Ingeniería del metabolismo primario · Web viewSin embargo, la modificación del metabolismo a...

Agrobiotecnología.

Clase 23: Ingeniería metabólica

Factores relevantes en i ngeniería m etabólica

Transparencias 3-6

Para poder encarar un desarrollo en la ingeniería metabólica es necesario conocer las rutas metabólicas involucradas, la regulación de las enzimas implicadas, la disponibilidad de sustratos y las afinidades enzimáticas para con los mismos, los efectos fisiológicos que se producen al alterar un vía, los efectos producidos por la compartimentación subcelular de los productos y los efectos de su expresión en determinados tejidos u órganos.

La ingeniería genética dispone hoy de varias estrategias para modificar rutas metabólicas (transparencias 5 y 6). Básicamente, éstas permiten efectuar procesos tales como: a) completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos; b) amplificar rutas normales; c) bloquear rutas alternativas; d) bloquear rutas normales; e) modificar la regulación de rutas normales; f) minimizar la aparición de respuestas en cascada. Las técnicas disponibles permiten prolongar, ramificar y bloquear rutas metabólicas. El flujo metabólico puede también incrementarse por expresión constitutiva de enzimas clave o por neutralización de los mecanismos de retroalimentación por acumulación de producto. Alternativamente, el flujo a través de una ruta determinada puede incrementarse por sobrexpresión de los factores de transcripción que intervienen en la regulación de la misma.

Modificaciones en las rutas de síntesis d e hidratos de carbono

Transparencias 7-22

Los hidratos de carbono son utilizados para la obtención de una gran diversidad de productos en distintas ramas industriales. La transparencia 7 enumera algunos ejemplos de estos productos. La tabla inferior muestra los valores globales de la producción estimada de los principales carbohidratos. La transparencia 8 resume las principales áreas de trabajo en que se ha concentrado la investigación en este campo

El almidón está formado por dos polímeros distintos, la amilosa y la amilopectina (transparencia 9). La amilosa es un polisacárido no ramificado de unos 1.000 residuos de glucosa. En cambio, las moléculas de amilopectina poseen cadenas líneales y ramificaciones (aproximadamente, una cada 20 residuos de glucosa) y comprenden de 104 a 105 residuos de glucosa. Existen dos clases de enzimas que intervienen en la síntesis del almidón. Las que realizan uniones a(1®4) pueden estar bajo una forma soluble (sintetasa soluble del almidón; SSS) localizada en el estroma de los amiloplastos, bajo una forma unida a los gránulos de almidón (sintetasa unida al gránulo del almidón; GBSS). La enzima que produce uniones a(1®6) realiza las ramificaciones de la amilopectina (enzima ramificante del almidón; BE) y está también localizada en los amiloplastos. La proporción de amilosa en el almidón varía normalmente entre 20 y 30%, y la de amilopectina entre 70 y 80%. Las diferentes proporciones entre ambos componentes determinan las diferentes propiedades fisicoquímicas de los almidones. En la imagen inferior de la transparencia 9 se muestran las estructuras de los gránulos de almidón de maíz, papa y mandioca. A

pesar de que el almidón se produce por la misma ruta metabólica en las tres plantas, la forma y las características de los gránulos de almidón son específicas para cada especie.

El uso del almidón depende de la estructura de los gránulos, así como también en su composición de amilosa, amilopectina y otros componentes menores (lípidos, proteínas y fosfatos). La relación entre amilosa y amilopectina, y la distribución de los glucanos de bajo peso molecular afectan propiedades tales como la temperatura de gelatinización, la retrogradación y la viscosidad. Los almidones con más del 90% de amilosa son más adecuados para la producción de películas. Para la confección de adhesivos se utilizan almidones con distintas proporciones de amilosa y amilopectina, dependiendo de las aplicaciones específicas. Las aplicaciones industriales del almidón dependen de su composición química particular, lo cual está principalmente determinado por el genotipo del cultivo de origen. Los programas de cruzamiento para alterar la composición del almidón resultan frecuentemente en líneas con rendimientos agronómicos reducidos, por lo que son poco competitivas en el mercado. Por esta razón, existe gran interés en explorar las posibilidades de mejoramiento de la calidad del almidón por técnicas de ingeniería genética.

La transparencia 11 muestra un esquema de las rutas de síntesis y degradación de algunos hidratos de carbono. La sobrexpresión o la supresión de los genes que participan de esta vía permiten favorecer la formación de algunos productos con decrecimiento de otros. Por ejemplo, cuando se disminuye la expresión de la enzima ramificante del almidón (BE), se produce almidón con un mayor contenido de amilosa. El incremento en la acumulación de almidón puede lograrse sobrexpresando enzimas heterólogas que no son reguladas por los mecanismos endógenos de la planta. Para modificar el balance amilosa/amilopectina, se puede reducir la expresión de las enzimas involucradas expresando transcriptos antisentido o induciendo el silenciamiento génico postranscripcional del gen correspondiente.

En las transparencias 12 y 13 se muestran los resultados de un trabajo en que se expresó un gen mutado de ADP-glucosa pirofosforilasa de Escherichia coli (gen glgC16) en S. tuberosum. Las ADP-glucosa pirofosforilasas vegetales están compuestas por tetrámeros. La fructosa 1,6-bifosfato y el Pi actúan como efectores positivo y negativo, respectivamente, de esta enzima. La enzima de E. coli es monomérica y no responde a los efectores que actúan en el tejido vegetal. Debido a que en las plantas la biosíntesis de almidón ocurre en los cloroplastos, se agregó una secuencia que codifica un péptido señal de transporte a cloroplasto (CPT) a la construcción utilizada para la transformación. La secuencia se puso bajo el control del promotor de 35S de CaMV. La enzima transgénica se procesó correctamente y resultó activa en las células vegetales. Se transformaron plantas de Lycopersicon esculentum, N. tabacum y S. tuberosum vía Agrobacterium tumefaciens. En el caso de Solanum, se utilizó el promotor del gen de patatina, el que se expresa en forma específica en los tubérculos. La transparencia 13 muestra el contenido de almidón en extractos de callos de tabaco transformados con el gen glgC16.. Las líneas 1 a 6 expresan el transgen; la línea 13 corresponde a una planta control no transformada. En una de las líneas transgénicas se llegó a obtener 26,9% de almidón mientras que en plantas controles el nivel fue de 3,4%. En la tabla, se muestran el incremento de la gravedad específica promedio y del contenido de almidón en tubérculos transgénicos. Como puede observarse, los tubérculos de las líneas transgénicas contienen un 35% más de almidón que en controles.

Las transparencias 14 y 15 muestran un ejemplo de modificación de la composición del almidón. El almidón de alta amilosa tiene gran demanda industrial por sus propiedades funcionales y existen pocos cultivos que lo producen naturalmente. Por

esta razón, se transformaron plantas de S. tuberosum con una secuencia antisentido del gen de la enzima ramificante del almidón obtenida de esta especie. Se comprobó la casi total inhibición de las dos isoformas de la enzima (codificadas por los genes sbe A y sbe B). La morfología de la planta no resultó alterada; en cambio, los tubérculos adquirieron una morfología más alargada. El nivel de Pi en el almidón se incrementó en más de 5 veces. La inhibición simultánea de SBE A y SBE B afectó la estructura del almidón, así como también a la de los gránulos. Los gránulos de almidón de las plantas controles fueron ovalados, con bordes suaves, y mostraron birrefringencia bajo la luz polarizada, un indicador de ordenamiento cristalino (A). La mayoría de los gránulos de las líneas de alta amilosa exhibieron menos birrefringencia, lo que indicaba una reducción en la estructura cristalina, y poseían bordes irregulares con fisuras profundas en el centro del gránulo (B). Los cambios en la estructura y composición granulares condujeron a alteraciones en las propiedades del almidón. Los gránulos de almidón control comenzaban a hincharse a 70oC y formaron una pasta viscosa después de alcanzar los 95oC (C). Los gránulos de alta amilosa mostraron un incremento en la temperatura de empastamiento acorde a sus niveles de amilosa, pero la hinchazón del granulo resultó completamente inhibida cuando este nivel fue mayor del 55% (D).

La transparencia 16 muestra las rutas de biosíntesis que conducen a la formación de distintos hidratos de carbono. Las rutas normales de las células vegetales se esquematizan mediante flechas negras, mientras que aquellas modificadas por la introducción de genes de otros organismos se esquematizan con flechas rojas. La sacarosa es sintetizada vía UDP-glucosa a partir del depósito de hexosas-fosfato en el citoplasma y almacenada en la vacuola. En este compartimiento, puede ser transformada en fructanos por introducción de levano-sacarasas o fructosil-transferasas de distinto origen. La UDP-glucosa y la glucosa 6-fosfato pueden ser utilizadas como precursores para formar trehalosa por transformación de la planta con trehalosa sintetasas de otras plantas, hongos, insectos, etc. La glucosa 6-fosfato puede usarse también como precursor de azúcares-alcoholes (manitol, pinitol) mediante la transformación con enzimas apropiadas. En las hojas, la triosa-fosfato es transportada al interior de los cloroplastos, donde es convertida a hexosas-fosfato y luego a ADP-glucosa para la síntesis del almidón. Las ciclodextrinas no se producen en las plantas, pero el almidón puede ser usado como sustrato por algunas enzimas bacterianas involucradas en su síntesis.

Existen muchos hidratos de carbono de interés comercial que son producidos sólo por algunas plantas (manitol, pinitol) y/o por microorganismos (fructanos, ciclodextrinas). Los compuestos que se refieren en la transparencia 17 han sido sobrexpresados en plantas modelo y/o cultivos agronómicos por técnicas de ingeniería genética. Como el almidón y la sacarosa, los fructanos están naturalmente presentes como reserva de carbohidratos en muchas plantas (algunas de las cuales comemos). Los fructanos, o polifructosilsacarosas, son polímeros de fructosa que derivan de la sacarosa. Los fructanos son producidos por alrededor del 15% de las especies de plantas con flores, como también por bacterias y hongos. En las pasturas, los fructanos son almacenados principalmente en la bases de las hojas y usados para el rebrote luego de la defoliación, mientras que el almidón es almacenado en semillas. En contraste con el almidón, el que es almacenado en organelas especializados (plástidos), los fructanos son sintetizados y almacenados en las vacuolas de las células vegetales. En otras plantas, los fructanos se almacenan en órganos especializados, como por ejemplo en la raíz principal de achicoria (Cichorium intybus), en los tubérculos de dalia (Dahlia variabilis), y en los bulbos del tulipán (Tulipa gesneriana) y de la cebolla (Allium cepa).

La transparencia 18 muestra un ejemplo de expresión de fructanos y levanos en plantas de S. tuberosum. Con este fin, se realizaron construcciones que contenían los

genes sacB de Bacillus subtilis o ftf de Streptococcus mutans fusionados a una secuencia señal de transporte a vacuola obtenida del gen de la carboxipeptidasa Y de levadura (cpy). Las construcciones se pusieron bajo la dirección del promotor constitutivo 35S del CaMV. Estas construcciones se introdujeron en plantas de S. tuberosum.

La transparencia 19 muestra una comparación del contenido de almidón en microtubérculos de plantas controles y transformadas en relación con el contenido de fructanos de las plantas transformadas. Como se muestra en la gráfica, los microtubérculos que acumularon altos niveles de fructanos (plantas transformadas KP) mostraron severas reducciones en el contenido de almidón, con niveles que alcanzaron un tercio de los observados en las plantas controles (un promedio de 64,9 mg de almidón/g de peso fresco en microtubérculos sin transformar versus 18,9 mg/g en microtubérculos de plantas transformadas con el gen sacB). Las plantas conteniendo el gen ftf exhibieron un contenido más bajo de fructano y niveles menos reducidos de almidón. La transparencia 20 muestra resultados del mismo trabajo. Se determinó el contenido de fructano y almidón en hojas jóvenes, de mediana edad y viejas, en plantas controles y transgénicas conteniendo el gen sacB (gráfico de la derecha). En las plantas controles de mediana edad se observaron los mayores contenidos de almidón. El análisis del contenido de fructanos en las plantas transgénicas reveló que los fructanos se acumulaban durante todo el desarrollo de la hoja. Los más altos niveles de fructano se alcanzaron en las hojas más viejas, pero las hojas jóvenes y de mediana edad también presentaron incrementos significativos. La acumulación de fructanos en las hojas viejas alcanzó hasta un 30% del peso seco. La acumulación de fructanos afectó dramáticamente el total de carbohidratos no estructurales en las hojas de las plantas de Solanum (gráfico de la izquierda). Esto demuestra que el metabolismo de los carbohidratos en hojas también es afectado.

