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Resumen—En la práctica de laboratorio se siguió una serie de pasos que se basa en la metodología para la extracción de ADN de hongos. Cada etapa del procedimiento fue fundamental para la obtención de una muestra significativa y exitosa, para esto se hizo una homogenización, una separación y purificación y luego una precipitación.

Índice de Términos—Bioseguridad, equipos de laboratorio, laboratorio, riesgo.

I.INTRODUCCIÓN

La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción adecuados. (UFPS, 2013)

II. OBJETIVOS

Conoce los fundamentos de la extracción y purificación del ADN genómico.

Que el alumno pueda describir y explicar cada una de las etapas del protocolo y

definir la importancia de cada uno de los ractivos en las diferentes etapas.

III. METODOLOGÍA

1. Ingresar al Laboratorio de Biología Molecular con su guía de trabajo, su bata y cuaderno de laboratorio.

2. Revisar junto con el docente y el asistente del laboratorio las normas de seguridad y reconocer los implementos de seguridad de uso en el laboratorio.

3. Reconocer los materiales y equipos que vamos a manipular al momento de las prácticas de Biología Molecular.

IV. DATOS Y RESULTADOS

A. Como resultado a la hora de realizar un trabajo de laboratorio tenemos que seguir las siguientes normas que ya han sido establecidas.

Independientemente del tipo de riesgo del laboratorio, existen unas series de normas de seguridad básicas para trabajar que se aplican en todos los casos. Luego, y de acuerdo a las características del laboratorio, el trabajo que allí se realice y el material con el que se trabaja, se aplicarán otras normas más específicas. Estas normas se conocen como precauciones universales de laboratorio, e incluyen:

Acceso limitado al laboratorio No beber, comer, fumar, manipular

lentes de contacto ni aplicarse cosméticos dentro del laboratorio utilizar

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EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN DE HONGOS

Jennifer Castro Estrada código: 1610757Lorena Chaparro código: 1610430

Wendy Restrepo Lizarazo código: 1610708

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las barreras de protección primaria adecuadas:

Guantes. Ropas protectoras: guardapolvo con

mangas largas, abotonado y/o bata. No usar el guardapolvo o bata de otra

persona. Calzado cerrado. Protección facial o/u ocular: gafas o

máscaras. De preferencia, no usar lentes de contacto en el laboratorio, aún con protección ocular.

El cabello debe estar recogido, no solo en el caso de usar mecheros, sino también para evitar que obstruya la visión.

No pipetear con la boca. No oler los reactivos y materiales. No tocar los materiales y reactivos sin

guantes. Adoptar procedimientos que impidan la

generación de aerosoles. Descontaminar adecuadamente las

mesadas, luego de finalizar el trabajo del día y cada vez que derrame material químico o biológico.

Colocar los residuos en los recipientes designados a tal fin.

Lavado de manos, luego de manipular cualquier tipo de material (químico o biológico), después de sacarse los guantes y antes de abandonar el laboratorio.

No trabajar solo en el laboratorio, cerciorarse de la presencia de otra/s personas en el servicio.

Almacenar las muestras y los reactivos en heladeras distintas y siempre correctamente tapadas.

No utilizar las mismas heladeras ni mesas para reactivos y muestras que para los alimentos.

No usar las batas o guardapolvos de trabajo fuera del laboratorio.

B. Recomendaciones de trabajo:

Averiguar las propiedades físicas y químicas de las sustancias que se van a utilizar en el protocolo e identificar sus potencialidades nocivas para la salud.

La manipulación de compuestos irritables o tóxicos debe hacerse siempre en la cámara extractora.

Antes de preparar mezclas de reacción en microtubos se debe etiquetar cada tubo con marcador indeleble.

Chequear muy bien la toma de volúmenes con la micropipeta y la adición de la misma en la mezcla de reacción.

Conocer el conocimiento de los equipos de antemano para evitar cualquier accidente.

Arrojar los desechos en el lugar adecuado para cada uno.

Dejar organizado el laboratorio después de terminar la práctica.

C. Recomendaciones generales de manipulación de reactivos peligrosos:

El fenol-cloroformo debe manipularse con guantes y protección respiratoria en cámara extractora.

El bromuro de etidio debe manipularse con guantes de nitrilo porque es cancerígeno.

