es menor al
ir aumentando la concentración de colesterol en la membrana y cuando la relación
péptido: lípido es 1:20 este porcentaje es levemente menor (10% menos en todos los
modelos de membrana). Observamos nuevamente que la concentración de péptido y el
porcentaje de colesterol en las vesículas es fundamental para la interacción (figura 55).
114
Figura 55: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido R9
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana:
DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas
de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
El péptido TAT presenta un % sin ingresar constante de un 5% aproximadamente en
todas las condiciones medidas.
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG muestra un aumento al aumentar la
concentración de péptido presente en vesículas sin colesterol, pero al aumentar el
colesterol presente a un 15% sólo se ve un aumento a la mayor relación péptido: lípido
(1:20). Los cambios en tiempo de vida sólo son observables con zoom y no es posible
apreciar en vesículas sin colesterol un claro efecto en la hidratación (se podría presumir
un aumento del tiempo de vida concordante con el aumento en la PG que se interpreta
como una disminución en la hidratación); en vesículas con colesterol se evidencia un
aumento en la hidratación (disminución del tiempo de vida). La relajación de solvente
no se ve afectada.
115
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía de DPH sólo aumenta en vesículas con un 33,3% de
CHO a una relación péptido: lípido 1:40 (disminución movimiento de DPH. El tiempo de
vida de DPH disminuye en vesículas sin colesterol y con 20% CHO, pero a altas
concentraciones (aumento hidratación alrededor de DPH). El porcentaje de péptido que
queda en membrana va aumentando a medida que aumenta el porcentaje de colesterol
en las vesículas (levemente menor a alta concentración de péptido).
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas es menor
cuando la concentración de colesterol en ellas va aumentando y levemente menor al
aumentar la concentración de péptido (figura 56).
Figura 56: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido TAT
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana: DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
116
El último péptido catiónico para analizar es penentratina cuyo porcentaje que no ingresa
es constante (10%).
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG aumenta al aumentar la concentración de
péptido presente en vesículas sin colesterol, pero al aumentar el colesterol presente a
un 15% sólo se ve un aumento a las mayores concentraciones (relación péptido: lípido
1:40 y 1:20) y luego al aumentar en colesterol a un 20% sólo se ve el aumento de PG
a la concentración más alta. El tiempo de vida de Laurdan se ve levemente aumentado
en vesículas sin colesterol y con un 15% (disminución en la hidratación) y el parámetro
se ve disminuido en vesículas con un 20% y 33,3% de colesterol. La relajación de
solvente se ve disminuida en todos los casos. Estos resultados nos indican que la
interacción de los péptidos con la membrana está influida por la concentración de
colesterol presente.
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía de DPH aumenta en vesículas sin colesterol al
aumentar la concentración de péptido presente y en vesículas con un 15% de CHO y
20% de CHO se observa el aumento, pero sólo a alta concentración de péptido (el
aumento se produce por una limitación en el movimiento de DPH). El tiempo de vida de
DPH disminuye en todos los modelos de membrana estudiados, pero solamente a alta
concentración de péptido. El porcentaje de péptido que queda en membrana va
aumentando a medida que aumenta el porcentaje de colesterol (excepto en vesículas
con un 20%CHO) cuando la relación péptido: lípido es 1:20, pero a una relación 1:40 el
efecto es el contrario al disminuir el porcentaje presente en membrana.
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas es menor
cuando la concentración de colesterol va aumentando en las vesículas en la relación
1:40, pero el efecto es totalmente opuesto a una relación péptido: lípido 1:20 (figura
57).
117
Figura 57: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido penetratina.
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana: DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
Siguiendo el análisis con los péptidos anfipáticos discutiremos el caso del péptido Bac7.
El porcentaje de péptido que ingresa va aumentando a medida que aumenta el
porcentaje de colesterol en las vesículas y es relativamente el mismo en las distintas
concentraciones de péptido estudiadas.
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG aumenta al aumentar la concentración de
péptido presente en vesículas sin colesterol, pero al aumentar el colesterol presente a
un 15% sólo se ve un aumento a alta concentración de péptido (1:20). El tiempo de vida
de Laurdan se ve levemente aumentado en vesículas sin colesterol y con un 15%
(disminución en la hidratación) pero al aumentar el colesterol en las vesículas (20% y
33,3%) el tiempo de vida de Laurdan disminuye (aumento de la hidratación). La
relajación de solvente no se ve afectada.
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía de DPH sólo aumenta en vesículas sin colesterol a una
relación péptido: lípido 1:80. El tiempo de vida de DPH no se ve afectado. El porcentaje
118
de péptido que queda en membrana aumenta en vesículas con colesterol (el porcentaje
es relativamente el mismo en vesículas con 15, 20 y 33,3% de colesterol).
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas es menor
cuando la concentración de colesterol aumenta en vesículas manteniéndose constante
(la concentración más alta de péptido presenta un menor ingreso) (figura 58).
Figura 58: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido Bac7
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana: DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
Lo que no ingresa, a los modelos de membrana estudiados, del péptido pVEC
corresponde aproximadamente a un 10%.
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG aumenta sólo a la más alta concentración
de péptido en vesículas sin colesterol y con un 15%. El tiempo de vida de laurdan
119
aumenta en todos los casos excepto a la más alta concentración de péptido en vesículas
con colesterol. La relajación de solvente no se ve afectada.
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía de DPH sólo aumenta en vesículas sin colesterol a una
relación péptido: lípido 1:20. El tiempo de vida de DPH sólo aumenta en vesículas sin
colesterol a una relación péptido: lípido 1:80.no se ve afectado. El porcentaje de péptido
que queda en membrana aumenta en vesículas con colesterol y se mantiene constante.
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas es menor
cuando hay colesterol en las membranas manteniéndose constante (figura 59).
Figura 59: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido pVEC.
