“ESTUDIO CINETICO SOBRE LA

HIDROLISIS DE UREA EN PRESENCIA DE

UREASA.”

Carlos Barajas IQ693623

Diego Ontiveros IQ693085

Miguel Núñez IQ692685

RESUMEN:

Se estudió la cinética de la hidrolisis de la urea por medio de la enzima ureasa. La ureasa fue extraída de Jack Bean Meal después de un proceso donde se sometió a centrifugación, filtración y refrigeración a 5°C aproximadamente, usando como vehículo glicerina. Una vez preparada la ureasa, se prepararon soluciones de fenol con nitroprusiato de sodio y NaOH con cloro comercial donde se dejaron reposar en refrigeración 24 horas a 5°C aproximadamente.

Se prepararon soluciones de urea a diferentes concentraciones donde evaluamos a 30°C (+-1°C) por espectrofotometría la absorbancia que estas soluciones poseían, donde por medio de una curva de calibración se obtuvo la concentración de amoniaco de cada solución.

Analizando con el mecanismo de Michaelis Menten las diferentes constantes como kcat y km. Posteriormente se grafica Lineweaver-Burk para obtener la regresión no lineal.

JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO:

Las enzimas tienen una gran importancia biológica ya que son catalizadores altos en proteínas de gran peso molecular, donde aceleran las reacciones disminuyendo su energía de activación sin afectar el producto final de la reacción.

El análisis sobre la hidrolisis de urea en presencia de ureasa, resulta de un gran interés para diferentes áreas como lo es la agricultura ya que sirve como fertilizante. Es decir la urea provee alto contenido de nitrógeno a la planta, ya en presencia de la ureasa esta se hidroliza. Las ventajas de la ureasa en la agricultura

es que tiene pocas desventajas en contra de la sequedad, irradiación, temperatura, etc.

SECCIÓN EXPERIMENTAL:

Se preparó una solución buffer de acetatos con un pH de 5.5 agregando 18g de acetato de sodio, 2ml de ácido acético aforando a 1 L.

La solución de ureasa requirió de 30g de Jack Bean Meal diluida en 50ml de H2SO4. Esta solución se agito 20 min en Kahn Shaker, una vez finalizado los 20 min se agregaron 150ml de glicerina y se volvió agitar 15 min más. Se dejó reposar a 5°C aproximadamente durante 24h. Una vez transcurrido el tiempo se centrifugo la solución por 20 min, donde por ultimo esta solución se filtró 3 veces por fibra de vidrio.

Se realizó una curva de calibración de amoniaco donde se preparó la solución madre a 1M, a partir de la solución madre se diluyo a 0.1, 0.08, 0.06, 0.04 y 0.02M.

Posteriormente se prepararon 2 reactivos donde uno de estos contenía 2.5g de fenol y 3mg de nitroprusiato de sodio aforando a 100ml (reactivo A), mientras el segundo reactivo se preparó con 2g de NaOH y 7.5ml de cloro comercial aforando a 100ml (reactivo B). Los reactivos se refrigeraron durante 24h a 5°C.

Una vez listos los reactivos y las disoluciones de amoniaco se continuó a elaborar la curva de calibración. Donde a cada disolución de amoniaco se le agregaron 2ml del reactivo A y del reactivo B. En seguida las disoluciones fueron incubadas a 50°C por 10 minutos. Finalizando los 10 minutos se buscó la longitud de onda adecuada en OCEAN OPTICS y el resultado fue 650nm.

En seguida una vez encontrada la longitud de onda se utilizó el espectrofotómetro marca Bacharach Coleman 35 donde medimos %T y por medio de la ecuación; Abs = 2-LOG (%T) obtuvimos la absorbancia de cada disolución ya mencionadas.

Ya determinada la curva de calibración se preparó una solución madre 0.1M de urea donde se agregó 4ml de esta solución, 2ml de reactivo A y B, 40µl de ureasa. Esto se hizo para 5 tubos hach donde se calentaron en baño María a 30°C a 1, 3, 5, 7 y 9 min, terminando el tiempo ya mencionado se midió %T de cada tubo.

A partir de la solución madre de 0.1M se prepararon 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.008 y 0.006M. A la solución de 0.08M se agregó 3.2ml de la solución, 0.8ml del buffer y 2ml del reactivo A y B, después se repiten los mismos pasos del baño maría y el %T. Para 0.06M se

agregaron 2.4ml de urea y 1.6ml de buffer las cantidades de los reactivos se mantienen fijas todo el tiempo. Y se repite el mismo procedimiento que los demás y así hasta 0.006M. Por lo que se mantiene la relación entre urea y buffer 1:5.

RESULTADOS:

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.120.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50

f(x) = 4.59069375530897 x + 0.017568926670772R² = 0.995147503262759

[NH3] M

Abso

rban

cia

Gráfica 1. Curva de calibración

La gráfica 1 muestra la curva de calibración sobre la solución de amoniaco 1M donde se diluyo 5 veces. La ecuación resultante es de y = 4.5907x + 0.0176 y una R2 = 0.9951 por lo que la curva de calibración funciona de la mejor manera para este sistema.

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.000.0000

0.0100

0.0200

0.0300

0.0400

0.0500

0.0600

0.0700

0.0800

0.1

0.08

0.06

0.04

0.02

Tiempo (min)

[NH3

] M

Gráfica 2. Tiempo contra concentración de amoniaco desprendido

La concentración de amoniaco respecto al tiempo fue doble inversamente proporcional a la de urea.

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.120

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.001

0.0012

.1 M .06 M .04 M .02 M

[S]

RGráfica 3. Valores de velocidad contra concentración de sustrato

La gráfica 2 corresponde a los datos experimentales tomados desde una equivalencia estequiométrica de la concentración de urea [S] donde se aprecia la tendencia de una velocidad rápidamente en aumento para después permanecer constante hasta que se termina prácticamente en su totalidad el soluto, generando la mayor parte de amoniaco posible.

0 50 100 150 200 25010

100

1000

10000

100000

1000000

10000000

100000000

1000000000

.1 M .08 M .06 M .02 M .04 M

1/[S]

1/r

Gráfica 4. Valores linealizados de velocidad contra concentración de sustrato

En su totalidad, las diferentes concentraciones muestran una tendencia lineal, cumpliendo así con el modelo Lineweaver-Burk, donde tomando el termino independiente de la ecuación de cada una de las concentraciones, podemos calcular el valor de la kcat y km.

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-050

50000

100000

150000

200000

250000

00.0050.010.0150.020.0250.030.0350.040.045

[ureasa]/[urea]o

Grafica 5. k2 y km vs [ureasa]/[urea]o NOTA: k2 azul y km naranja

La gráfica 5 muestra el comportamiento de las constantes de Michaelis Mentel, las cuales teóricamente se deberían de mostrar de una forma más lineal con respecto al eje y, por lo que se puede decir que el ajuste de las derivadas para las concentraciones .08M y .04M no fue el adecuado y que las constantes no son adecuadas para el modelo cinético.

CONCLUSIONES: Se determinó que la variante física que más afecto el cambio en la velocidad de reacción fue la temperatura. Así mismo se determinaron las constantes k2 y km para las diferentes reacciones y a diferentes concentraciones las cuales no

K2 Km

se pudieron obtener por mínimos cuadrados y solver pero si usando la pendiente y el termino independiente de la linelización 1/R vs 1/[S] pero que de igual manera no se pudo comprobar para las concentraciones de .o8M y .04M.