INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

INFORME FINAL DEL PROYECTO: Mejoramiento del desarrollo de plantas medicinales en invernadero cultivadas con vermicomposta y en condiciones hidropónicas.

20050480, 20060632, y 20071320

PARTICIPANTES DEL 2007 PROFESORES: M. OLIVIA FRANCO HERNANDEZ.- DIRECTOR DEL PROYECTO LOURDES MORENO participante GUADALUPE GARCÍA VELASCO participante LUC DENDOOVEN participante ALUMNOS: Tania Erika Gazca Espinal (Ingeniería Ambiental) Claudia Guzmán Jaramillo (Ingeniería Ambiental) Lizeth Sánchez Balvás (Ingeniería Ambiental) López Hernández Jazmín Alejandra (Ingeniería Biotecnológica) Román Jiménez Morales (Doctorado) Estos alumnos se titularan con este proyecto, mediante la opción curricular en mayo del 2008., López Hernández se título en septiembre de 2007 con el proyecto : Detección de microorganismos del tracto digestivo de la lombriz roja californiana por PCREl alumno de doctorado terminará su trabajo experimental en junio 2008.

A CONTINUACIÓN SE PRESENTAN LOS RESULTADOS EN DOS CAPÍTULOS. CAPÍTULO I.- RESUMEN CAPÍTULO II.- INTRODUCCION CAPITULO III.- METODOS Y MATERIALES CAPITULO IV.- RESULTADOS CAPITULO V.- BIBLIOGRAFIA CAPITULO VI.- IMPACTO

CAPÍTULO I. RESUMEN

INTRODUCCIÓN. Los biosólidos de plantas de tratamiento de aguas residuales contienen concentraciones importantes de nitrógeno amoniacal y nitratos, así como carbono orgánico. Estos pueden ser utilizados como mejoradores de suelo ya que incrementan las concentraciones de nutrimentos y mejoran las propiedades fisicoquímicas. Mediante el proceso de vermicomposteo de los biosólidos, se elimina el mal olor y los microorganismos patógenos., reduciendo también la concentración de huevecillos de helminto1. El objetivo del presente trabajo fue optimizar el vermicomposteo de biosólidos industriales y evaluar la efectividad de la vermicomposta en un suelo degradado mediante fermentaciones sólidas y el uso de plantas con propiedades farmacéuticas como bioindicadores en condiciones de invernadero. METODOLOGÍA. Los biosólidos se recolectaron en Reciclagua, Lerma Edo de México y se realizó la caracterización fisicoquímica y microbiológica. Se preparó una pila de composta con el biosólido, una vez disminuida la temperatura se adicionaron las lombrices mezclado con paja y estiércol de caballo, sometió al proceso de vermicomposteo y temperatura estable. Posteriormente los residuos pretratados se pusieron en contacto con las lombrices y se cuantificó la viabilidad de estas y después se mantuvieron durante dos meses con 80% de humedad. La efectividad del producto se probó en un suelo de pastizal de Lerma, Toluca contaminado con cenizas de biosólidos, analizándose fisicoquímicamente de acuerdo a la NOM 0212. Se uso como bioindicador Mentha piperita y evaluando semanalmente crecimiento y número de hojas. RESULTADOS.- El suelo resultó ser franco arenoso con 68% arena, 12% arcilla y 17% limo, capacidad de retención de agua 59%, pH neutro y salinidad despreciable. La concentración de nitrógeno amoniacal para el suelo fue de 16.52 mg N-NH4

+/Kg y para la vermicomposta fue de 185 mgN-NH4

+/Kg (base seca BS) y para el biosólido fue de 1242 mgN-NH4+/KgBS. La concentración

de nitratos para el suelo fue de 34.3 mgN-NO3-1/KgBS, 265 para vermicomposta y para biosólido

95.2. Los coliformes fecales disminuyeron de 9.1X107 UFC en el biosólido a cero UFC en la vermicomposta. Las plantas de M. piperita y Salvia sp presentaron una altura mayor en suelo pero el número de hojas para M. piperita fue significativamente diferente mayor en el tratamiento de suelo con vermicomposta con 340 hojas por planta, y en los otros casos el número de hojas fue en promedio la mitad de este caso. Para la Salvia sp., también el número de hojas fue mejor en suelo con vermicomposta con 11 hojas y en donde hubo menor número de hojas fue en el suelo con biosólido. Se sugiere que existen compuestos no degradados en el biosólido que inhiben la formación de hojas CONCLUSIONES. El mejor tratamiento para eliminar proteasas fue la cal. Las características fisicoquímicas del suelo mejoraron y tambien las características físicas de las planta se vieron mejoradas con esta vermicomposta.

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CAPÍTULO II.- INTRODUCCION Actualmente en la ciudad de México se generan alrededor de 5000 t/ día de residuos orgánicos, esto representa una porción importante del total de los residuos sólidos (42%) (INEGI, 2004). En la Zona Metropolitana del Valle de México pasan ya las 20 000 t/ día, lo anterior representa un gran reto para las autoridades del Distrito Federal y del Estado de México, ya que estos residuos, la mayoría de las veces se vierten en sitios no controlados y en tiraderos a cielo abierto (Robles, 2005). Por ello el gobierno del DF y el Estado de México han aprobado la ley de los residuos sólidos, en la que la separación, aunque limitada, permitirá el aprovechamiento de orgánicos para la producción de composta y facilitará la separación de cada uno de los materiales inorgánicos que son reciclables. Para dar tratamiento a estos residuos es necesario implementar tecnologías que permitan obtener un beneficio para el ambiente así como para las comunidades que enfrentan este problema día con día. El vermicomposteo es el proceso que incluye una serie de transformaciones bioquímicas y microbiológicas que sufre la materia orgánica al pasar a través del tracto digestivo de las lombrices (Edwards et al., 1984) el producto se considera como uno de los abonos orgánicos de fácil manejo y producción rápida; tiene buenas características físicas, químicas, microbiológicas y nutrimentales (Kulkarni et al., 1996). CAPITULO III.- METODOS Y MATERIALES Se realizó el muestreo por triplicado de biosólidos y de un suelo degradado en Lerma Edo de México en un área de 1 Km2. Para el análisis microbiológico, se usó agar papa dextrosa para hongos y levaduras, agar cuenta estándar para bacterias y Czapek para actinomicetos. Las frutas y verduras de desecho se obtuvieron del tianguis de la misma zona, fueron molidas en un molino semi-industrial de aspas con capacidad de 20 Kg. Los desechos fueron principalmente de mango, piña, naranja, zanahoria. Posteriormente el material se puso en contacto con las lombrices (Eisenia foetida) en camas de concreto de 0.5 m2. Se mantuvo la humedad al 80% y se midió la temperatura diariamente, y en el producto se evaluaron la concentración de nitrógeno de nitratos (N-NO3

-), (N-NH4+),

Nitrógeno total, conductividad, fósforo soluble y carbono orgánico (APHA, AWWA, WPCFE, 1992). El experimento fue conducido según un diseño al azar con 3 tratamientos y 3 repeticiones (suelo control, suelo mas vermicomposta y suelo mas fertilizante químico), como unidad experimental se utilizaron plantas de Mentha piperita, se evaluaron 9 controles que fueron manejados con suelo de la Laguna Ticomán. El muestreo del suelo se llevo a cabo en un terreno cercano a la planta de tratamiento de aguas residuales RECICLAGUA (figura 5), ubicada en la Antigua carretera Lerma-Toluca, Estado de México.