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana: DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
120
El último péptido anfipático para discutir es ARF (1-22) cuyo porcentaje que no ingresa
a las vesículas es relativamente constante (40%).
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG aumenta al aumentar la concentración de
péptido presente en vesículas sin colesterol, con un 15% de colesterol y con un 20% de
colesterol (esta última sólo a concentraciones altas de péptidos. El tiempo de vida de
Laurdan se ve levemente aumentado en todos los modelos de membrana indicando una
disminución en la hidratación acompañado de una disminución de la relajación de
solvente.
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía de DPH aumenta en vesículas sin colesterol, con 15%
de CHO y 20% de CHO pero solamente a altas concentraciones de péptido (el aumento
se produce por una limitación en el movimiento de DPH). El tiempo de vida de DPH
disminuye en presencia de vesículas con altas concentraciones de colesterol (20% y
33,3%) a la relación más alta lípido: péptido (1:20). El porcentaje de péptido que queda
en membrana aumenta en vesículas con un 20 y 33,3% de colesterol manteniéndose
constante.
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas es menor
cuando la concentración de colesterol es 20 y 33,3% (figura 60).
121
Figura 60: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido ARF (1-22).
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana:
DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas
de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
El único péptido hidrofóbico es FGF cuyo porcentaje que no ingresa es aproximadamente
70% en todos los modelos de membrana.
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG no presenta ninguna variación. El tiempo
de vida de Laurdan se ve levemente aumentado en todos los modelos de membrana
excepto en vesículas con 15% de CHO donde el tiempo de vida disminuye. La relajación
de solvente no se ve afectada.
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía ni el tiempo de vida de DPH se ve afectado por este
péptido. El porcentaje de péptido que queda en membrana es de aproximadamente un
10% (constante)
122
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas es constante
(20%) en vesículas con una relación péptido: lípido 1:20 y también constante (30%) en
vesículas con una relación péptido: lípido 1:40 (figura 61).
Figura 61: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido FGF
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana:
DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas
de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
Por último, tenemos los controles utilizados, partiremos con el control positivo melitina
cuyo porcentaje que no ingresa a vesículas es constante (10%).
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG aumenta al aumentar la concentración de
péptido presente en vesículas sin colesterol y con un 15% de colesterol también
aumenta, pero a altas concentraciones de péptido. El tiempo de vida de Laurdan se ve
levemente aumentado en todos los modelos de membrana excepto vesículas con un
20% de colesterol donde se observa una disminución del tiempo de vida.
123
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía de DPH aumenta en vesículas sin colesterol y con
15% de CHO solamente a altas concentraciones de péptido (relación péptido: lípido 1:40
y 1:20). El tiempo de vida de DPH disminuye en vesículas sin colesterol y sólo a una alta
concentración de péptido. El porcentaje de péptido que queda en membrana aumenta
sólo en vesículas con un 33,3% de colesterol.
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas es menor
cuando la concentración de colesterol es 33,3% (figura 62).
Figura 62: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido Melitina.
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana: DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
El control negativo pKCi no ingresa en un porcentaje de 30% (excepto vesículas con
15% de CHO donde lo que no ingresa llega al 50% a una concentración alta de péptido).
A nivel de las cabezas de los fosfolípidos: PG no presenta ninguna variación. El tiempo
de vida de Laurdan se ve levemente aumentado en vesículas sin colesterol y con 15% y
124
en vesículas con 20% de CHO y 33,3%CHO se ve una disminución de este parámetro.
La relajación de solvente no se ve afectada.
Núcleo hidrofóbico: La anisotropía ni el tiempo de vida de DPH se ve afectado por este
péptido. El porcentaje de péptido que queda en membrana es de aproximadamente un
20% y va aumentando al aumentar el porcentaje de colesterol en los modelos de
membrana.
Interior de la vesícula: El porcentaje de péptido que ingresa en las vesículas aumenta al
aumentar el porcentaje de colesterol en las vesículas (figura 63).
Figura 63: Esquema representativo de los resultados obtenidos por efecto del péptido pKCi
La figura roja en membrana representa el colesterol y la figura verde los péptidos. Se muestran los 4 modelos de membrana: DMPC/DMPG, DMPC/DMPG/CHO 15%, DMPC/DMPG/CHO 20% y DMPC/DMPG/CHO 33,3% y las dos concentraciones más altas de péptido utilizado (efecto mayor a estas concentraciones).
125
6. Conclusiones
Los péptidos fueron sintetizados y caracterizados para ser utilizados en los experimentos
de manera exitosa, la mayoría presentó un aumento en su estructura secundaria al estar
en presencia de las vesículas evidenciando una interacción en la superficie de estas. Por
un lado, el péptido melitina utilizado como control positivo, mostró variaciones en los
parámetros estudiados. En cambio, el péptido pKCi utilizado como control negativo el
cual se esperaba no mostrara ningún cambio en los parámetros ni tampoco se
evidenciara un ingreso, tuvo algunas pequeñas variaciones en las metodologías
utilizadas mostrando un porcentaje de ingreso en nuestros modelos de membrana, por
lo tanto, este control negativo no fue lo esperado e ingresa a nuestras vesículas por un
mecanismo desconocido.
Como era de esperarse, al aumentar el porcentaje de colesterol en las vesículas, hubo
variaciones en los parámetros estudiados. La PG aumentó a medida que aumentó el
porcentaje de colesterol en los modelos de membrana, esto ocurre por una disminución
de la hidratación del agua alrededor del motivo naftaleno de Laurdan producido por el
colesterol. El colesterol también produce un ordenamiento en la membrana que se puede
evidenciar con la restricción del movimiento de DPH (aumento de la anisotropía) y
disminución en la hidratación alrededor de DPH (aumento del tiempo de vida). El último
efecto observado por la presencia de colesterol fue el corrimiento de los puntos en las
gráficas de fasores hacia la izquierda lo que significa un aumento en el tiempo de vida
de Laurdan (al ordenarse la membrana por la presencia de colesterol disminuye la
cantidad de agua presente en esta).
