INFORME TÉCNICO FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

Enero – Diciembre 2006

Estandarización de las condiciones de inmovilización de Candida sp. para la reducción de cromo hexavalente

Clave del Proyecto: 20060533

Director del Proyecto: Dr. Eliseo Cristiani Urbina. Resumen En el presente trabajo se estandarizaron las condiciones de inmovilización de una

cepa de Candida sp. en perlas de alginato de calcio. Se determinó el efecto de la

concentración de alginato y de biomasa inicial inmovilizada sobre la reducción del

Cr(VI).

Se encontró que la concentración de alginato juega un papel importante en la

obtención de perlas adecuadas para la inmovilización de las células y para la

reducción del Cr(VI). La concentración de alginato más adecuada para ello fue de

aproximadamente 0.8% (w/v).

La concentración inicial de biomasa inmovilizada más apropiada para la reducción de

Cr(VI) depende de la concentración inicial del metal que se utilice. En general, las

eficiencias globales y las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) más altas

se obtuvieron a concentraciones celulares iniciales de 2-2.5 g/L.

De los estudios cinéticos de reducción de Cr(VI) por células libres e inmovilizadas de

Candida sp. LMB2, utilizando condiciones de inmovilización propuestas en la literatura

y las encontradas en este trabajo, se encontró que, en general, las células libres

presentaron una mayor capacidad para reducir el Cr(VI) que las células inmovilizadas,

lo que está acorde con lo reportado en la literatura. Asimismo, se encontró que las

condiciones de inmovilización establecidas en este trabajo son más favorables para la

reducción del Cr(VI) por la levadura Candida sp. LMB2 que las recomendadas en la

literatura.

1

Introducción El cromo es uno de los metales pesados más utilizados en los procesos industriales, lo

que ha ocasionado que grandes cantidades de éste sean liberados al medio ambiente.

De acuerdo a estimaciones realizadas por la Agencia de Protección del Ambiente de

los Estados Unidos de América (USEPA), cada año se descargan a la atmósfera más

de 1 642 500 kg de cromo.

El cromo existe en nueve estados de oxidación, del -2 al +6; sin embargo, en los

ambientes naturales el metal se encuentra principalmente en dos estados de valencia,

como cromo trivalente [Cr(III)] y como cromo hexavalente [Cr(VI)]. Estos dos estados

de oxidación del cromo son los más estables y comunes en el medio ambiente, pero

sus propiedades fisicoquímicas y toxicológicas difieren significativamente entre sí. El

cromo hexavalente es sumamente tóxico, exhibe propiedades carcinogénicas,

mutagénicas y teratogénicas y, además, es altamente soluble en agua, por lo que es

muy móvil a través de los ecosistemas; en contraste, el cromo trivalente es

considerablemente menos tóxico, menos soluble en agua, mucho menos móvil que el

Cr(VI) y es un elemento traza esencial para el metabolismo de carbohidratos, lípidos y

aminoácidos en mamíferos.

Debido a su alta toxicidad, el cromo hexavalente es considerado por la USEPA como

un contaminante prioritario y como uno de los 17 agentes químicos más peligrosos

para la salud del ser humano.

En la actualidad existen diversos métodos fisicoquímicos para remover el cromo

hexavalente presente en suelos y aguas contaminadas con el metal. Sin embargo,

estos métodos presentan diversas desventajas, tales como: costo alto, selectividad

baja, una baja eficiencia de remoción del metal (principalmente cuando el cromo

hexavalente se encuentra en concentraciones inferiores a 100 mg/L), se generan lodos

químicos difíciles de tratar, etc. A fin de subsanar algunas de estas desventajas, se

han propuesto algunos métodos biológicos utilizando microorganismos vivos. Estos

métodos se consideran en la actualidad como una alternativa potencial para el

tratamiento de los ecosistemas y efluentes industriales contaminados con cromo

hexavalente, ya que son de bajo costo y altamente eficientes en la remoción de

pequeñas cantidades del metal.

Sin embargo, el tratamiento biológico de efluentes industriales que contienen cromo

hexavalente es difícil porque el metal es altamente tóxico para los organismos vivos y

2

les causa pérdida de su actividad celular y de su viabilidad. Con el fin de proteger a los

microorganismos del efecto letal del cromo hexavalente, es conveniente colocar una

barrera de protección entre los microorganismos y el metal pesado. Esto último puede

lograrse mediante técnicas de inmovilización por atrapamiento en gel.

En trabajos previos realizados en el Laboratorio “Ing. Pablo Hope y Hope” de la

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, se logró el aislamiento de una cepa de

levadura que es capaz de transformar altas concentraciones de cromo hexavalente a

trivalente, el cual es 100 veces menos tóxico y 1000 veces menos mutagénico que la

forma hexavalente. La levadura fue identificada mediante técnicas de biología

molecular como Candida sp. A pesar de su alta capacidad de reducción del cromo

hexavalente, la levadura es altamente susceptible a los efectos tóxicos del metal.

Posteriormente, Candida sp. se inmovilizó en perlas de gel de alginato de calcio al 2%

(w/v) mediante la técnica de atrapamiento con el propósito de protegerla del efecto

tóxico del metal. Durante estos estudios se observó que la reducción del cromo

hexavalente por las células inmovilizadas era muy inferior a la de las células libres

(investigaciones realizadas con el apoyo económico de la Coordinación General de

Estudios de Posgrado e Investigación del Instituto Politécnico Nacional, con clave de

proyecto 20050250).

Con base en lo anterior, en este trabajo se llevó a cabo la estandarización de las

condiciones de inmovilización de la cepa de Candida sp., a fin de incrementar la

eficiencia y velocidad de reducción del metal de las células inmovilizadas.

Material y métodos Microorganismo Se utilizó una cepa de levadura que fue aislada por la M. en C. Liliana Morales Barrera

a partir del agua residual de una curtidora, y que posteriormente Juvera-Espinosa

(2006) la seleccionó de entre 28 cepas diferentes de levadura y la identificó como

Candida sp. LMB2.

Durante el desarrollo del presente trabajo la levadura se mantuvo creciendo

activamente mediante resiembras secuenciales y alternadas en medios de cultivo

líquidos con 1 mM de Cr(VI) y sin Cr(VI). Lo anterior se debió a que la levadura

Candida sp. LMB2 perdía parte de su capacidad para reducir Cr(VI) después de ser

cultivada consecutivamente en medios de cultivo con Cr(VI).

3

Medios de cultivo Se utilizó el medio de cultivo YPG (tabla 1) para preservar la cepa de Candida sp.,

bajo condiciones de refrigeración (aproximadamente a 4 ºC). Para la propagación del

inóculo, así como para realizar los experimentos de reducción de Cr(VI) se empleó el

medio de cultivo propuesto por Morales-Barrera (2005), cuya composición se muestra

en la tabla 2.

Tabla 1. Composición química del medio YPG

Componente Concentración [g/L]

Agar bacteriológico 20

Extracto de levadura 10

Glucosa 20

Peptona de caseína 10

Tabla 2. Composición química del medio de cultivo líquido

Componente Concentración [g/L]

Glucosa 10

(NH4)2SO4 3

KH2PO4 1

MgSO4 7H2O 0.3

KCl 0.1

Extracto de levadura 0.1

CaCl2 0.05

FeCl3 0.001

K2CrO4 Variable

Desarrollo del inóculo A matraces Erlenmeyer de 1 L con 250 mL de medio de cultivo estéril se les adicionó

una pequeña cantidad de la levadura Candida sp. LMB2. Los matraces se mantuvieron

en agitación constante a una temperatura de 28-30 °C, durante 72 horas.

4

Posteriormente, la biomasa se separó asépticamente mediante centrifugación a 1000

rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se desechó y el paquete celular se lavó dos

veces con agua destilada estéril y se separó mediante centrifugación. El paquete

celular resultante se resuspendió en una pequeña cantidad de agua destilada estéril

para obtener finalmente una suspensión celular concentrada, la cual se utilizó como

inóculo.

A fin de conocer la concentración de biomasa de la suspensión celular, un pequeño

volumen de ésta se filtró a través de membranas de fibra de vidrio con un tamaño de

poro de 1.2 μm (Whatmann GF/A), las cuales se habían colocado previamente a peso

constante. A continuación, las membranas y la torta de células se deshidrataron en

una estufa a 90 ºC hasta alcanzar un peso constante. La concentración de biomasa se

estimó por diferencia de pesos de la masa celular.

Métodos experimentales Inmovilización de las células de Candida sp. Se utilizó la técnica de atrapamiento en gel para inmovilizar las células de Candida sp.

Para ello se disolvieron cantidades variables de alginato de sodio en agua destilada, a

una temperatura de aproximadamente 60 ºC. Las soluciones de alginato así obtenidas

se esterilizaron en una autoclave a 120 ºC, durante 15 minutos, y posteriormente se

enfriaron a temperatura ambiente.

A continuación se les agregó un volumen determinado de suspensión celular

concentrada para obtener alguna concentración deseada de biomasa. Las

suspensiones celulares resultantes (alginato-biomasa) se agitaron manualmente y

posteriormente se extruyeron a través de una manguera de silicón estéril (Masterflex

96410 – 14), con ayuda de una bomba peristáltica que operó a velocidades diferentes,

dependiendo de la concentración de alginato utilizada. Las gotas formadas se

colectaron en recipientes que contenían una solución de CaCl2 al 5% (w/v), y se

mantuvieron en reposo durante una hora para permitir el intercambio de los cationes

sodio y calcio. En seguida, las perlas de alginato de calcio con biomasa inmovilizada

se lavaron dos veces con agua destilada estéril (Kolot y col., 1988).