Si va a manipular nitrógeno utilice guantes y protección para ojos.

Si va a utilizar el transiluminador de luz UV no olvide utilizar lentes de protección UV.

Informarse y acatar los procedimientos para desechar sustancias químicas y biológicas.

Manejar con cuidado los ácidos y bases concentrados, utilizando lentes de protección y guantes apropiados.

D. Equipos usados en laboratorio de biología molecular:

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Fig 1. Microcentrífuga

Microcentrífuga: coloca en rotacion una muestra pequeña para separa así cada una de sus fases, (generalmente una sólida y una liquida), en función de la densidad.

Fig.2 Autoclave

Autoclave: Dispositivo que se utiliza en los laboratorios para esterilizar, funciona con vapor de agua a alta presion y temperatura, evitando que el agua ebulla a pesar de las altas temperaturas. Su fundamento radica en que coagula las proteinas de los microorganismos, aunque recientemente se ha conocido que algunos microorganismos soportan dicho tratamiento como los priones.

Fig 3. Fuente de poder

Fuente de poder: Brinda la energía necesaria para que ocurra la electrophoresis a un determinado voltaje.

Fig 4. Cámara de electroforesis horizontal

Cámara de electroforesis horizontal: Es utilizada para la migración especialmente del ADN en gel de agarosa.

Fig 5. Cámara de electroforesis vertical

Cámara de electroforesis vertical: Se utiliza para la migración de ADN y proteínas y se usa gel de poliacrilamida

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Fig 6. Zona de descarte BrEt

Zona de descarte BrEt: En esta zona se descarta todo el bromuro de etidio utilizado en la práctica, ya que este compuesto es mutagénico.

Fig 7. Incubadora

Incubadora: Es un equipo cerrado que permite controlar la temperatura, humedad y otras condiciones necesarias para el desarrollo de un cultivo microbiologíco.

Fig 8. Transiluminador UV

Transiluminador UV: Sirve para la observación del ADN después de la migración del gel, debido a los rayos uv que emiten, haciendo que se detallen las franjas del ADN migrado.

Fig. 9. Vortex

Vortex: Es un equipo mezclador, se utiliza para agitar pequeños tubos con líquido a manera de vórtice.

E. Reactivos peligrosos en el laboratorio de biología molecular:

Ácido acético: peligroso por inhalación, manejar con guantes y lentes.

Ácido clorhídrico: volátil y puede ser fatal en caso de inhalación. Se debe utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular con extrema precaución.

Acrilamida: Potente neurotóxico que se absorbe por la piel; evitar inhalar, usar guantes y tapabocas.

Azul de bromofenol: peligroso por inhalación, ingestión o absorción por la piel. Usar guantes apropiadas, lentes.

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Bromuro de etidio: potente mutagénico y tóxico. Evitar respirar el polvo, utilizar guantes de nitrilo.

Cloroformo: Compuesto altamente volátil e irritante, carcinógeno. Evitar respirar los vapores.

Etanol: peligroso por inhalación, ingestión o absorción por la piel. Usar guantes, lentes.

Fenol: Extremadamente tóxico, altamente corrosivo y puede causar severas quemaduras. Peligroso por inhalación, ingestión y absorción por la piel.

Hidróxido de sodio: Altamente tóxico y caustico.

Luz UV: Peligroso y puede dañar la retina de los ojos. Es mutagénico y carcinogénica.

Tetrametiletilendamina (TEMED): Extremadamente destructivo para tejidos, mucosas y tracto respiratorio, ojos y piel. Su inhalación puede ser fatal, puede causar irritación o quemaduras.

Tris: peligroso por inhalación y absorción por la piel.

Xilencianol: Inflamable y narcótico a altas concentraciones. Peligroso por inhalación y absorción. Apartar del calor, chispas y flamas.

V. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

Como resultado obtenemos el conjunto de normas que se deben seguir dentro de un laboratorio para evitar el mínimo riesgo de peligros o accidentes que puedan ocurrir; para esto nace la bioseguridad, que es la encargada de proteger a todo el grupo de trabajo dentro de un laboratorio.

Como medida obtenemos una serie de sugerencias para trabajar antes, durante y después dentro en un laboratorio, logrando evitar que ocurra cualquier tipo de riesgo.

