Inmunohematologiabasica (2011) (1)

Dr. Silvio Rosell 24/10/2011

Escuela de Técnicos en Hemoterapia e Inmunohematología UBA

Hospital de Clínicas

INMUNOHEMATOLOGIA. C.- Consideraciones generales. Uso de diferentes

medios: salino, albuminoso, soluciones de baja fuerza iónica (LISS), enzimático, polybrene, polietilenglicol,

antiglobulínico, etc.

Diferentes enfoques de la compatibilidad pretransfusional. Interpretación de los resultados de las técnicas de detección de anticuerpos y pruebas

pretransfusionales.

24/10/2011 Dr. Silvio Rosell

Aglutinación

• La aglutinación es la agregación, mediada por anticuerpos, de las partículas que expresan antígenos de superficie.

• Tiene dos etapas

1. Sensibilización

2. Formación de puentes entre las células sensibilizadas.


Hemólisis

• La hemólisis es la destrucción de los glóbulos rojos, con liberación de la hemoglobina intracelular

• La hemólisis no ocurre si los antígenos interactúan con los anticuerpos en sueros sin complemento o plasma con anticoagulante

• La hemólisis constituye un resultado positivo

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Uniones químicas en la aglutinación

• Uniones polares • Puentes de hidrogeno entre grupos hidrofílicos

• Suelen asociarse a antígenos hidrocarbonados

• Uniones hidrófobas • En general involucran a antígenos proteicos

• Uniones o fuerzas de Van der Waals – London


Factores a tener en cuenta

• El grado de ionización de las moléculas

– Depende fundamentalmente del pH del medio

• Constante de equilibrio (afinidad de los anticuerpos)

– Deriva de las tasas relativas de asociación y disociación


Factores que afectan la aglutinación (primera fase)

• Temperatura • Los antígenos hidrocarbonados suelen relacionarse

con anticuerpos reactivos en frío y los proteicos con anticuerpos reactivos en caliente

• PH • En la mayoría de las pruebas de rutina debe

emplearse un pH de alrededor de 7

• La solución salina almacenada tiene un pH de 5-6

• Es mejor usar solución salina amortiguada



• Tiempo de incubación – En los sistemas salinos que utilizan suero

antiglobulínico para demostrar la fijación, la incubación a 37ºC durante 30-60 minutos permite detectar la mayoría de los anticuerpos significativos

• Relación Ag / Ac – Lo habitual es usar dos gotas de suero por cada gota

de suspensión de glóbulos rojos al 2-5%

– Muy rara vez, el exceso de anticuerpos puede inhibir la aglutinación y provocar un fenómeno de prozona



• Potencia iónica • Cuando se utiliza solución salina de baja fuerza

iónica (LISS) el tiempo de incubación a 37ºC se reduce a 10-15 minutos

• El uso de LISS abrevia la incubación en la detección de anticuerpos de rutina

• Prolongarla podría deteriorar la sensibilidad de la prueba


Segundo estadío de la aglutinación

La distancia entre los eritrocitos en un medio iónico

es proporcional al potencial Z

El agua de hidratación es la propiedad física más importante

que mantiene la distancia entre los glóbulos rojos suspendidos

en solución salina


Proporciones

La inhibición de la aglutinación por exceso de

anticuerpos es sumamente infrecuente


Para visualizar la reacción Ag/Ac:

• La centrifugación promueve el acercamiento físico de las células

• La prueba antiglobulínica indirecta emplea suero antiglobulínico

• Otros métodos actúan: – reduciendo la carga negativa de las moléculas

superficiales

– disminuyendo la capa de hidratación que rodea a las células

– introduciendo macro moléculas con carga positiva que las agregan


Métodos Potenciadores

• Albúmina Humana

• LISS (Low ionic saline solution)

• PEG (Polietilenglicol)

• POLYBRENE (BHDM)

• Técnicas con enzimas proteolíticas


ALBUMINA (Sol de albúmina bovina al 30%, 22%, 6%, 3%)

• Disminuye el potencial Z, favoreciendo la 2º fase de la aglutinación.