Los resultados de la interacción lípido-péptido nos mostró resultados diferenciales
dependiendo del péptido estudiado, la concentración de péptido presente y el porcentaje
de colesterol en las vesículas, existiendo muchas excepciones donde los resultados no
fueron proporcionales a la concentración, por lo tanto, existen ciertas concentraciones
mínimas para un ingreso óptimo de los péptidos y a concentraciones muy altas estos
péptidos sólo se acumulan siendo su ingreso incluso menor. El aumento de colesterol en
las vesículas produjo en la mayoría de los casos un ingreso menor a las vesículas, por lo
que los péptidos estudiados tienen un mecanismo de ingreso limitado por el porcentaje
de colesterol presente.
126
Los mecanismos de incorporación de los péptidos a las membranas no están del todo
dilucidados, pero basándonos en su comportamiento podemos agrupar algunos tratando
de proponer un mecanismo.
El péptido TAT como se explicó en la introducción tiene un mecanismo de incorporación
“como alfombra” y observando los resultados es esperable esta incorporación debido a
que es rápida y no deja grandes perturbaciones en la membrana. Los péptidos que se
comportaron de este modo fueron R6H4, R9 y penetratina, pero sólo esta última a una
relación péptido: lípido 1:40. El péptido FGF también tuvo el mismo comportamiento,
pero a un menor nivel al igual que el control negativo pKCi.
El otro péptido cuyo mecanismo es conocido es el péptido melitina, la cual tiende a
formar un poro. Este mecanismo deja como consecuencia una perturbación en el núcleo
hidrofóbico de la membrana. Los péptidos que más se acercaron a este comportamiento
fueron ARF (1-22) y penetratina a una alta concentración (relación 1:20).
Por último, los dos péptidos anfipáticos pVEC y Bac7 presentaron cierto comportamiento
similar a melitina, pero sólo en vesículas sin colesterol y al aumentar su concentración
su comportamiento fue más similar a TAT.
Algunas de nuestras metodologías fueron muy poco sensibles para evidenciar algún
cambio a nivel de membrana debido al rápido ingreso de los péptidos, por lo que en
futuros trabajos se hace necesaria la complementación con metodologías que se puedan
seguir en vivo como la utilización de microscopía de fluorescencia utilizando vesículas
unilamelares gigantes.
Finalmente, la hipótesis planteada fue contrastada y se han entregado antecedentes que
respaldan el rol del colesterol en el mecanismo de internación de péptidos penetrantes
de membrana.
127
7. Referencias
Abramov A., Ionov M., Pavlov E. y Duchen M. (2011). Membrane cholesterol content plays a key role in the neurotoxicity of b-amyloid: implications for Alzheimer’s disease. Aging Cell 10, 595–603.
Aguilar L., Pino J., Soto M., Cuevas F., Sánchez S. y Sotomayor C. (2012) Differential Dynamic and Structural Behavior of Lipid Cholesterol Domains in Model Membranes. PLoS ONE PLoS One 7(6):e40254.
Akdag I.O. y Ozkirimli E. (2013). The Uptake Mechanism of the Cell-Penetrating pVEC Peptide. Journal of Chemistry, Article ID 851915, 9 pages.
Alves I.D., Bechara Ch., Walrant A., Zaltsman Y., Jiao Ch.Y. y Sagan S. (2011). Relationships between Membrane Binding, Affinity and Cell Internalization Efficacy of a Cell-Penetrating Peptide: Penetratin as a Case Study. PLoS ONE 6(9), art. no. e24096.
Andrich M.P. y Vanderkooi J.M. (1976). Temperature dependence of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene fluorescence in phophoslipid artificial membranes. Biochemistry 15(6), 1257–1261.
Berezin M. y Achilefu S. (2010). Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chemical Reviews 110(5), 2641–2684.
Beychok S. (1966). Circular dichroism of biological macromolecules. Science 154, 1288– 1299.
Blazyk J., Wiegand R., Klein J., Hammer J., Epand R.M., Epand R.F., Maloy W.L., Kari U.P. (2001). A novel linear amphipathic beta-sheet cationic antimicrobial peptide with enhanced selectivity for bacterial lipids Journal of Biological Chemistry 276, 27899–27906.
Cao G., Pei W., Ge H., Liang Q., Luo Y., Sharp F.R., Lu A., Ran R., Graham S.H. y Chen J.(2002). In Vivo Delivery of a Bcl-xL Fusion Protein Containing the TAT Protein Transduction Domain Protects against Ischemic Brain Injury and Neuronal Apoptosis. The Journal of Neuroscience 22 (13), 5423–5431.
Caron N.J., Torrente Y., Camirand G., Bujold M., Chapdelaine P., Leriche K., Bresolin N. y Tremblay J.P. (2001) Intracellular Delivery of a Tat-eGFP Fusion Protein into Muscle Cells. Molecular Therapy 3(3), 310-318.
Chen Y. y Periasamy A. (2004). Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique 63(1), 72-80.
128
Cheng H. y London E. (2011). Preparation and Properties of Asymmetric Large Unilamellar Vesicles: Interleaflet Coupling in Asymmetric Vesicles Is Dependent on Temperature but Not Curvature. Biophysical Journal 100(11) 2671–2678.
Chong P., Zhu W. y Venegas B. (2009). On the lateral structure of model membranes containing cholesterol. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1788(1), 2-11.
Ciobanasu, C., Siebrasse, J. P. y Kubitscheck, U. (2010). Cell-Penetrating HIV1 TAT Peptides Can Generate Pores in Model Membranes. Biophysical Journal, 99(1), 153–162.