Como conclusión, según el país donde nos encontremos, se rigen y establecen pautas y recomendaciones para tener un ambiente controlado, en nuestro caso el real decreto 486/1997 del 14 de abril nos brinda las

normas mínimas de seguridad y salud de los lugares de trabajos. Además el real decreto 664/1997 del 12 de mayo dentro del marco normativo de la ley 31/1995 del 8 de noviembre me define a toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genética (bacterias, hongos, virus y protozoos).

Podemos concluir que según al tipo de laboratorio en el que nos encontremos, el nivel de bioseguridad será más estricto en algunos casos que en otros.

Para evitar una gran cantidad de riesgos, debemos saber de antemano el funcionamiento y manejo adecuado de los equipos, así como los reactivos a utilizar.

REFERENCIAS [1] ICRA. Electroforesis y Fotodocumentador [en línea].

<http://www.icra.cat/files/equipament/SCT-UTBM%2003_2.pdf> [citado en 2 de septiembre de 2014]

[2] UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO. BIOSEGURIDAD [en línea]. <http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/file.php/84/Unidad_1_-_Bioseguridad/Bioseguridad.pdf> [citado en 2 de septiembre de 2014]

[3] UNIVERSIDAD DE ALICANTE. USO DE TERMOCICLADOR PARA PCR [en línea]. <http://sstti.ua.es/es/instrumentacion-cientifica/unidad-de-genomica-y-proteomica/uso-de-termociclador-para-pcr.html> [citado en 2 de septiembre de 2014]

[4] M. Victor,. S. Xavier. Uso de chips de AND (microarrays) en medicina: fundamentos tecnicos y procedimientos basicos para el analisis estadistico de resultados. [en línea]. <http://www.sc.ehu.es/ccwbayes/docencia/mmcc/docs/divulgativos/UsoDeChipsDeADN.pdf> [citado en 2 de septiembre de 2014]

[5] eHOW. Efectos secundarios del EDTA oral. [en línea]. <http://www.ehowenespanol.com/efectos-secundarios-del-edta-oral-sobre_106060/> [citado en 2 de septiembre de 2014]

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ANEXOS

a. Consultar otras sustancias toxicas que se utilicen en el laboratorio de Biologia molecular.

Amoniaco: En concentraciones elevadas irrita la garganta, inflama los pulmones, daña las vías respiratorias y los ojos. El amoníaco puede producir irritación de la piel, sobre todo si la piel se encuentra húmeda. Este compuesto es gaseoso en condiciones atmosféricas normales siendo poco probable su ingestión.

El EDTA: Es la abreviatura de calcio disódico edathamil, se utiliza para tratar el envenenamiento por plomo o mercurio. Provoca:

Los problemas cardíacos: El EDTA es un compuesto a base de calcio que tiene el potencial de causar arritmia en el corazón. El ritmo cardíaco es controlado por el corazón a través de señales que utilizan calcio para comunicarse. Esta comunicación es necesaria para contraer el músculo del corazón y bombear sangre ya sea para el resto del cuerpo o a los pulmones. Cuando el EDTA se une a los metales tóxicos, puede causar una baja concentración de calcio en el cuerpo, dejando el corazón con menos calcio para generar señales, desarrollando así arritmia.

A. La diabetes: El EDTA puede interactuar con los receptores de insulina. La insulina es una hormona que almacena la glucosa como energía en el cuerpo. El EDTA afecta específicamente a los receptores de insulina que se encuentran en el corazón. Esto no afecta el número de receptores pero disminuye la afinidad de insulina al receptor a la mitad de los receptores en el tejido cardíaco. Al igual que todos los músculos del cuerpo, el corazón utiliza la glucosa como energía. Los diabéticos deben tener cuidado cuando toman EDTA, ya que pueden empeorar su condición.B. Problemas de riñón y del hígado: El EDTA soluble en agua se filtra a través de los riñones y se excreta en la orina. Las personas con enfermedad renal deben tener cuidado porque la concentración de EDTA será mayor en el cuerpo ya que el riñón necesita más tiempo para filtrar el producto en estos individuos. La sobrecarga del riñón es peligrosa y puede empeorar la insuficiencia renal. Desequilibrio de electrolitos: El EDTA puede causar un desequilibrio electrolítico en el cuerpo mientras se une a metales tóxicos. Si una persona ya tiene niveles bajos de potasio o magnesio, el ETDA se puede unir al magnesio o al potasio causando que los niveles de sangre disminuyan aún más. Los niveles bajos de potasio pueden causar arritmia cardiaca debido a que el corazón utiliza potasio durante la conducción de la señal.C. La reactivación de la tuberculosis: La infección de la tuberculosis en los pulmones conduce a una formación de masas conocida como un granuloma, que está formada por la respuesta inmune del cuerpo para contener la infección bacteriana. El calcio se utiliza para mantener la masa junta. El EDTA se puede unir al calcio extra del cuerpo incluyendo al calcio del granuloma de la tuberculosis. Esto causará la liberación de las bacterias activas en el cuerpo.