Estudio cinético de remoción abiótica de Cr(VI). Durante el desarrollo del presente trabajo se emplearon dos tipos de controles

abióticos. Uno de ellos consistió en medio de cultivo líquido al que se le adicionó un

volumen determinado de una solución stock estéril de cromato de potasio a 20 g/L

5

para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1 y 2 mM, pero no se agregó

biomasa de Candida sp. LMB2. Este tipo de control sirvió para determinar si, bajo las

condiciones ensayadas, los componentes del medio de cultivo podían transformar

(reducir químicamente) el Cr(VI) a Cr(III).

El otro tipo de control abiótico sirvió para determinar si las perlas de alginato de calcio

sin biomasa eran capaces de reducir y/o adsorber el Cr(VI) presente en los medios de

cultivo. Para ello se emplearon matraces Erlenmeyer de 250 mL que contenían 50 mL

de medio de cultivo con concentraciones iniciales de cromo hexavalente de 1 y 2 mM,

a las que se les adicionó la misma cantidad de perlas de alginato de calcio al 2% (w/v)

que a los matraces problema (en donde se realizaron los estudios de reducción de

Cr(VI) por Candida sp. LMB2) pero no se les adicionó biomasa de levadura.

Todos los matraces que se utilizaron como controles abióticos se mantuvieron bajo las

mismas condiciones de agitación y temperatura que los matraces problema. Se

colectaron muestras de cada uno de los controles cada 48 horas, a las que se les

determinó la concentración de cromo hexavalente residual.

Determinación del efecto de la concentración inicial de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente por Candida sp. LMB2. Se evaluó el efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de Cr(VI) por

las células inmovilizadas de Candida sp. LMB2, a fin de determinar la más adecuada.

En estos experimentos se ensayaron dos concentraciones iniciales de Cr(VI), las

cuales fueron de 1.5 mM y 3.6 mM. Para los experimentos realizados con una

concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, se obtuvieron perlas de alginato de calcio

con células inmovilizadas de Candida sp. LMB2. La concentración inicial de biomasa

se mantuvo constante a 1 g/L, mientras que la concentración de alginato se varió en el

intervalo de 0.2 a 2% (w/v).

Los cultivos se mantuvieron en agitación constante a 28-30° C, durante diferentes

periodos de tiempo, los cuales dependieron de las condiciones ensayadas. Se

colectaron muestras de cada uno de los cultivos cada 24 horas, a las cuales se les

determinó la concentración de cromo hexavalente y de glucosa residual.

Para los experimentos realizados con una concentración inicial de cromo hexavalente

de 3.6 mM, se elaboraron perlas de alginato de calcio que contenían a la levadura

6

Candida sp. LMB2 a una concentración inicial de biomasa de 1 g/L, mientras que la

concentración de alginato varió en el intervalo de 0.5 a 2.0% (w/v). Los cultivos se

mantuvieron en agitación constante a 28-30 ºC durante diferentes periodos de tiempo.

Se recolectaron muestras de cada uno de los cultivos cada 24 h, a las que se les

determinó las concentraciones de Cr(VI) y de glucosa residual.

Determinación de la concentración inicial de biomasa inmovilizada más adecuada para la reducción de cromo hexavalente. A continuación se determinó el efecto de la concentración inicial de biomasa

inmovilizada sobre la reducción de cromo hexavalente. Para ello se ensayaron

diferentes concentraciones celulares iniciales y dos concentraciones de alginato. Las

concentraciones de alginato utilizadas fueron la que sugiere la literatura especializada

(2% w/v) y la que se determinó previamente en este trabajo. Las concentraciones

celulares ensayadas fueron 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 g/L para ambos casos y para la

concentración determinada en este trabajo se ensayó también una concentración

celular de 3 g/L.

Asimismo, a ambas concentraciones de alginato, se utilizaron dos concentraciones

iniciales de Cr(VI). Cuando se empleó una concentración de alginato de 2% (w/v), los

experimentos se llevaron a cabo a 1 y 2 mM de Cr(VI), y cuando se utilizó la

concentración de alginato determinada en este estudio como la más adecuada para la

reducción del metal, se emplearon concentraciones de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM. Esto

último se debió a que el grado de reducción del metal alcanzado con la concentración

de alginato encontrada en este estudio fue mayor que el obtenido con la concentración

recomendada en la literatura.

Los experimentos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 mL que contenían 50

mL de medio de cultivo líquido, los cuales se mantuvieron en agitación constante a 28-

30 °C durante el tiempo que requiriera cada cultivo para reducir el cromo hexavalente.

Se recolectaron muestras cada 24 horas, a las que se les determinó la concentración

de cromo hexavalente y de glucosa residual.

Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y del consumo de glucosa de las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2 Una vez realizada la determinación de las concentraciones de alginato y de biomasa

inicial más adecuadas para la reducción de Cr(VI) por las células inmovilizadas de

7

Candida sp. LMB2, se procedió a comparar los parámetros del proceso de reducción

del metal (eficiencia global y velocidad volumétrica de reducción de cromo

hexavalente) de las células inmovilizadas y de las libres.

Se realizó el estudio cinético comparativo de la reducción de Cr(VI) y del consumo de

glucosa por las células libres y las inmovilizadas. Para las células inmovilizadas se

utilizaron dos condiciones de inmovilización, la sugerida en la literatura y la encontrada

en este trabajo como la más apropiada para el desempeño de la levadura.

Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y del consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2, empleando las condiciones de inmovilización sugeridas en la literatura. La mayoría de los estudios relacionados con la remoción de contaminantes por células

inmovilizadas se han llevado a cabo utilizando una concentración celular inicial de 0.5

g/L y una concentración de alginato de 2% (w/v) (Kolot, 1988). Debido a esto, en el

presente trabajo se emplearon esas condiciones para determinar su efecto sobre la

reducción del Cr(VI) y del consumo de glucosa por las células inmovilizadas de

Candida sp. LMB2.

Las concentraciones iniciales de cromo hexavalente ensayadas tanto para los cultivos

con células libres como para las inmovilizadas fueron de 0.75, 2.25 y 3.75 mM. Los

cultivos microbianos se desarrollaron en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL

de medio de cultivo líquido, los cuales se mantuvieron en agitación constante a 28-30

°C durante el tiempo de incubación necesario para permitir la mayor reducción posible

del Cr(VI).

Se recolectaron muestras cada 24 horas, a las que se les determinó la concentración

de cromo hexavalente y de glucosa residual.

Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2, empleando las condiciones de inmovilización encontradas en este trabajo. A continuación se realizaron los estudios cinéticos comparativos de la reducción de

Cr(VI) y de consumo de glucosa de las células libres y de las inmovilizadas, utilizando

las concentraciones de alginato y de biomasa inmovilizada que fueron encontradas

experimentalmente en este trabajo como las más adecuadas para la reducción de

Cr(VI).

8

Estos experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 250 mL que

contenían 50 mL de medio de cultivo. Se ensayaron dos concentraciones iniciales de

Cr(VI), de 1.5 y 3.6 mM. Los cultivos se incubaron con agitación constante a 28-30 ºC,

durante el tiempo necesario para permitir que las células redujeran el Cr(VI) presente

en los medios de cultivo.

Se recolectaron muestras cada 24 h, a las que se les determinó la concentración de

Cr(VI) y de glucosa residual.

Métodos analíticos Determinación de la concentración celular La determinación de la concentración celular del inóculo y de los cultivos en

suspensión se realizó por medio del peso seco de la masa celular. Para ello, las

muestras se filtraron a través de membranas de fibra de vidrio (Whatman GF/A) de 1.2

μm. Posteriormente, las membranas se colocaron en una estufa a 95°C, hasta

alcanzar un peso constante. El peso de la biomasa se estimó por diferencia de pesos.

Determinación de la concentración de glucosa: Se llevó a cabo mediante un método enzimático, utilizando a la glucosa oxidasa y

peroxidasa (Worthington, 1972).

Determinación de la concentración de cromo hexavalente. La determinación de la concentración de cromo hexavalente se realizó por el método

de la 1,5-difenilcarbohidrazida, conforme a los procedimientos descritos en el Hach

Water Analysis Handbook (2002).

Resultados y discusión Meta 1: Determinar el efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de Cr(VI).

Remoción abiótica de cromo hexavalente. Con la finalidad de determinar si la reducción de Cr(VI) se debía únicamente a la

actividad biológica de Candida sp. LMB2, o en su defecto establecer qué porcentaje de

la reducción se debía a las células, en el presente trabajo se utilizaron controles

9

abióticos. Estos controles son de suma importancia para establecer si las variables de

operación, tales como el medio de cultivo, los soportes utilizados para la inmovilización

y las condiciones ambientales utilizadas (por ejemplo, pH, potencial de óxido-

reducción, temperatura, etc.) tienen alguna influencia sobre la remoción de los

contaminantes.