Otra especie transformada con un gen de la fructosil-transferasa fue la remolacha azucarera (Beta vulgaris). Se transformaron plantas con el gen 1-sst que codifica una 1-sacarosa:sacarosa fructosil transferasa aislada de Helianthus tuberosus (transparencias 21 y 22). En H. tuberosus, la 1-SST media los primeros pasos en la síntesis de los fructanos de bajo peso molecular (GF2, GF3 y GF4). En la raíz de las plantas de B. vulgaris transformadas, la sacarosa fue convertida en su casi totalidad en estos fructanos. En contraste, la expresión del gen 1-sst en las hojas resultó en bajos niveles de fructanos. A pesar de que la composición de los carbohidratos de almacenamiento resultó alterada, la expresión del gen 1-sst no produjo cambios visibles en el fenotipo ni afectó la tasa de crecimiento de las raíces.

Modificaciones en las rutas de síntesis de ácidos grasos

Transparencias 23-35

En forma similar a los hidratos de carbono, los ácidos grasos de distintos tipos se producen en grandes cantidades a partir de los cultivos oleaginosos como colza (canola), soja y maíz, tanto para propósitos industriales como alimentarios. La ingeniería metabólica ha comenzado a jugar un rol importante en el mejoramiento de estos cultivos, ya sea incrementando la producción de ácidos grasos existentes como en el diseño de nuevos productos. La canasta tradicional de oleaginosas está compuesta principalmente por trece cultivos: algodón, coco, colza, girasol, lino, maíz, maní, oliva, palma de aceite, palmiste (palma kernel), ricino, soja y sésamo (ajonjolí). La de grasas animales la componen la manteca de cerdo, el sebo, la manteca (mantequilla) y los aceites de pescados. En la tabla de la transparencia 24 se muestran los valores de la producción mundial de aceites y grasas desde 1990 al

2002. Puede observarse que los aceites de soja, palma, colza y girasol representan el 67% de la producción mundial de grasas y aceites en el acumulado 1998-2002. En este cuadro no se tiene en cuenta la producción de grasa de cerdo, de aves de corral, de pescado, de otras grasas animales y de sebo. En quinto lugar está ocupado por el ghee, una mantequilla líquida clarificada por evaporación. La posición número 14 incluye aceites y grasas derivadas de peces y afines, excluyendo mamíferos.

Los constituyentes primarios de los aceites y las grasas son los triacilgliceroles (TAGs), los cuales están compuestos por ácidos grasos y glicerol. Los TAGs que son líquidos a temperatura ambiente son denominados aceites, mientras que aquellos que son sólidos bajo estas condiciones son conocidos como grasas. La composición de ácidos grasos de los TAGs determina el rango de aceites y grasas para propósitos nutricionales. Ello permite discriminar entre los lípidos que son considerados colesterogénicos y aquellos que no lo son. Los ácidos grasos de propiedades especiales abren un gran campo de aplicaciones técnicas para la síntesis oleoquímica. Estas aplicaciones no nutricionales dependen de la composición de ácidos grasos de los TAGs y, en particular, de la disponibilidad de residuos grasos homogéneos. Han sido descriptos más de 210 tipos diferentes de ácidos grasos en semillas y frutas de plantas, pero sólo a unos pocos se les ha encontrado una aplicación no alimentaria. Ejemplos de ellos son el ácido láurico (C12:0), el cual es ampliamente usado para la producción de detergentes y surfactantes; los ácidos linoleico y linolénico (D9,12 C18:2, D9,12,15 C18:3) usados en pinturas, barnices y coberturas; el ácido ricinoleico (D9,12 OH-C18:1) para coberturas y lubricantes y el ácido erúcico (D13 C22:1) como lubricante, agente antideslizante y como precursor de la síntesis de Nylon entre otras cosas. Los ejemplos que se describen en la transparencia 25 muestran las principales características que se tienen en cuenta en la clasificación de los ácidos grasos: a) variación en la longitud de la cadena; b) variación en la posición números de dobles ligaduras y c) sustitución por grupos funcionales.

La transparencia 26 muestra un esquema general de los pasos implicados en las rutas biosintéticas de los ácidos grasos. Las enzimas individuales de síntesis de ácidos grasos polimerizan en forma secuencial unidades de C2 derivadas de acetil-CoA a una cadena acil en crecimiento, la cual está unida a una pequeña proteína (proteína transportadora de acilos; ACP). En una serie de 7 ciclos de condensación, se produce un acil-tioester de C16:0, palmitoil-[ACP], lo que requiere, entre otras actividades, de la acción de una enzima de condensación (b-cetoacil-[ACP] sintetasa I; KAS I). La terminación prematura de la cadena por clivaje tiolítico de los intermediarios de acil-[ACP] mediante la expresión de acil-[ACP] tioesterasas específicas puede resultar en la producción de ácidos grasos de cadenas cortas e intermedias C8:0-C14:0. El palmitoil-[ACP] es el punto de partida para la producción de ácido petroselínico en semillas de coriandro. En muchos tejidos vegetales en que se acumulan lípidos, el palmitoil-[ACP] es elongado a estearoil-[ACP] C18:0 por una KAS II específica. La desaturación de estearoil-[ACP] a oleoil-[ACP] es catalizada por una enzima soluble, la D9-estearoil-ACP desaturasa, presente en el plástido. La sobrexpresión de esta enzima resulta en la producción de aceites con alto contenido de ácidos grasos insaturados y con bajos niveles de ácido esteárico. En general, el ácido graso producido en mayor cantidad en las plantas es el ácido oleico, el que es liberado por la acción de la oleoil-[ACP] tioesterasa y activado a oleoil-CoA por una acil-CoA sintetasa en la envoltura externa del cloroplasto mientras es exportado al retículo endoplásmico. El ácido oleico es incorporado en TAGs de almacenamiento durante la maduración de la semilla. En la membrana del retículo endoplásmico, se encuentran enzimas que introducen diversas modificaciones tales como insaturaciones (desaturasas específicas), hidroxilaciones, conjugaciones, epoxidaciones, acetilaciones, elongaciones y reducciones.

La tabla de la transparencia 27 describe la composición de ácidos grasos de aceites obtenidos de algunos cultivos de interés comercial. La tabla de la transparencia 28 muestra ejemplos de ácidos grasos no comestibles simples o conjugados y de las especies vegetales que los producen. El tratamiento de ácido erúcico y de ácido petroselénico con ozono da origen a productos de interés para la industria. El ácido láurico es utilizado para la fabricación de detergentes, surfactantes y shampúes. Los ácidos dicarboxílico y brassílico pueden emplearse para la producción de Nylon.

La transparencia 29 enumera los principales objetivos perseguidos en la modificación de ácidos grasos mediante ingeniería genética. Los perfiles de ácidos grasos pueden modificarse para obtener distintas proporciones de ácidos grasos saturados, monoinsaturados, de cadena media o con distintas sustituciones. Para ello, se introducen en la planta los genes de las enzimas apropiadas o se inhibe (mediante introducción de genes antisentido o silenciamiento génico) la expresión de las enzimas endógenas responsables del paso biosintético involucrado.

Los aceites con alto contenido de ácidos grasos saturados como palmítico y esteárico tienen gran demanda industrial, ya que son utilizados para la fabricación de jabones, detergentes y cosméticos. La mayoría de las plantas producen aceites con bajo contenido de ácidos grasos saturados. En las transparencias 30 a 32, se presenta un ejemplo en el que se modificó el perfil de ácidos grasos en semillas de Brassica napus y Brassica rapa con el objeto de incrementar la producción de ácido esteárico. Con tal fin, se realizaron construcciones con genes antisentido de la estearoil-ACP desaturasa de B. rapa para reducir la síntesis de ácidos grasos insaturados. Este procedimiento permite inhibir, total o parcialmente el siguiente paso de síntesis.

estearil-ACP-desaturasa 18:0- ACP ----------------------------------------4 18:1-ACP (estearoil-ACP) + O2 (oleoil-ACP) + ferredoxina

Las construcciones antisentido fueron puestas bajo la regulación de genes que se expresan durante el llenado de la semilla, es decir durante el período de máxima síntesis de ácidos grasos.

La transparencia 31 muestra los perfiles de ácidos grasos en semillas de las plantas transgénicas obtenidas con las construcciones previamente descriptas. Se observó que las semillas de la línea 3242-T-1 contenían hasta un 32% de estearato. En base a los niveles de estearato, se dividió a las semillas en dos grupos que correspondían a la segregación mendeliana del transgen: con alto estearato y con niveles normales de estearato. En las gráficas se observan los perfiles de la composición de ácidos grasos de cada grupo. Se analizaron 50 semillas maduras de la línea 3242-T-1. De ellas, 21 resultaron contener alto estearato (niveles que variaban entre 21,5% a 32%), y 29 resultaron con niveles equivalentes a las plantas control (Tobin) sin transformar (niveles entre 1,0-1,6%). El incremento de estearato fue acompañado por un descenso en los niveles de ácido oleico, el producto de reacción de la estearil-ACP desaturasa.

La transparencia 32 muestra un análisis de extractos de 10 semillas de la planta transgénica 3242-T-1 y de 10 semillas de una planta control para determinar los niveles de desaturasa y el contenido de estearato. El fenotipo de alto estearato se correlacionó con una marcada reducción de la enzima en el análisis de Western blot. Por el contrario, las semillas 3242-T-1 (segregantes no transgénicos) o las semillas control no transformadas (Tobin), exhibieron niveles no normales de estearato y de expresión de la enzima.

Los aceites compuestos con ácidos grasos saturados de cadena media también son utilizados en la industria cosmética para la fabricación de jabones, champúes, etc. Estos ácidos grasos están presentes en algunos cultivos como palma, cocotero, Cuphea, pero no en las semillas de los cultivos extensivos. La transparencia 33 muestra un ejemplo en el cual se cambió el perfil de ácidos grasos en detrimento de los de cadena larga y en favor de los de cadena media. La 12:0 acil-ACP-tioesterasa es una enzima que interrumpe el proceso de elongación de los ácidos grasos para producir ácido láurico (C12:0). En el trabajo que se presenta, se transformó Arabidopsis thaliana con el gen de la 12:0 acil-ACP-tioesterasa de Umbellinaria californica. La actividad de la tioesterasa se midió en conjuntos de 40 semillas maduras obtenidas de las plantas transgénicas. La actividad de la enzima en las plantas transgénicas varió entre 300 y 1.000 mU por semilla. En contraste, las plantas control exhibieron actividades promedio de 7 mU de por semilla. Como se muestra en la tabla, el laurato se acumuló en las semillas de plantas transformadas y permaneció ausente en plantas de Arabidposis no transformadas. En la transparencia 34 se analiza el perfil de ácidos grasos en 100 semillas maduras de cada planta por cromatografía gas-líquido. Las plantas transformadas exhibieron un alto contenido de ácido láurico y un descenso concomitante de algunos ácidos grasos de cadena larga (³ 16). La única excepción fue el linolenato, el que no fue afectado por la acción de la enzima introducida. El total de ácidos grasos por semilla permaneció sin cambios. Debido al amplio conocimiento disponible sobre la síntesis de ácidos grasos en distintos organismos, dentro de las limitaciones que imponen los efectos fisiológicos no deseados, es posible cambiar el perfil de ácidos grasos de una especie vegetal en un rango muy amplio de composiciones. La tabla de la transparencia 35 muestra ejemplos de modificaciones introducidas en B. napus (colza), uno de los cultivos en que más trabajo se ha realizado al respecto. El aceite producido por las semillas de B. napus posee un alto contenido de ácido erúcico, lo que lo torna inadecuado para usos alimentarios. La supresión de la expresión de la oleoil-CoA-elongasa en una mutante natural seleccionada por mejoramiento clásico permitió eliminar la producción de ácido erúcico y desarrollar el cultivo comercial (canola, por canadian oil). El aceite de canola posee un alto contenido de ácido oleico (62%) y niveles elevados de aceites omega 6 y 3 (22% y 10%, respectivamente). La introducción por ingeniería genética de distintas tioesterasas, desaturasas, elongasas y secuencias antisentido (listadas en la tabla) en este cultivo ha permitido cambiar su composición de ácidos grasos en forma sustancial. Trabajos similares han sido efectuados en la soja (Glycine max). Algunas de estas variedades transgénicas han ingresado ya en la etapa comercial.

Modificaciones en las rutas de síntesis de aminoácidos


Los animales, incluyendo al hombre, son incapaces de sintetizar 10 de los 20 aminoácidos requeridos para la síntesis de proteínas, por lo que estos aminoácidos “esenciales” deben ser obtenidos de la dieta. Los alimentos para animales se complementan muchas veces con aminoácidos puros producidos en bacterias por fermentación para obtener un balance adecuado. Un objetivo importante de la biotecnología vegetal ha sido crear variedades con una mejor composición aminoacídica de las semillas para mejorar la nutrición de humanos y animales domésticos. Los blancos más importantes han sido el contenido de lisina en los cereales y el de metionina en las leguminosas. Existen al menos tres estrategias para cambiar la composición aminoacídica de las semillas: a) alterar la regulación de las rutas de síntesis de los aminoácidos esenciales suprimiendo la inhibición por alta concentración de producto; b) sobrexpresar proteínas foráneas con mejor composición

aminoacídica en semillas o frutos de interés; c) modificar las secuencias de las proteínas de reserva propias del cultivo de interés introduciendo secuencias ricas en aminoácidos esenciales (transparencia 37). Esto último permite evitar la introducción de genes de proteínas foráneas, cuya acumulación en muchos casos va en detrimento de la morfología y viabilidad de las semillas.