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D. Reacciones alérgicas: Al igual que la mayoría de las drogas, el EDTA también puede causar reacciones alérgicas en algunas personas. La reacción alérgica se presenta como erupción cutánea, picazón, enrojecimiento, hinchazón y edema.

b. Consultar el uso de los siguientes equipos y menciónelos:

Termociclador de tiempo real: Teniendo en cuenta que la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) consiste en la amplificación de fragmentos de DNA mediante el uso de la enzima DNA polimerasa. Esta enzima tiene capacidad para sintetizar nuevas cadenas de DNA mediante la incorporación de bases nucleotídicas, a partir de una secuencia corta conocida (oligo, cebador o primer) que híbrida de forma complementaria con uno de los extremos de la hebra. El crecimiento de la nueva hebra se realiza en sentido 5’ a 3’.

Los actuales termocicladores son capaces de realizar rápidos cambios de temperatura que permiten realizar los tres pasos de la reacción de PCR de forma cíclica: desnaturalización del DNA, alineamiento o unión del cebador con la secuencia de DNA complementaria y extensión de la cadena. Algunos usos de este equipo son:

La PCR de punto final permite detectar y controlar fragmentos de ADN de interés (técnica de clonaje, recombinación dirigida, etc.).

Medicina: Como herramienta de diagnosis, como por ejemplo, el genotipado de especies que provocan un determinado cuadro infeccioso y en el diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma.

Paleontología, antropología biológica y ciencias forenses: permite recuperar las escasas cantidades de DNA que aún no se ha degradado.

Estudios evolutivos: establecimiento de relaciones filogenéticas de diferentes especies vegetales, animales y microorganismos.

Fotodocumentador de geles: La separación de las moléculas de ADN, procesadas en el gel de la electroforesis es visualizada y capturada en un sistema de fotodocumentador mediante la adición de un colorante específico que las hace visibles. En el caso de los genes de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del ADN y cuando se ilumina con la luz ultravioleta emite fluorescencia permitiendo la observación de ADN y de los marcadores del peso molecular. La imagen del gel de agarosa es registrada mediante una cámara digital.

Secuenciador automático: Con este equipo podemos determinar el orden de las bases de los nucleótidos en cualquier molécula dada. Un secuenciador de ADN automático inyecta lotes de ADN, de forma automática, en la parte superior del gel. Como tal, le ahorra a los investigadores una enorme cantidad de tiempo y esfuerzo. Después de que los lotes se inyectan, el secuenciador aplica automáticamente una carga negativa a un extremo del tanque, haciendo que las hebras migren a distancias variables a través del gel. Las diferentes distancias reflejan los diferentes tamaños de hebras de ADN que pasan a través del gel.

Microarrays: Tambien son llamados chip de ADN, es una superficie sólida a la cual se une una colección de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN

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son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de silicio. Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes, y se monitorean de manera simultánea los niveles de miles de ellos. Su funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la sonda específica, y la molécula diana, y se indican generalmente mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen, lo cual indica el nivel de expresión del gen. Suelen utilizarse para identificar genes con una expresión diferencial en condiciones distintas.

c. Consultar acerca de las señales que se deben tener en el laboratorio de genética y biología molecular.

Técnicamente se debe entender por señalización de seguridad y salud: el conjunto de estímulos que pretenden condicionar, con la antelación mínima necesaria, la actuación de aquel que los recibe frente a unas circunstancias que se pretende resaltar. Hemos de tener en cuenta las siguientes indicaciones:

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