Los controles abióticos que se emplearon fueron los siguientes: 1) controles libres de

células y de perlas de alginato de calcio, y 2) controles con perlas de alginato sin

biomasa inmovilizada. Estos controles se incubaron a las mismas condiciones de

operación que los cultivos con células libres e inmovilizadas con los que se realizaron

los estudios cinéticos de reducción de Cr(VI). Los primeros controles sirvieron para

determinar si los componentes del medio de cultivo (por ejemplo, el extracto de

levadura, etc.) eran capaces de reducir el Cr(VI) a Cr(III); los segundos controles

permitieron establecer si el Cr(VI) era adsorbido por el alginato de calcio y/o reducido

por los componentes del medio de cultivo bajo las condiciones de ensayo.

En los controles abióticos libres de células y de perlas de alginato de calcio se

utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.0 y 2.0 mM, asimismo en los

controles con perlas de alginato de calcio sin biomasa se emplearon concentraciones

iniciales del metal de 1.0 y 2.0 mM. Se recolectaron muestras cada 48 horas durante

un periodo total de incubación de 240 horas, a las que se les determinó la

concentración de cromo hexavalente residual.

En ninguno de los controles a los que no se les adicionó biomasa ni perlas de alginato

se presentaron variaciones considerables en las concentraciones de Cr(VI) residual a

lo largo del periodo de incubación, lo que indica que los componentes del medio de

cultivo no fueron capaces de transformar químicamente el Cr(VI) a Cr(III). Además,

estos resultados sugieren que cualquier reducción de Cr(VI) que se detecte en los

cultivos con células en suspensión (células libres) se deberá únicamente a la actividad

biológica de la levadura Candida sp. LMB2.

En los controles con perlas de alginato de calcio sin biomasa inmovilizada se observó

que la concentración del metal no disminuyó en todo el periodo de incubación

ensayado, sino que se incrementó ligeramente, lo que probablemente se debió a una

pequeña evaporación del agua que provocó la concentración de los compuestos

presentes en los medios de cultivo. Para fines prácticos estos resultados sugieren que

la concentración de Cr(VI) permaneció prácticamente constante a lo largo del tiempo

10

de cultivo y que el alginato de calcio no adsorbió cantidad alguna del Cr(VI) presente

en los medios de cultivo.

Los resultados obtenidos con los dos tipos de controles abióticos sugieren que los

componentes del medio de cultivo no reducen el Cr(VI) a Cr(III) y que las perlas de

alginato no adsorben algo del metal, por lo que cualquier reducción del Cr(VI) que se

detecte en los cultivos con células libres e inmovilizadas en gel de alginato de calcio se

debió exclusivamente a la actividad biológica de las células viables de Candida sp.

LMB2.

Efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente y el consumo de glucosa por las células inmovilizadas de Candida sp. La consistencia de los geles poliméricos que se utilizan para la inmovilización de las

células microbianas puede ser modificada variando las condiciones de elaboración de

los mismos. Entre las variables que afectan la consistencia de los geles se tienen a la

naturaleza química y a la concentración del polímero que se emplee (King, 1988). Si

se utilizan diferentes concentraciones de polímero se obtendrán geles con diferentes

características de permeabilidad y con diferentes propiedades de transferencia de

masa y energía. Por consiguiente, la concentración del polímero que se emplee para

la preparación de los geles repercutirá en el desempeño de los microorganismos

inmovilizados. Con base en lo anterior, en el presente trabajo se evaluó el efecto de la

concentración de alginato sobre la reducción del Cr(VI) y el consumo de glucosa por la

levadura Candida sp.

Se observó que, al variar la concentración de alginato, la consistencia del gel fue

diferente, lo que ocasionó cambios en la forma de las perlas obtenidas por extrusión. A

medida que disminuyó la concentración de alginato, la forma de la perla se hizo más

irregular.

Es importante mencionar que las concentraciones de alginato que se reportan en este

trabajo toman en consideración el volumen total obtenido al mezclar la suspensión

celular con la solución de alginato de sodio (a una determinada concentración del

polímero) y con una pequeña cantidad de agua destilada estéril que se adicionó para

alcanzar la concentración deseada de alginato. Debido a esto, la concentración final

de alginato fue siempre menor a la de la solución original de alginato por que ésta se

diluyó parcialmente por la adición de la suspensión celular y de agua estéril.

11

Con la finalidad de obtener perlas individuales con un tamaño lo más uniforme que

fuera posible, así como de minimizar la formación de conglomerados de perlas, se

modificó la velocidad de la bomba peristáltica a las diferentes concentraciones de

alginato ensayadas. Esto fue necesario ya que se observó que al disminuir la

concentración de alginato, se incrementaba el tiempo necesario para la extrusión de

las perlas. Si la velocidad de la bomba no se disminuía, se formaban aglomerados de

perlas.

Las escalas utilizadas de la bomba peristáltica para variar el flujo volumétrico de la

mezcla alginato de sodio-suspensión celular (que fue vertida en una solución de

cloruro de calcio al 5% (w/v)) en función de la concentración final de alginato, se

muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Escalas de la bomba peristáltica en función de la concentración de alginato

Concentración final de alginato en la mezcla

Escala de la bomba

Tiempo aproximado de vertimiento de la solución (10 mL)

0.2 % 0,70 30 min

0.3 % 0,90 25 min

0.4 % 1,57 20 min

0.6 % 1,60 18 min

0.8 % 1,70 13 min

1.0 % 1,80 8 min

2.0 % 1,91 5 min

En la tabla anterior se aprecia que el tiempo necesario para obtener perlas individuales

de alginato de calcio aumentó al disminuir la concentración del polímero. Para

preparar perlas de alginato de calcio con concentraciones finales del polímero en el

intervalo de 0.2 a 0.6% se requirieron tiempos de operación muy largos, lo que influyó

negativamente en la velocidad global del proceso de inmovilización.

Asimismo, es conveniente mencionar que cuando se utilizaron concentraciones finales

de alginato menores a 0.8%, la bomba peristáltica tenía que ser apagada

continuamente y la solución de cloruro de calcio debía mantenerse con agitación lenta

para evitar la formación de conglomerados de perlas. En síntesis, el uso de

12

concentraciones finales de alginato inferiores a 0.8% (w/v) ocasiona muchos

problemas de operación que hacen impráctico su uso.

A continuación se presentan los resultados obtenidos del efecto de la concentración de

alginato sobre la reducción de Cr(VI) y el consumo de glucosa por las células

inmovilizadas de Candida sp. LMB2, cuando se utilizaron concentraciones iniciales del

metal de 1.5 y 3.6 mM.

Efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa, cuando se utilizó una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM. Para determinar el efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de Cr(VI),

a una concentración inicial del metal de aproximadamente 1.5 mM, se prepararon

perlas de alginato de calcio con células inmovilizadas de Candida sp. Se ensayaron

diferentes concentraciones de alginato, las cuales fueron de 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,

1.2, 1.4, 1.8 y 2 % (w/v) y la concentración inicial de biomasa inmovilizada fue de 1

mg/mL.

En la tabla 4 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI) y los tiempos

requeridos para alcanzar las concentraciones de Cr(VI) residual más bajas. Se aprecia

que se obtuvieron altas eficiencias de reducción a todas las concentraciones de

alginato ensayadas, las cuales se encontraron en el intervalo del 95.2 al 100%.

Asimismo, los tiempos de incubación necesarios para alcanzar niveles bajos de Cr(VI)

residual en el medio de cultivo fueron menores cuando se utilizaron concentraciones

de alginato del 0.2 al 1% (w/v) (de 143 a 196 h); a concentraciones superiores se

requirieron tiempos de incubación superiores a 230 h. El menor tiempo de incubación

requerido para reducir todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo

[eficiencia global de reducción de Cr(VI) de 100%] fue de 143 h y se obtuvo a una

concentración de alginato de 0.4% (w/v).

Tabla 4. Eficiencias globales y tiempos necesarios para reducir el Cr(VI) (1.5 mM)

cuando se emplearon diferentes concentraciones de alginato.

Concentración inicial de Cr(VI) [mM]

Concentración de alginato [% w/v]

Concentración inicial de biomasa

Eficiencia [%]

Tiempo en el que se alcanzó la concentración más

13

[mg/mL] baja de Cr(VI) residual [h]

1.5 0.2 1.0 99.7 178

1.5 0.3 1.0 100 190

1.5 0.4 1.0 100 143

1.5 0.6 1.0 100 178

1.5 0.8 1.0 100 196

1.5 1.0 1.0 97.8 192

1.5 1.2 1.0 98.6 238

1.5 1.4 1.0 98.6 268

1.5 1.8 1.0 95.2 268

1.5 2.0 1.0 100 238

Posteriormente se estimó la velocidad volumétrica global de reducción de cromo

hexavalente para cada uno de los cultivos ensayados, con el propósito de determinar

el efecto de la concentración inicial de alginato sobre la velocidad a la que la levadura

inmovilizada es capaz de reducir el metal.

En la figura 1 se muestran las velocidades volumétricas globales de reducción de

cromo hexavalente, a las diferentes concentraciones de alginato ensayadas. El

comportamiento general observado es que al aumentar la concentración de alginato, la

velocidad de reducción del metal disminuye. Las mayores velocidades se obtuvieron

cuando se utilizaron concentraciones de alginato del 0.2 al 0.4% y las velocidades más

bajas se alcanzaron a concentraciones del polímero de 1.4 a 2% (w/v). En los estudios

de remoción o degradación de contaminantes orgánicos reportados en la literatura

especializada generalmente se ha utilizado una concentración de alginato de 2% (w/v)

(Kolot y col., 1988); sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren

que para la reducción de Cr(VI) por Candida sp. LMB2 es más conveniente emplear

concentraciones de alginato inferiores al 1% (w/v), cuando se utiliza una concentración

inicial de Cr(VI) de 1.5 mM.