La transparencia 38 muestra un esquema de las vías de síntesis de lisina, metionina y treonina y de los mecanismos de regulación negativa que actúan en las distintas rutas. La lisina al igual que la treonina, metionina e isoleucina, son aminoácidos derivados de aspartato. El primer paso de la vía de síntesis de estos aminoácidos es la fosforilación del aspartato por la enzima aspartato kinasa (AK), la que es regulada negativamente por la acumulación de lisina. La dihidrodipicolinato sintetasa (DHDPS) es la primera enzima comprometida en la ruta de la síntesis de lisina y es también regulada negativamente por acumulación de este aminoácido. Por su parte, la acumulación de treonina también regula negativamente la actividad de AK. La expresión de genes heterólogos de estas enzimas insensibles a la regulación por acumulación de producto, en forma individual o conjunta, ha sido utilizada para variar la composición de estos aminoácidos esenciales en semillas de cereales y leguminosas.

Como un ejemplo de la estrategia descripta, se presenta el caso de la transformación de soja (Glycine max) con genes heterólogos para incrementar el contenido de lisina (transparencias 39 y 40). El gen de dihidrodipicolinato sintetasa (DHDPS) de Coynebacterium glutamicum (gen dapA) y el gen mutado de aspartato kinasa (AK) de Escherichia coli (gen lysC) son insensibles a la inhibición por lisina. Ambas secuencias se clonaron bajo la dirección de un promotor específico de semilla (promotor de faseolina [Pv5’], aislado de Phaseolus vulgaris) y se ligaron a secuencias que codifican péptidos señal de transporte al cloroplasto (organela en que está localizada la síntesis de lisina, metionina y treonina). Ambas construcciones, acompañadas por el gen uidA (gus) como gen reportero, se introdujeron en plantas de soja mediante biobalística. Las construcciones fueron introducidas también en plantas de canola por co-transformación vía A. tumefaciens. Las plantas fueron autopolinizadas para obtener líneas homocigotas. La expresión del gen dapA produce un incremento de lisina libre unas 100 veces mayor en canola y de hasta 25% mayor en soja. La expresión de ambos genes, aumentó varios cientos de veces los niveles de lisina libre y hasta 5 veces el total de lisina en semillas de soja. La transparencia 40 muestra algunos de los resultados obtenidos en este trabajo. Se extrajeron los aminoácidos libres de 10 semillas segregantes R1 para cada línea transgénica y se determinó su composición. En el gráfico se compara la línea A2396-145 (barras violetas) con la línea A2396-183 (barras verdes). Ambas líneas expresan los dos transgenes y se indica la determinación de b-glucuronidasa (GUS), dihidrodipicolinato sintetasa (DHDPS) y aspartato kinasa (AK). Se observa un incremento significativo de lisina libre cuando las semillas expresan los dos transgenes. Las semillas de la generación R2 exhiben los más altos niveles de lisina libre cuando ambos genes están en homocigosis. Los niveles de acumulación de lisina libre se incrementaron de 10 a 100 veces en las distintas líneas transgénicas.

Las dietas basadas en semillas de leguminosas generalmente contienen un adecuado suplemento de lisina, pero son deficientes en aminoácidos azufrados como metionina y cisteína. La tabla superior de la transparencia 41 muestra que las semillas de leguminosas poseen un bajo contenido de metionina mientras que las de otras especies, como maíz (Zea mays), nuez de Brasil (Bertholletia excelsa) y girasol (Helianthus annuus), son ricas en este aminoácido. Los niveles de aminoácidos sulfurados en todos los cultivos mencionados varían entre las distintas variedades. El requerimiento de metionina para el crecimiento animal es 1,6-1,9 g por 100 g de proteína total. La tabla inferior enumera cultivos en los que fueron introducidos genes

de proteínas ricas en metionina con el propósito de incrementar su contenido en este aminoácido. Se detallan los genes que fueron utilizados y los niveles alcanzados. La albúmina 2S de B. excelsa se utilizó exitosamente para incrementar el contenido de metionina de soja y canola (transparencias 42 y 43). Sin embargo, esta proteína demostró poseer propiedades alergénicas, por lo que se decidió detener toda investigación posterior. La albumina 2S de H. annuus no es alergénica, por lo que el gen correspondiente se ha convertido en un candidato de elección para efectuar este tipo de modificaciones.

El cerdo es un buen ejemplo de cría intensiva que utiliza alimentos de origen vegetal. Para un crecimiento óptimo, este animal requiere que el 3,5% de la proteína dietaria esté compuesta de aminoácidos sulfurados, de los que por lo menos el 1,6% debe ser metionina. Se han desarrollado plantas transgénicas de canola (B. napus), haba (Vicia narbonensis) y lupino (Lupinus angustifolius) en las que se expresaron genes de proteínas foráneas ricas en metionina y se enriqueció el contenido de este aminoácido en las semillas. En algunos casos la modificación genética permite satisfacer el nivel óptimo de crecimiento sin el agregado de suplementos externos.

Las transparencias 44 y 45 presentan otro ejemplo en que se transformó un cultivo de interés alimentario con una proteína de reserva foránea para cambiar el perfil de la composición aminoacídica. S. tuberosum es la cuarta producción alimentaria mundial. Los aminoácidos esenciales que limitan su valor nutritivo son la lisina, la tirosina y los aminoácidos sulfurados. La albúmina AmA1 de Amaranthus hypocondriacus no es alergénica y es una proteína cuya composición está bien balanceada en términos de aminoácidos esenciales. Se diseñaron dos construcciones genéticas que permitieron la expresión constitutiva (promotor 35S de CaMV); serie de plantas pSB8) o tubérculo-específica (promotor GBSS de la sintetasa de almidón unida al gránulo; serie de plantas pSB8G) del gen AmA1. Se transformaron plantas de S. tuberosum con ambas versiones del gen AmA1 utilizando el sistema basado en Agrobacterium. Se observaron incrementos en prácticamente todos los aminoácidos. Se analizó el contenido de aminoácidos en tubérculos de 2 líneas que mostraron altos niveles de expresión del gen AmA1, una en la que la expresión era constitutiva (línea pSB8-3) y otra en que la expresión era específica de tubérculo (línea pSB8G-5). En ambas líneas, el contenido de lisina, metionina, cisteína y tirosina se incrementó en forma significativa respecto de las plantas control. La línea que expresaba la proteína en los tubérculos en forma tejido-específica exhibió mayores incrementos en la composición de aminoácidos (gráfico de la derecha). El contenido de proteínas de los tubérculos se incrementó entre un 35-45%. También se observó que las plantas transgénicas exhibían un aumento en el tamaño y el número tubérculos por planta.

Modificaciones en las rutas de síntesis de hormonas


La senescencia en plantas está regulada por un programa genético coordinado por cambios en el contenido de hormonas como el etileno, el ácido abscísico (ABA) y las citoquininas. La senescencia de las flores y la maduración de los frutos se acelera luego del corte debido a la producción de estas hormonas, lo que reduce su tiempo de comercialización. La inhibición de su síntesis por técnicas de ingeniería genética permite evitar su formación y retrasar los eventos de maduración y senescencia. El etileno es esencial para el desarrollo, crecimiento y supervivencia de las plantas. Es la hormona responsable de señalizar los cambios en las semillas durante la germinación, el desarrollo de flores y frutos, el inicio de ciertos mecanismos de defensa de las plantas, y participa en un número importante de interacciones con otras hormonas de

plantas. Al comienzo de la maduración de los frutos se producen altos niveles de etileno en casi todos los tejidos de la planta. La síntesis de esta hormona utiliza como precursor S-adenosil metionina (SAM), compuesto que deriva de la metionina transparencia 47). Este compuesto actúa además como precursor en muchas otras rutas y, por lo tanto, es abundante en diversos tejidos. La enzima ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico sintetasa (ACC sintetasa) convierte SAM en ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) y 5´-metiltioadenosina (MTA), y esta última es luego reciclada a L-metionina. El último paso de esta vía de síntesis es la conversión de ACC a etileno mediante la intervención de la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxílico oxidasa (ACC oxidasa). Se ha establecido que la ACC sintetasa y la ACC oxidasa presentan varias isoformas que se activan en distintas condiciones fisiológicas. Ambas enzimas son inducibles durante la maduración de los frutos.

Las estrategias más utilizadas para arrestar la síntesis de etileno se basan en la introducción de genes antisentido de las enzimas ACC sintetasa y/o ACC oxidasa. Otra alternativa que también ha sido implementada es la expresión de genes de enzimas que degraden el ACC, como la ACC deaminasa aislada de Pseudomonas spp. Esta enzima degrada al ACC en a-cetobutirato y NH3. Las transparencias 48 a 50 y muestran ejemplos de cultivos en que se ha inhibido la producción de etileno para evitar la senescencia y la maduración de los frutos. Se transformaron melón, tomate, clavel, brócoli y tabaco con genes antisentido de ACC-oxidasa o de ACC-sintasa de distintas especies y de ACC-deamina de Pseudomonas spp. En el caso del melón se inhibió la producción de etileno utilizando un gen antisentido de ACC-oxidasa de manzana. Las plantas controles produjeron hasta un 340% más de etileno que las plantas transgénicas.

En la figura superior de la transparencia 49 se muestran frutos de melón (Cucumis melo) obtenidos a partir de plantas transformadas con el gen antisentido de la ACC-oxidasa de manzana (AS1) y frutos control no transformados a los 15 d post-cosecha. Las plantas transformadas permanecen sin madurar, mientras que los controles maduran normalmente. Además, el sabor y el aroma se preservaron mejor en los melones transformados. La figura inferior muestra plantas de clavel (Dianthus caryophyllus L; cv White Sim) transformadas con un gen antisentido de ACC oxidasa dirigido por el control del promotor de 35S de CaMV. La senescencia de la flor se retarda en la planta transgénica (izquierda) en comparación con la control (derecha). Las dos flores tienen 8 d de post-cosecha.

Se han implementado diferentes estrategias para evitar la maduración de los frutos del tomate. En la transparencia 50 se muestran resultados de trabajos en que se ha inhibido la producción de etileno utilizando genes antisentido de ACC sintetasa y de ACC oxidasa o un gen de ACC deaminasa. En las fotografías superiores se observan los resultados obtenidos mediante transformación con ACC sintetasa. De izquierda a derecha, se muestran frutos de plantas control mantenidos en aire por 60 d, de plantas transgénica mantenidos en aire por 78 d, y de plantas transgénicas mantenida en atmósfera de 10 ppm de etileno por 78 d. En las fotografías centrales se observan resultados obtenidos mediante transformación con ACC oxidasa. De izquierda a derecha, se muestran frutos de planta no transformadas mantenidos en aire, de plantas transgénicas mantenidos en aire y de plantas transgénicas mantenidos en atmósfera de 10 ppm de etileno. Por último, en las fotografías inferiores se observan resultados obtenidos mediante transformación con el gen de ACC deaminasa. Se muestran frutos de tomate de una planta no transformada (izquierda) y de planta transgénica (derecha) mantenidos a 20oC en aire por 138 d.

Las transparencias 51 y 52 muestran otra estrategia implementada para evitar la senescencia de las flores. Como se ha dicho, la senescencia en plantas está regulada

por un programa genético coordinado que es mediado por cambios en el contenido de etileno, ácido abscisico (ABA) y citoquininas. La isopentenil transferasa (ipt) es la enzima limitante en la síntesis de citoquininas y su sobrexpresión durante la senescencia incrementa el nivel de estas hormonas y retrasa este proceso. En el trabajo que se presenta en la transparencia, se expreso el gen ipt de A. tumefaciens para retrasar la senescencia de flores de Petunia x hybrida cv V26. El gen fue puesto bajo el control del promotor específico de senescencia SAG12 (construcción PSAG12-IPT).

La transparencia 52 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Se observó que en las líneas transformadas la senescencia de las flores se retrasó de 6 a 10 días luego de su polinización respecto de las flores control. El nivel de los transcriptos de ipt se incrementó notablemente luego de la polinización y ello fue acompañado por un incremento de citoquininas. La acumulación de ABA y de otras hormonas que regulan la senescencia de la flor, fue significativamente mayor en las corolas de las plantas controles.