Culik R., Abaskharon R., Pazos I., y Gai F. (2014). Experimental Validation of the Role of Trifluoroethanol as a Nanocrowder. The journal of Physical Chemistry B 118, 11455−11461.
Dathe M., Schumann M., Wieprecht T., Winkler A., Beyermann M., Krause E., Matsuzaki K., Murase O. y Bienert M. (1996). Peptide helicity and membrane surface charge modulate the balance of electrostatic and hydrophobic interactions with lipid bilayers and biological membranes. Biochemistry 35, 12612–12622.
Derossi D., Joliot A.H., Chassaing G. y Prochiantz A. (1994). The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry 269, 10444-10450.
Deshayes S., Plenat T., Aldrian-Herrada G., Divita G., Le Grimellec C. y Heitz F. (2004). Primary amphipathic cell-penetrating peptides: structural requirements and interactions with model membranes. Biochemistry 43, 7698–7706. (a)
Deshayes S., Gerbal-Chaloin S., Morris M.C., Aldrian-Herrada G., Charnet P., Divita G. y Heitz F. (2004). On the mechanism of non-endosomial peptide-mediated cellular delivery of nucleic acids. Biochimica et Biophysica Acta 1667, 141–147. (b)
Deshayes S., Plenat T., Charnet P., Divita G., Molle G. y Heitz F. (2006). Formation of transmembrane ionic channels of primary amphipathic cell penetrating peptides. Consequences on the mechanism of cell penetration. Biochimica et Biophysica Acta 1758, 1846–1851.(a)
Deshayes S., Morris M.C., Divita G. y Heitz F. (2006). Interactions of amphipathic CPPs with model membranes. Biochimica et Biophysica Acta 1758, 328–335. (b)
Dietz GP y Bahr M. (2004). Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach. Molecular and Cellular Neuroscience 27, 85-131.
Dissanayake S., Denny W., Gamage S. y Sarojini V. (2017). Recent developments in anticancer drug delivery using cell penetrating and tumor targeting peptides. Journal of Controlled Release 250, 62–76.
129
Dubikovskaya EA, Thorne SH, Pillow TH, Contag CH, Wender PA. (2008). Overcoming multidrug resistance of small-molecule therapeutics through conjugation with releasable octaarginine transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 12128-33.
Dushinsky F. (1933). Der zeitliche intensitatsverlauf von intermittierend angeregter resonanztrahlung. Z Physik 81, 7-21.
Dunkin C.M., Pokorny A., Almeida P.F. y Lee H.S. (2011). Molecular Dynamics Studies of Transportan 10 (Tp10), Interacting with a POPC Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry B115(5), 1188–1198.
Eiríksdóttira E., Konateb K., Langela Ü., Divitab G. y Deshayes S. (2010). Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1798 (6); 1119–1128.
El-Andaloussi S., Johansson H.J., Holm T. y Langel U. (2007). A novel cell-penetrating peptide, M918, for efficient delivery of proteins and peptide nucleic acids. Molecular Therapy 15 (10), 1820–1826.
Elmquist A., Lindgren M., Bartfai T. y Langel U. (2001). Vecadherin-derived cell-penetrating peptide, pVEC with carrier functions. Experimental Cell Research, 269 (2), 237–244.
El-Sayed A., Futaki S. y Harashima H. (2009). Delivery of macromolecules using arginine-rich cell-penetrating peptides: ways to overcome endosomal entrapment. Journal of the American Association of Pharmaceutical Scientists 11, 13–22.
Eum W.S., Jang S.H., Kim D.W., Choi H.S., Choi S.H., Kim S.Y., An J.J., Lee S.H., Han K., Kang J.H., Kang T.C., Won M.H., Cho Y.J., Choi J.H., Kim T.Y., Park J.y Choi S.Y. (2005). Enhanced transduction of Cu,Zn-superoxide dismutase with HIV-1 Tat protein transduction domains at both termini. Molecular Cells 19(2), 191-197.
Ezzat K., El Andaloussi S., Abdo R. y Langel U. (2010). Peptide-based matrices as drug delivery vehicles. Current Pharmaceutical Design 16, 1167-78.
Frankel A.D. y Pabo C.O. (1988). Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55 (6), 1189-1193.
Futaki S., Suzuki T., Ohashi W., Yagami T., Tanaka S., Ueda K. y Sugiura Y. (2001). Arginine-rich peptides. An abundant source of membranepermeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. Journal of Biological Chemistry 276, 5836–5840.
Ghibaudi E., Boscolo B., Inserra G., Laurenti E., Traversa S., Barbero L. y Ferrari R.P. (2005). The interaction of the cell-penetrating peptide penetratin with heparin, heparansulfates and phospholipid vesicles investigated by ESR spectroscopy. Journal of Peptide Science 11, 401–409.
130
Goda T., Goto Y. y Ishihara K. (2010). Cell-penetrating macromolecules: Direct penetration of amphipathic phospholipid polymers across plasma membrane of living cells. Biomaterials 31 (8), 2380–2387.
Goldstein J. y Brown M. (2001). Molecular medicine. The cholesterol quartet. Science 292, 1310–1312.
Gräslund A. y Mäler L. (2011).Testing membrane interaction of CPPs. Methods in Molecular Biology 683, 33-40.
Green M. y Loewenstein P.M. (1988). Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55 (6), 1179-1188.
Greenfield N. y Fasman G.D. (1969). Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 8, 4108–4116.
Greenfield N. (2006). Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols 1(6): 2876–2890.
Gros E., Deshayes S., Morris M.C., Aldrian-Herrada G., Depollier J., Heitz F., Divita G. (2006). A non-covalent peptide-based strategy for protein and peptide nucleic acid transduction. Biochimica et Biophysica Acta 1758(3), 384–393.
Guidotti G., Brambilla L. y Rossi D. (2017). Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacology Science 38(4), 406-424.