14

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.8 2

[alginato] % w/v

Velo

cida

d vo

lum

étric

a de

redu

cció

n de

Cr

(VI)

[mg/

L x

h]

Figura 1. Velocidad volumétrica global de reducción de Cr(VI) a diferentes

concentraciones de alginato, cuando se utilizaron concentraciones iniciales del metal y

de biomasa de 1.5 mM y 1 g/L, respectivamente.

El hecho de que las mayores velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) se

hayan obtenido a concentraciones bajas de alginato sugieren que el polímero no tuvo

algún efecto protector sobre las células inmovilizadas. Se esperaba que al aumentar la

concentración de alginato en la matriz polimérica (perlas) se incrementaría la

reducción del Cr(VI), ya que las células estarían más protegidas de los efectos tóxicos

del metal. Sin embargo, los resultados demostraron que cuando se utiliza una

concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, los efectos tóxicos del metal no son tan

significativos como para que la matriz polimérica de alginato proteja a las células y

esto podría deberse a que la cepa de levadura utilizada en el presente trabajo es muy

tolerante (resistente) a altas concentraciones del metal (Juvera-Espinosa y col., 2006).

Estos resultados también sugieren que para que el alginato tenga algún efecto

protector sobre las células de Candida sp. deben utilizarse concentraciones más altas

de Cr(VI).

También se determinó la concentración de glucosa residual de cada una de las

muestras recolectadas durante el periodo de incubación, con la finalidad de establecer

si el alginato tenía algún efecto sobre el consumo del monosacárido de cada uno de

los cultivos ensayados, utilizando una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM y, de

esta manera, determinar si el polímero ocasionaba alguna resistencia a la

transferencia de la principal fuente de carbono y energía presente en el medio de

cultivo (glucosa).

15

Se observó que todos los cultivos microbianos fueron capaces de consumir

completamente el monosacárido en aproximadamente 120 h de incubación. A tiempos

inferiores a éste, los niveles de glucosa residual en los cultivos con altas

concentraciones de alginato fueron ligeramente inferiores a los alcanzados con los

cultivos en los que se emplearon concentraciones bajas del polímero. Estos resultados

sugieren que la matriz polimérica de alginato no ocasionó resistencia a la transferencia

de la glucosa.

Con base en los resultados anteriores se concluye que cuando se utiliza una

concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, la reducción del metal por las células

inmovilizadas de Candida sp. se favorece a concentraciones bajas de alginato.

Efecto de la concentración inicial de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa por Candida sp., cuando la concentración inicial del metal fue de 3.6 mM. A continuación se determinó el efecto de la concentración de alginato sobre la

reducción de Cr(VI) y consumo de glucosa por las células inmovilizadas de Candida

sp., cuando se utilizó una concentración inicial del metal de 3.6 mM. Para ello se

ensayaron cuatro concentraciones de alginato, que fueron de 0.5, 1.0, 1.5 y 2% (w/v).

Es importante mencionar que a la concentración de alginato de 0.5 % (w/v) se

presentaron los problemas de operación que se mencionaron anteriormente durante la

preparación de las perlas.

En la tabla 5 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI), así como los

tiempos de incubación que requirieron los cultivos con células inmovilizadas para

disminuir los niveles iniciales del metal hasta valores bajos. Se observa que los

cultivos presentaron eficiencias de reducción del metal muy semejantes, de 88 a

92.7%, y que éstas fueron alcanzadas en un tiempo de incubación de 262 h.

Tabla 5. Eficiencias globales y tiempos de reducción del metal (3.6 mM) a diferentes

concentraciones de alginato de calcio y a una concentración inicial de biomasa de 1

g/L

Concentración inicial de Cr(VI) [mM]

Concentración de alginato [% w/v]

Concentración inicial de biomasa

Eficiencia [%]

Tiempo en el que se alcanzó la concentración más

16

[ g/L] baja de Cr(VI) residual [h]

3.6 0.5 1.0 92.7 262

3.6 1.0 1.0 88 262

3.6 1.5 1.0 88.8 262

3.6 2.0 1.0 89.2 262

Aun cuando la eficiencia de reducción de Cr(VI) fue ligeramente mayor cuando se

utilizó una concentración de alginato de 0.5% (w/v), los resultados de eficiencia

obtenidos a las concentraciones de alginato ensayados no son significativamente

diferentes como para asegurar que alguna de ellas sea la más adecuada para que las

células inmovilizadas de Candida sp. reduzcan el Cr(VI).

En la figura 2 se presentan las velocidades volumétricas globales de reducción de

cromo hexavalente obtenidas para cada uno de los cultivos ensayados. Se aprecia

que, al igual que las eficiencias globales, las velocidades volumétricas de los cultivos

fueron muy similares. Estos resultados corroboran la afirmación que se hizo

anteriormente en el sentido de que no es posible establecer una concentración óptima

de alginato para la reducción de Cr(VI) (al menos de las ensayadas) cuando se utiliza

una concentración inicial del metal de 3.6 mM.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.5 1 1.5 2

[alginato] % w/v

Velo

cida

d vo

lum

étric

a de

redu

cció

n de

Cr

(VI)

[mg/

Lx h

]

Figura 2. Velocidades volumétricas globales de reducción del metal cuando se utilizó

una concentración inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, 1 g/L de biomasa, y diferentes

concentraciones de alginato

17

Las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) obtenidas a una concentración

inicial del metal de 3.6 mM, a las diferentes concentraciones de alginato ensayadas,

fueron semejantes a las alcanzadas a bajas concentraciones del polímero cuando se

utilizó una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, lo que podría sugerir que el

alginato protege en cierta medida a las células cuando se emplean concentraciones

altas del metal.

Los resultados obtenidos a concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM indican

que es posible obtener velocidades volumétricas globales de reducción de Cr(VI)

aceptables cuando se emplean concentraciones bajas de alginato [inferiores al 1%

(w/v)]. Esto último es de suma importancia ya que el uso de menores cantidades de

polímero disminuiría notablemente el costo del proceso de reducción del metal.

Asimismo, se determinó el consumo de glucosa de todos los cultivos ensayados a una

concentración inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, para establecer si la inmovilización de las

células a diferentes concentraciones del polímero afectaba las actividades metabólicas

de Candida sp. LMB2.

Se encontró que, aun cuando a las 48 h de incubación la velocidad de consumo del

monosacárido fue mayor cuando se utilizó una concentración de alginato de 1 y 1.5%

(w/v), a tiempos posteriores el consumo fue semejante para todas las concentraciones

de alginato utilizadas. Estos resultados confirman lo observado en los experimentos

realizados a 1.5 mM de Cr(VI) en el sentido de que la matriz polimérica de alginato no

ocasiona una resistencia a la transferencia de glucosa, por lo que esto no es un

proceso limitante en la reducción del metal.

Los resultados obtenidos a las concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM

sugieren que para lograr altas velocidades de reducción del metal es más conveniente

utilizar concentraciones bajas de alginato, de aproximadamente 0.8% (w/v). Además, a

esta concentración del polímero no se presentan los problemas de heterogeneidad en

la forma de las perlas ni se incrementa considerablemente el tiempo requerido para la

preparación de éstas. Debido a lo anterior, en el presente trabajo se seleccionó esta

concentración de alginato para realizar estudios posteriores y se comparó con la

concentración de alginato comúnmente reportada en la literatura (2%).

18

Meta 2: Determinar el efecto de la concentración de biomasa sobre la reducción de Cr(VI).

Efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción del cromo hexavalente y el consumo de la principal fuente de carbono y energía. En los estudios realizados por Juvera-Espinosa (2006) se encontró que la densidad

celular inicial juega un papel importante en la reducción de Cr(VI) por las células en

suspensión (células libres) de Candida sp. LMB2. En esos estudios se informó que las

mayores eficiencias y velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) se lograban

cuando se utilizaban concentraciones de biomasa entre 1.4 y 2 g/L. A concentraciones

inferiores y superiores a éstas se observó una disminución drástica en los parámetros

cinéticos del proceso de reducción del metal.

Por lo anterior, en el presente trabajo se evaluó el efecto de la concentración inicial de

biomasa inmovilizada en perlas de alginato sobre la reducción de Cr(VI) y el consumo

de glucosa. Para estos estudios se realizaron experimentos con densidades celulares

iniciales en el intervalo de 0.5 a 2.5-3 g/L y con dos concentraciones diferentes de

alginato, las cuales fueron de 0.8 y 2% (w/v). La concentración de 2% (w/v) fue

seleccionada como patrón de comparación ya que es la que generalmente se utiliza en

los estudios de inmovilización en alginato de calcio. Como se mencionó anteriormente,

la concentración de alginato de 0.8% se seleccionó porque a ésta se obtienen

velocidades adecuadas de reducción de Cr(VI) y se reducen los problemas y el tiempo

requeridos para la preparación de las perlas.

Efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa cuando se emplearon concentraciones iniciales del metal de 1 y 2 mM, y una concentración de alginato de 2 % (w/v). Para determinar el efecto de la concentración inicial de biomasa inmovilizada sobre la

biorreducción del Cr(VI), a una concentración de alginato de 2%, se realizó un

experimento utilizando dos concentraciones iniciales de cromo hexavalente, las cuales

fueron de 1 y 2 mM. Para estos estudios se utilizaron concentraciones iniciales de

biomasa de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 g/L.

