RESUMEN En el presente informe se estudio el aisla-miento de levadura procedente de la superfi-cie de una manzana adquirida en el mercado de abastos de la ciudad, se utilizo: agua pep-tona para la revivificación de la cepa, el agar Sabouraud para el cultivo de la levadura, a una temperatura de 25ºC . Los resultados obtenidos nos dieron un creci-miento de 76 UFC a los 5 días del inoculo en la primera dilución (10-1), 20 UFC a los 5 días en la segunda dilución (10-2), 6 UFC a los 5 días en la tercera dilución (10-3), todos pre-sentaron el color característico de blanco le-choso, forma circular, superficie ovalada.

Levadura es el nombre genérico dado a un gru-po de hongos Ascomicetes pertenecientes al orden Endomicetales. Las levaduras son mi-crohongos que se encuentran generalmente en forma de células únicas y que se reprodu-cen mediante gemación. Las levaduras fueron en un principio aisladas y utilizadas en el ámbito comercial en el año 1970 y muchas de las cepas de las levaduras de este tiempo se encuentran en uso en la ac-tualidad. La levadura bayanus del Instituto Enológico del Champagne (Institut Oenologique de Champag-ne) ha constituido uno de los pilares principa-les de la industria durante décadas. El aislamiento y reproducción de la levadura constituye un proceso largo y de gran trabajo. Primero se identifican las cepas aisladas por lo general en los viñedos, frutas y luego se anali-

INTRODUCCION

OBJETIVO

Estudiar la técnica de asilamiento de levaduras de la superficie de una manzana

Unamba

Fecha del boletín

Contenido:

Resumen, introduc-ción, objetivo

1

Marco Teórico 2

Materiales y Procedi-miento

4

Resultados 5

Discusiones, Conclu-siones, y Bibliografía

6

zan las características de fermentación. Se piensa que luego de haber buscado durante treinta años entre los viñedos y frutas, ya se ha encontrado la levadura ideal. En la actualidad, la tecnología se centra en comprender y manipular lo que ya se ha establecido.

“UNIVERSIDAD NACIONAL MICAE-LA BASTIDAS DE

APURIMAC”

CARRERA PROFE-SIONAL DE INGE-NIERIA AGROIN-

DUSTRIAL

BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL-

LABORATORIO

• DOCENTE: Bio. Yanett Campos

• ALUMNO: Christian Andrew Aguilar M.

ABANCAY-APURIMAC

Diagrama de una electronografía de la sección transversal de una célula en re-poso de levadura de panaderos (Saccharomyces cerevisiae). ER, retículo endoplásmico; M, mitocondrias; N, nú-cleo; Nm, membrana nuclear; Nn, nucléo-lo; Pi, invaginación; Pl, plasmalerna; V, vacuola; Vp, granulo de polimetafosiato; W, pared celular; Ws, cicatriz de gema-ción; L granulo lipídico

LEVADURAS Las levaduras son organismos pertenecien-tes al reino de los hongos: Como tales, son organismos heterotróficos por el hecho de que solo pueden alimentarse de materia ya preformada (como nosotros los mamíferos), al contrario que las plantas, que son orga-nismos autotróficos y que al estar dotadas de clorofila pueden utilizar la energía del sol juntamente con el aire y el agua para obte-ner todos los nutrientes. Las levaduras es-tán distribuidas en casi todos los hábitats naturales. Son comunes en las hojas de las plantas y en las flores, también se encuen-tran en la superficie de la piel y en el tracto intestinal de los animales de sangre caliente donde pueden vivir en simbiosis o como pa-rásitos. También se encuentran en los sue-los y en el agua salada donde contribuyen a la descomposición de plantas y algas. Las levaduras se multiplican asexualmente como células individualizadas que se divi-den por gemación o por división directa (fisión), hay especies que pueden crecer como filamentos formando el micelio típico de los hongos. En su apartado de reproduc-ción sexual las levaduras producen unas estructuras llamadas ascas, que contienen hasta 8 esporas. Estas asco esporas pue-den fusionarse entre sí y originar un nuevo individuo que podrá multiplicarse a través de una división vegetativa. Pero los más co-nocido y comercialmente significativo de las levaduras son las especies y cepas relacio-nadas de Saccharomyces cerevisiae. Este organismo ha sido largamente utilizado para fermentar azúcares del arroz, del trigo, de la cebada y del maíz para la producción de bebidas alcohólicas y en la industria de pa-nificación para expandir o aumentar la ma-sa. Saccharomyces cerevisiae es común-mente usada como levadura en el pan y pa-ra algunos tipos de fermentación. Extractos de levadura se administran a menudo como suplemento vitamínico ya que están consti-tuidas en un 50% por proteínas y son fuente importante de vitaminas B, niacina, y ácido fólico. ESTRUCTURA DE LA CÉLULA DE LEVADURA: Una célula de una levadura típica tiene, cuando se halla plenamente desarrollada, entre 8 y 14 nm de diámetro y una masa de materia seca de 40 pg. Por tanto 1012 célu-las desecadas pesan unos 40 g. En vivo, prensadas, ese mismo número de células