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Figura 5.- Ubicación de RECICLAGUA y de la zona de muestreo de biosólido

1.1. MUESTREO DEL LODO Para la obtención del biosólido de la empresa RECICLAGUA, se colectaron muestras simples tomadas a la salida del filtro banda (figura 7.a y b) que es utilizado para eliminar agua de los biosólidos, antes de ser llevados al incinerador.

Figura 7.- Muestreo del biosólido. (a) Filtro banda CAPITULO IV.- RESULTADOS

CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DEL SUELO La textura del suelo fue franco arcillo arenosa con un porcentaje de arena de 65% y arcilla en un 30% (tabla 1). Porta et al., (1999) menciona que de acuerdo a la distribución de partícula este suelo corresponde a la categoría de areno-limoso o franco–arenoso, estos suelos se caracterizan por tener valores muy bajos de actividad química, fertilidad, velocidad de infiltración, permeabilidad, fácilmente erosionables y riesgo de encostramiento superficial entre otras teniendo una capacidad de retención de agua de un 90%. Son suelos con muy poca capacidad de drenado. En los suelos estudiados, se observa que en época de estiaje la humedad que presenta el suelo es muy baja (6-10%), para que exista un crecimiento de microorganismos y el desarrollo de plantas. De acuerdo a la clasificación del suelo en cuanto a su valor de pH la NOM-021-RECNAT-2000 reporta que un suelo con pH entre 7.4-8.5 corresponde a un suelo medianamente alcalino. Por lo tanto iones como Calcio, Azufre, Potasio, Fósforo, Hierro, Manganeso y Cinc se encuentra en formas poco disponibles. Tabla1. Textura de los suelos de la Laguna Ticomán DF

Distribución de partículas % Arcilla 35 Arena 60 Limo 5

5

Los suelos de la Laguna Ticomán presentaron una gran variabilidad en los valores de conductividad, con un intervalo de 10 a 75 dScm-1. Por lo tanto el sitio 1 resultó moderadamente salino y el sitio 2 y 3 son fuertemente salinos (NOM-021-RECNAT-2000). La concentración de nitrógeno total en los suelos de la Laguna Ticomán, fue mayor al 0.25%, lo cual representa un concentración alta (NOM-021-RECNAT-2000). Pero el nitrógeno asimilable como nitratos no fue detectable; el nitrógeno amoniacal presentó variaciones, encontrando para el sitio 1 un promedio de 20 mgKg S-1 y para el sitio 2 y 3 un promedio de 45 mgKg S-1, por lo que se trata de un suelo poco productivo y con ausencia de nitratos, probablemente debido a su salinidad (Porta et al.,1999). En cuanto a fósforo soluble (PO4

3-), la concentración encontrada fue de 0.49 a 3.78 mg P.kgS-1, lo cual indica un suelo pobre en fósforo. Los valores obtenidos para la capacidad de intercambio catiónico variaron entre 20 y 40 mEq/100g. De acuerdo a la normatividad este es un valor alto, debido a la concentración de arcillas en estos suelos. La concentración de carbono orgánico para estos fue menor al 0.8%, mientras que en un suelo rico en materia orgánica se encuentra hasta 52%.

CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA En la tabla 2, se presentan los resultados que se obtuvieron por métodos tradicionales y aunque no pueden revelar la población microbiana total absoluta, nos dan una idea de la calidad del suelo. Los hongos son muy activos en descomponer los principales compuestos celulósicos. La estructura física del suelo se mejora por la acumulación del mismo de los micelios de hongos. Sin embargo el número de hongos presente en el suelo de estudio, se encuentran por debajo de lo que reporta Burges (1958), esto puede deberse entre otras cosas al elevado pH del suelo, pues los requerimientos de los hongos en cuanto a pH menor a 7, por lo que se cree que los hongos aislados se encontraban en forma de esporas. En la vermicomposta no se detectó Salmonella y Coliformes totales 1100x1010 NMP/g h Tabla 2. Cuenta total de hongos, bacterias y actinomicetos en suelos alcalinos de la Laguna Ticomán, DF, y en la vermicomposta de frutas de desecho. Muestra

Hongos UFC/10g s

Bacterias UFC/10g s promedio

Actinomicetos UFC/10g s

Suelo

123 x103

115 x103

0

Suelo (Burges, 1958)

4 x 105

2.5 x 109

7 x 105

Vermicomposta

9x108

7 x109

1x1011

Vermicomposta (Velazco y Fdz, 1989)

11x109

1x108

3x109

Los resultados obtenidos nos indican según Velazco y Fernández (1989), que la concentración de bacterias y actinomicetos encontrados en la vermicomposta son bajas, mientras que los hongos se encuentran por arriba de lo reportado, estas diferencias se deben a la composición de los residuos que fueron suministrados a las lombrices, así como a las condiciones en las que se mantuvo la vermicomposta tales como humedad (73.7%) y temperatura (12.5ºC).

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Mediante el microcultivo se demostró que los hongos del suelo provenientes de los 3 sitios de estudio son del genero Penicillum, encontrándose al menos 7 especies con características morfológicas diferentes y en la vermicomposta se aislaron cinco géneros Penicillum, Aspergillus, Geotrichum, Rhizopus, Mucor (tabla 3).

Tabla 3. Géneros de los hongos aislados del suelo y de la vermicomposta Muestra Género de los hongos aislados Suelo Solo Penicillum Vermicomposta Penicillum Aspergillus Geotrichum Rhizopus Mucor

A diferencia del suelo que solo se aislaron hongos del género Penicillium, en la vermicomposta se encontraron cinco géneros diferentes (tabla 3). Como se esperaba no se detectó la presencia de coliformes fecales, pues las bacterias que forman parte del tracto digestivo de las lombrices se encargan de la eliminación de estos microorganismos, así como de algunos otros microorganismos patógenos (Barbados J, 2003).

CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LA VERMICOMPOSTA Los resultados obtenidos de la caracterización fisicoquímica de la vermicomposta (Tabla 4). La humedad se mantuvo dentro de lo que marca Grepe (2001), el pH resultó fuertemente alcalino. La conductividad de la composta resultó en la clasificación de fuertemente salina (NOM-021 RECNAT 2000) Tabla 4. Características fisicoquímicas de la vermicomposta de frutas de desecho.

Característica Promedio obtenido

Desv. std (Grepe, 2001) NOM-021

Humedad

73.7

0.1

30-60

pH

8.9

0.1

6.8-7.2

Fuertemente alcalino

Conductividad (dS*cm-1)

32.4

3.7

Muy fuertemente salino

Los resultados de la concentración nutrimental de la vermicomposta no corresponde con los reportado por Grepe (2001), la causa de tal diferencia se debe principalmente a la composición de los alimentos suministrados a las lombrices, ya que estos fueron únicamente residuos de frutas lo cual representa una variación en concentración de nitrógeno, carbono orgánico y fósforo soluble (tabla 5 y 6). Tabla 5. Composición nutrimental de la vermicomposta de desechos de fruta

Característica mg/Kg h s Obtenido

Desv. std mg/Kg hs (Grepe, 2001)

NOM-021

Nitrógeno 30,000 0 1000-2600 Muy alto Carbono orgánico 172,000 0.1 140,000-300,000 Fósforo 70 5.7 20,000-80,000 Alto

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Tabla 6. Concentración de NO3-, NH4

+ en la vermicomposta de desechos de fruta. CARACTERÍSTICA Promedio (mg/Kg hs) Desv. Std NO3

- 15.3 10.9 NH4

+ 54.7 4.3 El experimento inicio con una cantidad de 0.270 Kg. de lombrices y se les adicionó 10 Kg de sustrato pre-tratado, finalmente se obtuvo 1Kg de lombrices y 31 Kg de humus con las características antes mencionadas. Lo anterior representa un rendimiento del 60% para el humus y del 73% para la biomasa de lombriz (tabla 7). Tabla 7. Balance de sustrato- biomasa de lombriz- humus. SUSTRATO ACUMULADO (Kg.)