Hancock R. y Rozek A. (2002) Role of membranes in the activities of antimicrobial cationic peptides. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Letters 206 (2), 143–149.
Harris F., Best K. y Bell J. (2002). Use of laurdan fluorescence intensity and polarization to distinguish between changes in membrane fluidity and phospholipid order. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1565 (1) 123-128.
Heitz F, Morris MC y Divita G. (2009). Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. British Journal of Pharmacology 157, 195-206.
Henriques S.T. y Castaño M.A. (2004). Consequences of nonlytic membrane perturbation to the translocation of the cell penetrating peptide pep-1 in lipidic vesicles. Biochemistry 43(30), 9716–9724.
Herbig M., Fromm U., Leuenberger J., Krauss U., Beck-Sickinger A. y Merkle H. (2005). Bilayer interaction and localization of cell penetrating peptides with model membranes: A comparative study of a human calcitonin (hCT)-derived peptide with pVEC and pAntp(43–58). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1712 (2) 197-211.
131
Herce H. D. y Garcia A. E. (2007). Molecular dynamics simulations suggest a mechanism for translocation of the HIV-1 TAT peptide across lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences 104, 20805–20810.
Herce H.D., Garcia A.E., Litt J., Kane R.S., Martin P., Enrique N., Rebolledo A. y Milesi V. (2009). Arginine-rich peptides destabilize the plasma membrane, consistent with a pore formation translocation mechanism of cell-penetrating peptides. Biophysical Journal 97, 1917–1925.
Hood C.A., Fuentes G., Patel H., Page K., Menakuru M. y Park J.H. (2008). Fast conventional Fmoc solid-phase peptide synthesis with HCTU. Journal of Peptide Science 14, 97–101.
Holowka D., Gosse J., Hammond A., Han X., Sengupta P., Smith N., Wagenknecht-Wiesner A., Wu M., Young R. y Baird B. (2005). Lipid segregation and IgE receptor signaling: A decade of progress. Biochimica et Biophysica Acta 1746, 252 – 259.
Holzwarth G. y Doty P. (1965). The ultraviolet circular dichroism of polypeptides. Journal of the American Chemical Society 87, 218–228.
Houghten R.A. (1985). General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences 82, 5131-5135.
Hua Y. y Patel S. (2016). Thermodynamics of cell-penetrating HIV1 TAT peptide insertion into PC/PS/CHOL model bilayers through transmembrane pores: the roles of cholesterol and anionic lipids. Soft Matter 12(32), 6716-6727.
Islam M., Sharmin S., Moniruzzaman M. y Yamazaki M. (2018). Elementary processes for the entry of cell-penetrating peptides into lipid bilayer vesicles and bacterial cells. Applied Microbiology and Biotechnology 102(9), 3878-3892.
Jameson D.M., Gratton E. y Hall R.D. (1984). The measurement and analysis of heterogeneous emissions by multifrequency phase and modulation fluorometry. Applied Spectroscopy Reviews 20, 55–106.
Jameson D. (2014). Introduction to fluorescence. Taylor and Francis group. Cap 5-6, 75-108.
Jameson D. y Ross J. (2010). Fluorescence Polarization/Anisotropy in Diagnostics and Imaging. Chemical Reviews 110 (5) 2685–2708.
Jin L.H., Bahn J.H., Eum W.S., Kwon H.Y., Jang S.H., Han K.H., Kang T.C., Won M.H., Kang J.H., Cho S.W., Park J.y Choi S.Y. (2001). Transduction of human catalase mediated by an hiv-1 tat protein basic domain and arginine-rich peptides into mammalian cells. Free Radical Biology & Medicine 31(11) 1509–1519.
132
Jones S.W., Christison R., Bundell K., Voyce C.J., Brockbank S.M., Newham P. y Lindsay M.A. (2005). Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. British Journal of Pharmacology 145(8), 1093–1102.
Jones A.T. y Sayers E.J. (2012). Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release 161, 582–591.
Karatekin E., Sandre O., Guitouni H., Borghi N., Puech P., Brochard-Wyart F. (2003). Cascades of transient pores in giant vesicles: line tension and transport. Biophysical Journal 84, 1734–1749.
Kassem T., Sabatino D., Jia X., Zhu X.X. y Lubell W. (2009). To rink or Not to Rink Amide Link, that is the Question to Address for More Economical and Environmentally Sound Solid-Phase Peptide Synthesis. International Journal of Peptide Research and Therapeutics 15, 211-218.
Koopman G., Reutelingsperger C.P., Kuijten G.A., Keehnen R.M., Pals S.T. y van Oers M.H. (1994). Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood 84, 1415–1420.
Koren E. y Torchilin V. (2012). Cell-penetrating peptides: breaking through to the other side. Trends in Molecular Medicine 18, 385-393.
Kramer S.D. y Wunderli-Allenspach H. (2003). No entry for TAT(44-57) into liposomes and intact MDCK cells: novel approach to study membrane permeation of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta 1609, 161–169.
Lamaziere A., Burlina F., Wolf C., Chassaing G., Trugnan G. y Ayala-Sanmartin J. (2007). Non-metabolic membrane tubulation and permeability induced by bioactive peptides. PLoS ONE 2 e201.
Lindgren M.E., Hallbrink M.M., Elmquist A.M. y Langel U. (2004). Passage of cell-penetrating peptides across a human epithelial cell layer in vitro. Biochemical Journal 377(1), 69–76.
Lundberg P. y Langel U. (2003). A brief introduction to cell-penetrating peptides. Journal of Molecular Recognition 16, 227-233.
Lundberg P., El-Andaloussi S., Sutlu T., Johansson H. y Langel U. (2007). Delivery of short interfering RNA using endosomolytic cell-penetrating peptides. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal 21, 2664–2671.