En la tabla 6 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI), así como los

tiempos de incubación que requirieron los cultivos con células inmovilizadas para

disminuir los niveles iniciales del metal hasta valores bajos. Se observa que las

19

eficiencias globales de reducción de Cr(VI) fueron altas para las dos concentraciones

ensayadas del metal.

A una concentración inicial de Cr(VI) de 1 mM, la menor eficiencia global de reducción

del metal (98.3%) se obtuvo a una concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L, y se

requirió un mayor tiempo de incubación para alcanzar esa eficiencia (232 h). Aun

cuando se obtuvo una elevada eficiencia de reducción de Cr(VI) a una concentración

inicial de biomasa de 2.5 g/L (99.7%), el tiempo necesario para la reducción fue mayor

(214 h) que el requerido a una concentración de biomasa de 2 g/L (183 h).

Cuando se utilizó una concentración de Cr(VI) de 2 mM, las menores eficiencias

globales de reducción de Cr(VI) se obtuvieron a las concentraciones iniciales de

biomasa de 0.5 y 2.5 g/L. Los resultados anteriores están acordes con lo reportado por

Juvera-Espinosa (2006).

Tabla 6. Eficiencias globales y tiempos de reducción del metal (1 y 2 mM) a diferentes

concentraciones iniciales de biomasa y a una concentración de alginato de calcio de

2%

Concentración inicial de Cr (VI) [mM]

Concentración de alginato de sodio [% w/v]

Concentración inicial de biomasa [g/L]

Eficiencia [%]

Tiempo en el que se alcanzó la concentración más baja de Cr(VI)

1.0 2 0.5 98.3 232

1.0 2 1.0 100 214

1.0 2 1.5 100 214

1.0 2 2.0 100 183

1.0 2 2.5 99.7 214

2.0 2 0.5 96.7 306

2.0 2 1.0 99.9 306

2.0 2 1.5 99.9 306

2.0 2 2.0 98.4 306

2.0 2 2.5 94.9 306

A una concentración inicial de Cr(VI) de 1 mM, el menor tiempo requerido para reducir

totalmente el metal fue de 183 h y se obtuvo a una concentración inicial de biomasa de

20

2 g/L. En contraste, a una concentración inicial de Cr(VI) de 2.0 mM, el menor tiempo

requerido para alcanzar los niveles más bajos de Cr(VI) residual fue de 306 h; a

tiempos posteriores a éste la concentración del metal se mantuvo constante, lo que

sugiere que los cultivos microbianos ya no fueron capaces de reducir más cromo.

A continuación se estimaron las velocidades volumétricas globales de reducción de

Cr(VI) para las diferentes concentraciones ensayadas de Cr(VI) y de biomasa

inmovilizada, las cuales se muestran en la figura 3.

Las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) fueron mayores cuando se utilizó

una concentración inicial del metal de 2 mM, para todas las concentraciones de

biomasa ensayadas, lo cual podría deberse a la mayor cantidad del metal inicialmente

presente en el medio de cultivo. Estos resultados sugieren que el efecto tóxico ejercido

por una concentración de Cr(VI) de 2 mM no fue el suficiente como para inhibir

totalmente la capacidad de reducción de las levaduras.

A una concentración de Cr(VI) de 1 mM, las velocidades volumétricas de reducción del

metal fueron similares en el intervalo de concentraciones iniciales de biomasa de 0.5 a

1.5 g/L. A esta concentración de Cr(VI), la mayor velocidad se alcanzó a una

concentración inicial de biomasa de 2 g/L, la cual fue sensiblemente superior a la de

los cultivos inoculados con una menor concentración de biomasa.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.5 1 1.5 2 2.5

[Biomasa] g/L

Velo

cida

d vo

lum

étric

a de

redu

cció

n de

Cr (

VI) [

mg/

L x

h]

1 mM Cr(VI)2 mM Cr(VI)

Figura 3. Velocidades volumétricas globales de reducción del metal, cuando se

utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1 y 2 mM , de alginato de 2% y a

diferentes concentraciones de biomasa inmovilizada.

21

En contraste, cuando se utilizó una concentración inicial de cromo hexavalente de 2

mM, el comportamiento fue diferente, ya que no se presentaron diferencias

significativas en los valores de velocidad volumétrica global de reducción de Cr(VI)

entre los cultivos con diferentes concentraciones iniciales de biomasa inmovilizada.

Aun así, las mayores velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) se obtuvieron a

concentraciones iniciales de biomasa de 1 y 1.5 g/L.

También se determinó la concentración de glucosa residual de cada una de las

muestras recolectadas durante el periodo de incubación, con la finalidad de observar

cómo se llevaba a cabo el consumo del monosacárido en cada uno de los cultivos

ensayados, a las dos diferentes concentraciones iniciales de cromo hexavalente

utilizadas.

Se encontró que la concentración inicial de biomasa afecta las velocidades de

consumo de glucosa, ya que, en general, al aumentar la concentración inicial de

levadura inmovilizada se requirieron tiempos de incubación más cortos para agotar

completamente el monosacárido presente en el medio de cultivo. Este comportamiento

se presentó a las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas, aunque fue más evidente

a la concentración de 2 mM.

Los mayores tiempos requeridos para consumir totalmente la glucosa se obtuvieron

con los cultivos que tuvieron una concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L, lo cual

resulta lógico si se considera que en estos cultivos había una menor demanda de la

fuente de carbono y energía.

Al comparar los tiempos requeridos para el consumo total del monosacárido y para la

reducción de Cr(VI), fue evidente que la glucosa fue agotada a tiempos inferiores a los

requeridos para la reducción casi total del Cr(VI). Este comportamiento se presentó

tanto en los experimentos en los que se determinó el efecto de la concentración de

alginato como de la biomasa inicial inmovilizada sobre la reducción del Cr(VI). Como la

reducción de Cr(VI) requiere energía metabólica para llevarse a cabo, es probable que

la falta de la principal fuente de carbono y energía para el crecimiento de los

microorganismos haya limitado la velocidad de reducción del metal. A pesar de ello,

las levaduras fueron capaces de reducir casi completamente el Cr(VI), probablemente

utilizando parte del poder reductor almacenado en sus materiales de reserva.

22

Efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa, cuando se utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM, y una concentración de alginato de 0.8 % (w/v). Se determinó el efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción de

Cr(VI) cuando la levadura se inmovilizó en perlas de alginato de calcio con una

concentración del polímero de 0.8% (w/v), la cual fue la que se determinó previamente

como adecuada para la reducción de Cr(VI), ya que los tiempos para la obtención de

perlas individuales y las velocidades volumétricas de reducción del metal fueran

aceptables, comparadas con concentraciones más altas de alginato.

En la tabla 7 se muestran las eficiencias y los tiempos requeridos para la reducción del

metal para las condiciones en las que se realizó el presente experimento.

Tabla 7. Eficiencias y tiempos de reducción del metal obtenidos a diferentes

concentraciones iniciales de biomasa y cuando la concentración de alginato fue de

0.8% (w/v).

Concentración inicial de Cr(VI) [mM]

Concentración de alginato [% (w/v)]

Concentración inicial de biomasa [g/L]

Eficiencia [%]

Tiempo en el que se alcanzó la concentración más baja de Cr(VI) residual [h]

1.5 0.8 0.5 100 191

1.5 0.8 1.0 100 145

1.5 0.8 1.5 100 116

1.5 0.8 2.0 100 116

1.5 0.8 2.5 100 116

1.5 0.8 3.0 100 145

3.6 0.8 0.5 67 240

3.6 0.8 1.0 98 240

3.6 0.8 1.5 100 240

3.6 0.8 2.0 100 192

3.6 0.8 2.5 100 192

3.6 0.8 3.0 100 240

23

Cuando la concentración inicial de Cr(VI) fue de 1.5 mM, todos los cultivos con

levaduras inmovilizadas fueron capaces de reducir totalmente el Cr(VI) presente en los

medios de cultivo, por lo que las eficiencias globales de reducción del metal fueron del

100%. Sin embargo, el tiempo que se necesitó para reducir el Cr(VI) varió

considerablemente con respecto a la concentración inicial de biomasa ensayada. El

menor tiempo de reducción se obtuvo en el intervalo de concentraciones iniciales de

biomasa de 1.5 a 2.5 g/L, con un valor de 116 horas.

A una concentración inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, las eficiencias globales de reducción

del metal de los cultivos con una concentración inicial de levadura de 0.5 y 1.0 g/L

fueron de 67 y 98%, respectivamente. En cambio, a concentraciones iniciales más

altas de biomasa, los cultivos presentaron una eficiencia global del 100%. De estos

resultados se puede apreciar que existe una relación entre la cantidad de Cr(VI) que

puede ser reducido por las levaduras y la concentración de éstas. Por consiguiente, la

baja eficiencia de reducción de Cr(VI) obtenida cuando se utilizó 0.5 g/L de biomasa se

atribuye a que a cada célula de levadura le correspondió una mayor cantidad de

Cr(VI), por lo que estuvo sujeta a mayores efectos tóxicos que a su vez provocaron

una disminución en su capacidad de reducción del metal.