• En concentraciones de 30% o >favorece la aparición de rouleaux

• En la PCI no aumenta la sensibilidad de la prueba

• Por falta de ventajas objetivas está en desuso


Enzimas Proteolíticas

• Bromelina, ficina, papaína y tripsina – (Las más usadas)

• Desnaturalizan ciertos antígenos eritrocitarios, en especial M, N, S, Fya y Fyb, XG

• Disminuyen la carga superficial de los GR por clivaje de las moléculas de ácido siálico de las cadenas polisacáridas

• El tratamiento enzimático lleva a la formación de espículas en los GR y aumenta así el número potencial de puntos de contacto


Moléculas con carga positiva Bromuro de Hexadimetrina, Sulfato de Protamina,

Polilisina B.

• Ante estos polímeros los GR normales exhiben agregación espontánea, que puede dispersarse con sales neutras como el citrato de sodio

• El BHDM es un polícatión de amonio cuaternario que neutraliza las cargas negativas de los GR.

• Favorecen la aglutinación por Ig G


POLYBRENE

• El Polybrene se añade a los GR incubados con anticuerpos a baja potencia iónica y bajo pH

• Si se adiciona citrato de sodio, se restablece la carga del GR

• Si el aglutinado se disocia – prueba negativa

• Si el aglutinado persiste – prueba positiva (aglutinación irreversible a los GR

sensibilizados con Acs)

• Tiene sensibilidad disminuida en la detección de anticuerpos del sistema Kell


Polietilenglicol (PEG)

• El PEG es un polímero lineal hidrosoluble que se usa como aditivo para incrementar la captación de anticuerpos

• Su acción principal es eliminar el agua intercelular favoreciendo el acercamiento de los GR

• No debe centrifugarse el PEG con el suero y GR

– Se lavan las células con solución salina y luego se efectúa la prueba antiglobulínica


Polietilenglicol (PEG)

–El reactivo AGH de elección en las pruebas con PEG suele ser el anti-IgG

• evita las reacciones falsas positivas con algunos agentes poliespecíficos

–Precipitados podrían interpretarse como reacciones positivas


Solución salina de baja fuerza iónica

(LISS) • Potencia mucho la captación eritrocitaria de

anticuerpos en la fase I de la aglutinación

– La cantidad de iones +/- del LISS (0,03 M) es menor al de la SF (0.17M)

• En la actualidad la mayoría de los profesionales usa aditivos LISS

• Contiene macromoléculas además de sales iónicas y amortiguadores


Solución salina de baja fuerza iónica (LISS)

• Puede aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ags y Acs

• El aumento del volumen de suero acrecienta la potencia iónica del sistema LISS – aditivo

• Se deben respetar estrictamente las instrucciones del fabricante


LISS

• Ventajas:

– Aumenta la sensibilidad de la PCI para detectar Acs clínicamente significativos

– Detecta Acs en baja concentración y los de baja afinidad que pueden perderse con los lavados

– Reduce el tiempo de incubación

• Desventajas:

– Debe ser sometido a estricto control de osmolaridad para evitar la fijación inespecífica de C

– Los GR suspendidos el LISS deben ser procesados dentro de las 24 hs

– Menor sensibilidad para anti-K. (1º fase de aglutinación)


Otros Métodos para detectar reacciones Ag-Ac

• Adherencia eritrocitaria en fase sólida (Microplacas)

• Aglutinación en columna, pruebas en gel y separación por afinidad

• Inmunofluorescencia

• Pruebas Inmunoabsorbentes ligadas a las enzimas (ELISA)

• Inmovilización de Antígenos Eritrocitarios con Anticuerpos Monoclonales Específicos (IAEAM)

• Radioinmunoensayo


Gel, microcolumnas • Las reacciones se producen en

microcolumnas que contienen mezclas de cuentas de vidrio o gel, amortiguadores y a veces reactivos