Madani F., Lindberg S., Langel U., Futaki S. y Graslund A. (2011). Mechanisms of Cellular Uptake of Cell-Penetrating Peptides. Journal of Biophysics 1–10.
Maget-Dana R. (1999). The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta 1462, 109–140.
133
Magzoub M., Kilk K., Eriksson L.E., Langel U. y Graslund A. (2001). Interaction and structure induction of cell-penetrating peptides in the presence of phospholipid vesicles. Biochimica et Biophysica Acta 1512, 77–89.
Magzoub M. y Graslund A. (2004). Cell-penetrating peptides: small from inception to application. Quarterly Reviews of Biophysics 37, 147–195.
Martin S.J., Reutelingsperger C.P., McGahon A.J., Rader J.A., van Schie R.C., LaFace D.M. y Green D.R. (1995). Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. Journal of Experimental Medicine 182, 1545–1556.
Matsuzaki K., Sugishita K., Fujii N. y Miyajima K. (1995). Molecular basis for membrane selectivity of an antimicrobial peptide, magainin 2. Biochemistry 34, 3423-3429.
Matsuzaki K., Sugishita K. y Miyajima K. (1999). Interactions of an antimicrobial peptide, magainin 2, with lipopolysaccharide-containing liposomes as a model for outer membranes of gram-negative bacteria. Federation of European Biochemical Societies 449, 221-224.
Maxfield F. y Tabas I. (2005). Role of cholesterol and lipid organization in disease. Nature 438; 612-621.
McGown L. B. y Nithipatikom K. (2000). Molecular fluorescence and phosphorescence. Applied Spectroscopy 35, 353-393.
Milletti F. (2012). Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today 17, 850-860.
Mishraa A., Laia G.H., Schmidt N.W., Sun V.Z., Rodriguez A.R., Tong R., Tang L., Cheng J., Deming T.J., Kameib D.T. y Wong G.C (2011). Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences 108 (41), 16883-16888.
Mueller J., Kretzschmar I., Volkmer R. y Boisguerin P. (2008). Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry 19, 2363–2374.
Mukherjee S. y Maxfield F. (2004). Membrane domains. Annual Review of Cell and Developmental Biology 20, 839–866.
Nakase I., Hirose H., Tanaka G., Tadokoro A., Kobayashi S., Takeuchi T. y Futaki S. (2009). Cell-surface accumulation of flock house virus-derived peptide leads to efficient internalization via micropinocytosis. Molecular Therapy 17, 1868–1876.
134
Oehlke J., Krause E., Wiesner B., Beyermann M. y Bienert M. (1997). Extensive cellular uptake into endothelial cells of an amphipathic beta-sheet forming peptide. Federation of European Biochemical Societies Letters 415, 196–199.
Padari K., Koppel K., Lorents A., Hällbrink M., Mano M., Pedroso de Lima M.C. y Pooga M. (2010). S413-PV cell-penetrating peptide forms nanoparticle-like structures to gain entry into cells. Bioconjugate Chemistry 21, 774–783.
Pan L., He Q., Liu J., Chen Y., Ma M., Zhang L., y Shi J. (2012). Nuclear-Targeted Drug Delivery of TAT Peptide-Conjugated Monodisperse Mesoporous Silica Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society 134, 5722−5725.
Parasassi T. y Gratton E. (1995). Membrane lipid domains and dynamicsas detected by Laurdan fluorescence. Journal of Fluorescence 5, 59-69.
Parasassi T., Krasnowska E.K., Bagatolli L. y Gratton E. (1998). Laurdan and Prodan as Polarity-Sensitive Fluorescent Membrane Probes. Journal of Fluorescence 8(4), 365-373.
Plenat T., Deshayes S., Boichot S., Milhiet P.E., Cole R.B., Heitz F. y Le Grimellec C. (2004). Interaction of primary amphipathic cell-penetrating peptides with phospholipid-supported monolayers. Langmuir 20, 9255–9261.
Pouny Y., Rapaport D., Mor A., Nicolas P. y Shai Y. (1992) Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membranes. Biochemistry 31, 12416-12423.
Polyanichko A., Andrushchenko V., Bour P. y Wieser H. (2011). Vibrational Circular Dichroism Studies of Biological Macromolecules and their Complexes. In Circular Dichroism: Theory and Spectroscopy; Rodgers, D. S., Ed.; Nova: Hauppauge, NY, 2011.
Pooga M., Hallbrink M., Zorko M. y Langel U. (1998). Cell penetration by transportan. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal 12 (1) 67–77.
Priyanka R.Kulkarni, Jaydeep D.Yadav, Kumar A.Vaidya. (2011) Liposomes:a novel drug delivery system. International Journal of Current Pharmaceutical Research 3 (2), 10-18.
Qiana Sh. y Heller W.(2015). Melittin-induced cholesterol reorganization in lipid bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1848 (10), 2253–2260.
Rascol E., Devoissellea J.M. y Chopineau J. (2016). The relevance of membrane models to understand nanoparticles-cell membrane interactions. Nanoscale 8, 4780-4798.
Redford G.I. y Clegg R.M. (2005). Polar plot representation for frequency-domain analysis of fluorescence lifetimes. Journal of Fluorescence 15, 805–815.
135
Repáková J., Holopainen J., Morrow M., McDonald M., Čapková P. y Vattulainen I. (2005). Influence of DPH on the Structure and Dynamics of a DPPC Bilayer. Biophysical Journal 88, 3398–3410.
Roiter Y., Ornatska M., Rammohan A. R., Balakrishnan J., Heine D. R y Minko S. (2009) Interaction of Lipid Membrane with Nanostructured Surfaces. Langmuir 25, 6287‐6299.
Rosenbluh J., Hariton-Gazal E., Dagan A., Rottem S., Graessmann A. y Loyter A. (2005). Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. Journal of Molecular Biology 345, 387–400.