pesan unos 200 g. El examen al microsco-pio ordinario revela que cada célula está rodeada por una pared y que en el interior de la misma se pueden distinguir pocas estructuras, salvo una o más vacuolas. Para observar el núcleo y varios otros orgánulos se necesita recurrir a preparaciones teñi-das, o a la microscopía de contraste de fa-ses. La superficie de las levaduras se pue-de estudiar mediante microscopía electróni-ca de barrido y las estructuras internas me-diante microscopía electrónica de transmi-sión, sobre preparaciones fracturadas por congelación, frescas, no fijadas. En la si-guiente figura se muestra un diagrama de la sección de una levadura. Una información más detallada de las par-tes de la célula exige la identificación bio-química de sus componentes. La pared ce-

MARCO TEORICO

Página 2 AISLAMIENTO DE LEVADURAS

lular representa el 30 % del peso seco total y tiene un grosor de 100-200 nm. Está constituida por aproximadamente un 40 % de (3 glucanos, otro 40 % de a mananos, 8 % de proteína, 7 % de lípidos, 3 % de sus-tancias inorgánicas y 2 % de hexosamina y quitina. El glucano está unido a la proteína y representa el componente estructural más abundante; se halla fundamentalmen-

te en la cara interna de la pared. El tamaño se encuentra también ligado a la proteína, a veces a través de hexosamina, y tiende a lo-calizarse en la cara externa de la pared. La superficie de la célula se encuentra cargada, debido a la presencia de grupos carbóxilo y fosfato que, al pH de la cerveza, la confieren una fuerte carga neta negativa. También se encuentran grupos amino, pero sólo le confie-ren regiones locales de carga positiva. Las paredes celulares se pueden disolver me-diante el uso de una preparación enzimática mixta, procedente de un actinomiceto deno-minado Arthrobader luteus, o de la glándula digestiva de un caracol comestible, Helix po-mada. Generalmente, se requiere un agente reductor, como el mercaptoetanol. Si se man-tienen en un estabilizador osmótico, como una disolución acuosa de manitol al 20 %, las células de levadura permanecen intactas, pero esféricas, al haber perdido su pared; se les denomina esferoblastos y, si las condicio-nes culturales son las adecuadas, resinteti-zan sus paredes. Algunas técnicas de mani-pulación genética explotan estos hechos. CULTIVO: Las características macro y micromorfológi-cas son importantes para la identificación y si la formación de las ascosporas no puede ser observada en Malta-Glucosa a 25-30ºC, se inocula elmedio Acetato . Las cepas producto-ras de ácido desarrollan en Malta-Acético y las levaduras xerófilas crecen sobre Malta-Sal-Glucosa o Malta-50%Glucosa. Con estos da-tos y el resultado de la incubación a 37°C, se puede acceder a la identificación de las 14 especies más comunes de levaduras obser-vadas en el 42,3% de los alimentos. Se utiliza también el medio Sabouraud par el creci-miento de levaduras. AMBIENTE: La vasta mayoría de las levaduras son mesó-filas, con una temperatura máxima de creci-miento entre 24 y 48ºC. Solo unas pocas (2%) son psicrófilas con una temperatura má-xima de crecimiento por debajo de 24ºC, pero mayor es el número de las levaduras que tie-nen la temperatura óptima de crecimiento por debajo de 20ºC. No hay levaduras que puedan crecer a 50ºC y solamente unas po-cas pueden desarrollar cerca de 0ºC, entre las que se encuentran Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii y Pichia membranae-

faciens. Por otra parte, Kluyveromyces marxianus crece a 48ºC, mientras que otras de los molinos azucareros son capa-ces de proliferar por sobre los 40ºC, entre ellas Pichia polymorpha, Geotrichum capi-tatum, Saccharomyces cerevisiae y espe-cies de Candida y Debaryomyces. En gene-ral, la presencia de etanol o bicarbonato aumenta la temperatura mínima de creci-miento (Déak & Beuchat 1996). La mayo-ría de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una actividad de agua mínima de 0,90-0,95. En general las levaduras toleran mejor altas concentracio-nes de azúcar que de sal. Entre las que prefieren substratos salados se hallan Geotrichum terrestre, Stephanoascus cife-rrii, D. hansenii y Lipomyces kononekoae. Por otra parte Zygosaccharomyces mellis tolera mejor la glucosa que la sacarosa (Déak & Beuchat 1996). CARACTERÍSTICAS DE LOS CULTIVOS: ♦Crecimiento en forma de velo en la super-

ficie de los medios líquidos indica que se trata de una levadura oxidativa o forma-dora de velo.

♦La producción de un pigmento carotenoi-de confirma que la levadura que ha creci-do pertenece al genero Rhodoturola.