Metabolitos secundarios


Los metabolitos presentes en las plantas pueden ser divididos en dos grupos fundamentales: los metabolitos primarios (proteínas, ácidos grasos y carbohidratos), que sostienen los procesos bioquímicos esenciales de la célula, y los metabolitos secundarios, (compuestos de muy diversa estructura química) que actúan como mediadores en las interacciones entre las plantas y su medio ambiente. Los metabolitos secundarios no poseen un rol aparente en el crecimiento o en el desarrollo de las plantas y no son esenciales per se para sus funciones vitales, pero juegan un rol importante para su supervivencia en los ecosistemas. Por ejemplo, muchos de estos compuestos están involucrados en las interacciones plantas-microorganismos, plantas-insectos y plantas-plantas. Asimismo, constituyen la respuesta química a los polinizadores y dispersores de semillas, a los competidores y a los herbívoros, a los patógenos y a los estreses abióticos. En general los metabolitos secundarios son específicos de especie. Por otro lado, suelen producirse en forma tejido-específica y en estructuras especializadas. Según sus características químicas, los metabolitos secundarios pueden clasificarse en tres grupos principales: a) terpenos (compuestos lipídicos); b) fenoles (compuestos derivados de carbohidratos) y c) alcaloides (compuestos derivados de aminoácidos).

Los metabolitos secundarios son necesarios (o al menos beneficiosos) para la supervivencia de las plantas en su medio ambiente (transparencia 55). Forman parte del sistema de defensa de la planta y están involucrados en la resistencia a pestes y enfermedades a través de la producción de fitoalexinas y fitoanticipinas. Se definen como fitoanticipinas aquellos metabolitos preexistentes en la planta (toxinas preformadas) que pueden ser activados en respuesta a enfermedades. Las fitolaexinas comprenden metabolitos que son sintetizados de novo y se acumulan en grandes concentraciones después de una infección fúngica o bacteriana, ayudando así a limitar el desarrollo del patógeno.

Alelopatía: cualquier efecto directo o indirecto, benéfico o perjudicial de una planta o microorganismo sobre otro a través de la producción de compuestos químicos secretados al medio ambiente.Aleloquímicos: biomoléculas no nutricionales producidas por un organismo y secretadas al ambiente que influyen en el crecimiento, desarrollo, salud y comportamiento de otro(s).

La transparencia 56 resume las principales propiedades biológicas de los metabolitos secundarios que son de interés económico por sus aplicaciones en la salud y otros sectores productivos. Los terpenoides (transparencia 57) tienen numerosas aplicaciones en la industria de alimentos. Por ejemplo, los monoterpenos determinan el aroma de los componentes de los aceites esenciales de numerosas hierbas, como la menta y la albahaca. Los carotenoides se emplean como colorantes en la industria cosmética y alimentaria. Entre los flavonoides (transparencia 58) se encuentran pigmentos diversos como las antocianinas, principales responsables de la coloración floral. Por otro lado, los flavonoides e isoflavonoides son de interés en el mejoramiento de la calidad nutricional de los alimentos debido a sus actividades antioxidantes y anticancerígenas. Como ejemplos, entre estos compuestos pueden mencionarse los flavonoides quercetina y epicatequina y el isoflavonoide genisteína. Los alcaloides (transparencia 59) poseen potentes efectos farmacológicos debido a que son capaces de atravesar las membranas celulares rápidamente. Dos de las principales y más comunes sustancias activadoras del sistema nervioso central son alcaloides: la nicotina (tabaco) y la cafeína (té, café y chocolate). El opio, la morfina y la codeína son alcaloides que se encuentra en el látex del fruto de la amapola. Se han llevado a cabo algunos trabajos tendientes a modificar por ingeniería genética la expresión de alcaloides importantes para la industria farmacéutica. La biosíntesis de alcaloides del indol ha sido una de las vías que más ha sido estudiada, debido a que existen al menos 15 alcaloides de este tipo de importancia industrial, entre los cuales se incluyen los antitumorales vinblastina y vincristina usados para tratar distintos linfomas. Dentro de los alcaloides del tropano, puede citarse a la escopolamina, compuesto con actividad anticolinérgica de gran importancia medicinal.

Manipulación genética del metabolismo secundario


La ingeniería metabólica se puede definir como el re-direccionamiento de una o más reacciones enzimáticas en una vía biosintética para producir nuevos compuestos, aumentar la producción de compuestos preexistentes, o disminuir la producción de compuestos no deseados. Se trata de un campo de aplicación relativamente nuevo que es muy dependiente del conocimiento bioquímico y fisiológico. Como resultado del uso de trazadores radioactivos, hacia 1975 se disponía ya de nociones generales adecuadas sobre la relación producto-sustrato en muchas vías metabólicas. El desarrollo rápido de este campo ocurrió a partir de la disponibilidad de herramientas de biología molecular (clonado de genes, análisis de promotores, técnicas de transformación, etc.), las que permitieron explorar los mecanismos moleculares que regulan la producción de metabolitos secundarios. De esta forma, a partir de la década de los 80, se logró un progreso significativo en la disección de muchas vías biosintéticas y en la sobrexpresión de genes heterólogos, lo que permitió los primeros avances. Desde entonces se han logrado numerosos resultados exitosos y un número aún mayor de resultados no esperados. El conocimiento ganado ha conducido a concebir el funcionamiento del metabolismo como el de una gran red de reacciones químicas interrelacionadas, en que la modificación de un sólo componente puede producir un impacto considerable en el metabolismo de todo el organismo. Aún así, el metabolismo secundario es un blanco particularmente atractivo para mejorar el rendimiento de un producto determinado sin que ello afecte marcadamente procesos esenciales para la planta. Sin embargo, para lograr esto de una manera relativamente controlada, no basta con conocer los componentes (enzimas y metabolitos) que participan de una determinada vía metabólica, también se debe conocer la regulación de esta vía (pasos limitantes, mecanismos de retroalimentación) y su relación con otras vías biosintéticas (vías competitivas). También es importante conocer la

compartimentalización celular de la ruta en estudio y la participación de tejidos u órganos especializados en la producción de determinados metabolitos.

La importancia económica de los metabolitos secundarios se ha acrecentado en los últimos años, y ello ha estimulado el interés en el estudio de su metabolismo y, en particular, en la modificación de ciertas rutas biosintéticas mediante técnicas de ingeniería genética. Sin embargo, el progreso en este campo ha sido limitado (transparencia 62). Una de las principales restricciones es que se conoce poco acerca de la biosíntesis de muchos componentes de interés, mientras que en otros casos sólo existen consideraciones teóricas sobre sus vías metabólicas. Las vías metabólicas a nivel de genes, enzimas y productos sólo han sido mapeadas en detalle para los flavonoides y las antocianinas. Para otras vías, sólo se conocen unas pocas enzimas y sólo algunos genes han sido clonados. Por otro parte, pocas plantas han sido estudiadas en profundidad en cuanto a su metabolismo secundario. Entre ellas, se encuentran N. tabacum (antocianinas, flavonoides, terpenoides, alcaloides), Catharantus roseus (alcaloides, flavonoides) y Cinchona (antraquinonas y alcaloides). Esto constituye una importante limitación, ya que los metabolitos secundarios son especie específicos. Esto implica que determinadas vías biosintéticas están presentes y son características de determinadas especies y no de otras. Cuando el objetivo de la modificación del metabolismo secundario es mejorar la calidad nutricional de un cultivo comestible, es necesario considerar el riesgo de que la modificación realizada conduzca a la producción de compuestos tóxicos no deseados. Para poder disminuir este riesgo, se requiere conocer con la mayor precisión posible el perfil de los metabolitos que produce la planta, lo que es corrientemente conocido como su “metaboloma”. Sin embargo, no existen en la actualidad métodos que nos permitan obtener este perfil en forma completa. En muchos casos, los métodos cromatográficos, como la cromatografía gaseosa y la cromatografía líquida de alta resolución, separan pobremente componentes con propiedades físicas muy distintas. La espectrometría HNMR, que detecta todos los compuestos presentes con la misma sensibilidad, no puede registrar compuestos minoritarios. De esta manera, para el análisis del metaboloma se deberán utilizar simultáneamente diferentes métodos y, a su vez, mejorar las técnicas actuales.

La ingeniería genética del metabolismo secundario tiene usualmente como objetivo aumentar o disminuir la cantidad de un cierto compuesto o grupo de compuestos. En general, lo que se intenta es aumentar la producción de un determinado compuesto en plantas que normalmente lo producen, o transferir partes de una vía metabólica a especies vegetales que no producen el metabolito en cuestión. El ejemplo más exitoso en el que se ha aplicado esta última estrategia es la producción de b-caroteno en arroz (ver caso del “golden rice”). También es de interés la producción de nuevos metabolitos que no son producidos naturalmente por las plantas. Para aumentar la producción de un compuesto se utilizan básicamente dos estrategias: a) variar la expresión de uno o varios genes con el fin de superar un paso metabólico limitante, inhibir una vía metabólica competitiva o disminuir el catabolismo del compuesto blanco y, b) variar la expresión de genes regulatorios (factores de transcripción) que controlan múltiples vías de biosíntesis. Para disminuir los niveles de un producto no deseado, pueden ser utilizadas diversas estrategias. Por ejemplo, un paso enzimático de una determinada vía metabólica puede silenciarse por disminución de la expresión del correspondiente ARNm, mediante la expresión del ARN antisentido, mediante silenciamiento post-transcripcional (ARN de interferencia), o por sobrexpresión de un anticuerpo contra la enzima blanco. La estrategia del ARN antisentido ha sido utilizada con éxito para modificar los colores de las flores. Otras estrategias incluyen desvío del flujo metabólico a una vía competitiva o aumento del catabolismo del compuesto blanco.

Los factores de transcripción son proteínas que modifican la expresión de los genes por unión a secuencias específicas de ADN ubicadas en las regiones regulatorias de los mismos (transparencias 64 y 65). Muchos factores de transcripción permiten el control de la expresión de múltiples genes dentro de una misma vía metabólica. Entre los primeros factores de transcripción descriptos en plantas se encuentran los factores R y C1, los que están involucrados en el control de la biosíntesis de antocianinas de la aleurona de maíz. La inducción de la vía de la síntesis de antocianinas en células indiferenciadas de maíz pudo inducirse por sobrexpresión de estos dos factores de transcripción. Asimismo, la sobrexpresión de estos factores en arroz produjo la activación de la vía de síntesis de las antocianinas, lo que se tradujo en un aumento de la resistencia del arroz a la infección por un patógeno fúngico. Este ejemplo muestra que la acumulación de un producto natural puede modificarse por la sobrexpresión de determinados factores de transcripción, aún en especies de plantas heterólogas. Los factores de transcripción también pueden ser represores de la acumulación de un producto natural. Por ejemplo el knocking out del factor de transcripción MYB4 en frutilla llevó a la reducción de la pigmentación de las flores y a la disminución de los niveles de antocianinas y flavonoles, sugiriendo que, en esta especie, MYB4 actúa como un represor de ciertos pasos de la síntesis de flavonoides.

Se acepta actualmente que el control del flujo metabólico a través de una vía biosintética se encuentra en más de un paso de esta vía. Estos “puntos” de control (pasos limitantes) pueden ser modificados por condiciones ambientales, metabólicas o del desarrollo y son, en última instancia, responsables de la productividad de la planta. La distribución del control regulatorio hace que la modificación del metabolismo por introducción o inhibición de unos pocos genes estructurales sea difícil de alcanzar. A pesar de los esfuerzos realizados para identificar los pasos limitantes de diferentes vías metabólicas, la sobrexpresión de genes sólo ha permitido obtener aumentos del flujo metabólico de moderados a muy pequeños. Estos resultados contrastan con los obtenidos con los factores de transcripción en que, por ejemplo, se han reportado aumentos de hasta 25 veces en el nivel de antocianinas de hojas de tomate sobrexpresando el factor de transcripción DELILA. Este efecto se debe a que los factores de transcripción controlan en forma simultánea la expresión de la mayoría de los genes comprendidos en una vía determinada, lo que permite eludir las restricciones generadas por la existencia de pasos limitantes. Además, la modulación del flujo metabólico utilizando factores de transcripción no requiere de la identificación, aislamiento y caracterización molecular de los genes que componen la vía en cuestión. Sin embargo, la modificación del metabolismo a través de la expresión de factores de transcripción no es una panacea para resolver todos los problemas de la ingeniería metabólica de plantas. Como es obvio, los factores de transcripción no pueden inducir vías metabólicas que no están presentes en la planta, por lo que, en estos casos, es necesario introducir todos los genes necesarios para recrear las mismas en las plantas de interés. Por esta razón, la ingeniería genética de genes estructurales continuará siendo necesaria para encarar muchos problemas.

La transparencia 66 enumera los principales objetivos que son usualmente considerados al encarar la modificación genética de las principales vías del metabolismo secundario (terpenoides, flavonoides y alcaloides). Cada uno de estos objetivos será ilustrado mediante la presentación de ejemplos específicos.