• Se establecen barreras de densidad permiten separar el suero problema de los eritrocitos

• Una de sus ventajas es que se evita el lavado con solución salina


Micrométodos, Microplacas

• Utilizan antígenos o anticuerpos inmovilizados

• Existen métodos manuales, semiautomatizados y automatizados

• En la prueba indirecta si las células indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reacción es positiva

• Si sedimentan no se produjo reacción Ag-Ac


Hacemos un breve intervalo


Prueba antiglobulínica, principios

• Todas las moléculas de anticuerpo son globulinas

• Los dos puntos Fab de la molécula de AGH forman un puente entre células adyacentes recubiertas con anticuerpos y provocan aglutinación visible


AGH poliespecífico

• La mezcla poliespecífica podría reaccionar con las cadenas livianas kappa y lambda presentes en todas las clases de inmunoglobulinas

• Muy pocas veces se reconoce a los anticuerpos por su capacidad de fijación de complemento

• La actividad anti-C3d es importante para la PAD


Reactivos AGH monoespecíficos

Anti-IgG, anti-C3b, anti-C3d • Anti-IgG

– Carecen de actividad anti- complementaria

• Pueden ser o no específicos para cadenas pesadas

• Pueden ser o no Monoclonales


Detección de anticuerpos antieritrocitarios inesperados. (DAI)

• Objetivos:

– Detectar la mayor cantidad posible de anticuerpos significativos

– Detectar la menor cantidad posible de anticuerpos no significativos

– Completar los procedimientos en un lapso razonable


Muestras

• Se puede utilizar suero o plasma

• El plasma no es adecuado para apreciar la activación del complemento

• Los GR de donantes múltiples se emplean en la evaluación de muestras de donantes pero no de receptores


Detección de anticuerpos antieritrocitarios inesperados. (DAI)

• La pesquisa de anticuerpos inesperados

requiere:

– GR reactivos de donante único

– Métodos que identifiquen a los Acs significativos

– Que incluyan una prueba antiglobulínica precedida de incubación a 37ºC

• La magnitud de la aglutinación o el grado de hemólisis debe registrarse de inmediato


Pruebas de compatibilidad • Si se identifican o identificaron anticuerpos

relevantes el paciente debe recibir sangre sin los antígenos correspondientes aunque los GR portadores de esos antígenos sean compatibles in vitro

• La evaluación pretransfusional no requiere control autólogo ni PAD

• La técnica de compatibilidad más simple es la centrifugación inmediata

• Detecta la incompatibilidad ABO y pueden detectarse anticuerpos anti-M, anti-N y anti-P1


Compatibilidad informatizada

Fundamento:

• Si la pesquisa y los antecedentes no revelan anticuerpos significativos, es factible omitir la prueba cruzada en fase antiglobulínica y sólo confirmar la compatibilidad ABO

• Su mayor dificultad radica en la validación de la metodología a utilizar


Tipificación y detección (Type and Screen)

• La metodología de tipificación y detección consiste en determinar el tipo ABO y Rh y la presencia de anticuerpos imprevistos en una muestra de sangre del paciente y luego guardarla para una eventual prueba cruzada

• Su indiscutible ventaja es de tipo logístico


Selección de unidades para transfusión

• Después de identificar los anticuerpos es preciso definir su significado clínico

• El grado de relevancia clínica podría variar aún en el caso de anticuerpos de igual especificidad

• Los anticuerpos reactivos a 37ºC y/o en la PAI, podrían ser relevantes y los reactivos a temperatura ambiente o menor, no


Excepciones a los resultados de las pruebas de rutina

• Anti-Ch, anti-Rg y muchos de los Knops y

Cost, ejercen efectos clínicos mínimos o nulos a pesar de la PAI positiva

• Los anti-Vel, anti-P y anti-Tja podrían reaccionar sólo a bajas temperaturas y aún así causar destrucción celular in vivo


Gracias por su atención

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