BIOMASA LOMBRIZ ACUMULADA (Kg.)

HUMUS (Kg.) TIEMPO (mes)

10 0.270 0 0 22 0.280 21 1 29 0.700 26 2 35 1 21 3 CRECIMIENTO DE Mentha piperita. La Mentha piperita fue una de las plantas elegidas para evaluar la calidad de los tratamientos aplicados al suelo. Se obtuvieron 76 plantas de menta por esquejes en agua, de las cuales se tomaron cuarenta, que después de mostrar una raíz lo suficientemente fuerte, fueron trasplantadas a los 3 tratamientos. Inmediatamente se midió la altura y el número de hojas por planta, con el fin de llevar a cabo un seguimiento semanal del incremento de estos, y poder evaluar así, la efectividad del tratamiento con respecto a las características físicas de las plantas. La figura 27 muestra la evolución del crecimiento de la menta con respecto al tiempo en cada tratamiento; puede observarse que en un inicio la altura de las plantas era mayor en el tratamiento suelo-biosólido-menta (SBM), seguido de suelo-vermicomposta-menta) y finalmente el tratamiento suelo-menta (SM). A lo largo de 10 semanas de tratamiento el crecimento de las plantas en SVM fue notorio aumentando aproximadamente 7 cm, aunque para SM el aumento fue similar, ya que la menta incremento su longitud 8 cm mas. En el caso del SBM, el aumento de la altura fue de solo 2 cm aproximadamente. Para la onceava semana se nota una disminución en la altura de los 3 tratamientos, debido a que las plantas se vieron afectadas por sequedad y aumento de temperatura en el invernadero; a partir de esa semana el incremento fue menos notorio, para los tres tratamientos, en donde la SVM y SM presentan valores similares en cuanto al tamaño. Labrador (1996), reporta que el crecimiento de las plantas esta aunado a la presencia de hormonas llamadas giberelinas, las cuales pueden ser producidas durante el proceso de vermicomposteo. La evaluación del número de hojas por semana se muestra en la figura 28, donde es de notarse que el tratamiento que ha resultado mas efectivo para el desarrollo optimo de la Mentha piperita es el SVM, en el cual el numero de hojas aumentó a una cantidad aproximada de 720 a lo largo de 10 semanas, en contraste a los otros tratamientos. Para la semana No. 11, se reporto una perdida en el numero de hojas de todos los tratamientos debido a la misma razón encontrada para la perdida de altura; aunque puede notarse que

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el incremento de las hojas permaneció siendo favorecido en el tratamiento con vermicomposta y no así para el suelo control.

Figura 28.- No de hojas de Mentha piperita por tratamiento con respecto al tiempo.

En la figura 29, se muestra una comparación del desarrollo de Mentha piperita en cada tratamiento, se observa que el numero de hojas incrementa de izquierda a derecha, es decir, el tratamiento SBM (a) presenta un numero inferior de hojas en comparación a SM (b) y a SVM (c), que es el que muestra una notable abundancia en cuanto a hojas se refiere, siendo esto de gran importancia pues el interés farmacéutico en estas plantas esta basado en sus hojas. Cabe destacar que, en el tratamiento SVM, la menta presenta una coloración mas intensa con respecto a los otros tratamientos, en donde las hojas de SBM, son de color mas claro, lo que podría significar que existe presencia de sales en el biosólido que fue agregado al suelo. De acuerdo a las observaciones visuales que se han realizado a lo largo del tratamiento, se ha notado que el suelo control en las macetas, tiende a secarse mas rápido y a endurecer, esto implica un mayor consumo de agua que hasta el momento es de 500 mL de semanales, pues esta planta requiere de suelos muy húmedos para sobrevivir exitosamente; en SVM y SB, la perdida de agua es menor, sin que se presente sequedad y endurecimiento, con la adición de 400 mL de agua por semana. Es importante destacar, que el medio propicio para el crecimiento de la menta incluye un pH neutro, clima templado, época especifica de siembra (verano), aunque en este trabajo su desarrollo se esta llevando a cabo en época de otoño, en cuanto al suelo es muy exigente, siendo mas apta para cultivarse en suelos areno-arcillosos o arenosos, bien drenados, fértiles; los requerimientos nutricionales son altos en P y N presentando respuesta a la fertilización con estos nutrientes, por lo que puede justificarse que la respuesta positiva al crecimiento en suelo con vermicomposta sea mayor en comparación a la del suelo control.

Figura.- Desarrollo de Mentha piperita por tratamiento. (a) Suelo con biosólido, (b) Suelo con vermicomposta.

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CRECIMIENTO DE Salvia sp. La Salvia sp. intentó germinarse colocando semillas de esta en placas que fueron incubadas a 25 °C, lo cual no puedo lograrse, pues las plantas se secaban, antes del desarrollo de las hojas. Posteriormente, en un nuevo intento por llevar a cabo la germinación, se utilizo tezontle contenido en recipientes y previamente lavado, el cual fue llevado a condiciones de invernadero, en donde fueron colocadas aproximadamente 800 semillas de Salvia sp.,de las cuales solo se desarrollaron 4, que después de un tiempo se perdieron, probablemente debido a la falta de nutrientes y a problemas con humedad y al aumento de temperatura del tezontle, el cual resultaba caliente al tacto. Finalmente, se opto por germinar las semillas en un suelo rico en materia orgánica, el cual fue colocado en semilleros, junto con la Salvia sp. estos fueron mantenidos en condiciones de laboratorio cuidando la humedad y temperatura a la que las semillas estaban expuestas, hasta que se logro el desarrollo de por lo menos dos pares de hojas. Luego de este tiempo y poco antes de que las plantas fueran llevadas a los tratamientos, se presento la propagación de una plaga de gusanos verdes, que se extendieron rápidamente por las hojas de las plantas, las cuales eran su alimento principal, de modo que una gran parte de las plantas se perdieron, lo que condujo a su vez a una nueva germinación de las plantas en las mismas condiciones antes mencionadas. Después de que se consiguió con éxito el crecimiento de la salvia en el laboratorio, 40 de estas plantas se tomaron para ser trasplantadas a los tratamientos en donde al igual que la menta, se evaluó la longitud y el numero de hojas por semana. La figura 30 muestra que el incremento de la longitud del tallo de la salvia ha sido mayor en el tratamiento suelo-salvia (SS), siendo el mas efectivo en cuanto al crecimiento de la planta, en comparación de SVS y SBS, los cuales muestras un crecimiento mas lento.

Para la semana 16, el incremento de las hojas de salvia habia sido más notorio en el tratamiento SBS, donde se logro obtener aproximadamente 58 hojas, seguido del SS con 30 hojas y finalmente el SVS con 28, este resultado refleja, que las características fisicoquímicas de estos dos tratamientos, no son las adecuadas para llevar al máximo el numero de hojas de Salvia sp (figura 31).

Figura 31.- No. de hojas de Salvia sp. por tratamiento con respecto al tiempo.

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La figura 32 muestra el estado de la salvia a 6 semanas de iniciado el tratamiento. Resulta ser evidente que el desarrollo de salvia en SBS (a) es menor a comparación de los otros tratamientos. SS (b), a pesar de presentar mayor crecimiento longitudinal, no presenta un amplio desarrollo en el número de hojas, a demás de que su tallo es muy débil impidiendo que pueda sostenerse y tienda a inclinarse. Por el contrario SVS (c), es el tratamiento en el que las hojas han llegado a su máximo desarrollo, junto con la firmeza de la planta.

