Introducción a las proteínas

Aminoácidos

Moléculas anfipróticas

Estructura de los a-aminoácidos

Estereoisomería de los aminoácidos

Aminoácidos Proteicos Modificados

•No incorporados por los ribosomas Se forman después de la síntesis proteica (modificaciones post transduccionales)

• Proporcionan propiedades funcionales específicas

Son modificaciones reversibles, por ejemplo la fosforilación es importante en regulación y señalización.

Otros aminoácidos modificados

• Algunos microorganismo evolucionaron para usar 22 aminoácidos (selenocisteína y la pirrolisina).

• La selenocisteína puede considerarse el aminoácido 21, aunque solo se ha encontradoen algunas enzimas codificadas por Escherichia coli (formato deshidrogenada).

• Existen aminoácidos no estándar (200) y algunos presentan actividad biológica importante pero que no forman parte de las proteínas, ejemplo:

• D-Acido Glutamico (en polipéptidos presentes en pared celular de microorganismos).

• L-homoserina (Presente en muchos tejidos, intermediarios metabólicos), etc.

• Histidina: histamina, controla la constricción de vasos sanguineos, secreción de HCl por el estomago.

• Tirosina; precursor de epinefrina, hormona tiroidea, tiroxina y triyodotropina.

• Neurotransmisores

γ -aminobutírico (GABA), derivado del Glu

serotonina, derivado del Trp

Ionización

A pH ácido, el grupo carboxilo esta protonado y el aminoácido esta en la forma catíonica

A pH neutro, el grupo carboxilo esta desprotonado pero el grupo amino esta protonado. La carga neta es cero, tales iones son llamados Zwitterions

A pH alcalino, el grupo amino es neutral –NH2 y el aminoácido esta en la forma aníonica.

Efecto de los sustituyentes sobre el valor de pKa

-carboxilo es mas ácido que los ácidos carbixílicos.-amino es levemente menos básico que en aminas

Aminoácidos sirven como

buffersAminoácidos con cadena lateral no cargada como la glicina, tienen dos valores de pKa.:

El pKa del grupo -carboxilo es 2.34

El pKa del grupo -amino es 9.6

Puede actuar como buffer en dos intervalos de pH.

Enlace Peptídico

La nomenclatura de tres letras

• Se empueza a nombrar a partir del N- terminal

• La secuencia se escribe como

Ala-Glu-Gly-Lys

• Muchas veces se emplea la nomenclatura de una sola letra: AEGK

Peptidos: Una Variedad de funciones• Hormones and feromonas:

– insulina (relación con azúcar)– oxitocina (relación con nacimiento)– sex-peptido (ralción con apareamiento de la mosca de la fruta)

• Neuropeptidos– sustancia P (mediador de dolor)

• Antibioticos:– polimixina B (para bacterias Gram - )– bacitracina (para bacterias Gram +)

• Protección, i.e. toxins– amanitina (hongos)– conotoxina (caracol cono)– chlorotoxina (escorpiones)

Proteinas son:

• Cofactor es un término general para camponentes funcionales no aminoácidos

– Iones metálicos o moleculas orgánicas

• Coenzima es usado para designar cofactores orgánicos– NAD+ in lactate dehydrogenase

• Grupos Prosteticos son cofactores covalentemente unidos– Grupo Heme en mioglobina

• Polipeptidos (α-aminoácidos unidos covalentemente) + posiblemente

• cofactores, • coenzimas, • Grupos prostéticos, • Otras modificaciones

Classes of Conjugated Proteins

Dogma Central de la Biología Molecular

Código Genético

Secuencias de aminoácidos de la mioglobina de cachalote y humano

Clasificación de las proteínas

• Con base en la función:– Catalíticas: enzimas.– Estructurales: colágeno.– Contráctiles: actina y miosina.– Defensa natural: anticuerpos.– Digestivas: tripsina.– Transporte: hemoglobina.– Sanguíneas: fibrinógeno.– Respiratorias: citocromos.– Represoras:…..

• Con base en la composición:– Proteínas conjugadas: grupo prostético (grupo no

peptídico orgánico o inorgánico); glicoproteínas, metaloproteínas, hemoproteínas, flavoproteínas, fosfoproteínas, lipoproteínas.

– Proteínas no conjugadas: sin grupo prostético.

• Con base en la estructura tridimensional:– Fibrosas.– Globulares.

Estructuras de las proteínas

Estructura secundaria

Estructura de la queratina

Estructura del colágeno

Estructura secundaria y terciaria de la mioglobina

Tipos de estructuras de proteínas globulares

Estabilización de la estructura terciaria

• Fuerzas de atracción ión-ión: residuos con grupos iónicos de carga opuesta, lisina, arginina, ácido glutámico y ácido aspártico.

• Puentes de hidrógeno entre enlaces no peptídicos: tirosina y ácido glutámico.

• Puentes de hidrógeno entre enlaces peptídicos.

• Interacciones hidrofóbicas: entre cadenas laterales no polares de Leu, Val, Ile, Ala, Phe y otros aminoácidos no polares.

• Interacción con el grupo prostético: por ejemplo entre un ión metálico y diversos grupos R.

• Puentes disulfuro: Presentes entre cisteínas; ambientes oxidantes presentes fuera de la célula favorecen su formación.

Estructura terciaria y cuaternaria

Estructura cuaternaria

• Agregados de dos o más cadenas polipeptídicas unidas entre sí sólo por fuerzas de atracción no covalentes.

• Las proteínas de este tipo se conocen como oligómeros.