♦El aspecto de crecimiento de los microor-ganismos tiene importancia cuando estos producen un moteado pigmentado en la superficie de los alimentos

♦La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, aunque es posible que tengan aspecto harinoso.

♦Algunas colonias tienen un color crema o rosado.

♦Las levaduras son oxidativas, fermentati-vas o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos.

♦En la superficie de un liquido, las levadu-ras oxidativas pueden ser en forma de película, de velo, o espuma y por ello se denominan levadura formadoras de pelí-culas.

♦El aspecto de crecimiento de los microor-ganismos tiene importancia cuando estos producen un moteado pigmentado en la superficie de los alimentos

♦Las levaduras fermentativas suelen cre-cer en toda la masa del liquido y produ-cen dióxido de carbono.

Página 3 AISLAMIENTO DE LEVADURAS

♦Beaker de 200 ml.

♦Agua peptona.

♦Matraz.

♦Tubos de ensayo.

♦Agar sabouraud.

♦Placas petri.

♦Pipeta.

♦Manzana.

MATERIALES

PROCEDIMIENTO

Página 4

Introducir, la manzana en el me-dio de agua peptona par revivifi-car a la levadura y agitar por alre-dedor de 30 minutos, el medio debe tapar completamente a la manzana.

Si hay bacterias, se aplica Rouling (bactericida)

Libre de bacterias

Cada tubo de ensayo contiene 15ml de agar sabouraud a una temperatura de 45ºC

Medio agua peptona libre de bacterias y carga de levaduras.

1 gota 1 gota

1 gota

10-1 10-2 10-3

Incubación a 25ºC promedio.

AISLAMIENTO DE LEVADURAS

En la siguiente tabla se muestran el crecimiento de la levadura según los días.

RESULTADOS

Página 5

Día cero Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

No hay creci-miento

No hay presen-cia de colonias, t=38ºC, presen-cia de agua.

La presencia de colonias es muy poca.

No se analizo No se analizo Existe presencia de colonia y es posible realizar el conteo

Los siguientes gráficos nos muestran el crecimiento al día 5 (lunes 09/05/08)

Dilución 10-1

Dilución 10-2

Dilución 10-3

1

1

10

10

19 476

UFC

UFC−

−

= ∗

=

31 06U F C − =

21020UFC − =

En el siguiente cuadro se muestra la descripción cualitativa de las colonias

AISLAMIENTO DE LEVADURAS

DISCUSIONES

COLOR Blanco lechoso

FORMA Regular

TAMAÑO 1.8-2.00mm

BORDE Circular

SUPERFICIE Lisa

CONSISTENCIA Semidura

ESTRUCTURA INTERNA Amorfa

OPACIDAD Opaco

ELEVACIÓN Convexa

SOBRE EL CRECIMINETO: Déak & Beuchat 1996, menciona que la vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48ºC, pero que res-ponden mejor a temperaturas menores a 30ºC, el día 1 se tuvo una temperatura de 38ºC lo cual no dejo crecer a las levaduras normalmente, ya de ahí par el día 5 se dejo la placa al medio ambiente y se tuvo el crecimien-to adecuado. SOBRE EL COLOR: Montes Díaz 2003, menciona al respecto: que la mayo-ría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas, aunque es posible que tengan aspecto harinoso. Algunas colonias tienen un color crema o ro-sado, las colonias aisladas presentaron un color blanco lechoso, lo cual nos muestra que resultados obtenidos

concuerdan con la teoría. SOBRE SU HABITAT: Fernández Vila 2005, menciona que las levaduras son comunes en las hojas de las plantas, en los fru-tos y en las flores, también se encuentran en la su-perficie de la piel y en el tracto intestinal de los ani-males de sangre caliente donde pueden vivir en sim-biosis o como parásitos. También se encuentran en los suelos y en el agua salada donde contribuyen a la descomposición de plantas y algas, para el asila-miento se utilizo manzana, lo cual nos indica por teó-rica que existe crecimiento de levaduras tal como se dio en la práctica.

CONCLUSIONES

♦ El crecimiento de levaduras se da dentro de una temperatura de 24 a 48ºC, pero para mejores resul-tados se debe cultivar a temperaturas menores de 30ºC.

♦ El color característico de las levaduras es de color

blanco lechoso. ♦ El habitad natural de las levaduras son la superfi-

cies de las frutas, hojas, también se encuentran en el suelo y agua salada.

BIBLIOGRAFIA

♦ Déak T, Beuchat LR. 1996. Handbook of Food Spoilage Yeasts. CRC Press, Boca Ratón, Florida. ♦ Fernández Vila Juan Antonio . 2005. Las Levaduras. http://www.cuinant.com/ ♦ Montes Díaz Elizabeth. 2003. Método de cuenta total de Mohos y Levaduras. Revista Microbiología Indus-

trial, Bogota-Colombia.

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