Con relación al tiempo de incubación requerido para reducir 3.6 mM Cr(VI), se observó

que el menor tiempo fue de 192 h y se obtuvo cuando la concentración inicial de

biomasa fue de 2 y 2.5 g/L. A la concentración de biomasa de 3.0 g/L, el tiempo

necesario fue semejante al obtenido a bajas concentraciones de biomasa (0.5-1.5 g/L).

Este comportamiento se asemeja al obtenido a 1.5 mM de Cr(VI).

A la misma concentración inicial de biomasa, el tiempo requerido para reducir el Cr(VI)

fue mayor cuando se utilizó una concentración del metal de 3.6 mM, comparada con la

de 1.5 mM.

A continuación se compararon los tiempos requeridos para reducir el cromo

hexavalente cuando se utilizaron concentraciones de alginato de 0.8%

(concentraciones del metal de 1.5 y 3.6 mM) y de 2% w/v (concentraciones del metal

de 1 y 2 mM). Se encontró que los tiempos necesarios para reducir casi totalmente el

metal fueron inferiores cuando se empleó una concentración de alginato de 0.8%

(w/v), a pesar de que se utilizaron concentraciones más altas de Cr(VI). Estos

resultados corroboran una vez más que la concentración inicial de alginato afecta la

capacidad de reducción de la levadura inmovilizada.

24

En la figura 4 se muestran las velocidades volumétricas globales de reducción de

cromo hexavalente alcanzadas a las concentraciones iniciales de cromo hexavalente

de 1.5 y 3.6 mM y de biomasa de 0.5 - 3.0 g/L.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0.5 1 1.5 2 2.5 3

Concentración inicial de biomasa g/L

Velo

cida

d vo

lum

étric

a de

redu

cció

n de

C

r VI m

g / l

h

1.5 mM de Cr(VI)3.6 mM de Cr(VI)

Figura 4. Velocidades volumétricas globales de reducción del metal, cuando se

utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM , de alginato de 0.8% y

a diferentes concentraciones iniciales de biomasa inmovilizada.

Se observa que las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) fueron similares a

las dos concentraciones iniciales de cromo cuando se utilizaron concentraciones de

biomasa de 0.5, 1, 1.5 y 3 g/L. En contraste, las velocidades obtenidas a las

concentraciones de biomasa de 2 y 2.5 g/L fueron significativamente diferentes, siendo

mayores las alcanzadas a 3.6 mM de Cr(VI).

A una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, las mayores velocidades volumétricas

de reducción del metal se obtuvieron a concentraciones de biomasa de 1.5 – 2.5 g/L, y

para el caso de los cultivos a 3.6 mM, las velocidades más altas se obtuvieron a

concentraciones iniciales de biomasa de 2 y 2.5 g/L.

Si se toma en consideración que a 1.5 mM de Cr(VI) se obtuvo una eficiencia global de

reducción del metal del 100% a todas las concentraciones iniciales de biomasa, las

concentraciones celulares más adecuadas para la reducción total de 1.5 mM de Cr(VI)

se encuentran en el intervalo de concentraciones de biomasa de 1.5 a 2.5 g/L, ya que

en él se obtiene una completa reducción del metal y este proceso se lleva a cabo a

altas velocidades volumétricas. Asimismo, a una concentración inicial de Cr(VI) de 3.6

25

mM, las concentraciones celulares más apropiadas para reducir el Cr(VI) son de 2-2.5

g/L, ya que en este intervalo se reduce todo el metal inicialmente presente en el medio

de cultivo con velocidades adecuadas.

La velocidad volumétrica de reducción del metal obtenida a concentraciones iniciales

de Cr(VI) de 1.5 mM y de biomasa de 1.5-2.5 g/L fue 40% superior a la alcanzada con

una concentración celular de 0.5 g/L. De igual manera, la velocidad obtenida a 3.6 mM

de Cr(VI) y a las concentraciones de biomasa de 2-2.5 g/L fue 110% mayor a la

alcanzada con 0.5 g/L de biomasa.

Al comparar las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) obtenidas a las

concentraciones de alginato de 0.8 y 2% (w/v), se observó que cuando las células

fueron inmovilizadas a una concentración de 0.8%, la velocidad fue prácticamente el

doble de la obtenida con 2% de alginato de calcio, aun cuando se utilizaron

concentraciones iniciales de Cr(VI) superiores. Estos resultados confirman el hecho de

que a menor concentración de alginato de calcio para la inmovilización de Candida sp

LMB2, el desempeño de la levadura en cuanto a la reducción del metal es mejor.

Posteriormente se determinó la relación existente entre el consumo de la principal

fuente de carbono y la concentración inicial de biomasa, a las dos concentraciones

iniciales de Cr(VI) utilizadas.

En general se observó que a medida que se incrementó la concentración inicial de

biomasa, el consumo de glucosa fue más rápido. A una concentración inicial de Cr(VI)

de 1.5 mM, los cultivos con concentraciones celulares superiores a 2 g/L consumieron

totalmente el monosacárido en menos de 48 h de incubación. De igual manera a 3.6

mM de Cr(VI), los cultivos con concentraciones iniciales de biomasa superiores a 1.5

g/L agotaron más rápidamente la glucosa del medio de cultivo.

En aquellos cultivos en los que se redujo totalmente el Cr(VI) se observó que la

glucosa fue consumida completamente antes de que se completara la reducción del

metal, lo que podría haber afectado la velocidad de reducción de éste debido a la falta

de la principal fuente de electrones.

A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas, las menores velocidades

volumétricas de consumo de glucosa se obtuvieron con los cultivos que fueron

inoculados con 0.5 g de células/L y, además, las levaduras no consumieron en su

26

totalidad al monosacárido. Esto fue más evidente cuado se utilizó una concentración

inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, en donde las levaduras sólo consumieron

aproximadamente el 60% de la glucosa inicialmente suministrada y, a partir de las 100

h de incubación, ya no se detectó variación en la concentración del monosacárido

residual.

Como se mencionó anteriormente, las concentraciones celulares iniciales más

adecuadas para reducir 1.5 y 3.6 mM fueron de 1.5-2.5 y 2-2.5 g/L, respectivamente,

ya que con ellas se obtuvieron las eficiencias globales (100%) y velocidades

volumétricas de remoción del metal más altas. Por consiguiente, se seleccionaron las

concentraciones de 2 y 2.5 g/L para realizar estudios posteriores.

Meta 3: Evaluar la remoción de cromo hexavalente por células libres e inmovilizadas. Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y de consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2. La levadura Candida sp. LMB2 es muy sensible a los esfuerzos de corte que se

originan en los reactores agitados mecánicamente, lo que afecta negativamente su

crecimiento, consumo de glucosa y su capacidad para reducir Cr(VI). A fin de

favorecer el óptimo desempeño de la levadura, es conveniente utilizar sistemas de

reacción en los que las fuerzas de corte sean menores que las generadas en los

reactores agitados mecánicamente, como por ejemplo en columnas de lecho

empacado. El uso de estas columnas requiere que las células microbianas sean

inmovilizadas en algún soporte inerte que retenga a los microorganismos dentro del

reactor y que, al mismo tiempo, permita la reducción del Cr(VI) en forma continua.

Sin embargo, el atrapamiento de los microorganismos en el interior de la matriz de los

soportes puede provocar cambios en el metabolismo de las células debido a que se

forman gradientes de pH, concentración de nutrimentos y productos, temperatura, etc.,

lo que puede afectar positiva o negativamente el comportamiento de las células. Es

por ello que es conveniente estandarizar las condiciones de inmovilización, a fin de

encontrar las que sean más convenientes para el propósito que se persigue.

Para determinar si la inmovilización de las células afecta sus procesos metabólicos de

remoción de contaminantes, es necesario realizar estudios comparativos del

desempeño de las células libres (células en suspensión) e inmovilizadas. Con base en

27

lo anterior, en el presente trabajo se realizó un estudio comparativo de la reducción de

Cr(VI) y de consumo de glucosa por células libres e inmovilizadas en perlas de

alginato de calcio de Candida sp. LMB2.

Al inicio de este trabajo se utilizaron condiciones de inmovilización propuestas en la

literatura, las cuales fueron las siguientes: concentración de alginato de 2% (w/v) y una

concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L (Kolot, 1988). Para estos experimentos se

utilizaron tres concentraciones iniciales de Cr(VI), de 0.75, 2.25 y 3.75 mM. Los

resultados obtenidos de reducción de Cr(VI) se muestran en la siguiente sección.

Como se verá más adelante, los parámetros del proceso de reducción de las células

inmovilizadas no fueron adecuadas para la reducción del metal por Candida sp. LMB2,

por lo que fue necesario estandarizar las condiciones de inmovilización a fin de reducir

los problemas que ocasionaron una baja expresión del potencial de la levadura para

reducir el metal.

Ya establecidas las condiciones de inmovilización, en cuanto a la concentración inicial

de biomasa (2-2.5 g/L) y de alginato (0.8% w/v), se procedió a realizar el experimento

comparativo de reducción de Cr(VI) y de consumo de glucosa entre las células libres e

inmovilizadas, utilizando dos concentraciones iniciales de Cr(VI), de 1.5 y 3.6 mM.

A continuación se compararon los niveles de reducción del metal alcanzados con las

dos metodologías, la propuesta en la literatura especializada y la de este trabajo.

Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y de consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas en alginato de calcio de Candida sp., utilizando condiciones de inmovilización propuestas en la literatura. Como se mencionó anteriormente, las células de Candida sp. LMB2 se inmovilizaron

en perlas de alginato al 2% (w/v). La cantidad de células adicionada a la solución de

alginato fue la suficiente para obtener una concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L

en todos los cultivos. Asimismo, se utilizaron como controles cultivos de células libres

con la misma concentración inicial de biomasa. Tanto en los experimentos con células

libres como con las inmovilizadas se emplearon tres concentraciones iniciales de

Cr(VI), de 0.75, 2.25 y 3.75 mM.

Las eficiencias globales de reducción de Cr(VI) y los tiempos requeridos para alcanzar

esas eficiencias se muestran en la tabla 8.

28

Tabla 8. Eficiencias globales y tiempos requeridos para la reducción del metal por las

células libres e inmovilizadas de Candida sp. (metodología de inmovilización propuesta

en la literatura).

Concentración inicial de Cr(VI) [mM]

Concentración de alginato [% w/v]

Concentración inicial de biomasa [g/L]

Eficiencia [%]

Tiempo en el que se alcanzó la concentración mas baja de Cr(VI) residual [h]

0.75 2 0.5 99.9 212

0.75 0 (células

libres) 0.5 100 45

2.25 2 0.5 63 212

2.25 0 (células

libres) 0.5 100 143

3.75 2 0.5 9 212

3.75 0 (células

libres) 0.5 61 212

Las células libres fueron capaces de reducir por completo 0.75 y 2.25 mM de Cr(VI)

(eficiencias globales del 100%); sin embargo, sólo redujeron 61% del metal

inicialmente añadido al medio de cultivo cuando se utilizó una concentración de 3.75

mM de Cr(VI). El tiempo necesario para reducir el metal se incrementó a medida que

aumentó la concentración inicial de Cr(VI).

En contraste, las células inmovilizadas sólo fueron capaces de reducir casi por

completo 0.75 mM de Cr(VI) (eficiencia global de 99.9%) y su eficiencia disminuyó

drásticamente a concentraciones superiores del metal, alcanzándose valores de

eficiencia tan bajas como 9% al final del periodo de incubación (212 h).

Aun cuando la eficiencia global de reducción de Cr(VI) de las células libres e

inmovilizadas fue semejante cuando se utilizó una concentración inicial del metal de

0.75 mM, el tiempo requerido para ello varió considerablemente, 45 h para las células

libres y 212 h para las inmovilizadas, lo que significa aproximadamente un 470% de

diferencia.

29

En la figura 5 se presentan las velocidades volumétricas globales de reducción de

Cr(VI) de las células en suspensión e inmovilizadas de Candida sp LMB2. Es notorio

que la velocidad de reducción del metal de las células libres fue mucho mayor que la

de las inmovilizadas.

Los resultados anteriores demuestran que las células libres de Candida sp. son

capaces de tolerar y reducir muy altas concentraciones de Cr(VI). Asimismo, es

evidente que las condiciones de inmovilización propuestas en la literatura no son

adecuadas para la reducción de Cr(VI) por las células de Candida sp. LMB2, por lo

que fue necesario estandarizarlas a fin de obtener eficiencias y velocidades

volumétricas lo más cercanas posibles a la de las células libres.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.75 2.25 3.75Concentración inicial de Cr (VI)

Velo

cida

d vo

lum

étric

a gl

obal

de

redu

cció

n de

Cr (

VI) [

mg/

L x

h]

Libres

Inmovilizadas 2.0%de alginato

Figura 5. Velocidades volumétricas globales de reducción de Cr(VI) de las células

libres e inmovilizadas, utilizando condiciones de inmovilización propuestas en la

literatura

Asimismo, se determinó el consumo de glucosa de las células inmovilizadas y libres.

Las velocidades iniciales de consumo de glucosa de las células libres fueron mayores

que las de las inmovilizadas, a todas las concentraciones de Cr(VI) ensayadas.

Se observó que el tiempo que requirieron las células libres e inmovilizadas para

consumir el monosacárido se incrementó conforme aumentó la concentración del

metal. A las concentraciones de Cr(VI) de 0.75 y 2.25 mM, el tiempo que requirieron

30

las células libres para consumir la glucosa fue mucho menor que el de las

inmovilizadas. Aun cuando a una concentración de Cr(VI) de 3.75 mM, ni las células

libres ni las inmovilizadas consumieron toda la glucosa presente en el medio de

cultivo, el porcentaje de consumo de las células libres fue ligeramente mayor al final

del experimento.

Los resultados obtenidos en el presente experimento muestran claramente que la

inmovilización de Candida sp. LMB2 en perlas de alginato con una concentración de

polímero de 2% (w/v) y a una concentración celular inicial de 0.5 g/L no es conveniente

para lograr altas eficiencias y velocidades volumétricas de reducción del metal, por lo

que era necesario estandarizar las condiciones de inmovilización.

Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y de consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2, utilizando las condiciones de inmovilización propuestas en este trabajo. Una vez realizado el experimento anterior, en donde se hizo evidente la necesidad de

estandarizar el método de inmovilización, se procedió a realizar el estudio cinético

comparativo de reducción de Cr(VI) y de consumo de glucosa de las células libres e

inmovilizadas, utilizando para ello las condiciones de inmovilización encontradas

experimentalmente en el presente trabajo (concentración de alginato de 0.8% w/v y de

biomasa de 2.0 – 2.5 g/L).

En la tabla 9 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI) y los tiempos

de incubación requeridos para alcanzar esas eficiencias.

Tabla 9. Eficiencias globales y tiempos de incubación requeridos para reducir el metal

de las células libres e inmovilizadas (metodología de inmovilización propuesta en este

tabajo)

Concentración inicial de Cr(VI) [mM]

Concentración de alginato [%]

Concentración inicial de biomasa [g/L]

Eficiencia [%]

Tiempo en el que se alcanzó la concentración mas baja de Cr(VI) residual [h]

1.5 0.8 2.0 100 116

1.5 0 (células

libres) 2.0 100 91

31

1.5 0.8 2.5 100 116

1.5 0 (células

libres) 2.5 100 191

3.6 0.8 2.0 100 192

3.6 0 (células

libres) 2.0 100 96

3.6 0.8 2.5 100 192

3.6 0 (células

libres) 2.5 100 144

A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) y de biomasa ensayadas, las células

libres y las inmovilizadas fueron capaces de reducir completamente el Cr(VI) presente

en los medios de cultivo, por lo que las eficiencias globales de reducción del metal

fueron del 100%. Con excepción de los cultivos realizados a una concentración inicial

de Cr(VI) de 1.5 mM y de biomasa de 2.5 g/L, los tiempos que requirieron las células

libres para reducir todo el Cr(VI) fueron inferiores a los necesitados por las células

inmovilizadas. A pesar de ello, la diferencia de tiempo no fue tan grande como la

obtenida con el método de inmovilización propuesto en la literatura.

Al comparar los resultados de eficiencia global de reducción de Cr(VI) obtenidas con

las dos metodologías de inmovilización (las propuestas en la literatura y en este

trabajo) se apreciaron grandes diferencias. Por ejemplo, se observó que las células

que fueron inmovilizadas utilizando las condiciones propuestas en la literatura sólo

fueron capaces de reducir 9% de 3.75 mM de Cr(VI) en un tiempo de incubación de

212 h, en cambio, las células inmovilizadas con las condiciones propuestas en este

trabajo tuvieron la capacidad de reducir 100% de 3.6 mM de Cr(VI) en un tiempo de

cultivo de 192 h. Con base en estos resultados se deduce que las condiciones de

inmovilización propuestas en este trabajo son más adecuadas que las descritas en la

literatura para la reducción de Cr(VI) por Candida sp. LMB2.

En la figura 6 se presentan las velocidades volumétricas globales de reducción de

cromo hexavalente de las células libres y de las inmovilizadas, cuando se utilizó una

concentración inicial del metal de 1.5 mM. A una concentración inicial de biomasa de 2

g/L, las velocidades obtenidas en ambos cultivos (células libres e inmovilizadas) fueron

semejantes (ligeramente mayor para las células libres); en contraste, a una

concentración celular inicial de 2.5 g/L, la velocidad de reducción de las células

inmovilizadas fue superior a la de las células en suspensión.

32

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

2 2.5

Concentración inicial de biomasa g/L

Velo

cida

d vo

lum

étric

a g

loba

l de

redu

cció

n de

Cr V

I mg

/ l h

Libres

inmovilizadasal 0.8%

Figura 6. Velocidades volumétricas globales de reducción de cromo hexavalente (1.5

mM) de las células libres e inmovilizadas

Cuando la concentración inicial del metal fue de 3.6 mM, la velocidad de reducción de

Cr(VI) de las células libres fue mayor que la de las células inmovilizadas, a las dos

concentraciones iniciales de biomasa ensayadas. A pesar de ello, las células

inmovilizadas fueron capaces de reducir todo el Cr(VI) inicialmente adicionado a los

medios de cultivo.

A las dos concentraciones iniciales de cromo hexavalente ensayadas, las células libres

presentaron mayores velocidades de reducción del metal cuando se utilizó una

concentración inicial de biomasa de 2 g/L. En cambio, las mayores velocidades

volumétricas de reducción de Cr(VI) de las células inmovilizadas se obtuvieron a

concentraciones celulares iniciales de 2 y 2-2.5 g/L, cuando se utilizaron

concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM, respectivamente. Es evidente que

los niveles de reducción del metal alcanzados tanto por las células libres como por las

inmovilizadas dependen de las concentraciones iniciales del metal y de biomasa que

se utilicen.