Terpenoides


Los terpenoides son compuestos lipídicos derivados del isopreno. Los diferentes lípidos isoprenoides se sintetizan a partir de la condensación de varias unidades de

isopreno activo (isopreno fosforilado). La adición de dos unidades de isopreno dan lugar a distintos tipos de terpenos, de manera que se distinguen monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, etc., según contengan, respectivamente, dos, tres, cuatro, etc., isoprenos. Además, entre ellos los hay acíclicos, ramificados y cíclicos y aquellos que pueden contener otros grupos funcionales (cetona, alcohol). Algunos terpenos, como el ácido abscísico y el ácido giberélico, que son reguladores del crecimiento de la planta, forman parte del metabolismo primario. Monoterpenos: los aceites esenciales contienen monoterpenos volátiles que son almacenados en los pelos glandulares de la epidermis. Estas esencias volátiles o aceites esenciales se obtienen de flores, de frutos, de hierbas y especias y son usados en perfumes y saborizantes. Algunas de las plantas más utilizadas para la obtención de este tipo de compuestos son: la menta (mentol) y el limón (limoneno). Algunas plantas emiten terpenos volátiles después que los insectos se ha alimentado de ellas. Estos atraen a los enemigos naturales del insecto predador y actúan como un mecanismo de defensa contra el mismo. Los piretroides (Crisantemo spp.) son monoterpenos con actividad insecticida que resultan ventajosos por su baja persistencia en el medio ambiente y baja toxicidad para mamíferos.

Sesquiterpenos: los aceites esenciales de hierbas y especias también contienen sesquiterpenos. Algunos sesquiterpenos actúan en los mecanismos de defensa de la planta produciendo fitolaexinas como la rosina y otras sustancias repelentes de herbívoros.

Diterpenos: Las resinas contienen diterpenos. Cuando los canales que transportan la resina son dañados, la descarga de la resina sirve como una barrera química y física a la alimentación de los insectos. Por otro lado, los diterpenos se polimerizan cuando la resina es expuesta al aire y contribuye a sellar las heridas. Ciertos escarabajos de la corteza han adquirido la capacidad de metabolizar los monoterpenos contenidos en la resina de las coníferas, convirtiéndose en depredadores especializados. Algunos diterpenos son muy importantes en aplicaciones medicinales. Una de las drogas más potentes contra ciertos tipos de cáncer es un diterpeno, el paclitaxel (Taxol), obtenido originalmente de la corteza del tejo del Pacífico (Taxus brevifolia).

Triterpenos: El algodoncillo de Siria (Asclepias syriaca) contiene triterpenos que se acumulan en las larvas de las mariposas Monarca, un lepidóptero que se alimenta de esta planta. En los adultos, los triterpenos son almacenados en las alas de la mariposa y ello las vuelve tóxicas para sus depredadores, los pájaros. El triterpeno digitalis, obtenido de la dedalera o digital (Digitalis purpurea), fortalece y aminora la contracción del músculo cardíaco. Fue desarrollado como droga hacia el final del siglo XVIII basándose en un remedio casero (té hecho con hojas de foxglove púrpura) y se usaba para tratar la angina de pecho.

Tetraterpenos: Entre los tetraterpenos se encuentran los carotenoides, compuestos que son de gran importancia como suplementos dietarios. Los carotenoides son sintetizados de novo a partir de geranil difosfato por todos los organismos fotosintéticos. Participan en la captación de la luz y en la protección por el exceso de luz blanca. Muchas bacterias no fotosintéticas (Erwinia herbicola, Thermus aquaticus, Deinococcus radiodurans) y hongos (Neurospora crassa, Phycomyces blakesleeanus) sintetizan también carotenoides. En las plantas, los carotenoides se acumulan en cloroplastos y en cromoplastos. Se puede encontrar un amplio rango de carotenoides en los cromoplastos (por ejemplo, licopeno en fruto de tomate, b-caroteno en raíces de zanahoria, luteína y zeaxantina en endospermo de maíz).

Los aromas de los alimentos tienen una gran influencia en la elección de los mismos. El aroma de los frutos y de los vegetales son mezclas de metabolitos volátiles, generalmente presentes en partes por millón. La combinación y la proporción de las distintas sustancias volátiles determinan el aroma particular de cada fruto o alimento. El tomate cultivado es un alimento popular y ampliamente consumido en el mundo. Su gran aceptabilidad no está exclusivamente relacionada a su capacidad nutricional y versatilidad, sino también a su típico sabor y aroma. El característico sabor y aroma del tomate no sólo está dado por la relación de azúcares (fructosa-glucosa) a ácidos (ácido cítrico, principalmente) sino también a la presencia de más de 400 diferentes compuesto volátiles. Los principales esfuerzos para mejorar el sabor de los tomates se han concentrado en controlar la relación ácido/azúcar en el fruto y en mejorar la textura y las características de almacenamiento (retardo de la maduración). Los tomates que carecen del distintivo “aroma a tomate” son percibidos por el público como productos de baja calidad. El mejoramiento de la calidad del aroma del tomate por técnicas de cruzamiento convencional es muy difícil debido a la gran cantidad de genes que involucran la formación de estos compuestos volátiles. A pesar de que muchos sabores y aromas específicos han sido identificados en frutos y vegetales, las enzimas y genes que controlan su producción han sido poco estudiados. Uno de los 10 compuestos volátiles más importantes que determinan el aroma del tomate es el alcohol monoterpeno acíclico s-linalol. La estrategia adoptada en el trabajo que se presenta en las transparencias 69 a 72 fue sobrexpresar el gen de la enzima linalol sintetasa (LIS) de Clarkia breweri en el fruto del tomate maduro. Para ello, el transgen fue puesto bajo la dirección de un promotor específico de la maduración del fruto (pE8). Se transformaron dos variedades de tomate que poseen poco aroma: UC82B (variedad de tomate para procesado) y CB3 (variedad de tomate fresco). La enzima linanol sintetasa (LIS) es responsable de la presencia del monoterpeno s-linalol en el perfume de las flores de C. breweri. Esta enzima usa geranildifosfato (GPP) como sustrato. Como el GPP también es un intermediario en la vía que lleva a la síntesis de los carotenoides y en el tomate ocurre una importante acumulación de licopeno y otros carotenoides durante la maduración, se asumió que la sobrexpresión de LIS de C. breweri en el fruto conduciría a la utilización de parte de la reserva de isoprenoides que se encuentra en los plástidos para formar s-linalol durante la maduración.

La transparencia 71 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Las variedades elegidas para la transformación (UC82B y CB3) no producen prácticamente s-linalol, lo que facilita el análisis de los resultados. La primera generación de tomates transgénicos (T1) fue analizada por Southern blot para identificar líneas con una única copia del transgen. La mayoría de estas plantas presentaban acumulación de s-linalol. Aquellas que producían mayores niveles (6 líneas de UC82B y 4 líneas de CB3) fueron autofecundadas para obtener la generación T2. Se determinó el patrón de compuestos volátiles de ambas variedades no transformadas y resultó similar. En el panel izquierdo de la transparencia, se presenta un cromatograma mostrando el análisis de espectrometría de masa de extractos de frutos de una línea CB3 y de su control no transformado. La única diferencia significativa en el patrón de compuestos volátiles de las líneas transgénicas con respecto a sus controles fue la producción de s-linalol y de 8-hidroxilinalol. La linalol sintetasa (LIS) cataliza la formación del enantiómero puro s-linalol a partir de geranil difosfato (GPP). Dado que el s-linalol es un alcohol alílico terciario, puede racemizarse en ambientes ácidos como el que prevalece durante la maduración del tomate. Por esta razón, se examinó por cromatografía gaseosa la quiralidad del linalol acumulado en las líneas transgénicas. El mismo fue enantioméricamente puro, detectándose exclusivamente s-linalol. La aparente falta de quiralización puede reflejar la compartimentalización que separa al linalol del ambiente ácido de la pulpa del tomate. En muchas plantas el linalol se acumula en estructuras secretorias como las tricomas o es emitido al medio ambiente. Todavía no se sabe como se distribuye el

linalol en los tejidos del fruto del tomate. La acumulación de 8-hidroxilanol puede explicarse por hidroxilación alílica, una reacción común en el metabolismo de los monoterpenos. En el panel de la derecha se muestra el análisis quiral de la misma línea transgénica presentada en el panel izquierdo (cromatograma superior). El cromatograma inferior muestra la separación racémica de una mezcla sintética de linalol analizado bajo las mismas condiciones.

La transparencia 72 muestra un análisis de los metabolitos de valor nutricional que se acumulan en el fruto del tomate son sintetizados a través de la ruta de los terpenoides. Los mismos incluyen hormonas, pigmentos y vitaminas, tales como giberelinas, licopeno y tocoferol. La modificación de la vía de los terpenoides por ingeniería genética podría tener efectos negativos sobre la acumulación de otros terpenoides o de hormonas que podrían afectar el desarrollo o la capacidad nutricional del fruto. Por esta razón, debe analizarse el posible efecto de la acumulación de s-linalol sobre la acumulación de otros terpenoides. La tabla resume algunos resultados que demuestran que los niveles de tocoferoles y carotenoides, como licopeno y b-caroteno, no variaron significativamente respecto de los de las plantas control.. Los monoterpenos son los principales componentes del aceite esencial en la familia de las mentas (Lamiaceae), incluyendo a la menta (Menta x piperita) que ha sido usada como sistema modelo para el estudio de la vía de síntesis de los monoterpenos. El aceite esencial de menta está formado en su mayor parte por mentol (50%), mentona (10-30%), metil ésteres (10%) y otros terpenos como pulegona, piperitona y mentofurano. Las trazas de jasmonato (0,1%), mejoran sustancialmente la calidad del aceite esencial. El mentol y el mentil acetato son los responsables del característico aroma fresco y penetrante de la menta. El mentol se encuentra mayormente en hojas viejas y es preferencialmente formado durante períodos con mayor exposición solar.

El mentofurano es un componente indeseable del aceite esencial derivado de la pulegona, que contribuye a la producción de un aceite esencial sin aroma y a la pérdida de color durante el almacenamiento. El mentofurano puede alcanzar niveles industrialmente inaceptables en plantas que crecen en condiciones de estrés como falta de luz, sequedad y altas temperaturas, condiciones sobre las que los agricultores tienen un control limitado. Por lo tanto, resulta interesante disminuir la acumulación de estos metabolitos indeseables y maximizar la producción de mentol. En principio, esto podría lograrse a través de la modificación de la síntesis de monoterpenos. En el trabajo que se presenta en las transparencias 73 a 77, los autores desarrollaron dos estrategias paralelas para alcanzar este objetivo. Con este fin, sobrexpresaron la enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR) e inhibieron la expresión de la enzima mentofurano sintetasa (MFR). La fotografía de la transparencia 74 muestra hojas de distintas mentas (de izquierda a derecha, menta (Mentha piperita), menta agua de colonia (M. citrata), menta japonesa (M. arvensis var. piperascens, también conocida como variedad japonica), menta plateada (M. longifolia), menta verde marroquí (M. spicata), menta piña (M. suaveolens) y menta carintia (M. carinthiaca = M. arvensis x M. suaveolens). La transparencia 75 muestra un esquema de las vías de síntesis de monoterpenos en el que se señalan los pasos afectados por ingeniería metabólica. Con la finalidad de aumentar la producción de mentol se sobrexpresó la enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR). La misma cataliza la conversión de 1-deoxi-di-xilulosa-5-fosfato (DXP) en metileritritol fosfato, la que constituye un paso limitante en la producción de los precursores de la síntesis de terpenoides y, por lo tanto, un posible blanco para controlar el flujo metabólico a través de esta rama. El ADNc de la enzima DXR de menta codifica una pre-proteína que posee un péptido señal de exportación a los plástidos. Se clonó el ADNc de DXR bajo la regulación del promotor constitutivo

35S CaMV y el terminador NOS del gen de la nopalina sintetasa y la construcción resultante se utilizó para transformar plantas de M. piperita. Por otro lado, con el objetivo de disminuir la producción de mentofurano, se inhibió la expresión de la enzima mentofurano sintetasa (MFS) por silenciamiento génico post-transcripcional. Para ello, se transformaron plantas de M. piperita con la versión antisentido del ADNc que codifica la enzima MFS bajo la regulación del promotor 35S de CaMV. La MFS cataliza la conversión de pulegona en mentofurano. Por lo tanto, si se inhibe su expresión, se espera que los niveles de mentofurano disminuyan y que se produzca un cierto aumento de pulegona. Las plantas fueron transformadas por infección de explantos de hojas con la cepa EHA105 de A. tumefaciens portando los vectores binarios que contenían las dos construcciones descriptas. Se obtuvieron 57 plantas transgénicas DXR y 19 plantas transgénicas MFS. De las plantas transgénicas, 47 presentaron un fenotipo normal, 11 presentaron una pigmentación anormal (sugiriendo algún problema en la síntesis de clorofila) y 4 plantas presentaban una pigmentación anormal pero en mosaico.