Ross J. y Jameson D. (2008). Time-resolved methods in biophysics. 8. Frequency domain fluorometry: Applications to intrinsic protein fluorescence. Photochemical & Photobiological Sciences 7, 1301–1312.
Rothbard J., Jessop T., Lewis R., Murray B. y Wender P. (2004). Role of Membrane Potential and Hydrogen Bonding in the Mechanism of Translocation of Guanidinium-Rich Peptides into Cells. Journal of the American Chemical Society 126 (31), 9506-9507.
Sanchez S.A., Tricerri M.A., Gunther G. y Gratton E. (2007). Laurdan generalized polarization: from cuvette to microscope. In: Mendez-Villas A, and Diaz J, editors. Modern Research and Educational Topics in Microscopy. Formatex. 1007–1014.
Sanchez S., Tricerri M. y Gratton E. (2012). Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(19), 7314–7319
Schmidt Th., Schuetz G. J., Baumgartner W., Gruber H. J. y Schindler H. (1995). Characterization of photophysics and mobility of single molecules in a fluid lipid membrane. Journal of Physical Chemistry 99, 17662–17668.
Scholtz J.M., Qian H., York E.J., Stewart J.M. y Baldwin R.L. (1991). Parameters of helix-coil transition theory for alanine-based peptides of varying chain lengths in water. Biopolymers 31(13), 1463-70.
Schwarze SR, Ho A, Vocero-Akbani A, Dowdy SF. (1999). In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 285, 1569-72.
Seelig J. (2004). Thermodynamics of lipid–peptide interactions. Biochimica et Biophysica Acta 1666, 40– 50.
Shai Y. (1999). Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. Biochimica et Biophysica Acta 1462, 55-70.
136
Sharmin S., Islam M., Karal M., Shibly S., Dohra H., Yamazaki M. (2016). Effects of lipid composition on the entry of cell-penetrating peptide oligoarginine into single vesicles. Biochemistry 55, 4154–4165.
Shin MC, Zhang J, Min KA, Lee K, Byun Y, David AE, He H y Yang VC. (2014). Cell-penetrating peptides: achievements and challenges in application for cancer treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A 102(2), 575-87.
Simons, K. y Vaz, W. L. (2004).Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 33, 269–295
Snyder EL y Dowdy SF. (2005). Recent advances in the use of protein transduction domains for the delivery of peptides, proteins and nucleic acids in vivo. Expert Opinion on Drug Delivery 2, 43-51.
Sonnichsen F., Van Eyk J., Hodges R. y Sykes B. (1992). Effect of Trifluoroethanol on Protein Secondary Structure: An NMR and CD Study Using a Synthetic Actin Peptide. Biochemistry 31, 8790-8798.
Soomets U., Lindgren M., Gallet X., Hällbrink M., Elmquist A., Balaspiri L., Zorko M., Pooga M., Brasseur R.y Langel U. (2000). Deletion analogues of transportan. Biochimica et Biophysica 1467 (1) 165–176.
Soto M., Olivares C., Quina F., Aguilar L. y Sotomayor C. (2013). Effect of cholesterol content on the structural and dynamic membrane properties of DMPC/DSPC large unilamellar bilayers. Biochimica et Biophysica Acta 1828, 2763–2769.
Sotomayor C., Aguilar L., Cuevas F., Helms M. y Jameson D. (2000). Modulation of Pig Kidney Na+/K+-ATPase Activity by Cholesterol: Role of Hydration. Biochemistry 39(35), 10928-10935.
Sreerama N. y Woody R.W. (2004). Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymology 383, 318–351.
Stoeckenius W. y Engelman D. M. (1969). Current models for the structure of biological membranes. Journal of Cell Biology 42, 613‐646.
Stott B., Vu M., McLemore C., Lund M., Gibbons E., Brueseke T., Wilson-Ashworth H. y JBell J. (2008). Use of fluorescence to determine the effects of cholesterol on lipid behavior in sphingomyelin liposomes and erythrocyte membranes. Journal of Lipid Research 49, 1202-1215.
Swiecicki J., Di Pisa M., Burlina F., Lécorché P., Mansuy C., Chassaing G. y Lavielle S.(2015). Accumulation of Cell-Penetrating Peptides in Large Unilamellar Vesicles - A straightforward Screening Assay for Investigating the Internalization Mechanism. Biopolymers 104(5),533-43.
Štefl M., James N., Ross J. y Jameson D. (2011). Applications of phasors to in vitro time-resolved fluorescence measurements. Analytical Biochemistry 410, 62–69.
137
Thoren P.E., Persson D., Lincoln P. y Norden B. (2005). Membrane destabilizing properties of cell-penetrating peptides. Biophysical Chemistry 114, 169–179.
Tiriveedhi V. y Butko P. (2007). A fluorescence spectroscopy study on the interactions of the TAT-PTD peptide with model lipid membranes. Biochemistry 46, 3888–3895.
Torchilin V.P., Rammohan R., Weissig V. y Levchenko T.S. (2001). TAT peptide on the surface of liposomes affords their efficient intracellular delivery even at low temperature and in the presence of metabolic inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences 98 (15) 8786–8791.
Trabulo S., Cardoso A.L., Mano M., y Pedroso de Lima M.C. (2010) Cell-Penetrating Peptides—Mechanisms of Cellular Uptake and Generation of Delivery Systems. Pharmaceuticals 3, 961-993.
Tünnemann G., Ter‐Avetisyan G., Martin R., Stöckl M., Herrmann A. y Cardoso C. (2008). Live‐cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo‐arginines. Journal of peptide science 14, 469-476.
Van Mau N., Vie V., Chaloin L., Lesniewska E., Heitz F. y Le Grimellec C. (1999). Lipid-induced organization of a primary amphipathic peptide: a coupled AFM-monolayer study. Journal of Membrane Biology 167, 241–249.