A pesar de que las condiciones de inmovilización propuestas en este trabajo son más

apropiadas para la reducción de Cr(VI) que las descritas en la literatura, las células

libres presentaron un mejor desempeño en la remoción del metal. Esto podría deberse

a que las células de Candida sp. LMB2 son muy tolerantes al metal, por lo que no fue

evidente que la matriz polimérica protegiera a las células del efecto tóxico ejercido por

el Cr(VI).

33

De la misma manera que en los experimentos anteriores, se determinó la variación de

la concentración de glucosa residual con respecto al tiempo de incubación para todos

los cultivos ensayados.

Se observó que tanto las células libres como las inmovilizadas fueron capaces de

consumir toda la glucosa del medio de cultivo y que el tiempo requerido para ello fue

mayor a la concentración más alta ensayada de Cr(VI) (3.6 mM), lo que podría

deberse a un mayor efecto tóxico del metal.

Además se observó que el tiempo que necesitaron las células libres e inmovilizadas

para agotar la glucosa presente en el medio fue menor al requerido para reducir todo

el Cr(VI).

Los resultados anteriores demuestran que la inmovilización de las células de Candida

sp. LMB2 en alginato de calcio no impide la reducción del cromo hexavalente, aunque

los niveles de reducción alcanzados son inferiores a los obtenidos con las células

libres. A pesar de esto último, la inmovilización de las células en perlas de alginato de

calcio permitirá la reducción continua del Cr(VI) en una columna de lecho empacado,

lo cual no puede lograrse con las células libres. Estos estudios serán abordados

próximamente por una tesista de licenciatura.

En la literatura consultada únicamente se encontraron dos informes sobre reducción

de Cr(VI) utilizando células inmovilizadas. Tucker y col. (1998) reportaron que las

células de Desulfovibrio desulfuricans inmovilizadas en gel de poliacrilamida fueron

capaces de reducir 0.5 mM de Cr(VI) con una eficiencia del 86-96%. Pattanapipitpaisal

y col. (2001) informaron que las células libres de Microbacterium liquefaciens MP30

redujeron más rápidamente 0.1 mM de Cr(VI) que las células inmovilizadas en polivinil

alcohol-nitrato (40% de eficiencia), polivinil alcohol-borato (100% de eficiencia) y

polivinil alcohol-alginato (100% de eficiencia). Las células de Candida sp. LMB2

inmovilizadas en alginato de calcio utilizadas en este trabajo fueron capaces de

remover 3.6 mM de Cr(VI) con una eficiencia del 100%.

Metodología de inmovilización de la levadura Candida sp. LMB2 en perlas de alginato de calcio para la reducción biológica de cromo hexavalente. La metodología sugerida en el presente trabajo para inmovilizar a la levadura Candida

sp. LMB2 para la biorreducción del cromo hexavalente se resumen a continuación:

34

Se disuelve alginato de sodio en agua destilada, a una temperatura de

aproximadamente 60 ºC. La concentración inicial de alginato en esta solución debe ser

mayor al 1% (w/v).

La solución se esteriliza en una autoclave a 120 ºC, durante 15 minutos, y

posteriormente se enfría a temperatura ambiente.

A continuación se agrega un volumen determinado de suspensión celular para obtener

una concentración de biomasa comprendida en el intervalo de 2.0 a 2.5 g/L y una

concentración de alginato de 0.8% (w/v).

La suspensión celular resultante (alginato-biomasa) se agita manualmente y

posteriormente se extruye a través de una manguera de silicón estéril (Masterflex

96410 – 14), con ayuda de una bomba peristáltica, la cual debe operar a una velocidad

tal que permita la formación de perlas individuales.

Las gotas formadas se colectan en recipientes que contengan una solución de CaCl2

al 5% (w/v), y se mantienen en reposo durante una hora para permitir el intercambio

de los cationes sodio y calcio.

En seguida, las perlas de alginato de calcio con biomasa inmovilizada se lavan dos

veces con agua destilada estéril y posteriormente se utilizan como inóculo para los

estudios de reducción de Cr(VI).

Conclusiones 1) En las condiciones ensayadas en el presente estudio, los componentes del medio

de cultivo no redujeron el Cr(VI) y el alginato de calcio no adsorbió cantidad alguna del

metal, por lo que todo el Cr(VI) que fue removido en los experimentos se debió

únicamente a la actividad biológica de las células.

2) La inmovilización de las células de Candida sp. LMB2 en perlas de alginato de

calcio no impidió la reducción del Cr(VI) por la levadura.

3) La concentración de alginato más adecuada para la obtención de perlas individuales

y para la reducción biológica de cromo hexavalente fue de aproximadamente 0.8 %

(w/v).

35

4) La concentración inicial de biomasa más adecuada para la reducción del cromo

hexavalente por las células inmovilizadas de Candida sp. LMB2 depende de la

concentración inicial del metal que se utilice. En general, las eficiencias globales y

velocidades volumétricas de reducción del metal más altas se obtuvieron a una

concentración celular inicial de 2.0 – 2.5 g/L.

5) La técnica de inmovilización en gel de alginato de calcio propuesta en el presente

trabajo es más adecuada para la reducción de Cr(VI) por Candida sp. LMB2 que la

descrita en la literatura especializada, por lo que se utilizará posteriormente para la

reducción continua del metal en una columna de lecho empacado.

Referencias 1. Hach Water Analysis Handbook. 2002. Hach Company. Colorado, USA. 4th. ed. pp. 433-444,

1210-1211.

2. Juvera-Espinosa, J. 2006. Evaluación de la remoción de cromo hexavalente por levaduras.

Tesis de Licenciatura. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico

Nacional.

3. Juvera-Espinosa, J.; Morales-Barrera, L. & Cristiani-Urbina, E. 2006. Isolation and

characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI). Enzyme and Microbial

Technology 40: 114-121.

4. King, A. 1988. Flavor encapsulation with alginates. En: Flavor encapsulation (S. Risch & G.

Reyneccius, Ed.), pp. 122-125. ACS Symposium Series 370, American Chemical Society,

Washington, D.C.

5. Kolot F. B., 1988. Inmobilized microbial systems; Principles, techniques and Industrial

Applications. Robert E. Krieger publishing company, Malabar Florida.

6. Morales-Barrera, L. 2005. Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad para

remover cromo hexavalente. Tesis de maestría. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del

Instituto Politécnico Nacional.

7. Pattanapipitpaisal, P.; Brown, N.L. & Macaskie, L.E. 2001. Chromate reduction by

Microbacterium liquefaciens immobilized in polyvinyl alcohol. Biotechnol. Lett. 23: 61-65.

36

8. Tucker, M.D.; Barton, I.L. & Thomson, B.M. 1998. Reduction of Cr, Mo, Se, and U by

Desulfovibrio desulfuricans immobilized in polyacrylamide gels. Ind. Microbiol. Biotechnol. 20

(1): 13-19.

Impacto La principal contribución de este trabajo fue la formación de recursos humanos, tanto a

nivel licenciatura como de posgrado. En este proyecto participaron activamente 3

estudiantes de licenciatura, 1 de maestría y 1 de doctorado. Una de las estudiantes de

licenciatura ya sustentó el examen profesional, otro estudiante de licenciatura ya

terminó de escribir la tesis y los demás tesistas continúan con el desarrollo de su

trabajo experimental.

Como productos de la investigación se tiene que se publicaron 2 artículos en revistas

internacionales incluidas en la base de datos del Institute for Scientific Information

(ISI). Además, se publicaron 4 artículos en extenso en memorias de Congresos

Internacionales, con registro ISBN, y se presentaron varios trabajos de investigación

en eventos académicos nacionales e internacionales.

La levadura utilizada en este trabajo es capaz de remover el Cr(VI) mediante un

mecanismo de reducción química, lo cual es lo más deseable desde el punto de vista

de biorremediación, ya que el Cr(III) es 100 veces menos tóxico, 1000 veces menos

mutagénico y mucho menos soluble en agua que el Cr(VI), lo que permite remover el

cromo del ambiente de una manera más sencilla y económica que por los métodos

fisicoquímicos.

En la literatura especializada prácticamente no existen informes sobre la reducción de

Cr(VI) por levaduras, por lo que el uso de este tipo de microorganismos en la remoción

del metal contribuye a generar conocimiento nuevo y útil sobre este tópico de interés

ambiental. Además, los estudios de biología molecular que se han realizado con la

levadura empleada en este trabajo sugieren que es una cepa aún no descrita en la

literatura, por lo que su estudio y caracterización son aún de mayor importancia.

En el presente trabajo se estandarizaron las condiciones de inmovilización de Candida

sp. en perlas de alginato de calcio. Los resultados mostraron que la técnica propuesta

en este trabajo es más recomendable que la reportada en la literatura para la

reducción de Cr(VI) por Candida sp.

37

Ya habiendo obtenido las condiciones de inmovilización más adecuadas para la

reducción de Cr(VI), se realizarán posteriormente estudios de reducción de Cr(VI) en

columnas de lecho empacado, a fin de proponer un sistema continuo de reducción del

metal. Esto es de vital importancia ya que se podría depurar una mayor cantidad de

aguas contaminadas con Cr(VI) en menor tiempo y, además, se podría llegar a

proponer una tecnología novedosa ya que la mayoría de los estudios sobre este tópico

se han realizado en sistemas por lote.

38