7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

1/23

Inmovilizacin

de enzimas

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

2/23

Inmovilizacin de enzimas

Se entiende por enzima inmovilizada (EI)aquella fsica/qumicamente asociada a, ocontenida en, un soporte/matriz noesencial para su actividad.

La inmovilizacin permite la utilizacin delas enzimas en procesos continuos, lo quepermite aumentar su productividad, bienpara facilitar la separacin del catalizadorde sus productos, simplificando la etapa

posterior de purificacin.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

3/23

Inmovilizacin de enzimas

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

4/23

Inmovilizacin de enzimas

La utilizacin de enzimasinmovilizadas o no depender deuna evaluacin econmica de lasalternativas, donde se considerarn

datos de cintica y estabilidad,costo, propiedades fisicoqumicas,eficiencia de inmovilizacin y cargadel soporte.

Se torna evidente que si el costo deuna enzima es muy bajo, lafactibilidad de su utilizacin en formainmovilizada es poco probable.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

5/23

Inmovilizacin de enzimas

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

6/23

Ejemplos de enzimas

inmovilizadas

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

7/23

Soportes

Un soporte para inmovilizacin debe tener lassiguientes propiedades:

Elevada resistencia mecnica, qumica ybiolgica

Insolubilidad Hidrofilicidad

Elevada razn rea/volumen

Regenerabilidad

Bajo costo

Por regla, no todas estas propiedades estnsimultneamente presentes en undeterminado soporte: necesario evaluartodas las alternativas.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

8/23

Soportes

Los soportes orgnicos presentan:

Buena relacin rea/volumen

Muy flexibles en su configuracin

Bajo costo en algunos casos(residuos orgnicos)

Los soportes inorgnicos a su vezpresentan:

Mayor resistencia

Mayor regenerabilidad

Propiedades fsicas (ej. porosidad)controlables

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

9/23

Sistemas de inmovilizacin

Las enzimas normalmente se inmovilizan atravs de algn tipo de interaccin entresus residuos aminoacdicos y el soporte.

Esto puede producir perdidas

considerables de actividad, alcomprometer los aminocidos en el, ovecinos del, sitio activo.

Para minimizar este problema seinmoviliza por intermedio de las molculas

de carbohidratos (enzimas glicoproteicas)o por la utilizacin de espaciadores.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

10/23

Sistemas de inmovilizacin

Los mtodos de inmovilizacin

se pueden dividir en:

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

11/23

Sistemas de inmovilizacin

- Adsorcin

Este un mtodo simple de inmovilizacin,en el que el soporte es mezclado con lasenzimas, en condiciones apropiadas de pHy fuerza inica, dejados en contacto por un

determinado periodo y despus lavadopara remover la protena no adsorbida.

Este mtodo permite valores elevados decarga enzimtica (hasta 1 gramo deenzima por gramo de soporte).

Las interacciones implicadas sonresultantes de fuerzas de van der Waals,efectos hidrofbicos y de carga inica

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

12/23

Sistemas de inmovilizacin

- Adsorcin

La seleccin del soporte pasa por sucapacidad de retener la enzima, sin dejardesorber nuevamente al seno del liquido,actividad enzimtica obtenida, posibilidad

de regeneracin y costo. Como ejemplos de soporte tenemos

materias orgnicas neutras (carbn activoy celulosa) y cargadas (quitina,intercambiadores aninicos y catinicos),

adems de materia inorgnica (bentonita,almina, vidrio y slica porosa).

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

13/23

Sistemas de inmovilizacin

- Adsorcin

Ejemplo: preparacin de invertasa

inmovilizada

Soporte

DEAE-Sephadex

(intercambiador aninico)

CM-Sephadex

(intercambiador

catinico)

pH 2.5 0 100

pH 4.7 100 75

pH 7.0 100 34

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

14/23

Sistemas de inmovilizacin

Enlace Covalente

La unin covalente se produce entregrupos funcionales del soporte ydeterminados grupos en los residuosaminoacdicos de la molcula enzimtica.