La transparencia 76 muestra ensayos realizados para determinar si la diferencia fenotípica observada en la plantas DXR correlacionaba con el patrón de expresión del transgen dxr se analizó el nivel del ARNm correspondiente en hojas inmaduras y maduras de plantas control y transgénicas. En el panel A de la transparencia se observa que el ARNm de DXR se expresa fuertemente en hojas inmaduras, tanto en plantas normales como en plantas transgénicas con fenotipo normal. Sin embargo, no se expresa en las plantas transgénicas con fenotipo de pigmentación normal y se expresa levemente en las plantas que presentan pigmentación en mosaico. En las hojas maduras (panel B), se puede observar que el ARNm DXR se expresa en las plantas transgénicas normales y con mosaico y no se expresa en las plantas normales ni en las transgénicas con fenotipo anormal. Dado que la 1-deoxi-di-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR) opera como un proveedor de precursores para la síntesis de metabolitos esenciales (entre ellos, la clorofila), no es sorprendente observar un alto nivel de expresión de este compuesto en hojas jóvenes. A medida que las hojas maduran, se espera que la síntesis de DXR disminuya, tal como se observa en las plantas control. Al expresar DXR bajo un promotor constitutivo, se logró que la enzima se exprese tanto en las hojas jóvenes como en las hojas maduras de las plantas transgénicas con fenotipo normal, logrando de esta manera mantener activa la vía del DXP. En las plantas con pigmentación anormal (despigmentadas), la sobrexpresión de DXR produjo la co-supresión del gen dxr. La inhibición de la expresión del gen dxr podría comprometer la síntesis de clorofila provocando la despigmentación de las hojas. Se midieron los niveles de DXR en extractos de hojas maduras de plantas control y transgénicas y se observó que la actividad correlacionó bien con los niveles de ARNm. Las plantas transgénicas con fenotipo normal presentaron 2 a 4 veces más actividad de DXR que las plantas control.

La transparencia 77 muestra un análisis de los aceites esenciales de plantas de menta transformadas y control. Los tricomas glandulares de la menta están prácticamente dedicados a la producción de monoterpenos a partir de los precursores que son generados a través de la vía de la 1-deoxi-di-xilulosa-5-fosfato (DXP) en plástidos. Por lo tanto, es razonable pensar que las alteraciones en el flujo metabólico debidas a cambios en la expresión del gen dxr podrían reflejarse en la acumulación del aceite esencial. El análisis del aceite esencial de menta se realizó por destilación de las hojas, seguida por la separación de los componentes en cromatografía gaseosa y por su cuantificación utilizando estándares internos. La tabla muestra algunos de los resultados obtenidos del análisis de plantas control y transgénicas DXR y MFS. Las plantas DXR acumularon más aceite esencial que las plantas control (la tabla no muestra los valores totales) y esta diferencia se debe principalmente a un aumento en la producción de mentol. En cuanto a las plantas MFS, el rendimiento final de aceite

esencial fue similar al de las plantas control, pero la inhibición de la expresión de MFS llevó a una disminución de los niveles de mentofurano y, sorprendentemente, a una disminución de los niveles de pulegona y a un aumento de la producción de mentol. Estos valores se mantuvieron aún en condiciones de estrés, situación que normalmente conduce al incremento de mentofurano. Este ejemplo muestra como los resultados de la modificación del metabolismo puede tener aspectos impredecibles originados en la falta de conocimiento y en la complejidad de la regulación de las vías de metabólicas. En este caso, utilizando una estrategia que se esperaba disminuyera sólo la producción de mentofurano, se logró disminuir los niveles de pulegona y aumentar los del mentol. Probablemente, ello fue causado por el desvío del flujo metabólico hacia la síntesis de mentol. Por otro lado, debe destacarse la similitud entre la composición del aceite esencial de las plantas DXR46 y de las plantas MFS. En las plantas DXR46, se observa una disminución de mentofurano y pulegona no esperable por la sobrexpresión de DXR. Una posible explicación para esta observación es que en esta línea se haya producido una inserción que inactivó al gen mfs.

Artemisia annua L es una hierba aromática anual utilizada en la medicina tradicional china para el tratamiento de la fiebre (transparencia 78). A partir de ella se extrae la artemisina, un sesquiterpeno que posee una eficiente actividad antiparasitaria contra cepas multirresistentes de Plasmodium falciparum, el agente causante de la malaria.

Debido a la aparición de cepas de Plasmodium resistentes a la cloroquina (droga antimalárica), la artesimina y sus derivados son actualmente considerados como una importante alternativa para el tratamiento de la malaria. Las limitaciones para su uso están dadas básicamente por la dificultad de obtener una alta producción de la droga. Las fuentes naturales de obtención son limitadas y la síntesis química es difícil y costosa. Los intentos por producir artesimina a partir de células en cultivo de A. annua L. no han tenido el éxito esperado. Por estas razones, una alternativa es producir plantas transgénicas de A. annua L. que sobrexpresen los genes de las enzimas involucradas en la biosíntesis de artemisina. Las transparencias 79 y 80 presentan los resultados de un trabajo realizado en esta dirección. Se transformaron plantas de A. annua L. por incubación de explantos de hojas con A. tumefaciens LBA 4404 portando el ADNc de la enzima farnesil difosfato sintetasa (FDS) de Gossypium arboreum bajo el promotor 35S del CaMV.

La transparencia 80 muestra los niveles de artemisina alcanzados en plantas de A. annua transgenicas y controles. La artesimina fue extraída por calentamiento de las hojas de plantas transgénicas y control en una solución de éter de petróleo y sus niveles se determinaron por HPLC. El gráfico de barras muestra los niveles de artesimina obtenidos en plantas control no transformadas (1) y en plantas transgénicas (2 a 6). En estas últimas se obtuvieron valores de entre 8 y 10 mg de artemisina por g de peso seco, lo que representa aproximadamente un aumento de 3 veces respecto de la planta no transformada.

La vitamina A (retinol) es un nutriente esencial cuya carencia en humanos puede afectar severamente la visión, la reproducción y la función inmune (transparencia 81). Se estima que unos 250.000 niños quedan ciegos cada año por esta deficiencia nutricional en el sudeste asiático. Más aún, la deficiencia en vitamina A exacerba otras enfermedades, como la diarrea, las enfermedades respiratorias y las enfermedades típicas de la infancia como la rubeola. Se estima que en el mundo existen 124 millones de niños deficientes en vitamina A y que una provisión adecuada de la misma podría evitar de 1 a 2 millones de muertes anuales. El arroz es uno de los principales alimentos para millones de personas. Generalmente, se lo consume luego de un tratamiento que remueve las capas externas (pericarpio, tegumento y aleuronas). Esto se hace para evitar que la aleurona, al ser una capa rica en aceites, se vuelva rancia

durante el almacenamiento del grano. Por lo tanto la parte comestible del arroz consiste básicamente en el endospermo, compuesto por gránulos de almidón y cuerpos proteicos, pero carece de los nutrientes esenciales para el mantenimiento de la salud, como es la pro-vitamina A (b-caroteno). El hecho que el arroz sea la principal fuente de alimentos de muchas poblaciones contribuye al problema de la deficiencia en vitamina A, convirtiéndose en un serio problema de salud pública en al menos 26 países que incluyen áreas altamente pobladas de Asia, Africa y América latina.

Una estrategia complementaria a las ya existentes para reducir la deficiencia de vitamina A en los países subdesarrollados podría ser la fortificación de los principales alimentos de estas poblaciones con pro-vitamina A. La administración de la pro-vitamina A o b-caroteno tiene como ventaja que puede acumularse en el organismo sin efectos nocivos a diferencia de su producto final, la vitamina A. En el caso del arroz, la suplementación con b-caroteno sólo puede lograse a través del uso de tecnologías recombinantes y no por mejoramiento convencional, ya que no existen cultivares de arroz que produzcan este compuesto en el endospermo. Dado que la transformación del arroz está bien establecida y que todas las enzimas que componen la vía de la síntesis de la pro-vitamina A han sido identificadas a nivel molecular, la modificación genética del cultivo para producir la pro-vitamina A en el endospermo es un objetivo factible.

El arroz produce geranil-geranil difosfato, precursor de los b-carotenos, pero carece de las enzimas correspondientes a esta ruta biosintética. Para completar la vía de síntesis del b-caroteno es necesario introducir por ingeniería genética 4 enzimas: la fitoeno sintetasa, fitoeno desaturasa, la caroteno desaturasa y la licopeno ciclasa. Alternativamente, para simplificar el trabajo de transformación, el número de enzimas puede ser reducido utilizando una fitoeno desaturasa bacteriana que es capaz de reemplazar a las dos desaturasas vegetales. La introducción de la vía de síntesis de b-caroteno en arroz se efectuó por transformación con A. tumefaciens portando vectores que contenían los siguientes genes: a) gen de fitoeno sintetasa (psy) de Narcissus pseudonarcissus bajo el control del promotor glutelina específico de endosperma (Gt1); b) gen de la fitoeno desaturasa (crtl) de Erwinia uredovora conteniendo la secuencia para el péptido de tránsito de la subunidad menor de la Rubisco de arveja bajo el control del promotor 35S CaMV; c) gen de la licopeno ciclasa (lcyl) de N. pseudonarcissus conteniendo la secuencia para un péptido de tránsito que permite la importación a plástidos bajo el control del promotor 35S CaMV (transparencia 83).

La transparencia 84 muestra resultados de este trabajo. Se transfirieron al invernadero 10 líneas transgénicas para las 3 enzimas con el fin de obtener semillas. Todas las líneas mostraron un fenotipo vegetativo normal y fueron fértiles. Las semillas maduras de las líneas transgénicas T0 y de las plantas control se secaron al aire y se aisló el endospermo. En la mayoría de las plantas transformadas, el endospermo presentó una coloración amarilla, sugiriendo la formación de carotenos. Se cuantificó por fotometría el contenido de carotenoides en semillas de líneas transgénicas individuales y se analizaron las muestras por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Ninguna de las líneas transgénicas acumuló licopeno en cantidades detectables, pero todas ellas produjeron b-caroteno (por ejemplo, la línea z11b produjo 1,6 mg/g de b-caroteno) y algunas líneas produjeron otros carotenoides como zeaxantina y luteína. El patrón de carotenoides obtenido en el endospermo de las plantas transgénicas es cualitativamente similar al que se encuentra en hojas verdes de plantas normales. Esto sugiere que las enzimas a y b-ciclasas son expresadas constitutivamente en el endospermo de arroz y/o que la expresión de estas enzimas es inducida por la formación de licopeno o derivados de él. La cantidad de vitamina A recomendada es de 1 mg por día, lo que corresponde aproximadamente a 6 mg de b-caroteno. Con

estas plantas transgénicas los autores sugieren que es posible llegar a obtener 2 mg de b-caroteno por g de arroz, lo que corresponde a 100 mg de vitamina A por cada 300 g de arroz. Si bien este valor esta aún lejos de los requerimientos diarios necesarios, podría tener un alto impacto en la dieta normal de poblaciones del sudeste asiático donde la avitaminosis A es un problema importante y el consumo de arroz es alto. La transparencia muestra los fenotipos de semillas de una línea transgénica (z11b) y de una control. Los gráficos de la derecha muestran los respectivos contenidos de carotenoides.

La transparencia 32 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. La gráfica y las fotografías muestran resultados alcanzados durante el proceso de desarrollo de las variedades del arroz dorado (“golden rice”). El objetivo del desarrollo consiste en obtener variedades que satisfagan los requerimientos mínimos para consumo humano. Por esta razón, se transformaron distintas variedades de arroz con un plásmido que porta como gen selector la fosfomanosa isomerasa, lo que permite evitar el uso de genes de resistencia a antibióticos. Por otro lado, se utilizó A. tumefaciens como sistema de transformación con el fin de obtener patrones de integración definidos y se determinó la ausencia de transferencia de ADN foráneo más allá de los bordes derecho e izquierdo del vector binario. Se priorizaron los eventos de integración simple, de manera de evitar posibles efectos epigenéticos en subsecuentes generaciones. Se eligieron 3 variedades de arroz para transformar: una variedad japonesa (Taipei 309) y 2 variedades indias (IR64 and MTL250). La elección de las variedades indias se debió a que éstas son consumidas principalmente en las áreas con alta deficiencia en vitamina A. Cabe destacar que, en un trabajo previo, los autores determinaron que la transformación con los genes psy y crtl es suficiente para producir b-caroteno en arroz.