La floración de la Salvia sp. se observo durante la semana No. 10,con algunos pequeños brotes de flores en algunas plantas de cada tratamiento, notándose que en la semana 15, todos los tratamientos presentaban floración, por lo que se procedió a cosechar. La figura 33 muestra el estado de la Salvia sp. en la semana 16 en cada tratamiento antes de la cosecha. Cabe destacar que aunque el tratamiento con biosólido resultó ser el que contribuyo a que se desarrollaran mayor número de hojas, fue n este mismo en el que el tamaño de las hojas se notó menor en comparación de los otros tratamientos, observándose mayor longitud en las hojas del suelo con vermicomposta. Los estudios con vermicompostas han demostrado consistentemente que los residuos orgánicos vermicomposteados tienen efectos benéficos sobre el crecimiento de la planta independientemente de las transformaciones y la disponibilidad de los elementos nutritivos. Cuando la vermicomposta se han utilizado como mejorador del suelo, ha mejorado consistentemente la germinación de las semillas, el incremento en el crecimiento y desarrollo de las plántulas, y una creciente productividad de la planta, mucho más de la que pudiera ser posible de la mera conversión de los elementos minerales en formas más accesibles para la planta (Atiyeh et al., 2002), aspectos que pueden verse reflejado en el desarrollo de los bioindicadores utilizados en este trabajo.

CONCLUSIONES • El análisis fisicoquímico indica que el suelo se encuentra degradado, debido a su

baja capacidad de intercambio catiónico, traducida en una deficiencia en la retención de nutrientes, además de una escasa concentración de fósforo inorgánico, siendo este, el mayor limitante para su uso agrícola. • El producto resultante del proceso de vermicomposteo de biosólidos, es un

material con características fisicoquímicas apropiadas para ser aprovechado como un mejorador de la calidad del suelo. • La adición del consorcio bacteriano (estiércol), a una mayor cantidad de sustrato

con menor población de lombrices, contribuyó en la optimización del vermicomposteo de biosólidos industriales, lo cual se reflejo en la disminución del tiempo de proceso de 6 (Ojeda, 2006) a 3 meses, teniendo como principales beneficios el incremento en el rendimiento de humus y biomasa (lombrices), mejora en la calidad fisicoquímica del producto, además de la conservación del índice de eliminación de microorganismos patógenos. • Las características fisicoquímicas con respecto al nitrógeno de los tres

tratamientos, sufrieron alteraciones con el paso del tiempo, lo que presuntamente se atribuye a las interacciones entre los microorganismos y los nutrientes presentes en las mezclas de suelo, biosólido y vermicomposta. • Por medio de las fermentaciones solidas se logro verificar la calidad de la

vermicomposta aplicada al suelo degradado, ya que se logro determinar que la transformación de amonio a nitrato es más rápida y en mayor cantidad en dicho

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tratamiento, lo que se traduce en mayor disponibilidad de nitrógeno asimilable para las plantas. • Con el tratamiento SVM se obtuvo el máximo desarrollo de crecimiento de Mentha

piperita, en comparación a los otros tratamientos, pues el incremento en el numero de hojas y la longitud del tallo fue evidente. • La Salvia sp. demostró que el tratamiento SBS fue el más efectivo, debido a que

en este tratamiento se desarrollaron el mayor número de hojas, aunque de menor tamaño en contraste a SVS, sin embargo en el tratamiento SS se obtuvo el mejor desarrollo en cuanto a longitud, ligeramente por encima de SVS, pero sin mostrar beneficio en el aumento del número de hojas,

• La experimentación que se llevó a cabo indica que el tratamiento suelo-

vermicomposta ha resultado positivo para Mentha piperita, de acuerdo a la medición de los parámetros físicos de los biondicadores. • Los beneficios encontrados durante el tratamiento parecen estar asociados, a los

efectos de los nutrientes, las sustancias húmicas presentes en la vermicomposta o a los reguladores de crecimiento de la planta asociados con los ácidos húmicos, aunque este se debe comprobar experimentalmente en el laboratorio. REFERENCIAS

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2. Atiyeh. 2000. Uso de vermicomposta a partir de diferentes sustratos como estiércol de cerdo, vaca y borrego para incrementar la productividad de diversos cultivos como tomates.

3. Barbados J. 2003. Cría de lombrices. Primera edición Albatros. Buenos Aires.

4. Benítez, 2000. Crecimiento vegetativo de frambuesa con la aplicación de vermicomposta asociada con lupino.

5. Capistrán E, Aranda, F., y Romero, J.C. 2004. Manual de reciclaje, compostaje y lombricompostaje. 151pp. Primera edición. Instituto de Ecología A.C. Xalapa Ver. México.

6. Edwards, C.A., 1984. The use of earthworms in the breakdown and management of organic wastes. In: Edwards, C.A. (Ed.), Earthworm Ecology. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 327±354.

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8. Grepe N, 2001. Lombricultura. 58pp. Primera edición. Grupo editorial Iberoamericana SA de CV. DF. México.

9. Ley General de Residuos Sólidos, GDF. 2004. 10. NOM–021-RECNAT- 2000. Que establece las especificaciones de fertilidad,

salinidad y clasificación de suelos. Estudios, muestreo y análisis.

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11. NOM-092-SSA1-1994. Método para la cuenta de bacterias aerobias en

placa. 12. NOM-111-SSA1-1994. Método para la cuenta de mohos y levaduras en

alimentos. 13. NOM-112-SSA1-1994. Determinación de bacterias coliformes, técnica del

número más probable. 14. NOM-114-SSA1-1994. Determinación de Salmonella en alimentos. 15. Ortiz Villanueva B. y Solorio Ortiz C. A. 1987. Edafología Sexta edición,

Universidad Autónoma de Chapingo México. 16. Primo Yúfera, E. y Carrasco Dorrién J. M (1973). “Química Agrícola”.

Suelos y fertilizantes. Editorial Alhambra. Primera edición. Barcelona, España. Pag. 472.

17. Robles F. 2005. Generación de biogás y lixiviados en los rellenos sanitarios. Primera edición. IPN

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Detección de microorganismos del tracto digestivo de la lombriz roja californiana por PCR II. Revisión Literaria Los métodos usados en la identificación de bacterias son los fenotípicos, los cuáles ponen

en evidencia los productos de los genes (pruebas bioquímicas) y los genotípicos (estudio

de ácidos nucleicos).

2.1 Métodos Fenotípicos 2.1.1 Aislamiento El aislamiento es un proceso que nos permite separar microorganismos, forzándolos a

crecer en un sustrato, mediante la siembra por las técnicas de estría cruzada y vaciado

en placa. (Rodríguez, 1994)

La separación de microorganismos presentes en una población mixta puede lograrse de

varias maneras:

Separación física de los microorganismos mediante diluciones

Por agotamiento de inóculo en un medio de cultivo sólido.

Mediante la utilización de medios de cultivo selectivos.

Aprovechamiento de características particulares de ellos.

2.1.2 Tinción de Gram Desarrollada empíricamente por Chistian Gram, es un método de doble tinción

diferenciando a las bacterias en Gram (+) y Gram (-), la diferencia de la reacción se basa

en la composición y estructura de la pared celular.

Las bacterias Gram positivas presentan una pared celular relativamente gruesa, con un

mayor contenido de peptidoglucano (20 a 80%) y con numerosos enlaces transversales

entra las cadenas de N-acetil-murámico y N-acetil-glucosamina. En este grupo bacteriano,

el decolorante deshidrata y reduce la permeabilidad de la pared, por lo que al ser tratadas

con alcohol acetona no pierden el complejo cristal violeta-yodo.