Velluz L., Legrand M. y Grosjean M. (1965). Optical Circular Dichroism: Principles, Measurements, and Applications (Verlag Chemie Academic Press Inc., New York and London).
Vie V., Van Mau N., Chaloin L., Lesniewska E., Le Grimellec C. y Heitz F. (2000). Detection of peptide-lipid interactions in mixed monolayers, using isotherms, atomic force microscopy, and fourier transform infrared analyses. Biophysical Journal 78, 846–856.
Vives E., Schmidt J. y Pelegrin A. (2008). Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drugdelivery. Biochimica et Biophysica Acta 1786, 126–138.
Wang A.Z, Langer R. Y Farokhzad O.C. (2012). Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs. Annual Review of Medicine 63, 185–98.
Wang F., Wang Y., Zhang X., Zhang W., Guo S. y Jin F. (2014). Recent progress of cell-penetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery. Journal of Controlled Release 174, 126-36.
Weber G. (1981). Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J. Phys. Chem. 85, 949–953.
Wender P., Mitchell D., Pattabiraman K., Pelkey E., Steinman L. y Rothbard J. (2000). The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: Peptoid molecular transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences 97(24), 13003-13008.
138
Wheeler D.S., Dunsmore K.E.y Wong H.R. (2003). Intracellular delivery of HSP70 using HIV-1 Tat protein transduction domain. Biochemical and Biophysical Research Communications 301(1) 54–59.
Wieprecht T., Beyermann M. y Seelig J. (2002). Thermodynamics of the coilalpha-helix transition of amphipathic peptides in a membrane environment: the role of vesicle curvature. Biophysical Chemistry 96, 191–201.
Yang L., Harroun T.A., Weiss T.M., Ding L. y Huang H.W. (2001). Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores. Biophysical Journal 81, 1475-1485.
Yeagle P. L. (2011). The structure of biological membranes, ed. C. Press, Taylor and Francis Group, Boca Raton, 3 edn., ch. 3, pp. 43‐66.
Yoon H.Y., Lee S.H., Cho S.W., Lee J.E., Yoon C.S., Park J., Kim T.U.y Choi S.Y. (2002). TAT-mediated delivery of human glutamate dehydrogenase into PC12 cells. Neurochemistry International 41(1), 37–42.
Ziegler A., Blatter X.L., Seelig A. y Seelig J. (2003). Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry 42, 9185–9194.
Ziegler A. (2008). Thermodynamic studies and binding mechanisms of cell-penetrating peptides with lipids and glycosaminoglycans. Advanced Drug Delivery Reviews 60, 580–597.
139
ANEXO 1
HPLC péptidos sintetizados
9876543210
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
1,4
25
4,1
50
RT [min]
1935(20%)-30316.DATAmV
Figura 1 Gráfica HPLC péptido R6H4. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130
C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
Figura 2 Gráfica HPLC péptido TAT. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
9876543210
600
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
-150
1,2
42
1,5
08
4,2
67
RT [min]
1934 Agua-250315.DATAmV
140
HPLC péptidos sintetizados
109876543210
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
-150
1,4
67
3,9
67
4,1
58
RT [min]
1937 20%-221015.DATAmV
Figura 3 Gráfica HPLC péptido penetratina. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
Figura 4 Gráfica HPLC péptido ARF (1-22). HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
109876543210
700
650600
550
500450
400
350300
250
200150
100
500
-50
-100-150
-200
1,4
67
4,5
50
RT [min]
1936 20%-221015.DATAmV
141
HPLC péptidos sintetizados
9876543210
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
1,4
25
4,4
67
RT [min]
1939(20%)-30316.DATAmV
Figura 5 Gráfica HPLC péptido FGF. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
Figura 6 Gráfica HPLC péptido pKCi. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
9876543210
850800750700650600550500450400350300250200150100
500
-50-100-150
5,5
58
RT [min]
1938(30%)-40316.DATAmV
142
HPLC péptidos sintetizados
109876543210
300280260240220200180160140120100
80604020
0-20-40-60-80
-100-120
1,4
58
3,5
58 4
,533
RT [min]
1941 20%-221015.DATAmV
Figura 7 Gráfica HPLC péptido R9. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
Figura 8 Gráfica HPLC péptido pVEC. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
9876543210
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
1,1
42
1,2
50
1,4
83 4
,233
5,3
67
6,5
17
RT [min]
1940-170614.DATAmV
143
HPLC péptidos sintetizados
109876543210
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
1,4
67
6,9
83
RT [min]
1943 20%-231015.DATAmV
Figura 9 Gráfica HPLC péptido Bac7. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
Figura 10 Gráfica HPLC péptido melitina. HPLC en fase reversa utilizando una columna XBridge BEH130 C18 3,5 μm dp, 4,6 x 100 mm y un programa de 0-70%ACN 8 min.
109876543210
900850800750700650600550500450400350300250200150100
500
-50-100-150
4,5
17
RT [min]
1942 20%-221015.DATAmV
144
ANEXO 2
Masas péptidos sintetizados
Figura 1 Espectro de masas péptido R6H4. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
Figura 2 Espectro de masas péptido TAT. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
145
Masas péptidos sintetizados
Figura 3 Espectro de masas péptido penetratina. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20
minutos.
146
Masas péptidos sintetizados
Figura 4 Espectro de masas péptido ARF (1-22). Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
Figura 5 Espectro de masas péptido FGF. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
Figura 6 Espectro de masas péptido pKCi. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
147
Masas péptidos sintetizados
Figura 7 Espectro de masas péptido R9. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
Figura 8 Espectro de masas péptido pVEC. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
148
Masas péptidos sintetizados
Figura 9 Espectro de masas péptido Bac7. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
Figura 10 Espectro de masas péptido melitina. Se utilizó un programa de 0-100% Acetonitrilo 20 minutos.