Estos grupos son reactivos segn lasiguiente orden:

-S- > -SH > -O-> -NH2> -COO-> -OH >> -NH3+

La reacciones qumicas que se puedenutilizar incluyen la acilacin, la alquilacin,

la diazotacin, la disulfuracin y laactivacin a travs de sales de metales detransicin.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

15/23

Sistemas de inmovilizacin

Enlace Covalente

Ejemplo de qumicos son la carbodiimida yel glutaraldedo.

Este ultimo es ampliamente utilizado para,adems de inmovilizar enzimas a soportes,

hacer el entrecruzamiento entre lasenzimas mezcladas con otras protenasinertes, hasta se producir agregadosinsolubles de tamao considerable.

Se puede combinar la adsorcin con la

formacin de enlaces covalente, con lo quese obtiene un aumento sustancial de laestabilidad del catalizador.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

16/23

Sistemas de inmovilizacin

Enlace Covalente

Como ejemplo tenemos la

inmovilizacin de invertasa en

quitina de camarn:

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

17/23

Sistemas de inmovilizacin

Inclusin en matrices

En este mtodo, la enzima escontenida entre las cadenas de unared polimrica, lo suficientementecompacta para retener la enzima,pero capaz de permitir el libre flujode reactantes.

Esto tiene la implicacin que solo estil este tipo de inmovilizacincuando se pretende procesarsustratos y productos de muy bajopeso molecular.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

18/23

Sistemas de inmovilizacin

Inclusin en matrices

Este mtodo es ms adecuado parainmovilizar clulas, donde el alginatode calcio es ampliamente utilizado.

Otros ejemplos de matrices son losgeles de poliacrilamida y el almidn.

Estos presentan las desventajas de:ser no regenerables, una baja

estabilidad, tener pobrespropiedades mecnicas y severasrestricciones difusionales.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

19/23

Sistemas de inmovilizacin

Retencin por membranas

En este tipo de sistemas la enzimaspermanece libre el solucin, separada delmedio de reaccin por una membranaprotectora que solo permite el libre paso delos reactantes (sustrato/producto).

Como ejemplo, tenemos las membranasde ultrafiltracin y dilisis.

Otro mtodo consiste en lamicroencapsulacin, en la cual se produceuna reaccin de polimerizacin en la

superficie de las gotas de solucinenzimtica, dispersas en un solventeinmiscibles con agua, que produce unadelgada pelcula (nylon), casi sinrestricciones difusionales.

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

20/23

Principales caractersticas de

los mtodos de inmovilizacin:

Caractersticas Adsorcin Enlace

covalente

Inclusin en

matrices

Retencin por

Membranas

Preparacin Simples dificil dificil Simples

Costo bajo elevado moderado elevado

Fuerza deligacin

variable fuerte flaca fuerte

Liberacin de

enzima

si no si no

Aplicabilidad amplia selectiva amplia Muy amplia

Problemas en la

utilizacin

elevados bajos elevados elevados

Efectos de la

matriz

si si si no

Restricciones

difucionales

no no si si

Proteccin

microbiana

no no si si

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

21/23

Parmetros de inmovilizacin

Hay dos parmetros a considerar en la

inmovilizacin: el rendimiento de

inmovilizacin y la capacidad de carga del

soporte.

El rendimiento de inmovilizacin (RI) esdada por:

Algunos autores usan:

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

22/23

Parmetros de inmovilizacin

Ejemplo del rendimiento de

inmovilizacin (%) de

glucoamilasa:

7/22/2019 Inmovilizacion Enzimas Clase

23/23

Parmetros de inmovilizacin

La capacidad de carga (CC) del soporte sedefine como la actividad cargadaexpresada en el catalizador (EI) por unidadde peso seco del soporte (W), lo que viene

dada por:

Ambos los parmetros, EI y CC, estnfrecuentemente en compromiso, es decir,para aumentar la CC se tiene quesacrificar el EI y viceversa.