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En tanto que en las bacterias Gram negativas, la pared celular es mas delgada y contiene

poco peptidoglucano (5 a 10%) con pocos enlaces transversales, estas bacterias

presentan una capa externa constituida por lipopolisacáridos; en éstas el alcohol-acetona

disuelve los abundantes lípidos (20 a35%) de la pared, abriendo los poros y facilitando la

salida del complejo cristal violeta-yodo y la decoloración, por lo que las bacterias se

tornan invisibles, y reaccionan con la safranina.(Ramírez,2003)

2.2 Pruebas Bioquímicas

2.2.1 Fermentación de carbohidratos en tubos con caldo Rojo de Fenol Determina la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un

medio, produciendo ácido y/o gas. ( Mac Fadding, 1993)

2.2.2 Fermentación de azucares en medio TSI Determina la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción de

gas a partir de la glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro

férrico al reaccionar con el hierro, la liberación de ácido sulfhídrico se libera por acción

enzimático, de los aminoácidos que contiene azufre produciendo una reacción visible

color negro. (Mac Fadding, 1993)

2.2.3 Rojo de Metilo Prtueba cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos que produzcan

ácidos lácticos, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por vía de la fermentación mixta.

Solo se concidera positivos aquellos organismos que puedan mantener pH bajo por largo

tiempo. (Mac Fadding, 1993)

2.2.4 Voges-Proskauer Se utiliza para identificar bacterias que al degradar la glucosa por la vía de la

fermentación ácido-mixta, producen acetoína como principal subproducto y menor

cantidad de ácidos fuertes.( Mac Fadding, 1993)

15

2.2.5 Citrato de Simmons dentifica bacterias que utilizan como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo

del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para

entrar al ciclo de Krebs. Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen

del pH del medio si es alcalino se produce mas acetato y formato con una disminución del

lactato y CO2. Por enzima del pH de 7 no hay producción de lactato y los productos son

CO2 ácido formica y acético.

Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de

utilización del lactato. (Mac Fadding, 1993 y Ramírez, 2003).

2.2.6 Caldo Urea La urea es una diamida del ácido carbónico y ésta es fácilmente hidrolizada con la

liberación de amoníaco y dióxido de carbono reaccionando en solución y formando

carbonato de amonio como producto final.

La enzima ureasa que posee un microorganismo puede hidrolizar a la urea presente en el

medio de cultivo.

2.2.7 Licuefacción de la Gelatina Identifica bacterias con la capacidad de producir enzimas proteolíticas.

Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo

tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes mas pequeños, las

enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias

para desdoblar a las proteínas (Mac Fadding, 1993 y Ramírez, 2003).

2.2.8 Medio SIM Mas sensible que el medio TSI y KIA , por que carece de carbohidratos que inhiban la

formación de H2S y al uso de hiero peptonado como indicador.

2.2.9 Medio MIO Medio que sirve para la lectura de movilidad, producción de Indol y descarboxilación de la

ornitina.

Movilidad: Determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos.

16

Indol: Capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la molécula de triptófano,

siendo oxidado para formar indol, escatol e indolacético por medio del complejo

enzimático triptofanasa.

Descarboxilación de la ornitina: Capacidad enzimática de un microorganismo de

descarboxilarla para formar una amina(Mac Fadding, 1993 y Ramírez, 2003).

2.2.10 Medio LIA Determina la descarboboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis.

La descarboxilación de la lisina determina la capacidad enzimática de un microorganismo

de descaboxilarla para formar una amina y alcalinizar el medio (proceso realizado por la

enzima lisina descarboxilasa).

La desaminación puede ser oxidativa o reductiva; en el primer caso, se obtiene cetoácido

y amoníaco. La desaminación reductiva se da con frecuencia en microorganismos

anaerobios como los clostridios, los que dan origen a un ácido graso saturado y

amoníaco. . (Ramírez, 2003).

2.2.11 Reducción de Nitratos Los microorganismos facultativos, durante la respiración utilizan como aceptor final de

electrones al oxigeno y, en ausencia, de éste a los nitratos, los que son reducidos a

nitritos, óxido de nitrógeno o a nitrógeno molecular. ( Ramírez, 2003).

2.2.12 Hugh y Leifson Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativa u oxidativamente, los

subproductos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes. Los ácidos

formados por degradación oxidativa de la glucosa son sumamente débiles capacidad

detectada por el medio OF. . (Mac Fadding, 1993 y Ramírez, 2003).

2.2.13 Citocromo Oxidasa El sistema citocromo oxidasa se encuentra en los microorganismos aerobios o anaerobios

facultativos, sistema que contiene a la enzima citocromo oxidasa, la cuál activa la

oxidación del citocromo que es reducido por el oxigeno molecular que produce agua o

peroxido de hidrógeno según la especie.El oxigeno actúa por tanto como aceptor final de

electrones en la cadena transportadora de electrones. . (Mac Fadding, 1993 ).

2.2.14 Producción de Catalasa

17

Determina la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra tanto en bacterias

aerobias como anaerobias facultativas que contiene citicromo.

La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno y agua.

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo

oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono( Ramírez, 2003).

2.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una de las técnicas mas usadas en la

actualidad para la identificación, de nuevos genes, en estudios taxonómicos y evolutivos,

y es estudio de genética de poblaciones, se emplean regiones altamente variables, o

polimorfitas, como las regiones repetidas en tandem en número variable (VNTR), que

constituyen las regiones mini y microsatélites, y los resultados se conocen como huella

genética (DNA fingerprint).

Consiste en una amplificación (aumento en el número de copias), de secuencias o

fragmentos específicos del DNA genómico o clonado (DNA molde), mediante el uso de

oligonucleotidos o primers, dNTP´s (los cuatro desoxinucleotidos trifosfato) y una DNA

polimerasa.

El DNA molde contiene las secuencias objetivo o blanco que pueden ser de unas

decenas, hasta miles de nucleótidos de longitud, y los primers- que actúan como

iniciadores- se unen a los extremos (3’ de una cadena y 5’ de la otra) de estas

secuencias, para que después la DNA polimerasa copie en DNA molde, empleando para

ello a los dNTP´s y se obtenga una nueva copia de ese fragmento. Ya que la unión de los

primers requiere que el DNA molde separe sus dos cadenas, se debe aumentar la

temperatura, hasta 90°C, (desnaturalización), sin embargo debe bajarse hasta 50-60°C,

para permitir la unión (hibridación) de los oligonucleótidos con su secuencia

complementaria en el DNA molde, después se vulva a subir la temperatura hasta 70°C

para permitir la copia del fragmento o polimerización por la DNA polimerasa. Estos

eventos se repiten varias veces en ciclos, que resumidos son:

• Desnaturalización del DNA molde a alta temperatura (90°C)

• Alineamiento de los primers a su secuencia complementaria

• Polimerización del fragmento para producir copias de DNA de doble cadena de las

secuencias objetivo

18

• Verificación de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis

III. Antecedentes Hyun-Jun et al., (2004 ) amplificaron 16S rDNA de Eisenia fetida utilizando dos primers

universales, p27F (5’-AGA GTT TCA TCM TGG CTC AG-3’) y p525R (5’-GYT ACC TTG

TTA CGA CTT-3’), utilizaron un kit para la purificación de las secuencias amplificadas

16S dDNA.

La similitud de las secuencias fue llevada a acabo por el programa BLAST y fueron

alineadas por el programa PHYDIT. Las secuencias de 16S dDNA fueron comparadas en

éstos con las cadenas tipo del Gen Bank database.