El desarrollo del “golden rice” ha sido posible gracias a los aportes de dos agencias, la Rockefeller Foundation y el programa de investigación de la Comunidad Europea. Si bien el aporte de la Rockefeller Foundation es libre de obligaciones, la Comunidad Europea requiere la participación de una contraparte industrial que debe hacerse cargo de los riesgos del desarrollo de la invención durante la etapa de investigación. En este caso, la contraparte industrial fue la compañía Zeneca (fusionada recientemente con Novartis para formar Syngenta). Este requerimiento de la Comunidad Europea afectó el status legal del proyecto “Golden Rice”, el que se desarrolla ahora por dos vías, una comercial y una no comercial o humanitaria. Syngenta (a través de la compania alemana Greennovations) recibe una licencia exclusiva para la comercialización de la tecnología en los países desarrollados. Simultáneamente, Syngenta le otorga a los inventores (Potrykus y Beyer) la licencia exclusiva y el derecho de sub-licenciar la tecnología para uso no comercial. El desarrollo del proyecto “golden rice” requiere del uso de varias tecnologías que son propiedades de otras industrias privadas y, por lo tanto su uso comercial o no comercial requiere el consentimiento por escrito de los respectivos propietarios intelectuales de estas tecnologías. Este complejo problema de propiedad intelectual, que involucró múltiples negociaciones entre compañías, fue resuelto por Syngenta, dado que ni la Universidad participante ni personas privadas tenían la capacidad para resolverlo. También se convino que los avances derivados de la investigación realizados por Syngenta estarían disponibles, libres de cargo, para la vía humanitaria del proyecto.

Los carotenoides son un grupo de pigmentos naturales ampliamente distribuidos en la naturaleza. Son sintetizados en todos los organismos fotosintéticos y en algunas bacterias y hongos. Dado que los animales son incapaces de sintetizarlos de novo deben obtenerlos a través de la dieta. Por esta razón, la manipulación del contenido y composición de carotenoides en las plantas puede mejorar su valor agronómico y

nutricional y proveer una fuente de productos económicamente importantes para la industria. Dado que en los últimos años se han identificado gran parte de las enzimas involucradas en la síntesis de carotenoides, actualmente es posible modificar la expresión de los carotenoides por manipulación genética. En este trabajo, se reporta la producción de astaxantina en flores de tabaco. La astaxantina (3.3´-dihidroxi-b,b-caroteno-4.4´diona) es un cetocarotenoide que forma parte de la dieta natural de muchos animales acuáticos. Este pigmento es el responsable del característico color rosado del salmón, la trucha y el camarón. Se ha demostrado que, tanto en la trucha como en el salmón, la astaxantina protege los huevos del daño por radiación ultravioleta y mejora la tasa de crecimiento de los juveniles. En la naturaleza, la astaxantina es sintetizada por bacterias y microalgas marinas y desde allí pasa a los peces a través de la cadena alimentaria. Para que desarrollen su característico color rosado, los peces cultivados, como el salmón y la trucha, deben ser alimentados con dietas suplementadas con astaxantina. Actualmente, la astaxantina se produce comercialmente por síntesis química y se vende como fórmula alimentaria.

El alto costo de la síntesis química de la astaxantina lo convierte en uno de los componentes más caros de la cría del salmón, representando aproximadamente el 15% del costo total de producción. Por otro lado, la molécula de astaxantina tiene dos centros quirales idénticos, la astaxantina sintética se produce como una mezcla de 3 isómeros configuracionales: (3S,3´S), (3S,3´R) y (3R,3´R) mientras que la astaxantina natural sólo existe en la configuración (3S,3´S). Las consecuencias de alimentar peces con productos no naturales como los isómeros no naturales de la astaxantina no se encuentran bien establecidas. Las desventajas planteadas llevaron a la búsqueda de fuentes alternativas de producción de astaxantina. En el trabajo que se comenta en la transparencia 35 y las siguientes transparencias, los autores modificaron la vía de síntesis de los carotenoides para producir astaxantina en cromoplastos de tabaco por expresión de la enzima b-caroteno cetolasa (CrtlO) del alga Haemetococcus pluvialis. Para sobrexpresar la b-caroteno cetolasa, se utilizó el promotor y la secuencia de tránsito de la fitoeno desaturasa (Pds). De esta manera, la expresión de la construcción se restringió a los tejidos que contienen cromoplastos, como los de los frutos y las flores.

La transparencia 36 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. En la figura se muestra la vía de síntesis de la astaxantina a partir de b-caroteno. Como puede observarse, la b-caroteno cetolasa cataliza la conversión del b-caroteno en cantaxantina en dos pasos mediados por el agregado de grupos ceto en C4 y C´4. En conjunción con la enzima b-caroteno hidroxilasa (Crl-b), presente en la planta, este proceso permite la formación de astaxantina. Los compuestos que participan de esta rama de la vía de síntesis se indican en anaranjado. De esta manera, se logró expresar astaxantina con su conformación natural en los cromoplastos del tejido del nectario, el cual normalmente sólo sintetiza b-caroteno y xantófilas.

Flavonoides


Los flavonoides son un grupo diverso de compuestos sintetizados por las plantas a partir de fenilpropanoides y precursores derivados del acetato. Estos compuestos juegan un importante rol en el desarrollo y crecimiento de las plantas (protección contra luz UV, atracción de polinizadores, activación de genes de modulación, fertilidad, germinación del polen), así como en la defensa contra patógenos (hongos, virus, bacterias) y plagas (transparencia 86). Los flavonoides poseen generalmente

actividad antioxidante, particularmente los flavonoles como el kemferol y la quercetina. Por esta razón, los efectos benéficos para la salud de los frutos, vegetales, té verde o vino tinto pueden ser atribuidos en parte a los flavonoides. Existen crecientes evidencias que apoyarían esta actividad protectora de los flavonoides, la cual está basada tanto en su actividad antioxidante como en su capacidad para inducir enzimas humanas protectoras. Estudios epidemiológicos sugieren una correlación directa entre el consumo de una dieta alta en flavonoides y la disminución en el riesgo de sufrir enfermedades cardiovaculares, cáncer y otras enfermedades relacionadas con la edad, como la demencia senil. Por otro lado, los isoflavonoides presentes en leguminosas poseen actividades anticancerígenas y estrogénicas, haciendo que también sean considerados como compuestos potencialmente beneficiosos para la salud. Sin embargo, son necesarias evidencias más acabadas sobre sus efectos benéficos in vivo. Recientemente, Duarte et al. (2001) han demostrado que la quercetina tiene la capacidad de disminuir la presión arterial en ratas hipertensas. Otro estudio realizado en humanos concluyó que el extracto de vino tinto libre de alcohol y uno de sus componentes, la quercetina, pueden inhibir la oxidación del LDL luego de una suplementación in vivo. El incremento de la biosíntesis de flavonoides en cultivos de interés podría generar una fuente de materia prima apropiada para la producción de alimentos con propiedades benéficas para la salud humana y animal. Sin embargo, cabe destacar que, dado que los flavonoides e isoflavonoides actúan como señales para la infección tanto de microorganismos patógenos como benéficos, la ingeniería metabólica de esta vía podría tener repercusiones ecológicas complejas.

Una de las primeras vías biosintéticas a ser modificadas por ingeniería genética fue la vía de síntesis de flavonoides y antocianinas. Esto se debió principalmente a que era una de las vías biosintéticas más conocidas y los resultados de su manipulación eran fácilmente observables a través de cambios en el color de las flores. La transparencia 87 muestra un esquema de los principales pasos involucrados en la síntesis de flavonoides y antocianinas. Los flavonoides se clasifican según su estructura central aglicona en 5 grupos: chalconas, flavononas, flavonoides, dihidroflavonoides y antocianinas. Hasta el presente, han sido identificados más de 4.000 flavonoides diferentes. Esta gran diversidad es consecuencia de distintas modificaciones químicas sobre la estructura aglicona, tales como glicosilación, metilación y acetilación.

La transparencia 88 muestra las estructuras químicas de los principales pigmentos florales de plantas superiores: las antocianinas. Las antocianinas pelargonidina, cianidina y delfinidina son los compuestos responsables de los colores anaranjado, rojo y azul, respectivamente, de los pigmentos que dan la tonalidad final a las flores.

Los productos de la floricultura, como las plantas ornamentales y las flores de corte, son apreciados por el atractivo de sus flores, frutos y follaje. La producción global de flores de corte ha alcanzado niveles industriales en el Siglo XX y la industria se encuentra actualmente en plena expansión (transparencia 89). El cultivo de flores cortadas y bulbos de flores se extiende ampliamente a lo largo del mundo. Estadísticas basadas en los 17 principales países productores, permiten estimar que la superficie mundial destinada a flores cortadas es de 60.000 ha. En cuanto a la demanda mundial de flores cortadas sólo pueden darse cifras aproximadas. Se estima que el mercado mundial de flores cortadas está creciendo a una tasa de 6-9% por año. La demanda total en 1985 era aproximadamente de U$S 12.000 millones. En 1990, ésta subió a aproximadamente a U$S 25 mil millones. No existen estadísticas exactas sobre la producción florícola de América Latina, pero está claro que el volumen producido está creciendo muy rápidamente en esta región. Debido al buen clima e infraestructura que ha favorecido la entrada de capital y conocimiento desde el extranjero, esta región ha alcanzado una posición en el comercio mundial que hoy se acerca al de la Unión Europea. A nivel de flores cortadas, los dos países productores y también

exportadores más importantes de esta región son Colombia y Ecuador. En cambio, Costa Rica es gran productor de plantas ornamentales. Usando métodos tradicionales de cruzamiento y selección, los cultivadores han logrado desarrollar nuevas variedades de plantas de corte de flores y de ornamentales con características deseables de color, forma, arquitectura, vida en el vaso y resistencia a pestes y enfermedades. De esta manera, se han logrado, por ejemplo, rosas, crisantemos y claveles en una variedad de colores. En contraste, la falta de éxito para obtener flores azules se debe a que estas especies de plantas carecen de la información genética necesaria para sintetizar los pigmentos derivados de la delfinidina. En términos generales, podría decirse que una de las principales desventajas de los cultivadores tradicionales en este campo es el repertorio limitado de genes presentes en las especies que se desea modificar. Las técnicas de ingeniería genética permitirán alterar muchas características individuales de los cultivos ornamentales una vez que los genes que las determinan hayan sido clonados, a condición de que la especie en cuestión pueda ser transformada y regenerada, y que los genes introducidos puedan ser expresados de la forma deseada. Una vez obtenidas las variedades transgénicas, su viabilidad comercial depende de la estabilidad y perdurabilidad del fenotipo modificado. En general, esto se ha logrado por introgresión de los genes incorporados por transformación.

Es inusual encontrar la gama completa de colores dentro de las especies florales convencionales. En Petunia hybrida, una de las plantas en que la vía de síntesis de antocianinas ha sido más extensamente estudiada, se producen derivados de delfinidinas y de cianidinas pero no derivados de pelargonidina. Esto se debe a la especificidad de la enzima dihidroflavonol 4-reductasa de petunia, la cual no puede reducir al precursor de pelargonidina, el dihidrokemferol, en kemferol. Sin embargo, hace casi dos décadas se obtuvo una variedad de petunias anaranjadas que representa el primer producto exitoso de modificación del color de las flores por ingeniería genética. La transparencia 90 muestra un esquema de la correspondiente ruta biosintética en la que se ha subrayado el paso afectado por la modificación genética. Esto se logró transformando una variedad de petunia blanca con el gen de la dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) de maíz. La variedad de petunia blanca (mutante RLo1) acumula dihidrokemferol debido a que los genes f3’h (3´flavonoide hidroxilasa) y f3’5’ (3´-5´flavonoide hidroxilasa) se hallan afectados por mutaciones; en consecuencia, produce flores que no muestran pigmentación. La transformación de esta variedad con el gen de maíz condujo a la producción y acumulación de pelargonidina, obteniéndose flores de petunia color anaranjado (fotografía de la derecha). Muchos de estos transformantes sufrieron inestabilidad epigenética (expresión inestable debido a la metilación del promotor), no pudiéndose obtener cultivares uniformemente coloreados, lo cual impidió su comercialización. Sin embargo, los investigadores de la empresa Novartis lograron obtener petunias anaranjadas uniformemente coloreadas por introgresión del gen DFR en plantas de petunia. Dado que las antocianinas se acumulan en vacuolas y que su espectro de absorción depende del pH, éstas se convierten en indicadores naturales del pH vacuolar. A pH ácido, las antocianinas toman un color que varía entre el rojo y el anaranjado, mientras que a pH más básico se vuelven más azuladas. Por ejemplo, el cambio de púrpura a azul durante el desarrollo de las flores de Ipomoea se correlaciona con un aumento del pH vacuolar, lo que requiere la actividad de una bomba Na+/H+ (PURPLE) que alcaliniza el contenido vacuolar. En petunia, el pH vacuolar es normalmente ácido al comenzar la floración, haciendo que las antocianinas viren en el rango de los anaranjados. Mediante el análisis genético de mutantes que exhibían flores con colores más azulados, se identificaron 7 loci, denominados PH1 a PH7, que estarían involucrados en el desarrollo de estos fenotipos. Como el pH vacuolar del

tejido floral es más básico que en las flores salvajes, se sugirió que estos loci eran requeridos para la acidificación vacuolar. La transparencia 91 muestra la incidencia del pH vacuolar sobre el color de las flores. En la hilera superior se muestran flores que acumulan antocianinas 3´-hidroxiladas (tipo cianidinas) y en la hilera inferior, flores que acumulan antocianinas 3´,5´-hidroxiladas (tipo delfinidinas). De izquierda a derecha, se muestran flores salvajes para el gen ph4 (ph4+) y petunias mutantes para el locus pH4. Se observan dos fenotipos: uno estable (ph4- estable) y otro inestable (pH4-inestable).