• Isoenzimas: formas híbridas de proteínas. Por ejemplo la enzima láctico deshidrogenasa existe por lo menos en 5 formas híbridas.

Desnaturalización de proteínas

Factores que evitan la desnaturalización

• Baja temperatura

• En la separación y purificación se deben emplear amortiguadores

• La agitación puede cambiar la conformación.

Agentes desnaturalizantes

• Temperaturas altas.• pH´s extremos.• Mercaptoetanol (reducción de puentes

disulfuro).• Hidrocloruro de guanidina(6 M).• Urea (6-8 M).• Agitación vigorosa.• Detergentes (SDS).

Algo de Bioinformática

Estructuras tridimensionales.

• http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

Propiedades de las proteínas.

http://bioinf.ibun.unal.edu.co/eexplorer/html/index.html

Hidrólisis de proteínas

Algunas proteasas

Bromuro de cianógeno

Comportamiento polianfolítico de un tetrapéptido

Purificación – Separación de mezclas de proteínas

• Separación se basa en las propiedades físico químicas – Solubilidad – precipitación selectiva (Centrifugación)– Estabilidad térmica – Carga --Electrofóresis, enfoque isoeléctrico, IEC– Tamaño – Diálisis, Sedimentación (Centrifugación), GFC– Afinidad por un ligando – Ensayos interacción “Pull

down” (Centrifugación), AC– Hidrofobicidad (HIC)

• Cromatografía es el método de uso común usada para separaciones preparativas.

http://www.salinesystems.org/content/figures/1746-1448-4-1-2-l.jpg

Separación de proteínas

FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIÓN DE LA SOLUBILIDAD

(Voet)

(p.e. sulfato de amonio)

(Voet)

Separación por Carga

•Cromatografía de intercambio iónico

•Intercambio aniónicoMatriz positiva

Proteinas negativas

Desplazadas por aniones

•Intercambio catiónico –opuesto

• pH determina la carga neta de las proteínas

•Elución con gradiente de fuerza iónica o de pH.

•Electrofóresis en gel en condiciones nativas

•Isoelectro enfoque

Separación por tamaño

• Cromatografía de exclusión de tamaño (Filtración en gel) – Volumen de carga <5%

volumen de la columna– Se diluye la muestra

• Diálisis o concentración centrifuga

Separación por afinidad

• Cromatografía de afinidad

• Ligando libre-perlas -- centrifugación

• Ligando-Perlas magneticas

• Inmuno ensayos sobre soportes sólidos

Electroforésis para Análisis de Proteínas

Separación en escala analítica es hecha por electrofóresis

– Un campo eléctrico dirige las proteínas deacuerdo a su carga

– Una matriz de Gel reduce la movilidad de las proteínas deacuerdo a su tamaño y forma.

SDS PAGE: Tamaño molecular• SDS – sodio doddecil

sulfato- un surfactante

• Las micélas de SDS se unen a todas las porteínas y las denaturalizan “unfold”– SDS da a todas las

proteínas una carga negativa uniforme.

– La forma nativa de la proteína no importa

– Velocidad de desplazamiento depende unicamente del tamaño: las más pequeñas son más rápidas.

-

Determinación el peso molecular de una proteína “problema”

Ejemplo de análisis de proteínas por SDS-PAGE en cada paso de una purificación. En el último paso hay una única banda, lo que indica que tenemos la proteína de interés completamente purificada

Ejemplo de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie

Marca

dor de P

M

Marca

dor de P

M

GELES BIDIMENSIONALES (2D)Primero isoelectroenfoque y luego SDS-PAGE

Ejemplo de gel bidimensional

Cuantificación de Proteínas

Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by

means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949

• El método de Biuret se basa en la reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el cobre es reducido a Cu+ formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 0.5 a 10 mg proteína/ml.

• Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína.

• Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.

Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951

• El color producido por el método de Lowry resulta de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos, además de la reducción del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas con cobre en medio alcalino.

• El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno.

• El color azul, es determinado a 650 nm. • Este es un método muy sensible, por lo que permite trabajar

con soluciones muy diluídas de proteínas (0.02 - 0.5 mg proteína/ml).

Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248

• El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas.

• El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad.

• La reacción entre el colorante y la proteína es muy rápida (aproximadamente 2 min), y el completo proteína-colorante permanece disperso en solución por un tiempo relativamente largo.

• Rango de detección: 0.5-10 mg proteína/ml.

Absorción Ultravioleta de las Proteínas

• La mayoría de proteínas presenta un máximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y fenilalanina).

• La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir proteínas en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura.

• Algunas preparaciones de proteínas parcialmente purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm.

• Una ecuación para calcular la concentración de proteína en la presencia de ácidos nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es:

(proteína)mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm

• La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de ácido nucleico de levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras proteínas y otros ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solución de proteína 0.1% (p/v) varía entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la proporción de aminoácidos aromáticos que contengan.

•

Absorción Ultravioleta de las Proteínas

•Todas las proteínas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico.

• Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las proteínas. Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A vs. proteínas.

(proteína)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225)

• La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos en solución. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5 mM NaOH no causa problemas).

MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)

• FUNDAMENTO

SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS PROTEÍNAS REDUCEN LOS IONES CÚPRICOS A IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA.

VentajasSENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg)

LA MEZCLA EN UN PASO ES MÁS FÁCIL QUE EN EL MÉTODO DE LOWRY

EL REACTIVO ES MÁS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY

LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DELÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)

• EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA.

• LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.

• ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.

• LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL

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