Algunas bacterias identificados fueron:

1. Aeromonas media

2. Aromyces ulmi

3. Bacillus pulmilus

4. Bosea thiooxidans

5. Microbacterium aurum

6. Nocardia asteroides

7. Rhodococcus opacus

8. Streptomyces setonill

Marcus et al.(2002) determinaron que la producción de N2 O in vivo por la lombriz de tierra

esta asociada con los microorganismos contenidos en su intestino, así como que la

mayor concentración in situ de N2 O fue el gut lumen.

Blazejak et al.(2004) analizaron la población de simbiontes de O. crassitunicatus mediante

la amplificación con primers específicos para los genes bacterianos 16S rRNA (primers

8F Y 1492R).

Los productos de PCR fueron clonados separadamente usando un kit de clonación TA

(Invitrogen, Breda, The Netherlands), para la correcta inserción utilizaron vectores M13F y

M13R.

Las secuencias de 16S rRNA de simbiontes fueron revisadas en el banco de datos

GenBank usando BLAST. Las secuencias de 16S rRNA fueron analizadas por el software

ARB (www.arb-home.de) . El árbol genealógico fue armado con 1400 pb.

19

Dubilier et al.(1995) caracterizaron bacterias simbiontes quimiautotrófos de Oligochaeta,

Annelida comparando las secuencias para el análisis genético en el editor de secuencias

Genetic Data Environment .

Utilizaron las secuencias de simbiontes de RDP (Ribosomal Database Project),

obteniéndose algunos de los siguientes resultados:

1. Laxus sp.

2. Solemya reidi

3. Vesicomya cordata

4. Bathymodiolus thermophilus

IV. Justificación:

El vermicomposteo es el proceso que incluye una serie de transformaciones bioquímicas

y microbiológicas de la materia orgánica al pasar a través del tracto digestivo de las

lombrices (Edwars et al., 1984) , el producto se considera como uno de los abonos

orgánicos de fácil manejo y producción rápida; tiene buenas características físicas,

químicas, microbiológicas y nutrimentales (Kulkarni el al., 1996). La acción de las

lombrices no es aislada, sino que se realiza en múltiples vías, junto con los

microorganismos degradadores a los cuales favorece y multiplica.

En el aparato digestivo trituran y muelen la materia orgánica, incrementando en miles de

veces la superficie de exposición a los microorganismos, lo que facilita también su acceso

y degradación. Éstos microorganismos han sido motivo de diferentes estudios, existen

diferentes consorcios microbianos (microorganismos nitrificantes), los cuáles se buscan

sean identificados y conocido su mecanismo de trabajo.

V. Objetivo General:

Identificar las poblaciones microbianas en el tracto digestivo de Eisenia sp por

técnicas convencionales y PCR .

VI. Objetivos Particulares:

20

Aislar y purificar por técnicas convencionales los m.o presentes en el tracto

digestivo de Eisenia sp.

Identificar por técnicas moleculares y convencionales los m.o aislados (nitrificantes

principalmente) presentes en el tracto digestivo de Eisenia sp,

VII. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1 Aislamiento Primario

Se obtuvieron muestras de la lombriz roja californiana de la vermicomposta tratada con

desechos orgánicos del mercado de Ticomán, se procedió a la realización del lavado y

posteriormente a la inmovilización de las lombrices con alcohol etílico desnaturalizado.

Para la extracción de los consorcios microbianos se extrajo el contenido del intestino

mediante una insición transversal al tracto de la lombriz, en tubos conteniendo solución

salina estéril se realizaron diluciones hasta 10-5 y 10-6 , mismas que fueron sembradas en

medio infusión cerebro corazón (BHI) por la técnica de extensión por varilla y por

duplicado.

La incubación se dio a 35°C durante 24h, trascurrido ese lapso de tiempo se procedió a la

selección de cepas con morfología colonial diferente entre ellas, siendo sembradas en

tubos de 13/100 con medio BHI.

Las cepas resembradas fueron incubadas a las condiciones anteriores, a las 24h de

incubación se realizó la técnica de Gram para cada una de ellas.

Las cepas puras fueron almacenadas a 4°C y los consorcios fueron resembrados en agar

cuenta estándar por la técnica de estría cruzada siendo incubadas a 35°C X24h.

Las cepas de tamaño entre 1 y 2 mm fueron resembradas en agar nutritivo para promover

su crecimiento y poder realizar la técnica de Gram.

7.2 Aislamiento Secundario El protocolo anterior fue repetido pero la siembra se realizó en medios diferenciales y

selectivos:

Agar Sellers

Agar Mac Conkey

Agar EMB

21

Agar Columbia

Agar Sanders

Tanto para el aislamiento primario como para el secundario se tomaron en cuenta las

siguientes características:

Tamaño

Forma

Borde

Elevación

Luz reflejada

Luz transmitida

7.2.1 Pruebas bioquímicas Para la realización de las pruebas bioquímicas se resembraron las cepas aisladas a 24h.

Las pruebas fueron realizadas por triplicado.

En tubos de 13/100 con solución salina estéril se inocularon con 3 asadas de cada cultivo,

los cuales sirvieron para la siembra de cada una de las pruebas.

7.2.2 Tinción de Gram

De una cepa de 24h de incubación se tomó una asada a un portaobjetos (con una gota

de agua), Haciendo frotis se fijó a la flama.

Se cubrió el frotis con solución cristal violeta por un minuto, transcurrido el tiempo se

procedió a un lavado y se adiciono lugol por un minuto, se lavó y se decoloro con alcohol-

cetona, lavado inmediatamente, seguido se adicionó safranina por treinta segundos, se

lavó, se dejó secar la muestra y posteriormente se observo al microscopio en el objetivo

100X.

7.2.3 Fermentación de Carbohidratos en tubos con Caldo Rojo de Fenol Manitol Se inocularon los tubos por picadura y estría en el pico de flauta. Los tubos inoculados se

incubaron a 35°C durante24h.

Una prueba positiva para glucosa: Fondo del tubo amarillo y negativa sin cambio

Una prueba positiva para sacarosa y lactosa: Superficie amarilla y negativa roja

Prueba positiva para lactosa: Coloración amarillo en el pico de flauta y negativo roja.

Producción de H2S: Presencia de coloración negra.

22

Producción de CO2 y H2 : Presencia de burbujas, lijera muesca en el costado del tubo o

desplazamiento de medio.

7.2.4 Prueba Rojo de Metilo Se inocularon los tubos que contenían al caldo rojo de metilo a partir de la suspensión, se

incubaron durante 48h a 37°C. Después de la incubación, se añadio al tubo 2 gotas de la

solución rojo de metilo.

Prueba positiva: El cultivo presenta coloración roja y una prueba negativa no presenta vire

de color.

7.2.5 Voges-Proskauer Se inocularon los tubos que contenían al caldo Voges-Proskauer a partir de la

suspensión, se incubaron durante 24h a 37°C. Después de incubar se agregarón 6 gotas

de la solución alfa-naftol y 2 gotas de la solución KOH, se agitó suavemente y se dejó

reposar 15 minutos . Prueba positiva: Coloración roja en la superficie del medio y una negativa sin cambio.

7.2.6 Citrato de Simmons Se inocularon los tubos que contenían agar Citrato de Simmons en forma de S a partir

de la suspensión, se incubaron durante 24h a 37°C..

Prueba positiva: Desarrollo de coloración azul y una negativa sin cambio.

7.2.7 Caldo Urea Se inocularon los tubos que contenían al caldo Urea a partir de la suspensión, se

incubaron durante 24h a 37°C.