Las flores modificadas genéticamente se encuentran actualmente disponibles en muchas partes del mundo. La primera introducción en el mercado la llevó a cabo la empresa australiana Florigene en 1996 con el lanzamiento de los claveles violetas Moondust®. Desde entonces, esta variedad ha sido comercializada en Japón, EEUU y Europa. En 1998, la misma empresa inició la comercialización de la segunda variedad de claveles modificados genéticamente Moonshadow®. La transparencia 93 muestra detalles de las flores transgénicas. Estos claveles transgénicos han sido sometidos a un riguroso escrutinio regulatorio y, en principio, no presentan mayores riesgos para el ambiente que los obtenidos por métodos convencionales. La mayoría de estos claveles son infértiles. Por otro lado la dispersión de semillas se ve limitada ya que las flores son removidas de la planta cuando están aún cerradas. La mayoría de las plantas son cultivadas en invernaderos, lo cual disminuyen el riesgo de dispersión del polen, y los claveles son propagados por corte y no vegetativamente (bulbos, tubérculos, etc.) de manera que la dispersión por residuos está limitada.

Una cantidad creciente de evidencias sugiere que los flavonoides, y en particular los flavonoles, son potentes antioxidantes, y que un aumento en su consumo diario podría reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Por esta razón, existe gran interés en el desarrollo de cultivos comestibles que produzcan altos niveles de flavonoles, siendo el tomate uno de los principales candidatos. El fruto maduro del tomate posee en su piel pequeñas cantidades de flavonoides, principalmente naringenina chalcona y el flavonol rutina. En la pulpa prácticamente no se producen flavonoides. Dado que la piel del fruto representa sólo el 5% del peso total del mismo, se procuró aumentar los niveles de flavonoles en la pulpa del tomate. Las transparencias 94 y 95 presentan resultados de un trabajo en que se alcanzó este objetivo. Para ello, se utilizó una estrategia basada en la expresión de factores de transcripción heterólogos. Los factores de transcripción que regulan la síntesis de flavonoides en diversas plantas forman parte de dos familias principales: la familia C1, tipo MYB y la familia R, tipo MYC. Los autores sobrexpresaron en tomate los factores de transcripción C1 (factor tipo MYB) y L1 (factor tipo MYC) de maíz. Transformaron plantas de tomates con pares de construcciones diferentes en forma simultánea: a) gen C1 bajo la regulación del promotor constitutivo 35S de CaMV y el gen L1 bajo la regulación del promotor específico de fruto E8 (35SC1/E8L1); b) genes C1 y L1 bajo la regulación del promotor específico de fruto E8 (E8C1/E8L1). Dado que los factores C1 y L1 actúan en forma coordinada, se asumió que ambas estrategias conducirían al incremento específico de flavonoles en el fruto. Como controles, se transformaron plantas de tomate con las siguientes construcciones: a) gen C1 bajo la regulación del promotor constitutivo 35S de CaMV (35SC1); b) gen L1 bajo la regulación del promotor específico de fruto E8 (E8L1). La transparencia 95 presenta una tabla que resume los resultados del análisis de la expresión de flavonoides en tomates transformados con cada una de las construcciones mencionadas. La cantidad y tipo de flavonoles fue determinada por HPLC a partir de pulpa de tomates controles y transgénicos. Como puede observarse, sólo hubo producción de flavonoles en las plantas que expresaban los dos factores, lo que demuestra que ambos son requeridos para activar completamente la vía correspondiente. En el gráfico de barras de la derecha se muestran los niveles de expresión de los distintos flavonoles (kemferol, quercetina y

naringenina) en pulpa de tomate maduro obtenida a partir de diferentes líneas transformadas con la construcción 35SC1/E8L1. En el fruto de las plantas transgénicas se observa un aumento de kemferol de hasta 60 veces en relación con el nivel de las plantas control. En contraste, la quercetina sólo aumentó unas 3 veces. Los niveles de naringenina aumentaron aproximadamente 2 veces respecto de las plantas control, pero sólo en algunas líneas transgénicas. Se obtuvieron resultados similares con las plantas transformadas con las construcción E8C1/E8L1.

Alcaloides


Los alcaloides producidos por las plantas constituyen uno de los grupos de productos naturales que provee mayor cantidad de compuestos farmacológicamente activos. Como es generalmente el caso para los metabolitos secundarios, la producción de alcaloides es baja, lo que hace que su producción a escala comercial sea muy cara. Los métodos de producción alternativa (por ejemplo, la síntesis química) continúan siendo impracticables, por lo que las plantas continúan siendo la mejor fuente de obtención de estos valiosos compuestos. Recientemente, se ha logrado un significativo progreso en la caracterización de las vías biosintéticas que llevan a la producción de varios alcaloides y un número relevante de genes involucrados en estas vías han sido clonados. Utilizando estos genes, es posible mejorar la productividad en cultivos de células vegetales, en cultivos de tejidos vegetales o en plantas enteras mediante enfoques de ingeniería metabólica.

La hiosciamina (y su forma racémica atropina) y la escopolamina son alcaloides del tropano presentes en varias plantas solanáceas. Son usados en medicina como agentes anticolinérgicos con acción sobre el sistema nervioso parasimpático. Dado que difieren en sus acciones sobre el sistema nervioso central, existe una demanda comercial de escopolamina 10 veces mayor que la de hiosciamina y atropina juntas. Aunque varias especies de solanáceas pueden ser utilizadas como fuente comercial de estos alcaloides, los contenidos de escopolamina son siempre mucho menores que los de hiosciamina. Por esta razón, existe gran interés en aumentar los niveles de escopolamina en plantas medicinales cultivables como la A. belladona. La escopolamina se forma a partir de la hiosciamina vía la 6b-hidroxihiosciamina. La hiosciamina 6b-hidroxilasa (H6H) cataliza la hidroxilación de la hiosciamina a 6b-hidroxihiosciamina, y la epoxidación de ésta a escopolamina (ver reacción en la transparencia 97). A pesar de que la actividad de epoxidación de la H6H es bastante menor que la de la actividad de hidroxilación, una serie de evidencias indirectas sugiere que la reacción de epoxidación no es un paso limitante en la planta. Por ejemplo, no se observa acumulación de 6b-hidroxihiosciamina en plantas, pero sí existe una correlación entre la actividad de H6H y la tasa de escopolamina/hiosciamina en tejidos de raíces productoras de escopolamina. Por lo tanto, la enzima H6H parece ser una un buen blanco para modificar la producción de escopolamina por ingeniería metabólica. La estrategia elegida en el trabajo que se presenta en las transparencias 98 y 99 fue sobrexpresar la enzima en plantas que acumulan hiosciamina, asumiendo que esto generaría un aumento de escopolamina en las plantas transformadas. El gen que codifica la enzima hiosciamina hidroxilasa (H6H) de Hyosciamus niger fue clonado bajo la regulación del promotor constitutivo 35S de CaMV. Esta construcción fue utilizada para transformar A. belladona, una planta típicamente rica en hiosciamina.

La transparencia 99 muestra resultados de este trabajo. El cambio en la composición de alcaloides de las plantas transgénica de A. belladonna fue remarcablemente eficiente: la escopolamina fue prácticamente el único alcaloide presente en las partes

aéreas de la planta. Cabe destacar que la producción exclusiva de escopolamina no pudo lograrse a través de cruzamientos convencionales. Mientras que usualmente la purificación implica una extracción diferencial y una separación cromatográfica de la fracción de alcaloides, debido a que la escopolamina se produce en forma exclusiva, la purificación a partir de hojas transgénicas puede efectuarse sin dificultad mediante recristalización de la fracción total de alcaloides. Por otra parte, la conversión a escopolamina no fue eficiente en las raíces de plantas transgénicas, a pesar de observarse una relativa alta expresión de H6H en las mismas. Existen dos argumentos alternativos, pero no exclusivos, para explicar este resultado: a) la hiosciamina podría ser sintetizada en un subgrupo de células de la raíz en el cual la expresión a partir del promotor 35S de CaMV podría no ser tan fuerte y, b) la conversión de hiosciamina a escopolamina puede ocurrir en forma más eficiente durante la translocación y almacenamiento de los alcaloides en las partes aéreas. La transferencia del gen de H6H y su expresión constitutiva en una planta típicamente rica en hiosciamina, convirtió a esta planta herbácea perenne en una planta de alto valor farmacológico.

Existe una creciente demanda de café libre de cafeína debido a los efectos adversos que este compuesto produce en personas sensibles: palpitaciones, aumento de la presión sanguínea e insomnio. El café es actualmente descafeinado mediante un proceso industrial costoso que da como resultado un café con menos sabor. Las transparencias100 y 101 presentan un trabajo cuyo objetivo es la obtención de plantas de Coffea canephora que no producen cafeína mediante técnicas de ingeniería metabólica. La biosíntesis de cafeína en plantas de café involucra a tres N-metiltransferasas: CaXMT1, CaMXMT1 (teobromina sintetasas) y CaDXMT1 (cafeína sintetasa), que agregan grupos metilos a la xantosina en forma sucesiva para producir cafeína. El trabajo comentado describe la construcción de plantas de café transgénicas en que la expresión del gen de teobromina sintetasa (CaMXMT1) es reprimida mediante ARN de interferencia (ARNi). Para diseñar los fragmentos cortos (ARN-S) y largos (ARN-L) de ARNi se utilizaron secuencias del extremo 3´ no codificante del gen CaMXMT1. Se transformó A. tumefaciens EHA101 con vectores conteniendo las construcciones ARN-S y ARN-l, y el gen de la Proteína de Fluorescencia Verde (gfp) de Aquearea victoria como control. Las bacterias transformadas fueron usadas para transformar plantas de C. canephora. En cada transformación se obtuvieron más de 35 brotes transgénicos somáticos independientes. Los fenotipos fueron aparentemente normales. La transparencia 101 muestra resultados de este trabajo. Se colectaron hojas jóvenes de brotes de un año y se les midió el contenido de alcaloides. Las plantas control y las transformadas con el gen de la Proteína de Fluorescencia Verde (GFP) contenían cantidades similares de teobromina y cafeína (aproximadamente 1 y 8 mg por g de tejido fresco, respectivamente). En contraste, las hojas jóvenes de de las líneas transformadas presentaron una reducción del 30-80% en el contenido de teobromina y un 50-70% en el contenido de cafeína en comparación con las plantas control. Como el gen CaMXMT1 se expresa en hojas jóvenes, yemas y frutos inmaduros, es de esperar que, cuando las plantas transgénicas maduren, produzcan granos de café que, además de su bajo contenido en cafeína, sean esencialmente normales. Actualmente, los autores están utilizando el mismo enfoque con plantas de Coffea arabica, especie de la que se obtiene el 70% del café que es comercializado mundialmente.

En los últimos años, se han sobrexpresado numerosos genes, ya sea en sus plantas de origen o en otras especies (transparencia 102). En algunos casos, la sobrexpresión resultó en un aumento de la acumulación de los compuestos deseados. Sin embargo, en otros resultó sólo en el aumento de la enzima codificada por el propio gen o, peor aún, en la producción de compuestos no deseados. Estos resultados evidencian la complejidad de las redes metabólicas y la limitada capacidad existente para predecir las consecuencias de sobrexpresar determinados genes estructurales. Esta situación

prevalecerá aún por cierto tiempo, en tanto y en cuanto no se cuente con mayor información sobre la composición de las vías metabólicas que se desean modificar. En este sentido, la utilización de factores de transcripción para activar vías metabólicas completas parece ser actualmente una estrategia prometedora. En los próximos años, el principal desafío será obtener mayor información acerca de la regulación metabólica a todos los niveles: genético, enzimático, de la compartimentalización, del transporte y de la acumulación. Dado que los metabolitos secundarios son específicos de especie, la información genética obtenida de A. thaliana será de utilidad limitada, por lo que la secuenciación de otras especies de interés será de gran valor en este campo. A su vez, será necesario integrar los datos obtenidos de los estudios genómicos con los de los estudios proteómicos y metabolómicos, lo que permitirá generar un panorama más completo del conjunto de las interacciones regulatorias. A pesar del limitado conocimiento actual de las vías metabólicas, se han obtenido ya resultados muy interesantes, lo que demuestra el gran potencial de la ingeniería genética en la modificación del metabolismo secundario. Esta capacidad se traducirá en el futuro en numerosas aplicaciones en campos tales como “molecular farming”, fortalecimiento nutricional y resistencia a patógenos.

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