Prueba positiva: Color rosa fucsia en el medio y negativa sin cambio.

7.2.8 Licuefacción de la Gelatina Se inocularon los tubos que contenían gelatina nutritiva a partir de la suspensión por

picadura, se incubaron durante 48h a 37°C, transcurrido el tiempo se sacaron los tubos de

la incubadora y se colocaron en el refrigerador por cinco minitos junto al testigo.

Prueba positiva se observa licuefacción de la gelatina.

23

7.2.9 Medio SIM Se inocularon los tubos que contenían medio SIM a partir de la suspensión por picadura,

se incubaron durante 24h a 37°C. Después de la incubación se añadieron 3 gotas del

reactivo de Kovac’s.

Producción de H2S: Presencia precipitado negro alrededor de la picadura

Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie.

7.2.10 Medio MIO Se inocularon los tubos que contenían medio MIO a partir de la suspensión, se incubaron

durante 24h a 37°C. Después de la incubación se adicionó 3 gotas del reactivo de

Kovac’s.

Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.

Descarboxilación de la ornitina positiva: Coloración púrpura y negativa amarilla.

Indol positivo, formación de un anillo rosa o rojo e indol negativo sin anillo.

7.2.11 Medio LIA Se inocularon los tubos que contenían medio LIA a partir de la suspensión por picadura y

estria, se incubaron durante 24h a 37°C.

Desaminación de aminoácidos positiva: Superficie color rojo vino y negativo sin cambios.

Descarboxilación de aminoácidos positiva: Fondo del tubo color púrpura y negativa

amarillo.

7.2.12 Reducción de Nitritos Se inocularon los tubos que contenían al caldo nitrato a partir de la suspensión, se

incubaron durante 24h a 37°C. Después de incubar se añadió al tubo 3 gotas de alfa-

naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico.

Prueba positiva: Aparición de color roja y negativo sin cambios.

Nota_ Si no se presenta coloración roja se adiciona Zinc al medio, reduce a los nitratos

presentes y se forma el color rojo.

24

7.2.13 Hugh y Leifson Se inocularon los tubos que contenían al medio OF a partir de la suspensión por

picadura, se incubaron durante 48h a 37°C.

A un tubo se le añadió 1mL de aceite mineral estéril para propiciar ambiente de

anaerobiosis.

7.2.14 Citocromo Oxidasa A una hoja de papel filtro se le impregnó con el reactivo N.N-tetrametil-p-fenilendiamina

recién preparado, se tomó una asada del cultivo TSI y se frotó en el papel, una coloración

azul violeta es positiva.

7.2.15 Catalasa Se colocó en un portaobjetos limpio dos gotas de peróxido de hidrógeno, se tomo una

asada de TSI y se colocó sobre el mismo.

Una prueba positiva se indica por la presencia de burbujas de oxígeno.

7.3 Pruebas Moleculares

7.3.1 Preparación de la reacción de PCR Se descongelaron los reactivos de PCR (Buffer, MgCl2 , dNTPs, primers) y se realizaron

los cálculos para obtener las concentraciones requeridas por la reacción,

La mezcla de reacción (mix) se realizó sobre hielo y posteriormente se le adicionó la

enzima Taq polimerasa (almacenada a -20”C). Se colocaron alícuotas de 24µ L de la

mezcla en tubos de microcentrífuga.

Para cada cepa se tomo una muestra de 1 µL de la siembra en caja.

Se dio un pulso de centrífuga y posteriormente los tubos se colocaron en el termociclador

previamente programado.

Tabla 2_ Concentraciones y volúmenes de los reactivos utilizados en la PCR

Reactivo Concentración de

almacenamiento

Concentración final Volumen

Buffer de PCR 10X 1X 10µL

dNTPs 10Mm 0.1 Mm 2µL

25

MgCl 50Mm 0.2 Mm 3µL

Primer mix 10mM c/u 0.5mM c/u 5µL

DNA templado - - 1µL

TAQ POLIMERASA 5U/µL 2.5 U/µL 0.5µL

dH2O - - 100µL

BSA 10 mg/mL 1 mg/mL 7.5µL

7.3.2 Programa para la PCR Temperatura de primera desnaturalización del DNA 95°C.

Temperatura segunda desnaturalización del DNA 94°C

Temperatura de hibridación 55°C

Temperatura de polimerización 72°C

7.3.3 Primers Los iniciadores utilizados fueron los reportados por Kwang-Hee et al.,(2004), los cuáles

fueron utilizados para la amplificación del DNA de los microorganismos del tracto

digestivo de Eisenia fetida de los suelos de Korea.

p27F(5’AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3’)

p1525R(5’GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)

95°C 15 min. 94°C 1 min. 55°C 1 min. 72°C 1 min. 72°C 7 min.

30 ciclos

26

7.3.4 Verificación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis Terminado el tiempo de la programación del termociclador, se procedió a tomar 2µL de

cada tubo y a mezclarlor con 2µL de Buffer de corrimiento y se cargó en gel de agarosa

al 1%, con TAE .

La electroforesis se corrió a 130mV por10 minutos el marcador utilizado fue de 100pb.

Transcurrido el tiepo se retiró el gel de la cámara de electroforesis y se pasó a un

contenedor con bromuro de etidio durante 15 minutos, después de lavó y se procedio a

ser revelado en el equipo

VIII. Resultados y Discusión

8.1 Morfología Colonial En la tabla 3 se pueden observar los elementos que fueron considerados para poder

llevar a cabo el aislamiento primario, tomando como base las diferencias entre las cepas

obtenidas. La mayoría resultó translúcida y de forma circular y con tamaños de radio,

menores a los 0.5 cm.

Tabla 3_ Morfología Colonial para las 16 cepas aisladas.

Cepa Tamaño cm

Forma Elevación Borde Luz Reflejada

Luz Transmitida

Ais con

0.5 Irregular Convexa Entero Mate Translúcida

Ais 22 1

0.1 circular Plana Entero Brillante Translúcida

20 0.2 Circular Elevada Ondulado Mate Translúcida

27

27 0.3 Circular Plana Ondulado Brillante Translúcida 32- 0.5 Circular Pulvinada Ondulado Brillante Translúcida 60 0.1 Circular Plana Enteros Mate Traslúcida 3 0.2 Circular Convexa Ondulado Mate Translúcida 28 0.1 Circular Plana Entero Mate Translúcida 55 1 Circular Convexa Entero Brillante Translúcida I3 0.3 Circular Elevada Entero Mate Traslúcida 46I 0.2 Irregular Umbonada Ondulado Mate Transparente I2 0.2 Circular Plana Entero Brillante Translúcida 35 0.5 Circular Elevada Entero Brillante Transparente ConII 1 Irregular Umbilicada Ondulado Brillante Traslúcida Col2 0.5 Circular Convexa Rizado Brillante Translúcida 34I 1 Circular Convexa Entero Mate Translúcida 14I 1 Irregular Pulvinada Ondulado Brillante Translúcida Emb A2

0.5 Irregular Plana Ondulado Brillante Traslúcida

8.2 Resultados Pruebas Bioquímicas Como se puede observar en la tabla 4, todas las cepas aisladas reducen los nitratos a

nitritos, son gram + y catalasa + , oxidativas-fermentativas. El crecimiento del 100%de las

bacterias fue facultativo, lo cuál nos dice que el ambiente de la vermicomposta ofrece las

características apropiadas para el desarrollo de microorganismos capaces de adaptarse

al medio. En la prueba de reducción de nitratos se observa que el 82% de las bacterias

son capaces de llevar a cabo las reacciones de desnitrificación, dado que los

microorganismos desnitrificantes son los mas variados y más fáciles de aislar ya que

crecen en muchos sustratos. La nitrificación en este caso puede ser uno de los controles

de la desnitrificación esto nos indicaría que existe una interacción entre los dos procesos,

estableciendo un equilibrio entre ellos.

Tabla 4_Pruebas bioquímicas básicas para identificación de género

Ce- pa.

Gram

Forma

M CA Canae Catalasa Oxidasa. PA F/O/-

RN

Ais con

- B + + D - + - - +

Ais 22 1

- B + + D - + - F +

20 - B - + + + + - F + 27 - C + + D - + - O/- -

28

32- - B - + D - + - O/F + 60 + C D + + + + - F - 3 - C - + + + - - - + 28 - C + + D + + - - + 55 + B D + + - + + F + I3 + C - + + - - + - + 46I + B + + D V V + O/- + I2 + C D + + - - + - + 35 + B D + + + - - - + ConII + B + + + + - + F + Col2 + B - + + + - - F - 34I + B + + + + - - O/F + 14I + B + + D + - + F + 11 - B + + + + - V O/F + EMB A2

+ B + + + + + - F +

B=forma de bacilos, C=forma de cocos,M=movilidad,CA=crecimiento aerobio,

Canae=crecimiento anaerobio,PA=producción de ácido, F/O/-=Huhg-Leiifson,

RN=reducción de nitratos, V=variable, O=oxidativo,F=fermentativo,D=reacción débil

8.2.1 Identificación de género. Con los análisis realizados hasta el momento, no se ha podido identificar al 100% el

género de las bacterias aisladas, sin embargo podemos comentar que las posibilidades se

reducen a dos o tres géneros por cepa y con los análisis que se realizarán de biología

molecular, se podrá tener una mejor asignación. Géneros como Branhamella, Gemella,

Rothia, Veillonella no han sido reportados en estudios previos, esto puede ser

consecuencia del tipo de suelo y sustrato con que se alimentan estas lombrices, además

de que para ésta lombriz no se ha concluido la identificación total de microorganismos.

Tabla 5_Identificación de género

Cepa Género Ais con Branhamella Ais 22 1 Branhamella, Acinetobacter 20 Actinobacillus seminis

29

27 Veillonella, Neisseria, Branhamella

32- Micoplasma, Streptobacillus,Cardiobacterium 60 Staphylococcus, Steptococcus, Pediococcus, Gemella 3 Branhamella 28 Branhamella 55 Aerococcus,Streptococcus,Pediococcus I3 Streptococcus, Gemella, Aerococcus, 46I Rothia dentocariosa I2 Steptococcus 35 Corynebacterium,Eurobacterium,Erysipelothris ConII kurthia, Corynebacterium, Listeria Col2 Staphylococcus, Aerococcus 34I Bacillus polymyzs 14I Curtía, Corynebacterium, Listeria, Rothia EMB A2 Enterobacteria

8.2.2 Identificación de especie

En la tabla 6 se puede observar las características propias de las especies para los

géneros encontrados, con lo cuál se procedió a la diferenciación para cada una de los

microorganismos mostrados.

Tabla 6_Reacciones para identificación de especie

MEDIOS DE PRUEBA

Actinobacillus seminis Rothia dencariosa Bacillus polyzs

Reac. Coloración Gram

-

+

V

Cápsula

+

30

Reducción de nitrato

+

+

+

OF glucosa

+

Indol

-

-

-

Licuefacción de la gelatina 22°C

+

+

Citrato de Simmnons

-

Voges-Proskauer

-

+

Manitol

V

-

Cátalasa

+

Oxidasa

V

Cl Na 7.5%

-

Hidrólisis del almidón

+

Ureasa

-

-

-

V=reacción variable

8.2.3 Pruebas comparativas

En la tabla 7 se muestran 10 pruebas bioquímicas que además de servir como sistema

de comparación entre métodos nos indican características propias de las cepas aisladas .

El 62% de ellas presentan resistencia a condiciones extremas de concentración de NaCl,

en este caso una concentración de 7%. El 68.75% de las bacterias presenta facilidad

para poder utilizar diferentes fuentes de carbono, el 81.25% facilita la degradación de la

materia por medio de enzimas proteolíticas.

Dichas propiedades pueden ser utilizadas para aplicaciones directas tales como

tratamiento de desechos de la industria de alimentos, así como la presencia de enzimas

proteolíticas para poder llevar a cabo la degradación de la materia sin la necesidad de la

presencia de la lombriz.

Tabla 7_Pruebas bioquímicas adicionales para comparación de métodos

31

Cepa CRFM TSI Gel. Nut.

Citrato Caldo Urea

LIA Indol Desc. ornitina

VP NaCl 7%

Ais con - + H2S, CO2

+ - - - + - V +

Ais 22 1 + + H2

- + + Des:V Desa: -

+ NR + -

20 V - - - - Des:V Desa: V

- + -

27 V + - V - Des:- Desa:+

+ + - -

32- V - + + - + - + - 60 - Glu - + + - Des:-

Desa: -

- - - +

3 - Glu - V - - Des:+ Desa: -

+ + - -

28 - + - - - - - - V + 55 + + + + - - V - - - I3 - - + - + - - + - + 46I V V + - - Des:-

Desa: V

- - - +

I2 V + + - V Des:- Desa: +

- - - +

35 - + + - - - - + - V ConII + + + - - + - - V + Col2 - - + - - - - + + - 34I + + + - - - - - + + 14I + + + - - - - - - + EMB A2 + + H2 - + - Des:V

Desa: -

+ - + -

V =variable, Glu=glucosa, Des=descarboxilación, Desa = desaminación, NR=no reacciona

8.4 Verificación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis En la figura 2_ se puede observar la amplificación 15000 pb de DNA por PCR convencional,

dicho proceso resulto satisfactorio para 4 de 6 cepas, lo que nos obliga hacer una segunda

32

corrida de ellas para determinar si se realizará una estrategia diferente para las cepas que no

amplificaron. De las cepas positivas se procederá a la purificación de DNA e identificación.

Figura 2.- Perfil de amplificación de DNA de 6 cepas con respecto a un marcador de

pares de bases.

Los carriles corresponden a 1.- blanco, 2.- testigo positivo, 3. a 8 bacterias aisladas y 9.-

marcador de pares de bases.

33

IX. Conclusiones

Los m.o del tracto digestivo identificados son facultativos consecuencia de la adaptación

al cambio de medio (vermicomposteo-tracto digestivo).

82% de las bacterias aisladas son capaces de reducir nitratos a nitritos.

68.7% de las bacterias presentan facilidad al cambio de la fuente de carbono principal.

El 81.25% de las cepas cuentan con un sistema propio de proteólisis facilitando así la

degradación de la materia orgánica.

El 62% de presentan resistencia a condiciones extremas de concentración de NaCl 7%

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X. Bibliografía

• Edwards, A. 1984. The use of earthworms in the breakdown and

Management of organic wastes. Ed. Earthworm Ecology. FL, USA pp. 327±354.

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VI. IMPACTO

Formación de recursos humanos

Se adiestraron 7 alumnos de la carrera de Ingenieria Ambiental, en el área de tratamientos alternativos de la basura orgánica. 3 PIFI y 4 de Servicio Social

1 alumna de la carrera de Ing. Biotecnológica, en el área de biología molecular.

1 alumno de doctorado en el área de biología molecular, que terminará su trabajo en este año.

Se participó en congresos internacionales y esta en revisión un artículo que será publicado en una revista internacional.

La empresa Reciclagua esta interesada en el tratamiento a sus lodos por vermicomposteo.

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